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[分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇
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我没有做过MTT实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样）。都说CCK8简单点而且数据更稳定，所以就用了这个试剂盒。
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间；4、cck8试剂加入量；5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
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最新回复
吴才子 (2011-12-19 14:45:24)
能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。
补充：谢谢大家的热烈讨论。突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题，园子里也有前辈提过。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊
补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。
不知道以上补充的内容是否能够回答同学们的那个问题。
milkdog (2011-12-19 14:45:48)
我今天刚刚接种了一批细胞，准备培养24小时后加入CCK-8检测。到时结果出来请大家指教啊。
[ 本帖最后由 milkdog 于 2011-12-19 14:57 编辑 ]
milkdog (2011-12-19 14:47:35)
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请问，假如加药的时间长于5天，应该是可以换液的吧？如果真的不换液，是不是做多可以培养3天？我印象中3天不换液培养基颜色都有变化了
吴才子 (2011-12-19 14:51:26)
而且我考虑到这里有一个问题，就是你加药后孵育，培养基里应该就是有药物的，你如果换液，那么这个药物的量该如何去计算？这个时候细胞内肯定已经有药物进入了，我觉得这个也许就是CCK8试验没有提到换液问题的原因吧。当然是个人推测。
我觉得这个试验与用六孔板做TRANSPORT试验需要换液是不一样的。因为目的不一样，考虑的细节就不一样。
whitesheep (2011-12-19 14:51:49)
本人也是刚刚做细胞试验，正在用CCK8做细胞增殖抑制试验，很头疼加了CCK8后孵育时间，我摸索了0.5h、1h、2h及4h，其中一例，OD从0.5h的0.2到4h的0.9，差得也忒大了吧!? 另外一实验，2h读数复孔之间跳孔严重，4h后CV值立马下降，但OD值已经2.7了。关于最大OD控制在1.0的说法，请楼主指明出处，可有权威资料共享一下，不甚感激
whitesheep (2011-12-19 14:52:28)
网址如下：cuturl('http://www.dojindo.cn/products/C/cck-8.htm')
吴才子 (2011-12-19 14:52:59)
再有异议欢迎再讨论。
+小生怕怕+ (2011-12-19 14:55:42)
曾经做过一个抑制凋亡实验，显色一直不完美，于是做了这么一个预实验。在24孔板内加细胞加药后培养适当时间，取上清，离心，收集了上清液，离心沉淀物，分别加CCK8，同时24孔板内原有贴壁细胞也加CCK8，结果是：三者都有不同程度的显色，随着细胞凋亡越多，上清和离心沉淀显色值越高。
看了很多资料，有一篇文献里是这么说的：细胞凋亡后裂解出的乳酸脱氢酶会很稳定的存在于培养液中。我料想可能是部分脱氢酶的存在与CCK8发生了氧化还原反应。
我是针对我的细胞查得这一资料，不知道是否所有的细胞都有这个特质。大家有时间可以考证下自己的细胞，在得到的活性检测曲线不完美的情况下，这个因素可以考虑下。
鉴于这个原因，我每次做CCK8测活都是换液的，换无血清培养基（PBS我也试过，好像也可以），1：10配制CCK8。最大程度降低了细胞代谢物已经低浓度血清的影响，实验结果也不错。DOJINDO回访的时候我也提了这个问题，他们也觉得不错。
吴才子 (2011-12-19 14:57:17)
nn255 (2011-12-19 14:58:26)
可是，
