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标题: [总结帖]细胞版疑难帖 [打印本页]
作者: 一叶    时间: 2012-8-30 16:18     标题: [总结帖]细胞版疑难帖

本集合帖将尽可能地收集本版的疑难帖，请战友们积极回复这些疑难帖
作者: lixi559    时间: 2012-8-30 16:20

各位楼上楼下的乡邻：
你们好！
我从sigma 公司购买了从蛋黄提取的溶血卵磷脂(LPC)用于试验，需要配制它的摩尔浓度，但目前不知道其分子量，各位知情的乡亲能否指点迷津。本人将不胜感激！
作者: redbutterfly    时间: 2012-8-30 16:20

各位楼上楼下的乡邻：
你们好！
我从sigma 公司购买了从蛋黄提取的溶血卵磷脂(LPC)用于试验，需要配制它的摩尔浓度，但目前不知道其分子量，各位知情的乡亲能否指点迷津。本人将不胜感激！
作者: mamamiya    时间: 2012-8-30 16:21


请问MTT与51Cr释放法检测CMC 活性有何区别?哪一种方法更准确?文献报道用51Cr释放法,但没有γ－计数仪（或液闪计数仪）是否可以用MTT法替代?先谢了!
作者: mamamiya    时间: 2012-8-30 16:22

同时【求助】:请问哪位使用过葡聚糖T-500?有没有具体的配制方法(粉剂配成工作液).最好是有图解说明的.这厢有礼了!
作者: mamamiya    时间: 2012-8-30 16:22


请问上海哪里有卖柠檬酸氢二钠的，用于提RNA
作者: yueban-1147    时间: 2012-8-30 16:23


各位好，
我准备做关于wsitar大鼠海马神经干细胞的分离和体外培养，请具有相关经验的朋友多多指教哟！
北泉花园
作者: owanaka    时间: 2012-8-30 16:23


RH-35是大鼠肝癌细胞系，请问RH-35在什么品系的大鼠上成瘤性好？
谢谢了
作者: pencil菲    时间: 2012-8-30 16:24


我因实验需要,急需人肾的末端肾小管细胞系,不知道哪里有,知道的请告知,不胜感谢!
作者: junjie05    时间: 2012-8-30 16:24


我做的课题是研究枯否细胞抑制剂对其释放细胞因子的抑制作用，请问有什么更加特异性的指标能说明枯否细胞的活性被抑制了吗？比如电镜下其活性抑制后会有什么特异性改变？请各位赐教，急~ 谢谢！
作者: cj_mondy    时间: 2012-8-30 16:25


想用神经酰胺诱导PC12细胞凋亡，请问有没有做过这方面实验的高手？如何溶解神经酰胺，我是从sigma买的，C2－ceramide。谢谢！
作者: qqq111    时间: 2012-8-30 16:26

标记率是阳性率么？平均荧光蛋白强度做什么用？标本间怎样比较

图片附件: 43699048.snap.jpg (2012-8-30 16:26, 46.44 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13513

作者: utt0989    时间: 2012-8-30 16:26

标记率是阳性率么？平均荧光蛋白强度做什么用？标本间怎样比较
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 16:28


有没有人用无血清培养基培养过肾小球系膜细胞？因为我要检测肾小球系膜细胞培养液中的纤维连接蛋白的含量，要用到ELISA试剂盒，但这个试剂盒的说明书中要求在培养基中不能含有血清，因此我必须要用无血清培养基进行培养，但不知道关于肾小球细胞细胞的无血清培养基的配方是什么？如果有人用过希望多多请教。
作者: bananapeople    时间: 2012-8-30 16:28


呵呵！楼主有点误解！
ELISA要求只是在培养基中不能含有血清，并不是要求一直要用无血清的培养基培养。无血清的培养基培养细胞的话效果会很差的！我们以前做ELISA的时候平时就用普通的加了血清的培养基培养，一直要到最后要做实验的时候最后一次换液，用PBS洗干净，再用不加血清的培养基，这样就可以了！
肾小球系膜细胞我们培养的时候就用1640培养基加10％的胎牛血清！没什么特殊的！希望楼主实验成功！
作者: one    时间: 2012-8-30 16:30

最近需要EC109，哪位正在养可以交换啊，我这儿有大鼠的成骨细胞MC3T3－E1、兔和人的平滑肌细胞SMCs、人的脐静脉微血管内皮细胞。
最好在北京，这样方便一点：）
可以信箱联系我bicezou@163.com
拜托了！
作者: u234    时间: 2012-8-30 16:33


请教各路大侠:
请问有哪个朋友知道从哪里可以购买到黑素标准品???
谢谢!!!
作者: idea2011    时间: 2012-8-30 16:34

我是用 共聚焦做的FRET，标记的荧光蛋白是CFP－YFP，因为是活体内成像所以不打算用acceptor photobleaching 的方法，想用sensitized emission的方法测。因为是在蓝藻中做所以细胞的自身荧光（autofluorescence)非常强，利用资料上的校正方法,扣除自身荧光后双标细胞的信号基本没有，该怎么办啊？好急啊，请大家帮帮我！除了共聚焦外还有其他适合的测量方法吗？酶标仪可以吗？谢谢啊！！
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 16:35


请各位老师指点
水稻愈伤组织在什么时期适合做电镜切片观察细胞器？叶绿体能观察到吗？
作者: bohe221    时间: 2012-8-30 16:35


听说肿瘤细胞都有很强的吞噬作用，请问k562细胞是否有吞噬作用？有资料证实吗？急！谢谢！
作者: qumm1985    时间: 2012-8-30 16:36


我要做红细胞的CONFOCAL，用兀二醛固定效果非常的好，红细胞也不溶血，但是兀二醛有自发荧光，影响实验结果。所以请教各位大侠，有没有人做红细胞confocal，而且固定效果比较好的？谢谢了。
作者: 一叶    时间: 2012-8-30 16:36



QUOTE:
原帖由 qumm1985 于 2012-8-30 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我要做红细胞的CONFOCAL，用兀二醛固定效果非常的好，红细胞也不溶血，但是兀二醛有自发荧光，影响实验结果。所以请教各位大侠，有没有人做红细胞confocal，而且固定效果比较好的？谢谢了。 ...

