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标题:[分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇

吴才子[使用道具]
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[分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇

[分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇(转载)


我没有做过MTT实验,但其实原理及目的都是一样的(反应机理不一样)。都说CCK8简单点而且数据更稳定,所以就用了这个试剂盒。

CCK8的说明书大家一定要认真阅读,里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值,因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何,做这个试验一定要摸条件。你就算再懒,这个懒不得,否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提,如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括1、种板数;2、种板后细胞的贴壁生长时间;3、加药后的孵育时间;4、cck8试剂加入量;5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多,其实这就是一个实验。而且都是种的空白板,也就是不加药物,只加细胞和CCK8。

1、种板数:这个要查文献,看你所用细胞别人有无做过,把范围大致找出。记住还要参考说明书,这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全,一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内,不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间,那么在4天内,细胞是刚好铺满还是堆积生长?因为每块板都会设置对照孔,也就是含有细胞的培养基+CCK8,这个数值是板上的最大数值,CCK8试验最佳OD值在1.0附近,所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满,一旦长满了很难去判断是否堆积生长了,对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一,其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大,而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了,这个时间细胞已经贴壁完全,而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间,我的实验摸了3个时间,24h,48h,72h。然后根据数据的稳定性(RSD)、OD值的范围(1.0左右)这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了,细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量,说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题:假设我要孔内是200微升的体系,即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢,还是细胞悬液+药液=200微升,cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

5、cck8试剂加入后孵育时间,随着时间的增加,OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔,得到的OD值去掉最大值与最小值,其余取平均值。我用的是排枪,会省很多力气,但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
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做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定,组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件,其实就一个原则,把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数,借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心,尽量平行操作。

能力有限,表达不清的大家凑合着看看吧。有疑问的欢迎大家留言讨论,我们的目标是共同进步,哈哈。

补充:谢谢大家的热烈讨论。突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题,园子里也有前辈提过。比如孔里不能有气泡,如果有气泡,就用吸耳球吹掉,气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净,当然了,盖子一定要记得拿掉啊

补充说明:这几天有同学提出了一个问题,这个问题非常好也非常关键:将OD值控制在1.0这个说法是否有依据?

这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书,试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒,说明书的P7Q23:OD值在什么范围比较合适?答:一般情况下OD值在0.1-2.0都可以,在1.0附近比较好。

再说到自己的实验设计,酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的,所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡,为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围,超过了这个范围,数值就会呈现出不稳定,无规律。(大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。)而更有甚者就是超出了仪器的检测范围,仪器读数为—。我在摸条件的时候,cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。

不知道以上补充的内容是否能够回答同学们的那个问题。
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milkdog[使用道具]
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我今天刚刚接种了一批细胞,准备培养24小时后加入CCK-8检测。到时结果出来请大家指教啊。


[ 本帖最后由 milkdog 于 2011-12-19 14:57 编辑 ]
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milkdog[使用道具]
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3、加药后的孵育时间,我的实验摸了3个时间,24h,48h,72h。然后根据数据的稳定性(RSD)、OD值的范围(1.0左右)这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了,细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

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请问,假如加药的时间长于5天,应该是可以换液的吧?如果真的不换液,是不是做多可以培养3天?我印象中3天不换液培养基颜色都有变化了
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吴才子[使用道具]
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回复 #4 milkdog 的帖子

CCK8试验我掌握到的文献还没有5天这样长时间的。
而且我考虑到这里有一个问题,就是你加药后孵育,培养基里应该就是有药物的,你如果换液,那么这个药物的量该如何去计算?这个时候细胞内肯定已经有药物进入了,我觉得这个也许就是CCK8试验没有提到换液问题的原因吧。当然是个人推测。
我觉得这个试验与用六孔板做TRANSPORT试验需要换液是不一样的。因为目的不一样,考虑的细节就不一样。
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whitesheep[使用道具]
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本人也是刚刚做细胞试验,正在用CCK8做细胞增殖抑制试验,很头疼加了CCK8后孵育时间,我摸索了0.5h、1h、2h及4h,其中一例,OD从0.5h的0.2到4h的0.9,差得也忒大了吧!? 另外一实验,2h读数复孔之间跳孔严重,4h后CV值立马下降,但OD值已经2.7了。关于最大OD控制在1.0的说法,请楼主指明出处,可有权威资料共享一下,不甚感激
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whitesheep[使用道具]
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呵呵,我们用的也是dojindo的,我看了说明书,包括官方网站上的Q&A,均未提到OD值范围。
网址如下:cuturl('http://www.dojindo.cn/products/C/cck-8.htm')
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吴才子[使用道具]
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回复 #7 whitesheep 的帖子

2010年1月印刷的产品说明书P7Q&A: Q23:OD值在什么范围比较合适?答:一般情况下OD值在0.1-2.0都可以,在1.0附近比较好。

再有异议欢迎再讨论。
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+小生怕怕+[使用道具]
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我用CCK8不长,就一年,之前都是MTT、结晶紫之类,楼主说得很好很详细的,真是很用心做事情了,佩服一记!我就补充个小小的细节问题。
曾经做过一个抑制凋亡实验,显色一直不完美,于是做了这么一个预实验。在24孔板内加细胞加药后培养适当时间,取上清,离心,收集了上清液,离心沉淀物,分别加CCK8,同时24孔板内原有贴壁细胞也加CCK8,结果是:三者都有不同程度的显色,随着细胞凋亡越多,上清和离心沉淀显色值越高。
看了很多资料,有一篇文献里是这么说的:细胞凋亡后裂解出的乳酸脱氢酶会很稳定的存在于培养液中。我料想可能是部分脱氢酶的存在与CCK8发生了氧化还原反应。
我是针对我的细胞查得这一资料,不知道是否所有的细胞都有这个特质。大家有时间可以考证下自己的细胞,在得到的活性检测曲线不完美的情况下,这个因素可以考虑下。
鉴于这个原因,我每次做CCK8测活都是换液的,换无血清培养基(PBS我也试过,好像也可以),1:10配制CCK8。最大程度降低了细胞代谢物已经低浓度血清的影响,实验结果也不错。DOJINDO回访的时候我也提了这个问题,他们也觉得不错。
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吴才子[使用道具]
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回复 #9 +小生怕怕+ 的帖子

前辈好。我也有考虑过测之前换液,不过说明书上说酚红对检测不影响,就偷懒没有换。不过想请问换液是直接用吸管将废液吸走吗,要吸很干净吗?
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