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【求助】盐析法沉淀蛋白质，为什么这样？
【求助】盐析法沉淀蛋白质，为什么这样？
我用PB从海胆卵中提取蛋白质后，用盐析法分级沉淀，每次离心后，虽然有蛋白质沉淀下来，但溶液的上层也有大量的悬浮物（应该是蛋白质），为什么这些蛋白质不沉淀下来却悬浮着？请高手指教。
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2014-5-29 11:23 作者: whitesheep 来源: 分析测试百科网
最新回复
xue258 (2014-5-29 11:23:36)
QUOTE:
请问您离心得条件是什么？？whitesheep (2014-5-29 11:23:56)
bring (2014-5-29 11:24:26)
QUOTE:
我们在做蛋白质的硫酸铵沉淀的时候也经常会遇到这种情况，我认为是跟蛋白质的结晶行为有关系，在做实验的时候会发现但加硫酸铵的速度比较快和搅拌的速度比较快的时候，悬浮在上面的蛋白质就会增多，而且悬浮在上面的蛋白质是一种絮状的沉淀物，所以你离心的时候它也只会悬浮在上面，我也曾考虑我要的蛋白质是沉淀在上面还是只在下面，但结果表面目的蛋白质既在沉淀中也在悬浮物中，所以我认为它们只是结晶行为上的一种不同。同时我们还发现有些蛋白质沉淀的时候没有悬浮物，而全都沉淀下去。也有人认为悬浮物可能是一种变性的蛋白质，总之是一种有趣的现象，欢迎大家继续讨论！00无名指00 (2014-5-29 11:24:43)
也说说我的经历，我用氯化铯梯度离心，离心过程中遇到了上面的问题，25000rpm高速离心了24小时，结果发现所要的目的蛋白还是承絮状沉淀物飘在上面，我们的解决办法是将所有沉淀分装成不同的ependorf管中，取不同位置的沉淀分别做小鼠免疫，结果是小鼠都得到了免疫，也就是说目的蛋白并没有离心到下面。我比较赞同主任的看法，我觉得沉淀物是某种空间构向已经改变的蛋白质，与所加的溶液中的盐离子结合形成了某种络合物，导致其密度相近，从而没办法沉淀，一家之言，希望战友继续讨论。
bring (2014-5-29 11:25:22)
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离心机受得了吗？
00无名指00 (2014-5-29 11:25:41)
bamboo16 (2014-5-29 11:26:06)
panda王 (2014-5-29 11:26:30)
00无名指00 (2014-5-29 11:26:50)
沉淀要想比较完全,那需要在低温下放一段时间,只有这样那些小的沉淀才会很好聚集而上面的完全澄清,此外这也很浓度有关,浓度低些这样的现象更明显,所以我建议你沉淀后放4度过夜,那沉淀应该更完全了,此外这样的方法蛋白一般是不变性的,因此不用为活性担心.不知道你有没有这样处理.
对于顶楼来说，这样的方法应该可行，因为它是纯化过的蛋白质，不过有个问题想请教前辈，我们的蛋白是从昆虫细胞中提取出来的，也即在离心时，其中包含了很多杂蛋白，以及核酸等杂质，那应该怎么办呢，虽然我们最终的结果很不错，但就这一步来讲还是不尽如人意，想找些解决办法。
如果用层析柱，首先我们是要用蛋白产生抗体从而制作疫苗，所以应该不可行。
bamboo16 (2014-5-29 11:27:14)
别客气,我不是前辈,核酸去除你可以用沉淀的办法,你的量不大的话,你可以用硫酸铵分级沉淀试试,我做过DNA疫苗的纯化,一般的核酸在2.5M硫酸铵可以去除不少,这样你可以用不同浓度的硫酸铵沉淀试试.当然你也可以用PEG分级沉淀,如果你要进一步纯化可分别配合疏水和离子交换去纯化,不知道你说如果用层析柱，首先我们是要用蛋白产生抗体从而制作疫苗，所以应该不可行。这是为什么.做抗体不也需要纯度高点的蛋白吗,沉淀怕是纯度不高的.
whitesheep (2014-5-29 11:27:38)
我沉淀的时候，一般是缓缓加入硫酸铵，然后在冰箱中放置约一小时再离心，应该不会变性。可能是因为几位前辈所说，沉淀时间太短？
另外，有没有可能悬浮的蛋白质与其他物质结合造成的？还请指教？
whitesheep (2014-5-29 11:28:08)
如果你的目的蛋白对温度不是很敏感，在分级沉淀的时候，可以室温沉淀过夜（不过夜，也得至少4小时），这样形成结晶样的漂浮物可能性就大大降低。
如果对温度比较敏感，则必须在4度冰箱里面沉淀过夜。离心后，收集上层的漂浮物，透析溶解后，再浓缩。
bring (2014-5-29 11:28:28)
我的意思是蛋白过柱子我没有相应的抗体与之结合，所以不可行。
请问，什么样的蛋白对温度敏感，可不可以举个简单的例子说说
whitesheep (2014-5-29 11:28:44)
一些酶类，温度高了，自身容易发生变性，酶活损失太大；另外的情形是，有些样品液中，目的蛋白容易被蛋白酶水解，随着温度的升高水解酶的活性增加，目的蛋白就损失很大。
通常，如果只是保留目的蛋白的免疫原性，变性并没有太大影响，只要有灵敏特异的方法检测目的蛋白就行。
你没有相应的抗体，一是看有没有商品化的抗体卖？二是用已知阳性抗原自己制作抗体，不过这个很麻烦和费时。
bring (2014-5-29 11:29:10)
如果你的目的蛋白对温度不是很敏感，在分级沉淀的时候，可以室温沉淀过夜（不过夜，也得至少4小时），这样形成结晶样的漂浮物可能性就大大降低。
请问 形成结晶的原理是什么呢，
你没有相应的抗体，一是看有没有商品化的抗体卖？二是用已知阳性抗原自己制作抗体，不过这个很麻烦和费时。
因为我是要免疫小鼠得到抗体，从而确定我们收获的蛋白能够产生免疫效果，也即可以制作疫苗，所以没有商品化的抗体卖，自己订购对我们试验目的完全没有任何意义，所以我需要的不是现有的抗体，而是能使小鼠产生的抗原，我实在提纯方面遇到了一点问题。
还请您指点一二
orangecake (2014-5-29 11:29:31)
蛋白被硫酸铵沉淀看起来是什么样子的？能不能说的详细一点？
duoduo (2014-5-29 13:09:23)
我纯化的蛋白也是这种情况，当缓缓加入硫酸铵时就会发现在酶液的上层有一层薄薄的混浊的东西，搅拌一个小时后再放置于4°冰箱中静置2－3h，溶液经过静置后比较澄清，混浊仍然聚集在上层。12000rpm离心弃去清液取沉淀，沉淀完全复溶于缓冲液中，没有任何变性蛋白产生。
ladyhuahua (2014-5-29 13:09:42)
硫酸铵沉淀蛋白后,用什么样的缓冲液再溶解它,因为我想做DOT-BLOT检测
【求助】盐析法沉淀蛋白质，为什么这样？