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【求助】最近在做非变性活性电泳实验步骤如下

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-3-17 11:54    作者: yazi    来源: 分析测试百科网

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【求助】最近在做非变性活性电泳实验步骤如下
最近在做非变性活性电泳，遇到些问题不知怎么解决。我的实验步骤如下：
1.电泳：分离胶交联浓度12%，加SDS，与普通变性胶一样，浓缩胶不加SDS，上样缓冲液和电泳缓冲液均不加SDS。冰水混合物中电泳，电压100v.
2.洗去SDS：2.5%Triton X-100 振荡1h.之后pH7.2磷酸盐缓冲液洗3次。
3.反应：50度下 泡在酪蛋白溶液中反应30min.
4.考染脱色
如图：
两种样品，空白区域太大，可能是酶活高，未稀释。
另外，我想拿胶去做质谱鉴定，不知可不可以。酶将酶本身及周围区域的酪蛋白和周围的蛋白（？会不会分解周围原有的蛋白）都分解，显示白色，做个对照不加酪蛋白的对比下，看哪个条带继续存在就是酶的条带，不知对不对？然后去鉴定。
这两张图，貌似也看不出来。还有什么好的办法啊。我就想弄清同工酶的种类。
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  • xgy412 (2016-3-17 11:55:08)

    空白区域是，酶还有活性，把周围的酪蛋白分解而形成的，没被分解的被染成蓝色。恩，我再试一下，不加SDS，切胶用滤纸片在平板上显色。谢谢！

  • 美人鱼 (2016-3-17 11:55:30)

    两种样品、空白区域是什么意思？
    能不能不加SDS？这东西也算是个变性剂。
    能不能跑胶结束后贴在平板上显色？

  • 大花猫bb (2016-3-17 11:55:52)

    最近做的非变性蛋白电泳，12%的分离胶，条带不往下跑而且有的地方脱色脱不掉，后来用8%的分离胶，颜色根本就脱不掉是怎么回事？下面前面是12%时的胶非变性胶，两边的泳道是变性maker，只是用来检测，没有标记作用的；后面的是跑的变性的。而且变性蛋白电泳的条带在非变性中跑不出来。。请专业人士帮忙解决一下。。。非常感谢！！！

  • 8899 (2016-3-17 11:56:13)

    SDS-PAGE 12% 0416-1.JPG

  • 今生如此 (2016-3-17 11:56:35)

    我是做蛋白质电泳的，看看各位大侠有没有什么方法，可以将目标蛋白从聚丙烯酰胺胶中割出来并回收，除了用专门的试剂盒外，看看是否在操作中有什么要求的注意事项？

  • 跳跳哈里 (2016-3-17 11:56:59)

    可以使用PAGE胶微量蛋白回收试剂盒 BSP062

  • 燕子@ (2016-3-17 11:57:19)

    请教下这个具体步骤是什么？

  • 女儿情 (2016-3-17 11:57:41)

    跑活性胶，将两侧的泳带切下，正常固定染色脱色，然后对照两条泳带的条带位置，将蛋白条带切下，加液氮研磨后，用缓冲溶液浸提。
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