对红细胞进行轻微的固定？使得MCV不变
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-8-30 16:37

我转然的是一种原虫，然后放到细胞里体外培养，没有内参，请问如何计算转染效率呢？
大家指点一下！
作者: tieshazhang    时间: 2012-8-30 16:37

我转然的是一种原虫，然后放到细胞里体外培养，没有内参，请问如何计算转染效率呢？
大家指点一下！
作者: 66小飞侠    时间: 2012-8-30 16:38


请问有人做细胞机械牵张实验的吗？牵张装置在哪买，国外有家公司flexcell在国内的代理商有谁知道联系方式吗?
作者: tangxin_80    时间: 2012-8-30 16:38


我是做细胞诱导分化试验的，哪位高人能给我提供一下关于B-巯基乙醇和全反式维甲酸的诱导分化机理，如果有新的进展那就更好了，在下将不胜感激，谢谢！！
作者: xueyouzhang    时间: 2012-8-30 16:39

用PEG介导的动物细胞融合技术实验时，为什么经常选择用鸡的红细胞？
还有怎么鉴别融合细胞与重叠的鸡红细胞呀？
作者: zzzz    时间: 2012-8-30 16:41


我用8－mop和uva合用诱导成纤维细胞衰老，可是药物剂量已经到了300ng/ml在超净台里照射的uva，uva灯管是从正规厂家进的，uva输出波长是365nm，分别照射了10、15、30、45、60分钟，（文献上只是照射4－6min）我的竟然没有衰老！真是不可思议！还有药物剂量也已经是有关文献的几倍了！我的天哪，救救我吧！我的药是sigma的，应该不会有问题吧，有做过相关东东的朋友请帮我出出主意吧！
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-8-30 16:42


求包含sv40大T抗原的表达质粒，主要用于真核细胞永生，万望大家帮忙，急呀：）谢谢！
作者: loli    时间: 2012-8-30 16:42

大家好.我现在用TUNEL法做病理科存档的石蜡标本切片来检测细胞凋亡.结果出现一个想不到的问题:出现几乎90%的细胞染成棕黄色,从形态学来看绝对不是凋亡细胞,不知道是什么环节出现问题 ,现请大家讨论一下,希望得到一些线索.我的实验步骤如下试剂盒为Promega 的TUNEL试剂盒)
1 烤片 60℃ 10分钟 , 切片厚5微米 为人正常小肠的组织
2 二甲苯脱蜡 10分钟*3次; 酒精水化 100% 5分钟*2, 90% 5分钟 ,80% 5分钟
3 蒸馏水 5分钟;PBS 5分钟*2
4蛋白酶K 20微克/ml ,15分钟,( 5分钟也做过) PBS5分钟*3 然后加3%H2O2 10分钟 . PBS 5分钟*3
5平衡液 5分钟
6混合反应液 37℃ 1.5h ,
7 SSC 终止液15分钟
8 PBS 5分钟*3
9 HRP 30分钟
10 PBS 5分钟*3
11 DAB 30秒 蒸馏水清洗
12 苏木素 复染
13 泛滥
结果 :90%的细胞核染成棕黄色, 但无背景染色,形态学不像凋亡细胞.
原因:1 可能为蛋白酶K 的问题吗? 说明书提到是10~30min ,时间过长是不是阳性率更高?但孵育 5分钟做出来的结果跟10分钟的一样
2 是不是混合反应液的浓度太高? 但我是按说明书配的,
3 反应时间太长? 但说明书提到混合反应液可以反应1~2h
4 DNA 酶的污染 ? 可能性很小 因为别人都在同样的条件下 都可以出结果
5 组织在固定的时候引起DNA的断裂?
6 DAB 的浓度太高? 但背景染色不深
7 假如用微波处理,其作用是什么?能否降低假阳性
8 配反应混合液的时候顺序有问题?我是先加平衡液98微升,然后加 rTDT酶及标记物各1微升
请大家多多指导 谢谢
作者: zwsyrt    时间: 2012-8-30 16:45


我想问一下，哪位朋友有关于Alkaline phosphatase activity测定的protocol。我已经查了相关文献，但是相差很大。

谢谢！
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 16:45

尽管网上有些资料，但总是不着边际，希望熟悉的人提供如下资料：
这种方法与使用显微镜测定Ca++有什么区别，各有什么优缺点？
这种仪器国内有几台，目前使用情况如何，如何收费。
这样的仪器购买一套是否合适？
作者: kulee    时间: 2012-8-30 16:46


我接下来要做骨陷窝形成实验，但是我们实验条件所限，没有锯式切片机，骨片也无法制作。请问哪里有卖现成的骨片的，我们需要厚度10微米的。
作者: zzzz    时间: 2012-8-30 16:48

向大家请教一下：
我做磷酸钙转染时，经常形成的DNA-磷酸钙沉淀颗粒大小不一致，有时很小肉眼难见，有时颗粒很大沉淀在管底，请问沉淀颗粒大小不同是什么原因造成的，是不是涡旋仪的速度不同的结果，还是各种成分加入比例的不同造成的？
更重要的是，大的磷酸钙沉淀颗粒转染效率高还是小的更好？大的沉淀颗粒对细胞的毒性是不是很大？
谢谢！
作者: hyuu    时间: 2012-8-30 16:49


请教各位专家：ＯＧＤ导致大鼠皮层神经元细胞的凋亡模型，可否给予详细的具体的实验操作？谢谢，谢谢！
作者: 小螺号    时间: 2012-8-30 16:49


【求助】我正做一个酶抑制剂的筛选试验，考察药物对黄嘌呤氧化酶的抑制作用，从有的文献上看见黄嘌呤氧化酶可以从奶油中提取制备，请教各位，提取制备的具体方法
作者: junjie05    时间: 2012-8-30 16:50


我买的SIGMA 的黄嘌呤氧化酶，是液体悬浮液，我不止到该怎么用，你用了吗？谢谢
作者: toy    时间: 2012-8-30 16:51


有老鸟用过fluorescent brightener 28吗? 是染细胞壁的.
有先人用他来染原生质体, 看看壁有没有去掉, 去掉就没荧光.
我做的是真菌,想在用他来染色看我的原生质体的再生情况,
理想情况是再生后,细胞壁染上荧光. 可是我碰到的问题的,
我用0.01%的fluorescent brightener 28加到含原生质体的培养液中,
原生质体就全破了, 所剩无几. 我在过程中的都是用的含0.6MKCl
的PBS溶液的, 不存在渗透压的问题. 看别人的文献,
fluorescent brightener 28对细胞应该没什么毒性, 不得其解.
谁来帮帮我, 谢谢
作者: windy+++    时间: 2012-8-30 16:52

请问Icam-1在sd大鼠肠道内的正常值是多少？ELISA法
作者: whitesheep    时间: 2012-8-30 16:56

[color=Blac
请教各位大侠，不知哪家公司的HDAC4和HDAC5抗体质量比较好，并可以用来做IF,IP和IHC？谢谢！！
作者: pengke1983    时间: 2012-8-30 16:57



刚刚接触这个问题，看文献说参与胞饮作用的蛋白上百个，但有没有普通的阻断剂，可以阻断所有的胞饮作用？
暂时的也好。
多谢
作者: utt0989    时间: 2012-8-30 16:57

