查看完整版本请点击这里:
【求助】关于电泳前样品的处理
【求助】关于电泳前样品的处理
各位大虾,我跑电泳是个新手看了一些帖子,对电泳前样品的处理不是太明白,想请问:
1.为什么要煮沸,到底煮沸多久就可以了?
2.煮好后加样前为什么要离心?离心后加样时是不是还是要打匀后再加样?
还有,我几个月前做过几次电泳,只有第一次做的比较好,现在又要做几种样品,昨天跑了一回,根本没条带,晕死了,准备重配一些东西,我想请问几个月前配的tris-HCL(PH6.8)和(PH8.8)的,还能用吗?要不要重配?其他一些试剂那些最好重配一下呢?
查看完整版本请点击这里:
【求助】关于电泳前样品的处理
【求助】关于电泳前样品的处理
最新回复
00无名指00 (2014-6-18 18:00:29)
1.煮蛋白的作用是让蛋白充分变性,这才能使蛋白在SDS-PAGE中完全靠分子量分离,测定的分子量准确性才高,一般100度至少煮5min
2,因为有些蛋白在煮沸后会有一些杂质沉淀,那样跑电泳的话就会影响电泳效果,离心后加样前的确需要混匀一下,因为离心会使蛋白浓度变的不均,加样的量就会有变化.
几个月前配的试剂应该不能再用了,因为其中的PH可能发生变化了,BUFFER的PH很重要,会影响跑胶效果,建议你所有试剂重配,那样有利于以后分析原因.
ladyhuahua (2014-6-18 18:00:47)
huifeng0516 (2014-6-18 18:01:03)
你是用考染吧?我认为刚开始做时不用那么长时间,一般脱色时间是染色时间的1.5-2倍,我一般是染1-1.5h,脱色2-3h(中间换液2次),效果还不错。
有时候如果你的蛋白的量非常低,可能需要染色时间长一些,提高灵敏度。另外好像脱色时间长的话可以提高分辨率。但我都没有试过,不知效果如何。
个人意见,你可先染1-2小时,然后脱色随时看着,勤换液,应该问题不大。祝好运!
水母 (2014-6-18 18:01:26)
哦,明白了,我还想问为什么电泳不能跑空道啊?
大海啊故乡 (2014-6-18 18:01:43)
电泳可以跑空道啊!一般加样时需要使得左右两测加样空对称,那样跑下来的胶就会不歪,好看些,因此假如你的样品是奇数个的话,那就需要在加样空里加点LOADING BUFFER来"压一压"使得加样空两测平衡,假如你的加样空是10个的话,你的蛋白样品只有5个,那你就需要加个LOADING BUFFER来充当一个样品使得左右平衡,而剩下的4个加样空就可以不加任何东西跑空道了.
水母 (2014-6-18 18:02:01)
我今天跑了一次电泳,不知道为什么,到了分离胶后就跑得非常慢,以前一个小时就跑完了,今天跑了三四个小时还没跑下来,急死我了,什么原因啊?今天染色也来不及脱色了,我该今天晚上染到明天早上呢还是放在那到明天再染?
nn255 (2014-6-18 18:02:23)
分离胶跑得慢了可能跟你的电极缓冲液有关系吧,电极缓冲液如果不是新配的而是上次用过的可能就会让你的胶跑慢。
可以今天晚上染明天脱色,我们实验室一般都是过夜染色的
放到那里明天染的话你的胶不是要干掉了吗
我也是新手,不知道解答的对不对
flower-201 (2014-6-18 18:02:42)
1:关于煮沸:100度,5分钟即可;
2:染胶是这样:一般制胶的时间在1个半小时,加样电泳总的需要3-4个小时,早上8点开始干活,下午2点基本可以跑完电泳。然后将胶染上,室温、摇床过夜,第二天一早脱色,中午看结果。
3:电泳泡的时间长短与电泳液的离子浓度、电压大小和整个电路中有无气泡等增加电阻的因素有关。
水母 (2014-6-18 18:03:00)
谢谢各位,我昨天跑的时候刚开始在浓缩胶跑得还好,但跑了一会我看条带有点歪,我就关掉电源把板子拿出来看看,在此过程中内外电泳液好象有所混合,然后我再开始继续跑,就发现条带跑不动,溴芬兰停在原地不动,反正最后跑了好几个小时,以前跑的时候只要一个小时就够了,不过以前的是8%的分离胶,昨天跑的是10%的,在整个操作过程中,有哪个地方做的不对,请大家帮忙指出.
flower-201 (2014-6-18 18:03:17)
如果阴极和阳极电泳液混合的不多,感觉问题不大,关键是液体用了多长时间了?我们一般2周就换。
此外,用10%的胶跑的时候你的电压加了多大?我曾经加到过180v(冷却情况下),只要胶不溶就没什么。结果也不错。(当然这个也比较奔放的说。。。。)
如果你上样的时候按照楼上的说的是比较“平衡”的,那么条带再歪就可能跟胶有关系了。
flower-201 (2014-6-18 18:03:43)
tris-HCL(PH6.8)和(PH8.8)按照《精编》上的说法,室温保存最好不超过1个月。
水母 (2014-6-18 18:03:59)
mamamiya (2014-6-18 18:04:15)
mamamiya (2014-6-18 18:04:31)
考染只要30-50min就可以了,染太深了脱色会比较困难。如果第一次染色的效果不够好的话,可以重新染色,再脱色,效果不错的。电泳的电压可以调高点,这样可以节约实验的时间,分离效果也不会有太大的变化,我们可以上午做胶,下午电泳带染色,晚上脱色,第二天就可以看结果了。
大海啊故乡 (2014-6-18 18:04:50)
考染只要30-50min就可以了,染太深了脱色会比较困难。如果第一次染色的效果不够好的话,可以重新染色,再脱色,效果不错的。电泳的电压可以调高点,这样可以节约实验的时间,分离效果也不会有太大的变化,我们可以上午做胶,下午电泳带染色,晚上脱色,第二天就可以看结果了。
【求助】关于电泳前样品的处理