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红细胞膜的制备
关键词：熔点标准物质 农残检测 煤炭石油标准物 国产标准品红细胞膜的制备
【实验原理】
成熟的红细胞不含细胞核，也没有其他任何细胞成分，因此通过离心技术红细胞膜制备比较容易。取新鲜肝素抗凝全血，在4℃用3000r/min离心20分钟，分离血清弃之。保留沉淀的红细胞，加入3倍量预冷的pH 7．4等渗磷酸盐酸缓冲液洗涤3次，每次加洗涤液后用玻棒轻轻搅拌悬浮，4℃3000 r/min离心15分钟。去除黏附在红细胞表面物质。离心后保留洗净的红细胞按1：40的比例加入预冷的pH 7．4低渗Teis破胞液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/LEDTA-2Na)，边加边搅拌，置于4℃冰箱中1小时，使之完全溶血，4℃用12000r/min
离心15分钟，弃上清，再用破胞液洗3次，即得白色的红细胞膜。
【试剂与器材】
1．pH 7．4等渗磷酸盐酸缓冲液。
2．pH 7．4低渗Teis破胞液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA-2Na)。
3．肝素抗凝管1只，消毒注射器1只，吸管1只。
4．离心机。
5．实验动物 家兔。
【操作步骤】
1。固定实验动物家兔，用温水纱布敷家兔一侧耳背外缘，使耳静脉充血。固定兔耳，用消毒注射器采血，新鲜全血置于肝素抗凝管，边轻轻振摇。
2．盛有新鲜全血抗凝管，4℃用3000r/min离心20分钟，分离红细胞。
3．将盛有红细胞试管中，加3倍量预冷的pH 7．4等渗磷酸盐酸缓冲液洗涤3次，得到洗净的红细胞。
4．在洗净的红细胞的试管中按1：40比例，加入pH 7.4低渗Teis破胞液，置于4℃冰箱中1小时，得到血红蛋白液。
5．将血红蛋白液4℃用12 000r/min离心15分钟，弃上清，得红细胞膜，再用Teis破胞液洗涤，离心，见离心管底部白色红细胞膜。
【注意事项】
1．新鲜抗凝全血与新鲜全血均可制备红细胞膜，方法相同：先分离红细胞，洗涤红细
胞，破红细胞，分离红细胞膜。全过程需要多次离心、洗涤，注意操作顺序。
2．分离红细胞时，防止溶血现象的出现。洗涤红细胞时要用等渗液体。破红细胞时要用低渗溶液。等渗液体也可用生理盐水，低渗溶液也可用蒸馏水。
[ 本帖最后由 rmhot 于 2014-6-28 17:54 编辑 ]
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上海丰核 (2014-7-01 15:19:31)
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