请问有哪位大侠曾经使用过或配制过ECS溶液，我在网上找不到ECS溶液的配制方法和购买途径，如果能提供从哪里购买，也是十分感谢！ECS溶液是用来用来配制WST-1的（一种新型细胞增殖检测物，比MTT敏感、快捷、方便）。
作者: dog002    时间: 2012-8-30 16:58

不知道有没有人这么做过呢？

谢谢告之：）小鼠肺上皮细胞和神经元共培养的方法？
作者: fei1226com    时间: 2012-8-30 16:59

我想用流式细胞仪测检MDR1细胞内的RH123的蓄积浓度，从而评价p-gp蛋白泵的功能，所到的结果中有个荧光百分数（M）（听测检的老师称之为门），另外看到参考文献有个常用的指标“细胞内平均荧光强度（MFI）”，请问这个“荧光百分数”与“细胞内平均荧光强度（MFI）”有什么样的关系？是不是平行几个样品的“荧光百分数”的平均值即为“细胞内平均荧光强度（MFI）”？

另外我有一个很迷惑的问题（也是很菜的问题）：流式细胞仪在检测细胞内RH123的蓄积的时候，比如：
A组细胞：总细胞数：7，其中2个细胞内各有3个荧光颗粒，其余细胞无荧光颗粒，即A组细胞有2个阳性细胞，6个荧光颗粒，那么其荧光百分数是2/7，还是6/7？
B组细胞：总细胞数：7，其中2个细胞内各有1个荧光颗粒，其余细胞无荧光颗粒，即B组细胞有2个阳性细胞，2个荧光颗粒，那么其荧光百分数是2/7，还是2/7？
比较A、B组细胞RH123的蓄积，若按阳性细胞数看是一样的，但所含的荧光颗粒是不一样的，该怎样比较？
其实我就是不明白“荧光百分数”是怎么计算的。
我说的很罗嗦，不知大家能否看懂？
感谢大家指点迷津！！
作者: TNT    时间: 2012-8-30 17:00


我想了解一下C3H10T1/2 cell 的一些情况，包括它的特点，有什么缺陷等等
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 17:01


我想以诱导痰上清培养细胞，但如何除掉细菌、病毒等病原体呢？不知有没有什么过滤网？请懂微生物的朋友提供帮助，多谢
作者: misswu61    时间: 2012-8-30 17:02

各位战友:请问G1724 E.coli cells 能用Cacl2制备感受态吗?
急!!
先在此谢谢啦!
作者: qqq111    时间: 2012-8-30 17:02

我做苜蓿转化组织培养，先期是UM＋2.4D 2 +KT 0.25 ，愈伤诱导较好，但分化时，用UM去激素和MS0＋NAA0.05+BA0.5两种，多天都没什么反映，请问各位高手为何？谢谢
作者: rxcc33    时间: 2012-8-30 17:04


各位战友：我想用BTX细胞融合仪进行细胞融合，不知各位用过BTX仪器的经验人士对此有何建议和注意事项？谢谢
用惯PEG融合，现在有种鸟枪换炮的感觉了，呵呵
作者: zsxan1990    时间: 2012-8-30 17:05


不分离，直接溶红后用台盼兰检测，能否看活性？
作者: zranqi_1    时间: 2012-8-30 17:06


如果能将pegfp质粒转染到R3细胞中，就准备进口这株细胞。
作者: wood533    时间: 2012-8-30 17:06


有谁知道大鼠肾小球系膜细胞原代培养后可以传几代啊？谢谢
作者: pengke1983    时间: 2012-8-30 17:07



请问，血清对细胞呼吸的影响怎样？主要是有血清或者无血清对产ATP的量的影响，利用葡萄糖的影响。
作者: TNT    时间: 2012-8-30 17:07


我用滤纸片沾取胰酶局部消化细胞，细胞能够被滤纸吸附从而从平皿被分离出来，但是不知道怎么才能有效的把细胞从滤纸上游离出来到培养液中，用镊子夹住滤纸在培养液里涮似乎大部分的细胞都不能下来，请教各位高手，怎么才能把细胞有效游离下来？多谢了！！急！！！
作者: idea2011    时间: 2012-8-30 17:08


我要用流式细胞仪检测鸡CD4\CD8阳性T细胞，我有人用的淋巴细胞分层液，必须加入适量的 泛影脯胺才能用于鸡的淋巴细胞分层，请问哪位知道加多少，紧急求救，非常感谢！
作者: idea2011    时间: 2012-8-30 17:08


欲用T细胞花环沉降法分离T、B细胞，可却买不到溴化二氨基异硫氢化物（AET，β-aminoethylisothiuronium bromide hydrobromide或S-(2-aminoethyl)isothiuro-nium bromide hydrobromide的略称。分子式为C3H11Br2N3S,分子量为281.04），哪位告知哪里有卖啊？
作者: zwsyrt    时间: 2012-8-30 17:09


请教各位老师:
我的实验中需要把15-脱氧-前列腺素-J2溶解于DMSO再溶解于细胞培养液中,我买的15d-PGJ2是溶解于methy acetate的液体,根据试剂说明书,它需要在氮气的环境中把溶剂蒸发掉然后立刻加入DMSO,目前我没有这样的条件.请教各位老师有没有办法把15d-PGJ2提纯出来溶解于DMSO?
谢谢!
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 17:09


我养的是β细胞株，培养一段时间后发现细胞伸出的伪足很长，是怎么回事，我怀疑是ph的问题，因为我测ph有点偏高，换新培养基后，细胞伪足仍然曾在，这会不会影响实验，有做过这个的吗，有作RIN－mβ细胞株的高手，请不吝赐教，感激不尽！
作者: DDD    时间: 2012-8-30 17:09

准备做一个药的血管内皮细胞氧化保护作用实验，请问哪里可以做，费用是多少？？
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 17:10


紧急求购放射性配基125ICYP，做淋巴细胞膜beta受体密度检测。请问各位战友，除了用放射性配基检测以外，可以用其它的方法检测么？比如ELISA.
作者: daod    时间: 2012-8-30 17:11

