【求助】荧光定量溶解曲线双峰怎么办？

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标题:【求助】荧光定量溶解曲线双峰怎么办？

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位大侠请帮忙看一下
我用SYBR Green法做相对定量PCR检测两个目的基因得表达，但是用ABI7500两步法扩增得到得溶解曲线都有双峰，并且将退火延伸温度从60度提高到65度重新跑后，溶解曲线双峰仍然没有消掉。
基因1的溶解曲线

附件

2015-8-1 15:26

69184825.snap.jpg (30.03 KB)

社会主义好[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般的主峰前面出峰的话，是引物二聚体，而如果主峰后面出峰的话，一般的是非特异性的大片段的扩增。如果主峰相对强于次峰，可以通过改变引物浓度，退火温度和镁离子浓度来解决，但如果次峰强于主峰，就是说杂带的特异性高于目的条带，一般的只能换引物了。
不过从你的图上看主峰很强，你所谓的“双峰”不明显，我个人认为结果可以做分析用。不过值得注意的是你的溶解曲线的尾巴上，有往上抬的样子而不是平的，貌似有个干扰的大片段？建议把pcr产物跑个胶看看。
还有，你的目的片段也大了点，过300bp了吧？理论上100-200bp最好，不过300以上也没什么问题。呵呵呵呵，罗嗦了点。

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

十分感谢楼上得回答，我的目的片段是428bp，那我的主峰前面的小峰就是引物二聚体了，如果通过条件调整，把引物二聚体消掉的话，我的这对引物可以用来做实验吗？至于后面翘起来的尾巴，只要有翘起来的就都是非特异性扩增吗？那引物是不是就不可以用啦？我的电泳跑过了，没有十分明显的大片段杂带啊
还有一个基因，目的片段351bp,溶解曲线也一样有双峰，尾巴也翘起来了，请帮忙看看

附件

2015-8-1 15:27

74343985.snap.jpg (30.92 KB)

feiya[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小峰也许是因为DNA污染呢？

tudou85[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果琼脂糖电泳看了也没什么杂带的话
我认为你的引物二聚体也不是很明显，所以我认为这样的结果已经可信了，
可以不去管它了，直接取数据吧。

milkdog[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

那你就要考虑重新设计引物了。

DCS[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你图上的小峰看似不是引物二聚体，而是二楼说的非特异性扩增。引物二聚体一般的Tm值在75～80度之间，在80度前的大多是引物二聚体。
关于溶解曲线最后的上翘，建议你贴张溶解曲线的原始图片（荧光信号对温度的曲线），最后的上翘可能是数据采集和处理的问题，你把溶解曲线的结束温度设置为95度，再看看原始图片，如果90多度原始曲线没有明显的斜率变化，应该就没有问题。

fox_79[使用道具]
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发表于 2015-8-1 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

十分感谢诸位的帮助，这个是不是就是溶解曲线的原始图片呢？
基因一：

附件

2015-8-1 15:29

14706484.snap.jpg (31.85 KB)