【求助】关于western blot 结果分析及stripping buffer 问题

最新回复

• redbutterfly (2014-3-13 13:10:49)

  昨天我做是也是和膜一样大小相同的黑色背景，根本分不出条带，也想请问一下是什么原因？

• guagua (2014-3-13 13:11:16)

  QUOTE:

  原帖由 superboy 于 2014-3-13 13:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  各位战友，在下有几个关于western blot 的问题，需要各位帮忙解答，还请大家帮帮忙。在此先谢过！
  问题：1.使用发光显影的方法，第一次在底片上得到的是与膜的大小相同的黑色背景，完全分不出条带。请问这主要是什么原因引起的呢？请 ...

  1黑色背景是一抗比例不合适，可适当加大一抗稀释比。曝光时间是根据发光条带的强弱来确定，肉眼可见的很强话，可2-10秒，很弱的话5-10min，甚至1h 或过夜，显影时间没什么要求，只要看到条带显出即可终止。
  2要用stripping buffer来洗。

• rxcc33 (2014-3-13 13:12:08)

  
  全黑的背景我没见过呢
  会不会是没有封闭？
  一抗和二抗一样的话是不需要stripping的

• tuuu2 (2014-3-13 13:12:29)

  谢谢楼上两位的答复。膜是用5％脱脂奶封闭一个小时，一抗加在封闭液中4度过夜，一抗效价是1：200。我之前用同样的一抗和二抗、效价分别是1：200和1：500，用4CN显色，膜上有目的蛋白带，就是条带比较淡。所以改用发光显影的方法，可是一直没做出条带来。 还请各位高手指点指点啊！

• superboy (2014-3-13 13:12:55)

  谢谢楼上两位的答复。膜是用5％脱脂奶封闭一个小时，一抗加在封闭液中4度过夜，一抗效价是1：200。我之前用同样的一抗和二抗、效价分别是1：200和1：500，用4CN显色，膜上有目的蛋白带，就是条带比较淡。所以改用发光显影的方法，可是一直没做出条带来。

• redbutterfly (2014-3-13 13:13:22)

  谢谢楼上两位的答复。膜是用5％脱脂奶封闭一个小时，一抗加在封闭液中4度过夜，一抗效价是1：200。
  
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  原来是一抗过夜啊，背景深很正常了，我们一般室温1h就可以了。你可以在洗膜时多洗几遍。

• bamboo16 (2014-3-13 13:13:46)

  
  1背景比较深可能是你的封闭不够充分。我一般用10%的脱脂奶粉封闭过夜，还有可能是你的一抗、二抗浓度太高了。不知道你是用什么稀释一抗、二抗的？我一般用TBST稀释。
  2如果你想重复利用你的膜的话，可以买膜再生液进行再生，我用了效果还是可以的350元\500ML。我不知道stripping buffer 能否洗下一抗、二抗。我没用过。

• superboy (2014-3-13 13:14:10)

  
  我将膜洗涤之后重新封闭、加一抗二抗，然后用4－CN显色，最终得到目的蛋白带了。也证明了一抗二抗是没问题的。所以是发光显影这一过程出问题。请问发光显影这一过程需要注意些什么问题？谢谢啊。

• zhezhe (2014-3-13 13:15:48)

  
  显影的时间可以长一点，但定影的时间在30秒就可以了，因为时间长你的X片背景会很深。
  曝光时间自己多摸索因为个人的情况不一样，一般5-10分钟就可以了。

• DONT (2014-3-13 13:16:10)

  
  曝光时间也不能太长,假如太长,尽管会出结果,但结果很难重复的.
  即结果可能是错误的,因此建议暴光时间不宜超过10分钟。

• DONT (2014-3-13 13:16:31)

  
  我们实验室经常重复利用膜，因为如果膜转得很好，只是因为抗体浓度不对就扔了，太可惜了，如果一抗二抗和前面的一样，只需用TBST洗就可以了，strip buffer 只是在你用一张已经显过的膜上孵育不同的一抗二抗时才需要。