各位朋友你们好：
我现在裂解细胞提出胞浆和胞液的某个蛋白，需要细胞骨架 缓冲液（CSK Buffer），但我看了些资料，有的差别很大， 不知道那里提供的准确。
另外是否有买配制好的？
版本1：0.5% Triton X-100 ，5mMNaCl, 10mM Pipes, 3M MgCl2, 300mM sucrose and protease inhibitor cocktail tablets
版本2：CSK buffer (50 mM NaC1,10 mM Pipes, pH 6.8, 3 mM MgCI2, 0.5% Triton X-100, 300 mM sucrose,1.2 mM PMSF, 10 ~g/mi leupeptin）
版本3：CSK-TritonX-100 细胞骨架缓冲液：10mol/L PIPES,100mol/L KCl,300 mmol/L sucrose, 3mmol/L MgCl2, 1mmol/L EGTA,1.2mol/L PMSF，2mg/L aportinin, 0.5%(v/v) Triton Ⅹ-100, pH 6.8］,
版本４：1% Triton X-100, 1% Nonidet P-40, 0.2 mmol/L　leupeptin, 10 mmol/L Pefablock, 2.77 nmol/L aprotinin, 10mmol/L NaF and 1 mmol/L NaVO3 in PBS)
版本５：10 mmol/L PIPES, 100 mmol/L KCl, 300 mmol/L蔗糖,3 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA, 1.2 mmol/L PMSF,1% TritonX-100, pH=6.8
很多版本　，我看了一下，主要是在NaCl的浓度上，有的还有加KCl,请问高手，　那个好一些。　
另外M-缓冲液作用是什么？？ 是相当于CSK 缓冲液吗？
作者: ffooll    时间: 2012-8-30 17:12


请问各位站友：
adenovirus 12-SV40 virus 转染的人晶状体上皮细胞会失去转分化能力吗？
adenovirus 12-SV40 virus 转染的人晶状体上皮细胞有什么特点？会影响生长因子对其转分化作用吗?

谢谢！
作者: 831226    时间: 2012-8-30 17:12


植物细胞培养的激素比如IIA/KT,对人会起作用吗?如果培养的产物用来做食品,回引起残留问题吗?
作者: yonger    时间: 2012-8-30 17:13


我最近做哮喘模型，肺泡灌洗液中白细胞和嗜酸粒细胞记数较少，但我的脾细胞培养中发现了较多的嗜酸粒细胞（制备脾细胞时未用淋巴细胞分离液），我养脾细胞只养三天然后取上清液测细胞因子。各位高手请问我的哮喘模型是否成功？
作者: lixi559    时间: 2012-8-30 17:13


我准备开展流式细胞术测HLA－B27项目，没有这方面的经验，请教各位站友：
1.单用抗HLA－B27荧光抗体可以吗？还是需要HLA－B27/CD3双标记抗体？
2.如何报告结果？
3.按照试剂说明书操作就可以吗？有什么注意事项？
4.各位用的是哪家公司的抗体，价格如何？
多谢！！！
作者: tangxin_80    时间: 2012-8-30 17:13


我们用的是HLA－B27/CD3双标记抗体，BD的，北京利文公司代理，流式的抗体都不便宜
报告数值
作者: 气泡    时间: 2012-8-30 17:14

老师是哪家单位，我们用的是HLA－B27/CD3双标记抗体，BD的，直接出来数值，价格在5000-6000之间，可以做100t。
作者: zhezhe    时间: 2012-8-30 17:15


1.BD公司的是HLA－B27/CD3双标抗体，Coulter是HLA－B27/B27双标抗体。两个都可以选择，但个人建议使用BD的试剂，因为其中有校准微粒，较少受人的主观因素影响。Coulter的试剂中没有校准物，说明书判定标准写得也不清楚，所以操作者做判断时（特别是对于在Cutoff值附近的样本），有时需要一些经验。
2.报告结果只报阴阳即可。像阳性细胞百分比、荧光强度等可不报，报了的话临床会问你很多问题，自找麻烦。
3.BD的按照说明书操作即可，Coulter的说明书写得笼统不清晰，操作时需找公司的人帮你设一下模板，确定一下判定标准。BD的试剂在别的仪器上操作的流程基本相似，但需要以线性方式显示坐标轴。可以查查文献参考一下。
4.现在市面上基本就这两家的试剂，其他厂家的试剂都是模仿Coulter的原理，价格如楼上。
作者: zsxan1990    时间: 2012-8-30 17:16

各位战友:
我想检索一下,哪个细胞或者组织中TNFα和IL-6的含量最高,以及量.
不胜感激!
作者: ququer787    时间: 2012-8-30 17:17


本人用fluo-3/AM标记细胞内钙，严格按照步骤清洗细胞，但在上镜观察时在细胞的周围总有一些红色的物质，照成照片后就变为绿色的，显得细胞及其不干净，开始以为负载后未冲洗干净，后来加大冲洗力度，细胞损失了不少可还是有这些红色的物质，不只何原因？如何能解决？
另外 ，我即时加入了一种可以增加细胞内钙的药物，但是未见细胞亮度明显改变，排除药物的原因，有人认为是因为细胞外环境中的钙离子浓度太小，所以建议我在细胞外环境中加入钙离子，不知有道理否？如何加入？
作者: dog002    时间: 2012-8-30 17:18


希望做白细胞从血管中渗出的模型，用白细胞与内皮细胞共培养看两者之间的作用，想知道是不是应该先把白细胞和内皮细胞先激活，我看得文献好像都是只激活了内皮，而白细胞用的是新鲜分离的并没有激活，对这种做法不太理解，我觉得应该是两种都激活才对，想问一下各位高手的意见
作者: eric930    时间: 2012-8-30 17:18


请问如何可以把一个鲜活植物组织分散成单个的细胞，以作细胞染色观察呢？？
我做的是龙眼果肉的细胞悬浮液，是从新鲜的果肉上取样的，用过机械破碎的方法，不过效果不好；然后也用过2%的果胶酶（含蔗糖5%）来酶解胞间层以得到单个细胞，可是没有效果
请问我做的两个方法是否有问题，或者有更好的方法可以制作活组织的细胞悬浮液的
谢谢告知
作者: kulee    时间: 2012-8-30 17:19

a549细胞生长周期多长？一点也不懂，请指教
作者: milkdog    时间: 2012-8-30 17:20



QUOTE:
原帖由 kulee 于 2012-8-30 17:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
a549细胞生长周期多长？一点也不懂，请指教


A549的倍增时间约22 h， 2-3天换液一次。传代时间根据种的细胞密度，我试过种的密度大的【2*10（4）/cm2左右，隔天就可以传代了】，密度小的，具体没计数，大概一个75cm2的培养瓶中种几滴消化后的细胞悬液，需要长一个星期才能传代。可以传的代数具体我也不清楚，我们实验室的A549是来源于ATCC的，在我们实验室大概传了二十代生长仍然良好。
不知对你是否有点帮助呢？
作者: pencil菲    时间: 2012-8-30 17:21

A549的倍增时间约22 h， 2-3天换液一次。传代时间根据种的细胞密度，我试过种的密度大的【2*10（4）/cm2左右，隔天就可以传代了】，密度小的，具体没计数，大概一个75cm2的培养瓶中种几滴消化后的细胞悬液，需要长一个星期才能传代。可以传的代数具体我也不清楚，我们实验室的A549是来源于ATCC的，在我们实验室大概传了二十代生长仍然良好。
不知对你是否有点帮助呢？
作者: vcve    时间: 2012-8-30 17:22


角膜缘干细胞原代培养，消化法，该消化多长时间才恰当？
作者: wu11998866    时间: 2012-8-30 17:22


这个我正在做 哈哈

我用DISPASE 消化5-10分钟. 然后加血清终止.

