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标题:【求助】诱导细菌表达异源蛋白时加葡萄糖起什么作用？

pulala[使用道具]
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发表于 2014-6-17 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】诱导细菌表达异源蛋白时加葡萄糖起什么作用？


本人现在用Qiagen公司的pQE-30载体，在M15细胞中表达一种蛋白。加了IPTG诱导后，细菌生长速度都减慢，有的减慢多，有的减慢少，但我就是方法提炼不出我要的蛋白来。
各位大侠，加IPTG后细菌生长减慢是好事还是不好？是说明异源蛋白表达占用了细菌的资源导致细菌生长减慢，还是可能有异源蛋白表达，但后者对细胞的生长有毒性作用，导致细菌生长减慢？
看了许多高手在IPTG诱导细菌表达过程中加不同浓度的葡萄糖，加葡萄糖诱导细菌表达异源蛋白的机理是什么？多大的浓度比较好？
再次感谢各位大侠的赐教。
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vvmmoy[使用道具]
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发表于 2014-6-17 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的问题在本版归档贴中已有介绍,请参看:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1166755_1.html')
蛋白的表达水平与诱导时的温度(25-37度)、IPTG浓度（0.1-1mM）及AMP浓度（50-200ug/ml）都有关系，你可以改变一下诱导条件，跑SDS-PAGE看表达的水平，我也在实验中遇到过不表达的情况，做了半个月，不断改变条件，终于成功了，因此你还得有耐心啊，再试试吧。
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发表于 2014-6-17 11:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加葡萄糖是为了降低目的蛋白在诱导前的表达,如果目的蛋白是对菌有毒性的,加葡萄糖就很有必要了.
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发表于 2014-6-17 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
葡萄糖使用浓度是1%,IPTG的使用浓度要看不同的载体了,如果是T7启动子,是0.4mM,如果是T7lac启动子就是1mM.我的经验是温度比较低的时候诱导表达较好,30度就差不多.180rpm
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pulala[使用道具]
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发表于 2014-6-17 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢您们的指点。我已经改变一些条件诱导3~4个月了，还是没起色。请问你在修改条件时，那项是最关键的？你最好改了那一项表达蛋白了？若是30度低温诱导，多长时间比较好？另外，我们在诱导时从没有添加AMP，是否很重要，或是否必须另加？培养基是用LB好还是2×YT好？还有文献报道用TB培养基，这种培养基是否用于结核菌培养的？
再次感谢。
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发表于 2014-6-17 11:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

温度很重要，我是在32度培养了4小时，加IPTG后转为30度培养3小时。不同质粒及细菌的表达条件肯定有差异，只有尝试了。
有一个提示，你是否做过鉴定和测序？也就是你的重组菌是正确的！
此外你在诱导表达包括细菌扩大培养时，不加AMP肯定不行！因为转入质粒的重组菌是带AMP抗性的，如不加AMP，则有可能会有杂菌甚至是污染菌生长，故必须加AMP，且最适浓度范围在50-200ug/ml为妥。
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发表于 2014-6-17 11:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

诱导多长时间,每个蛋白有不同的时间,我的诱导八小时表达量最大,也有的三小时就够了,AMP是肯定要加的, 不然会有杂菌生长.加AMP就是为了让有重组质粒的菌大量生长.
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pulala[使用道具]
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 小中大
我的表达体系测序过了，序列是对的，在培养体系中加入了氨苄青霉素和卡他霉素两种抗生素，一般都是头一天挑选菌落过夜，第二天上午按1:10的比例接种到新鲜培养基，培养2~3个小时，到D600为0.6的时候，开始诱导4~6个小时，好像效果不大。我诱导的蛋白前半段cDNA的CG比例相当高，近70%，蛋白表达不出来是否和此有关。另外，在诱导的过程中，有的菌落加IPTG后生长明显减慢，有的减慢不明显，那一种值得我花更多的时间去筛选？
非常感谢！
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 小中大

SDS-PAGE有时很难检出低表达的蛋白，有条件试一下western blot,测序是对的，表达元件什么的没有突变，也不是说就一定能表达，有的基因在某个特定的启动子下就是不表达。
前半段cDNA的CG比例相当高，近70%，极可能会影响表达。我试过干扰素2b、GM-CSF（GC含量较高），在 pET系列T7启动子下就是不表达，换了个热启动子TLTR pBV220就表达了，表达量还很高，你也可以试一下融合表达嘛，做个N端融合试一下。
如果该做的表达优化都做了，测序又对，真该换一下表达载体了。
我的经验是如果重组蛋白对细胞毒性较小，诱导后菌浓还是会有所增长的。如果细胞毒性较大的话，就要用严谨型表达载体，表达量也不会太高。因为微量的毒性蛋白表达，菌体生长就很受影响，菌体会想办法把你的目的基因表达框破坏掉（一般是通过突变的方式），这样的话质粒稳定性也成问题。
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发表于 2021-9-20 15:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
伙伴们，我做蛋白诱导，有个奇怪的现象，我用的是GST标签，37℃诱导，待OD值为0.5-0.8时按照1:100的比例添加0.1M IPTG，16℃诱导过夜，蛋白包涵体很多，并且，除了目的蛋白外，载体也很明显，有没有大佬知道这是怎么回事啊，上面浅的那条是我的目的蛋白，下面是GST载体


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