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标题:【求助】关于western blot后的stripping

bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于western blot后的stripping


实验室之前有人做过,但是效果一直不好
本人新手上路,由于所用样品制备周期长,所需的药物现短缺,于是老师命我尽快尝试stripping
给我的protocal实在是太简单,且前人尝试后效果不好
望前辈指点迷津,不胜感激!!!
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vcve[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
这是最常见的配方。
但是这个配方有几个很明显的缺点，
1、操作不太方便，需要55度水浴加热，并且振荡，不易控制。
2、beta-metaptoethanol 有很强烈的味道。
3、去除效果不好确定，并且可能对膜上的抗原会有较大的影响。
等等。
另外就是商品化的stripping solution.
可以很好的去除以上的几个明显的缺点，可以尽可能的保证去除和再生的效果，进而使实验数据更为准确。
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发表于 2014-4-10 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
试试这个配方吧：
已配500ml的终体积为例：
甘氨酸-----------25mM-------------0.9385g
SDS--------------1%（w/v）-------------5g
pH2.0
步骤很简单：
膜第一次曝光后，用TBS或PBS洗去发光液10min，2次
加入上述stripping液，摇床，室温，30-45min。
TBS洗2-3次，10min/次
重新开始封闭、一抗。。。。。。即可。
前一段的试验由于样品量少，而检测的抗体多，一直用此方法，效果不错。不仅把原来的一、二抗洗得很干净，还不太影响本身的蛋白样品。LZ可试试。
祝实验顺利！
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

stripping洗涤30-60分钟,摇床,然后TBST洗30分钟,摇床,
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris (0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50-55℃，30min。
这是最常见的配方。
但是这个配方有几个很明显的缺点，
1、操作不太方便，需要55度水浴加热，并且振荡，不易控制。
2、beta-metaptoethanol 有很强烈的味道。
3、去除效果不好确定，并且可能对膜上的抗原会有较大的影响。
等等。
另外就是商品化的stripping solution.
可以很好的去除以上的几个明显的缺点，可以尽可能的保证去除和再生的效果，进而使实验数据更为准确。
......
-------------------------------------------------------------------------------------
谢谢
我老师给我的参考方案就是这个
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-10 10:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 131415 于 2014-4-10 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
试试这个配方吧：
已配500ml的终体积为例：
甘氨酸-----------25mM-------------0.9385g
SDS--------------1%（w/v）-------------5g
pH2.0
步骤很简单：
膜第一次曝光后，用TBS或PBS洗去发光液10min，2次
加入上述stripping液，摇床 ...

================================================

我明天想尝试此法,因为stripping的配方实在是太方便了!
在此还有两个疑问:
1.此方法对曝光几天后的膜是否仍然有效?(玻璃纸封住保存4°C)
2.用TBS还是TBS-T的效果比较好?
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avi317[使用道具]
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发表于 2014-4-10 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

beta-metaptoethanol 的配方适合抗体亲和力比较强的抗体strip，
甘氨酸的配方属于比较温和的配方，适合亲和力一般的抗体。
整个过程，反应时间也是个重要因素，过长会导致膜上抗原的损失，过短去除不充分。
我一般做这个实验，会根据使用的抗体的性质和膜上蛋白结合抗体的量来选择stripping buffer和去除的时间。
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vcve[使用道具]
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发表于 2014-4-10 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果两次的二抗不同源 且蛋白条带位置相差比较大
可以不strip直接杂第二个一抗
就是TBST洗下显影后的膜
封闭 一抗 二抗
由于这样不损失膜上的蛋白
如果抗体不紧缺 可以先试试
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bs4665[使用道具]
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发表于 2014-4-10 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用甘氨酸,SDS法处理后,原来曝1min的样品现在需要30min才有很弱的条带
stripping时间为30min,封闭过夜了
导致蛋白损失这么多的原因是因为stripping过度还是因为封闭的时间太长呀?
我stripping之后加底物又曝了一次bata-actin,30min只有很淡的背景
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daod[使用道具]
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 小中大

甘氨酸,SDS法，属于比较温和的stripping buffer，一般不会使膜上的蛋白损失太多。有几点需要确定。
第一，你stripping后是使用不同的一抗和二抗，还是相同的。如果是不同的考虑一下是否因为第一次的一抗和二抗去除的不彻底造成的第二次显色比较淡甚至没有。
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