然后就组织块剪成适当大小让它贴壁37度孵箱里放着

每次都做出来的.周五刚做了一批. 今天看看已经有好多细胞了

来这里求助, 没想到可以帮到别人.~~希望我的帖子也有人可以帮我解答啊
作者: 一叶    时间: 2012-8-30 17:23


楼上的方法不能称之为消化法吧？？还有DISPASE是不能被血清终止！
作者: remenb    时间: 2012-8-30 17:24


各位好，我来报个到．
因为课题缘故，需要培养人血管平滑肌细胞．我希望从脐带血管中获得ＳＭＣ，但参考了教科书方法和文献方法，均告失败．我把收细胞过程写出，请大侠们会会诊吧，希望能早日养出细胞来．谢谢

组织块法：
１．剖宫产所取脐带，４度无菌带回，０．２５％氯霉素冲洗三次；
２．分离出脐动脉，解剖显微镜下剥除外膜，切为小段，ＰＢＳ洗净血渍；
３．以眼科剪将动脉剪为小块，再以显微外科剪将其剪为１mm3大小；
４．滴几滴培养液于培养皿中，均匀铺满底部，将组织块均匀分散于培养皿，间隔０．５cm，全过程保证组织块湿润状态．
５．过夜加液．（２０％ＦＢＳ的Ｍ１９９）
　以此方法，组织块贴壁后，边缘清楚，皿底清洁，但２周未见细胞爬出（７天时换一半液）

消化法：
剪碎方法同贴壁法，剪碎组织后，试过的消化方案如下：
Ｉ型胶原酶，以０．１％的浓度，分别消化０．５，１，１．５，２小时（３７度），过夜（４度），组织块已基本消化完全，滤网过滤后离心，收集，以２０％ＦＢＳ的Ｍ１９９培养，但２４小时未见细胞贴壁．仅看到大量的碎屑和少量红细胞，和众多类似细胞的亮圆点．

脐动脉的感觉是切碎后就象鼻涕一
作者: yapuyapu    时间: 2012-8-30 17:24



QUOTE:
原帖由 remenb 于 2012-8-30 17:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位好，我来报个到．
因为课题缘故，需要培养人血管平滑肌细胞．我希望从脐带血管中获得ＳＭＣ，但参考了教科书方法和文献方法，均告失败．我把收细胞过程写出，请大侠们会会诊吧，希望能早日养出细胞来．谢谢

组织块法：
１．剖宫产所取脐带，４度无 ...

我以前做过这个的原代培养，
关于组织块法我觉得３．以眼科剪将动脉剪为小块，再以显微外科剪将其剪为１mm3大小；剪成成小块后用无菌D-hanks或者PBS洗一下，然后离心收集；我以前是直接加培养基，静置，培养，不用过夜；另外，我觉得没必要间隔０．５cm，密一些好；我用的培养基是加15%FBS的DMEM，FBS为Hyclone，DMEM为Gibcol
消化法：
我是用胰酶，胶原酶，弹性蛋白酶依次消化，都是37摄氏度，每一步用离心收集，而且没有需要过夜，过夜时间太久，可能消化过了。
作者: loli    时间: 2012-8-30 17:25

酶消化法中酶的浓度和时间？
作者: join    时间: 2012-8-30 17:25


1. 1mg/mL 胶原酶， 室温消化30min ，离心，弃上清
2.1mg/mL胰酶，37摄氏度消化20min ，离心，弃上清
3.1mg/mL胰酶，37摄氏度消化20min ，离心，弃上清
4.1mg/mL 胶原酶和0.5mg/mL 弹性蛋白酶混合酶液，37摄氏度消化2小时 ，
5.rpm900离心5min，收集细胞
6.接种于1０％ＦＢＳ的DMEM
作者: 泡泡    时间: 2012-8-30 17:26

各位前辈：
我正在做狗的主动脉平滑肌及成纤维细胞培养，都是刚开始做，也都失败
。二者都是用组织贴块法，用的培养基都是DMEM+20%FBS，平滑肌培养用的过程中感觉困难的是：在剥除血管外膜时很困难，要想做到不污染，且动作轻柔不损伤组织，还要剥的干净，感觉特难，我总怕剥的不干净，所以每次都剥的时间很长，不知道哪位老师能够指点一二，有什么好的方法，到底要剥到什么程度才算干净等等
其二，成纤维细胞，我用的是狗的一快皮肤，第一次培养不知道用脱毛剂，光剪除毛发用了很长时间，真难弄，而且皮肤容易卷到一起，有的文献说剪成3mm大小，有的说要剪成1mm大小的组织块（个人感觉血管组织剪成1mm还能做到，但皮肤组织剪成1mm真的很难，而且皮肤伸展性很好，很难掌握），到底要剪成多大，以及培养过程中的注意事项，请各位老师不吝指教，我真的好急啊，时间好紧，可是细胞还不知道在哪，都想买了！！
作者: one    时间: 2012-8-30 17:28



QUOTE:
原帖由 泡泡 于 2012-8-30 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位前辈：
我正在做狗的主动脉平滑肌及成纤维细胞培养，都是刚开始做，也都失败
。二者都是用组织贴块法，用的培养基都是DMEM+20%FBS，平滑肌培养用的过程中感觉困难的是：在剥除血管外膜时很困难，要想做到不污染，且动作轻柔不损 ...


犬胸主动脉平滑肌贴块法
1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，时间太长就先天不足；
2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；
3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；
4、用两个小号的有齿镊，一个夹紧剥离出的脐动脉，另一个小心地撕开外膜，不能太深，以免撕开中膜。一般可以有一段像袖套样剥下来，这一段的外膜成功剥离了。如果不行可以用刀切的，买几个吉列的刮胡刀片，用时高压消一下就ok了。
5、培液Gibco的DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20％。

成纤维我没有做过，希望可以帮上你。
作者: remenb    时间: 2012-8-30 17:28


不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章发表。
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:29



QUOTE:
原帖由 remenb 于 2012-8-30 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章 ...


不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章发表。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 17:30

楼上，,请问这个细胞株是国际上公认的么?在PUBMED中查不到啊!
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:30



QUOTE:
原帖由 kewanqi2011 于 2012-8-30 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上，,请问这个细胞株是国际上公认的么?在PUBMED中查不到啊!


