分析测试百科

标题: [求助]有关细胞冻存 [打印本页]

作者: tuuu2 时间: 2012-5-15 13:11 标题: [求助]有关细胞冻存

请问冻细胞的时候是不是一定要4度放30分钟，然后-20度放2小时？我如果4度放了1小时，-20度放了3小时会不会很大影响？我看到有些人4度和-20度都才放了10几分钟就放进-80度了，这样行不行？还有为什么放在-20度2、3小时后，液体还是未融清亮偏红而不是变融偏白的？这样子状态能直接就放进-80度保存吗？谢谢！

作者: xueyouzhang 时间: 2012-5-15 13:11

细胞冻存及复苏的原则：慢冻快溶。
1、标准的冻存程序为降温速率-1~-2度/min；当温度达到-25度以下时，可增至-5~-7度/min；当温度达到-100度时，可迅速浸入液氮中。
2、也可将细胞直接放入-20度冰箱，放置2h，再放入-70度冰箱过夜，第二天放入液氮中保存。
3、我们实验室是直接将细胞放入-70度保存，在冰箱中放置3个月都没问题，这样做更省事，因为实验一忙起来，先放4度，再放-20度，再放-70度，很容易把冻细胞的事忘掉。长期还是保存到液氮。

作者: chuntian1983 时间: 2012-5-15 13:12

我们实验室是做癌细胞的，每次冻存效果还不错，具体过程如下：
1 消化培养瓶内的细胞，收集到离心管中。
2 1000rpm离心5-10min，弃上清。
3 用冻存液将离心管内的细胞沉淀打散，分装至冻存管，1.5ml每管。一般一支冻存管冻存一瓶细胞。
4 冻存管用消毒的封口胶封住，避免复苏时细胞溅出，导致污染。
5 4度放置30min，-20度放置30min-1h。
6 脱脂棉包好，贴标签著名细胞株及冻存日期，放入-80度长期冻存。
冻存液的配方：1.5ml 75%的高压灭菌的DMSO+9ml 含10%FCS 的RPMI1640培养基。
细胞冻存的原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，从而减少对细胞的伤害，使细胞受到最大限度的保护。
细胞冻存的细胞冻存方法大致上是相同的，理想的是采取梯度降温，可根据自己的具体条件加以调整。4度及-20度放置时间不可过长，对于-20度来说，30分钟和更长时间没有区别。-20℃时间过长，会形成过大冰晶，造成细胞大量死亡。

作者: moonlight45 时间: 2012-5-15 13:12

请问DMSO还要灭菌吗？DMSO不是不长菌吗？

作者: zwsyrt 时间: 2012-5-15 13:12

我们一般直接放入-70度，隔夜或次日转入液氮

作者: baidukk 时间: 2012-5-15 13:13

三楼你们一直都是在负80冻存细胞的吗？
不是负80不能长期保存细胞的吗？
我们是液氮冻存的。
效果还不错的。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-15 13:13

我平时冻存细胞的方法如下：
1、将细胞放入程序冻存盒，没有程序冻存盒，也可以放入泡沫保温盒（厚度大于1cm），注意扣紧盖子，然后直接放-80冰箱冻存24h，如果忘了多冻几天也没有关系。
2、转移置液氮灌中。注意，最好不要直接浸入液氮，应该先放入小布包悬于液面以上2h，然后放置入架浸入液氮，可以长期保存至2年。
按照这个方法冻存的细胞，我复苏效果的都很好。
如果按照4度，-20，-80，液氮的程序冻存，时间比较难以把握。

作者: ROSE李 时间: 2012-5-15 13:14

请问DMSO还要灭菌吗？DMSO不是不长菌吗？

————————————————————————————————————————————————————————

一般不用滤菌，我是用的没有滤过的，一直没有污染。如果不放心要过滤，一定用有机膜过滤，用水膜是不行的。

作者: tuuu2 时间: 2012-5-15 13:14

谢谢各位让我了解了很多细节！我们都是放-80度保存而没放液氮的，不过一停电或天气过热时就怕那冻的细胞出问题。我怀疑我之前出现的那种放-20度3小时都是液体状样的情况有可能是那DMSO失效了或者冰箱里没有达到-20度的效果温度？因为我师兄发现一个现象：以前细胞放-20度冰箱时，一般都放冻存盒装着的，但复苏的效果都不好；但是直接把细胞就这样放在冰箱中，不放任何东西装着，好像复苏效果要好些。他说盒子有吸热保温的作用，请问是不是这样子？DMSO好像可以从公司直接买，几十块就行，不用过滤除菌的。

作者: feima+ 时间: 2012-5-15 13:15

老板暑假里让我和师弟去中科院上海分院学习了一个多星期~~！！来说说他们是怎么冻存细胞的~~！！
将待冻存细胞转入冻存管中，密度至少要大于10X6，否则复苏的时候活的细胞就少了~~！！！
把冻存管放入冻存盒中，冻存盒再放入4度冰箱中半个小时的样子，时间长一点也没关系~~！！然后把冻存盒放到-70度冰箱中过夜，第二天就把细胞转移到液氮灌中即可！
楼上有好几个朋友都把细胞放在-20度冰箱中超过了半小时，我觉得可以跳过这一步，因为一是-20度对细胞的损伤比较大，第二是做实验时可能做着做着就忘了，-20度超过半个小时会死很多细胞的~~！！跳过-20度只不过得率稍微少了点而已~~！！

作者: 大白菜 时间: 2012-5-15 13:15

听说直接用塑料泡沫包裹装有细胞的冻存管，直接放-80冰箱也可，有同学试过，效果不错，我也这样做过，但还没有开始复苏！说明下癌细胞可用，其他细胞不太清楚

作者: feima+ 时间: 2012-5-15 13:16

其实这也就是细胞冻存复苏的一个原则：慢冻快复~~！！
冻存时要缓慢降温，这样细胞死的才会少，复苏的时候要让细胞快速通过0°c，因为这个温度细胞内易形成结晶，从而细胞活的就少了，可能活的状态也不好~~！！

作者: *今天不学习明天变垃圾* 时间: 2024-1-9 20:43

4度完了放负30度冰箱可以吗？

作者: *今天不学习明天变垃圾* 时间: 2024-1-9 20:44

4度完了放负30度冰箱可以吗

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)