PCR仪

个人的一点看法,供参考.
我认为融解曲线的峰面积并非表征产物的量.先从数学上进行理解,融解曲线是荧光信号对温度的一阶负导数,所以融解曲线的纵轴高度表征的是原始荧光信号的变化率,Tm值对应的融解曲线的峰高表征了目标产物的纯度,生物学含义表征的是表达丰度.打个比方,两个复孔得到同样的Tm值,但融解曲线的高度不同,表征的是在两个复孔中目标产物所占的比例融解曲线峰高的比例高,所以在Tm值位置上变化率最大.从你上面的融解曲线图上,只能说86度左右的产物纯度较高,而80度以下的产物(疑似引物二聚体)纯度较低(里面可能包括很多几个碱基错配的产物,且所占比例相当),所以电泳图产物较亮,而融解曲线峰值不高.
不知解释清楚没有,说起来还是挺复杂的.

1：我感觉峰高就象您说的是代表目标产物的纯度。
2：峰面积的话我觉得还是应该代表在该峰在Tm范围内的荧光量，也就是我需要的目的产物的荧光量，这个可以通过积分来算。
3：接着2，也可以象您这样的解释，我目标产物较大的片段在电泳图中显示的条带中有其他的带，从而导致在溶解曲线中表现出来峰小，而且矮。
4：我上次看到过一篇关于讲荧光染料的文章，上面说sybr greenI 对CG碱基比较偏爱，这也正好比较符合我的电泳图和real time PCR溶解曲线的峰。因为我较小片段的CG含量丰富，而较片段CG含量较低，这也在一定程度上说明峰的面积还是表示在该Tm范围内荧光量的，请见下文。而EB有没偏爱就不是很清楚了。
Comparison of multiple DNA dyes for real-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNA amplification and melting temperature
Nucleic Acids Research, 2007, 1–8
Haukur Gudnason1, Martin Dufva1, D.D. Bang2 and Anders Wolff1,*

试着回答一下：
1.我做实验的时候也发现是这样，可能与发光机理相关。SYBR Green染料法只有双链存在的情况下发光比较强烈，而探针虽然说在水解后5‘端发出强光，但其实在反应初期3’端也会发光，背景比较高；
2.从图上来看，重复样本的重合性也较好，个人认为可以使用。就Ct值来说，的确如你所说，单独做的时候Ct值还比较靠前，这可能与阈值的位置选择有关，双荧光要兼顾两种荧光。不知你使用的定量PCR仪是否有最大二阶导数法的Ct值分析法，采用这种方法不受阈值的限制，可以应用于双荧光分析。如果没有这种分析方法，可以再看看背景基线调整的算法是否有比例法（常用的为算术法），一般做双荧光或多荧光时最好使用比例法的基线调整法，会平衡不同荧光间的差异，然后再调整阈值线，得到Ct值就比较接近单光了；
3.其实不同的荧光标记探针，受染料本身的消光系数、量子产率，以及荧光的光谱和所用仪器的激发光（决定于激发光源是光谱还是单色，及不同谱带上的强度等）、检测器件（不同的检测器件对不同谱带的接受情况不同）的影响，即便是使用同一摩尔浓度的探针，平台期的高度也会不同，这是正常的。如上一条所说，可以用比例法调整基线后进一步分析。如果想了解扩增产物终产量的情况，还是跑个电泳看看更直观；
4.个人认为不需要优化条件了，重复样本的重合性较好（除了HEX有一条差异较大除外）；
5.参见1及3的建议。

下面是对应的HEX扩增曲线

[ 本帖最后由 七彩星星 于 2011-8-13 16:12 编辑 ]