该细胞是建系不是很早，但是也是国外多个实验室公认的一个细胞株。

具体该细胞分泌什么递质我没有查过，你可以查查看看，毕竟可能我们专业不同，关心的角度可能也有所不同。

我给您发一篇文献，你看看。你可以再以此为基础查查其他文献，希望能对您有帮助。
作者: kulee    时间: 2012-8-30 17:31


请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:32



QUOTE:
原帖由 kulee 于 2012-8-30 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！

鄙人做过iNOS的检测。采用的一抗是rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA)，武汉博士德的ABC试剂盒。当时没有做nNOS,但是估计sigma也有该一抗。具体请到以下网址查询：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/Local/SA_Splash.html')

此外，在近期我们发表的一篇文章里详细介绍了试验方法，操作类似，在此提供，希望能有所帮助。
The primary anti-iNOS was rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA), and the ABC kit was purchased from the Boster Company in Wuhan, China. The procedure of iNOS immunohistochemistry was as follows. Phosphate buffered saline (PBS, 0.1 mol/L, pH 7.2-7.4) was used to replace the primary antibody for negative control. The sections were soaked in double distilled water for 15 min, then incubated at room temperature in 3% hydrogen peroxide for 10 min to inactivate endogenous peroxidase, and then treated with PBS for 2 min. After the nonspecific reaction was blocked with normal goat serum at room temperature for 20 min, the sections were incubated with a reaction buffer containing primary antibody at a dilution of 1:100 for at least 14 h at 4°C. The sections were then washed three times with PBS for 15 min before being incubated with biotinylated anti-rabbit IgG for 20 min at 37°C. The reaction was terminated by washing the sections with PBS for 15 min. Then the sections were incubated with streptavidin biotin complex solution at 37°C for 20 min, followed by four washings with PBS for 5 min each time. Finally, they were visualized with diaminobenzidine substrate working solution and then counterstained with hematoxylin.
作者: utt0989    时间: 2012-8-30 17:32

偶做过啊。

试验中兔源大鼠nNOS 单抗、SABC 免疫组化试剂盒、DAB试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。

具体步骤：
　nNOS 免疫组化反应　用SABC 法。(1) 先烤片,恒温烤箱内60 ℃放置1 h ; (2) 脱蜡,梯度酒精脱水, PBS 洗10 min ×3 次; ( 3) 新鲜3 % H2 O2 中10 min灭活内源性过氧化物酶,双蒸水洗10 min ×3 次; (4) 切片置于0. 01 mol/ L 柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,25 min ; (5) 冷却后,滴加抗原修复液30 min ,双蒸水洗10 min ×3 次; (6) 滴加正常山羊血清60 min ,不洗,甩去多余液体; (7) 滴加兔抗鼠
nNOS 一抗(1 ∶2 000) ,室温下(25 ℃) 孵育1 h ,再4 ℃过夜,PBS 洗10 min ×3 次; (8) 滴加生物素化山羊抗兔IgG, 室温下60 min , PBS 洗10 min ×3 次; ( 9 ) 滴加试剂SABC , 室温60 min , PBS 洗15 min ×4 次; (10) DAB 显色,室温下20 min ,双蒸水多次洗涤; (11) 脱水,透明,中性树胶封片。
作者: kulee    时间: 2012-8-30 17:33



不知你们的结果怎样， 听说有南京建成的NOS及亚型检测试剂盒，不知咋样？
作者: pengke1983    时间: 2012-8-30 17:33


我曾经用过南京建成的分型NOS的试剂盒，一个试剂盒可以策总NOS和iNOS，结果还可以，价钱也不贵
作者: kulee    时间: 2012-8-30 17:34


请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！！
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:35


鄙人做过iNOS的检测。采用的一抗是rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA)，武汉博士德的ABC试剂盒。当时没有做nNOS,但是估计sigma也有该一抗。具体请到以下网址查询：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/Local/SA_Splash.html')

此外，在近期我们发表的一篇文章里详细介绍了试验方法，操作类似，在此提供，希望能有所帮助。
The primary anti-iNOS was rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA), and the ABC kit was purchased from the Boster Company in Wuhan, China. The procedure of iNOS immunohistochemistry was as follows. Phosphate buffered saline (PBS, 0.1 mol/L, pH 7.2-7.4) was used to replace the primary antibody for negative control. The sections were soaked in double distilled water for 15 min, then incubated at room temperature in 3% hydrogen peroxide for 10 min to inactivate endogenous peroxidase, and then treated with PBS for 2 min. After the nonspecific reaction was blocked with normal goat serum at room temperature for 20 min, the sections were incubated with a reaction buffer containing primary antibody at a dilution of 1:100 for at least 14 h at 4°C. The sections were then washed three times with PBS for 15 min before being incubated with biotinylated anti-rabbit IgG for 20 min at 37°C. The reaction was terminated by washing the sections with PBS for 15 min. Then the sections were incubated with streptavidin biotin complex solution at 37°C for 20 min, followed by four washings with PBS for 5 min each time. Finally, they were visualized with diaminobenzidine substrate working solution and then counterstained with hematoxylin.
作者: 阿敏    时间: 2012-8-30 17:35

本人欲用Alcian blue法检测细胞硫酸软骨素的含量,但找不到硫酸软骨素做标准曲线,不知那位好心人能提供一点或告之如何买!谢谢!
作者: HP007    时间: 2012-8-30 17:36


我这里还有一点，不知道够不够你用。呵呵。其实不算太贵的。自己买吧。

我用的是从sigma买的：
Chondroitin 6-sulgate sodium, Sigma, C4384, 1g, 38.00$

详情：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/C4384')
作者: 阿敏    时间: 2012-8-30 17:36


我在做实验，需要分离大鼠的卵泡膜细胞和颗粒细胞，还有哪位知道卵泡膜细胞上含有那些酶？我的信箱是moqu214@sohu.com
作者: kswl870    时间: 2012-8-30 17:37


1. 颗粒细胞分离与培养：
采用成年雌性大鼠, 在动情周期的滤泡阶段处死动物, 取出卵巢并去除粘连的脂肪, 放入含少量培养基(DM ENM /H am ’s F12 培养基1∶1, 0.1% 牛血清白蛋白、碳酸氢钠2.4g/L 及抗菌素) 的器皿中; 在体视显微镜下解剖出卵泡并切开, 冲洗出颗粒细胞,收集后清洗、离心, 将颗粒细胞悬浮于2m l 培养基中反复吹打使之分散。如需提高纯度, 可用0～ 90%Perco ll 介质作密度梯度离心; 如细胞分散不佳, 可用透明质酸酶(230U/m l) 对细胞作分散处理15 分钟。细胞分离制备后, 计数细胞数的存活率, 调整细胞密度后分装到含10% 小牛血清的培养基中, 每孔10 万个细胞, 在37℃、5%CO 2 下孵育24 小时。24 小时后更换不含小牛血清的培养基(原因是血清对细胞激素分泌功能有抑制作用) , 并加入睾酮作为芳香化酶的底物及受试物, 视研究目的培养不同时间。

