【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？ - 分析百问

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标题:[未解决]【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊？

[未解决]本主题悬赏可用分 10

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发表于 2022-8-22 12:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。

https://168won.com/

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发表于 2022-10-11 11:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #1 am10 的帖子

我当时做的是180kd的蛋白，不喜欢太软的胶，配了10%的胶，转膜液加了5%的SDS，恒流100mA转膜2h，转出来还可以在胶上看到一点170的marker条带，用胶去跑个考染也可以看到不少蛋白，但是由于膜上的蛋白已经足够我用了，我就没有再继续折腾了。

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2022-10-11 11:52

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chenzhen2016[使用道具]
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发表于 2023-7-26 16:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于较大的蛋白（如200 kDa），在进行Western Blot实验时，确实需要注意一些因素，以下是一些建议：

1. 蛋白分离：由于蛋白分子量较大，传统的SDS-PAGE电泳可能不适用。可以考虑使用较低的聚丙烯酰胺浓度（例如6％或8％）或使用Bis-Tris缓冲系统。此外，使用长时间的电泳（如慢速电泳）可能更适合分离大分子量的蛋白。

2. 转膜条件：由于蛋白分子量较大，转膜的条件需要进行优化。可能需要使用低电流和较长的转膜时间来确保蛋白成功转移到膜上。

3. 转膜膜：选择适合大分子量蛋白的转膜膜。PVDF膜通常比NC膜更适合转移大蛋白，因为它具有更好的蛋白结合性能。

4. 阻断缓冲液：使用合适的阻断缓冲液，例如5％的脱脂奶粉或3％的牛血清白蛋白，来防止非特异性结合。

5. 抗体选择：确保使用的一抗和二抗对目标蛋白有较高的特异性和敏感性。

6. 标记的蛋白量：对于大分子量的蛋白，可能需要加载更多的样品量，以确保可以检测到充足的信号。

7. 选择合适的标准品：如果需要估算蛋白的分子量，使用合适的蛋白标准品，例如蛋白分子量标尺。

8. 成像条件：根据实验结果的要求和蛋白表达水平，选择合适的曝光时间以获取清晰的图像。

以上建议是为了优化大分子量蛋白的Western Blot实验。注意，每个实验室和蛋白质可能存在差异，因此可能需要根据实验结果进行进一步优化。预实验是很重要的，通过多次尝试和优化，你会逐渐找到最适合你实验条件的方法。祝你实验顺利！

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