我的细胞在加药后所有的细胞都死了。晕！
milkdog (2011-12-19 14:59:32)
吴才子 (2011-12-19 15:00:06)
milkdog (2011-12-19 15:02:07)
我的CCK-8的第二次试验结果：
背景：悬浮细胞，加入药物后培养24小时。
加入CCK-8后，颜色马上发生了改变。虽然CCK-8的说明书上推荐1-4小时检测，但是我的检测时间为20分钟后，结果在0.7-0.8左右。
在50分钟的时候，检测的结果在1.3-1.4左右。
请大家给提供点参考：是不是接种的细胞太多了？这次的CCK-8检测数据有效吗（那一次20或50分钟的数据比较好）？
吴才子 (2011-12-19 15:04:32)
milkdog (2011-12-19 15:06:15)
非常感谢楼主的提示。
此次实验基本认为要失望了。总结做过的2次CCK-8实验经验，更准确的话说是失败经验如下：
1）CCK-8加法：沿侧壁加入，避免产生气泡。还有一个技巧是用1：1体积的培养基混匀后加入，这样起到减小加样误差。
2）CCK-8使用之前，先做个标准曲线。用不同的细胞数接种，然后加入CCK-8 1小时，2小时，3小时检测450nm 以OD值1.0--2.0为标准选择细胞数。
3）确认药物跟CCK-8不反应。在培养基中加入CCK-8，2-3小时后检测。以及在培养基中加入药物和CCK-8，2-3小时后检测。检测出来的OD值为空白对照，以不超过0.3为标准。
4）待续-
milkdog (2011-12-19 15:06:43)
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什么条件下测出来的是全细胞的OD值？
数据有效性如何判断？
RSD我理解了。
吴才子 (2011-12-19 15:08:03)
吴才子 (2011-12-19 15:08:39)
数据有效性如何判断？
RSD我理解了。
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数据有效与否，其实说白了就是你自己想要的实验结果是怎样的，你的实验目的是什么。你做出的实验数据与你的预想是否符合。如果不符合，在你确定所有的操作无误的情况下，再去分析讨论实验结果产生的可能原因。比如说你配了一系列浓度的药物溶液，上了细胞后OD值与浓度梯度不符合，而你又确定实验操作无误，那可能的原因就是药物的溶解性问题等等。我这是打个比方，具体的还要看你的实验是怎样设计的。在不知道你的实验设计、药物性质前提下，你这样简单说数据如何，然后问数据是否有效，真的是爱莫能助。
我们这里能够讨论的也就是实验操作，对于数据的分析肯定是自己根据实验本身去分析考虑的。
milkdog (2011-12-19 15:09:01)
最近做了一个5000，开始倍比递增的细胞生长曲线。
分别检测1，2，3，4小时的CCK-8 在450nm的OD值。
结果说明，细胞以2万的接种浓度比较适合，依据是此时OD值接近1.0。
兔唇 (2011-12-19 15:09:46)
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枪头吸会更干净些哦！操作熟练后基本可以控制每次的实验误差在10%或20%之内。
检测之前最好镜检，要相信自己看到的，而不是一味遵从比色数据。我就是因为每次镜检，才会发现很多显色液使用过程中的问题，再加以改进，直到理论数据与实际看到的相符。不要怀疑自己的能力，有时候只是细节方面没有做好罢了，我们一味照本宣科了，太迷信产品说明，没有做足预实验。
说下最近遇到的问题，也许会对一些人有些帮助。测活用的细胞株的药物敏感度是最重要但是也是很容易被忽视的问题。如果你不是用原代的话，商品化的细胞株有个很致命的问题就是细胞代次。测活用的细胞不能有所变异或者功能退化，这很致命，但这是不停的传代必然导致的问题。我一直坚持认为要用从ATCC购买的细胞，在小代数以内尽可能冻存尽量多的细胞。这回贪便宜在某院细胞所买了一株未知代数的细胞株（再具体就不说了，大家心里明白啊，呵呵），我花了大半年时间几乎没有任何实验结果，最后用干扰素一测，该细胞压根儿没有反应……崩溃了！挨了很多批评不说，自己的信心差点丢失了。现在又要花两个月的时间去买ＡＴＣＣ的细胞，真的很得不偿失的。说下ＡＴＣＣ的细胞价格，官网价格乘以１８，就是人民币的价格，代理商么大陆就一个，我就不作宣传了，大家可以自己去查。最好走正规代理商，运输历时近两个月，小代万一出问题了，赔偿问题很纠结的。如果你的产品最后需要申报，细胞来源也需要证明，当然走正规渠道比较放心些。
我又废话多了……＾＿＾
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