2. 卵泡膜分离和培养：
取已去除颗粒细胞的卵泡膜, 用培养液反复吹打清洗或用一金属环进一步刮去粘附的颗粒细胞, 然后分装到培养管(孔) 中(3～ 4 个卵泡膜/m l) ,用上述DM EM/Ham′s F12 培养基在37℃的二氧化碳孵箱中培养。
作者: eric930    时间: 2012-8-30 17:37


各位楼上楼下的乡邻：
你们好！
我从sigma 公司购买了从蛋黄提取的溶血卵磷脂(LPC)用于试验，需要配制它的摩尔浓度，但目前不知道其分子量，各位知情的乡亲能否指点迷津。本人将不胜感激！
作者: hold住    时间: 2012-8-30 17:39     标题: 回复 #100 eric930 的帖子

既然是从Sigma买的，那到Sigma公司的网站上肯定能查到。
看看下面链接中的TABLE 1，里面有你要的。
[iframe]http://www.sigmaaldrich.com/sigma/product%20information%20sheet/l4129pis.pdf[/iframe]
作者: newway    时间: 2012-8-30 17:39

大家好！有哪位高手能指点一下，我的实验需要用到HSC－T6，我想知道它的生物学性状，它本身有没有cox－2基因的表达，量多吗能否测到，还有如果要做RT－PCR扩增cox－2的哪一断比较好，我察了很多资料就是没有找到答案，马上就要准备买材料了，我还没有弄清楚，真着急，希望大家帮帮忙，感谢！盼复
作者: dongdongqiang    时间: 2012-8-30 17:40


它本身有没有cox－2基因的表达，量多吗能否测到？

看看下面这篇文章：
cuturl('http://www.jbc.org/cgi/content/full/275/26/20136')

如果要做RT－PCR扩增cox－2的哪一断比较好？

可参考下面的文章：
cuturl('http://jpet.aspetjournals.org/cgi/content/full/303/3/1248')
cuturl('http://www.jneuroinflammation.com/content/2/1/4#B22')
cuturl('http://www.jpgn.org/pt/re/jpgn/fulltext.00005176-200108000-00013.htm');jsessionid=DZTi1QKK6ucDinYM2K39BGM44MEhhTxRE8zrmaB97g12jcl4eIdK!1389088241!-949856145!9001!-1
作者: ladyhuahua    时间: 2012-8-30 17:41


请教高手：
1. 大鼠肺微血管内皮细胞原代培养选择哪种培养基为好？
2. 文献资料显示大多选用DMEM培养基，那么该选用哪个公司的产品？是低糖还是高糖？除了L-谷氨酰胺和丙酮酸钠，是否还要加入HEPES和肝素？
3. 胎牛血清是在培养基过滤前加入好，还是培养基过滤后加入好？如果是在培养基过滤后加入，是否会使已调好的培养基PH值发生改变？
谢谢！
作者: 831226    时间: 2012-8-30 17:42


1.一般为DMEM
2.使用较多的是GIBCO的高糖型，DMEM的配制（添加3.7克NAHCO3，20mmol/L
HEPES,肝素钠100mg/L,青霉素100U/ml,链霉素100ug/ml).PH调至7.2-7.4 ，过滤分装4度保存。
3.一般在过滤前加血清。
作者: 04906    时间: 2012-8-30 17:42


我是做生殖免疫的，需要对小鼠的子宫内膜细胞进行培养，而这方面的资料很少，希望大家慷慨解囊，告知具体步骤，主要是细胞的采集，以及鉴定。
先谢谢大家。
作者: pengke1983    时间: 2012-8-30 17:45


小鼠子宫内膜细胞的培养和处理：

取受精后第4 d 的孕子宫,纵向剖开,用手术刀片小心刮取子宫内膜, 而后用0.5 %胰酶-0.2 %EDTA ,37 ℃消化30 min ,制成细胞混悬液,将细胞加入放有盖玻片的24 孔板(预先用0.1 %多聚赖氨酸处理24 h) ,每孔细胞浓度为2～3 ×105/ 孔。培养基为1∶1 F12/ DMEM含有10 %胎牛血清,培养24 h 后换液, 以后隔天换液。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 17:46

研究脑缺血后损伤修复的问题
以前一直养原代, 现在想换成N2a细胞, 想问问关于这个细胞系的详细情况,
比如, N2a细胞表面的受体
能否用于研究能量代谢方面的问题
能否利用外源性的一些物质,比如丙酮酸,乳酸等

N2A细胞是单纯的神经元细胞系,还是也有胶质细胞,这个问题我也没有搞清楚
还请研究过这个细胞系的大侠们给予指点,非常非常感谢!!
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:46


关于N2a细胞方面我已经发过不少帖子，也提供了培养方法，具体请见：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4171148&sty=3')
N2a细胞全称mouse neuroblastoma N2a cells，也有人称其为Neuro-2a，是小鼠来源神经瘤母细胞。我们目前主要是以该细胞作为AD研究的细胞模型，这部分试验是与The Burnham Institute, La Jolla, California, USA共同合作进行的。即将有主体工作在国内的paper发表。
据我所知，该细胞是来源于单纯的神经元细胞，而非胶质细胞。对于外源性一些东西对该细胞的影响是可以研究的，且已有研究报道，比如说RA（视黄醛酸），cAMP等对其分化的影响。
但是，对于该细胞表面受体和能否用于研究能量代谢方面的问题，恕在下不敢妄言。在此提供一篇文献，你可以参考一下。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 17:47     标题: 回复 #109 viviwang1987 的帖子

但有些细节方面的问题想与你探讨一下
1 有战友说N2a不是单纯的神经元细胞，而是一个杂细胞，含有神经元，胶质细胞和星性胶质细胞等，但可以肯定的一点是，它不是单纯的胶质细胞。这对于我们的研究就ok了。
2 一个比较有意思的问题是，这个细胞在培养到第3天，给它换过液，到第4天的时候，开始长出很多的突触，和你拍的照片一样，这是不是提示，如果该细胞用于做实验的话，应该至少培养至第4天，等它具有比较健全的功能的时候再使用呢？
3 其实是想找一些具体的文献来支持我用这个细胞，但其实，很多的东西都是创新的，所以找不到类似的文献，其实，要是别人用这个细胞做了我想要做的方面，那么我也就没什么可做了。
4 关于它的培养基，OPTI－MEM实在是太贵了，所以，想要寻找一种可以取代的培养基，不知道你们有没有试过其他的，比如自己加全氨基酸的DMEM培养基，我正在试，可以互相交流：）
5 关于它的表面受体and transporter 我已经找到相关文献，可做为依据支持我的实验。
在次感谢你的详细解答以及你提供的文献，希望就为数不多的N2A细胞，能多多交流：）
作者: rxcc33    时间: 2012-8-30 17:48


