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标题:【求助】原核表达蛋白水平太低怎么办，或者原因是什么？

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达蛋白水平太低怎么办，或者原因是什么？


原核表达一个大约一百多KD的蛋白，诱导五小时之后发现蛋白质表达水平太低，估计肯定是纯化不出来的，所以想请教大家一下如何能提高一下表达水平，以及为什么它会表达的那样低，但明显是表达了的.而且敢肯定这个蛋白表达出来是没有降解的.
当然还有一个线索就是当然在加IPTG时发现菌量好象不是很高，但我觉得这不是一个主要的原因.急等，在线等.谢谢战友们
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3648755[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我不知道你做的是什么实验，IPTG，菌之类的我并不了解。
我用细胞做过western也有过应该表达挺好的蛋白降低表达的现象，后来发现是sample buffer（5X dye）出了问题，少加了DTT, b-mecaptoethanol之类的东西。
我想你的情况是不是纯化出来后处理的不妥当造成的？
个人想法，供参考。
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，谢谢回答，不是的，我是用原核表达蛋白的菌来做.
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发表于 2014-3-10 14:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议措施：
1：菌液OD在0.5左右加入IPTG,过早表达量少，过迟表达量少。
2: 有些表达量就是低，想着换载体或是表达菌试试。
3：可能你表达的基因是毒性蛋白（可能性较小），换表达菌。
先从这几个方面考虑吧！
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eric930[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议措施：
1：菌液OD在0.5左右加入IPTG,过早表达量少，过迟表达量少。
2: 有些表达量就是低，想着换载体或是表达菌试试。
3：可能你表达的基因是毒性蛋白（可能性较小），换表达菌。
先从这几个方面考虑吧！
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luoliqiong[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
诱导前OD的大小对诱导成功与否、蛋白表达量大小是有直接关系的，一般诱导前OD选择0.8-1.2。有的蛋白可能随便做做就可以表达，有的蛋白却是需要仔细摸索的，敝人曾做过一个蛋白，就是在OD为1.0时诱导，表达量最高。
表达量的高低跟菌体活力也是有密切关系的，可以多活化几次，状态好了才能多生产啊。
另外还有诱导温度、诱导时间、IPTG浓度都会影响表达量，这个需要多做几次，摸索一下。
楼上几位战友也给出了非常有建设性的建议。
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发表于 2014-3-10 14:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
原核表达一个大约一百多KD的蛋白，诱导五小时之后发现蛋白质表达水平太低，估计肯定是纯化不出来的，所以想请教大家一下如何能提高一下表达水平，以及为什么它会表达的那样低，但明显是表达了的.而且敢肯定这个蛋白表达出来是没有降解的.
当然还有一个线索就是当然在加IPTG时发现菌量好象不是很高，但我觉得这不是一个主要的原因.急等，在线等.谢谢战友们

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“原核表达一个大约一百多KD的蛋白，诱导五小时之后发现蛋白质表达水平太低，估计肯定是纯化不出来的？？”
您是怎么肯定目的蛋白表达的呢？SDS-PAGE鉴定还是WESTERN？
如果是SDS-PAGE，那您纯化过吗？在上清的话，纯化应该没问题。
纯化不出来是纯化方法有问题还是量低呢？
还有您的目的蛋白表达是在上清还是沉淀呢？
如果是在上清，能做的就是增加菌的诱导时浓度，可以达到1.
祝好运！
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我通过SDS-PAGE检测,发现其表达量很低,然后做了一次纯化,发现在上样时,以及各个操作步骤中都有较多的目的蛋白流出,如果说能不让这个蛋白在用Elution buffer洗之前损耗太多的话,那我肯定能收到足够用的蛋白了.
谢谢大家给的建议,我准备再做一个把菌的活力恢复的试验,然后在菌的浓度达到1.0时再加诱导剂.一有结果马上向大家汇报啊!!!
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-3-10 14:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我表达的是91KD的蛋白，我用的是三角瓶，这样营养就够充足的，用试管可是可以 ，但是对于较大的蛋白可能营养就不是很足了，同事你可以做个诱导的时间梯度看看 看看你蛋白在那个时间点表达 还可以看出你蛋白在那个时间点表达量是最大的
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