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头痛
方案都不错！但是难度在于实现的过程！
1。对于这个方案，最大的难度在于探针设计。我理解你的意思是只设计一对引物，针对这一类群的功能区，也就是说引物是保守的，基因的同源性很高，那么在这个同一类群的几个基因中想找到各自特异的探针似乎不是很容易。由于没有基因的信息，暂时猜测两种情况：a.虽然同一类群，但是剪切方式不一样，得到的RNA有区别，可以在区别区域设计探针，但如果长度差异较大，后续扩增效率优化会比较困难；b.表达产物或基因本身长度都一样，但其中有SNPs之类的突变，探针则选择在这一区域，但是难度（包括设计和后续试验）也比较大，祝好运。但是这个方案的最大好处就在于在这一体系中所有的引物与模板的结合效率都是一样的，对于后续的反应的扩增效率的优化会比较容易。
2。这个方案实施起来相对比较容易，如引物和探针设计都会有更多的选择余地，但是难度在于引物和探针的特异性，引物二聚体的避免，不仅一对的两个引物，还要避免这几对引物相互之间的二聚体，由于探针法二聚体多了虽然对信号没有影响，但是扩增效率肯定受影响，此外各基因之间由于引物和探针不同，导致与模版的结合效率或多或少有差异，这种差异在多重PCR中更容易被放大，直接影响扩增效率的优化。
其实这两个方案都会牵扯到扩增效率的优化，只不过有利有弊，没有哪个是完美的，这是无法避免的，而且多重里最头疼的就在这里，所以做多重的人少，只能智者见智了。说的不够全面，另外再参考参考导师和老外文献的经验。好运！