我要培养流感病毒 ,需要买MDCK细胞,在cctcc中查到有MDCK细胞和MDCK/wild 细胞,二者有什么区别吗?哪个对流感病毒更敏感,谢谢!
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:48

据我所知，MDCK细胞应该是一种永生化了的肾上皮细胞株。不知道为什么大家都不回答这个问题。如果是因为大家都没有培养过该细胞的话，请斑竹不要给我加分，因为到现在为止，我也没有培养过该细胞。但我觉得可能并不是这个原因。

对于楼主的问题，我觉得你问的不够好，或者说还没有好好搞清楚有关细胞培养的基本问题。不管是什么细胞，都有野生型（就是你所说的wild type），也有根据不同目的，转染各种不同基因的突变株。
从概念上讲，MDCK细胞是一个总称，MDCK/wild 细胞应该是其中的一种。而且不能直接说哪种对流感病毒更敏感，除非你已经将抗流感病毒的基因转到MDCK细胞中，那就是wild type更敏感了。
作者: lagua123    时间: 2012-8-30 17:49

我们已经做这个流感病毒几年了，当然mdck也用了几年了，很好用，病变现象明显，明显~
贴壁细胞，比较难消化~
没有用过mild type
作者: orangecake    时间: 2012-8-30 17:49


由于试验需要，急需”鸡胚心肌、肝细胞及雏鸡脾细胞的原代培养方法“，哪位做过或者有相关资料的，请赐教。万分感谢！
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:50


鸡胚心肌细胞原代培养：
无菌下摘取孵育10～15d的鸡胚心脏，剪除心房、大血管及结缔组织，于预冷的Hank's液中洗净心腔血液后，剪成约1mm3大小碎块，用含0.06%胰酶的无钙镁的Hank's液多次消化心肌组织，制成心肌细胞悬液，经贴壁2h去处成纤维细胞及内皮细胞，将细胞弄点用含20%小牛血清的1640培养基调整至1.0*106细胞/ml后接种于细胞培养板，生长4～5d后细胞贴满瓶底，并可见心肌细胞搏动。即可采用该原代细胞进行试验。
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:51

鸡胚肝细胞的制备：

将鸡胚用70 %酒精浸泡进行表面消毒,在超净工作台中打开蛋壳,无菌取出鸡胚的肝脏。放入盛有少量生长液的器皿中。剪碎肝脏,并用PBS 洗涤除去血细胞。将剪碎的肝脏移入血清瓶中,按每胚10mL左右加入5 %胰酶,37 ℃水浴3 —4min 进行消化,第一次消化的溶液应弃掉。将消化好的溶液放入加有少量生长液和20 %牛血清的容器中终止胰酶消化,并冰浴。重复消化过程,直到胰酶中的肝脏完全消化,只剩下粘稠的—些结缔组织。将冰浴中的溶液取出,分别用400 目和500目的细胞筛过滤。将过滤好的溶液进行1000rPmin , 10min 离心,除去胰酶。将沉淀下来的细胞用10mL 生长液悬浮,并取出011mL 稀释4 —10 倍,用Typan 蓝染色,用血球记数板在显微镜下计数。配成每毫升1 ×106 细胞悬浮,接种到细胞瓶中。37 ℃,5 %CO2 培养3d 后可长成单层。
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 17:58


雏鸡脾细胞培养：
无菌下摘取雏鸡脾脏，Hank's洗3次，剪除脾外部结缔组织，于预冷的Hank's液中洗净，剪成约1mm3大小碎块，用4℃预冷0.83%NH4Cl溶液置4℃冰箱中作用10min,汽上清，反复2次，破坏红细胞，再用Hank's洗3次，用含10%小牛血清的1640培养基反复吹打，二层纱布过滤，悬液计数，调整至1.0*106细胞/ml后接种于细胞培养板。
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-30 17:58


作缺氧模型，需要测出气孔的氧浓度，请问有测氧仪这个东西吗？给介绍一下，不贵的话我准备买？它能测溶液中的氧含量（物理含量）吗？
另外，有用过可以过滤气体的装置吗？可以装到胶管或钢瓶嘴上都行？
作者: jujuba    时间: 2012-8-30 17:59

看到你的贴子，经过查找，发现答案如下、
1－测氧仪这种仪器很多，而且型号很多，主要是根据用途分。
下面提供几个地址，可以自己联系，向生产厂家提出具体要求，应该可以解决你的问题。
浙江省新安江分析仪器二厂

厂 址: 浙江建德市梅城镇市民路205号
电 话: 0571-64141684
传 真: 0571-64141182
手 机: (0)13906818049
联系人: 吴新林
邮 编: 311604
Email: xf2cwxl@yahoo.com.cn
网 址: cuturl('http://www.xf2c.xom')

无锡中钢仪器仪表有限公司
地　址： 江苏省无锡市滨湖区华庄镇明芳路71号
邮　编： 214131
电　话： 0510-5600679 5602679
传　真： 0510-5600679
联系人： 朱敏奇
手　机： 13093050679 13861876783
邮　箱： webmaster@zg-yb.com
网　址： cuturl('http://www.zg-yb.com')
2－你问有无过滤气体的装置。当然有，就是空气过滤器。
目前常用的，主要是外壳是不锈钢的，内部是化工原料做成的气体滤芯。根据要求不同孔径不同，据我所知，最小的孔径应该小于0.1um，可以达到无菌要求。
带有很好的快接接口，可以练到设备或者其他装置上面。

具体地址，自己在网上搜索急得。
作者: ending    时间: 2012-8-30 18:00

我们用的是上海市嘉定学联仪表厂出产的CYS-1数字式测氧仪，大概一千元左右。过滤气体我用的是咱们培养细胞用的小滤器，气体速度要慢，以免冲破滤膜。其实在缺氧条件下细菌不容易滋生，而且细胞缺氧的装置也要紫外消毒，所以不用担心污染。
作者: u234    时间: 2012-8-30 18:00

猪的常见细胞系有那些？谢
作者: misswu61    时间: 2012-8-30 18:02


PK-15  来源猪肾脏细胞  
就知道这一种
作者: zranqi_1    时间: 2012-8-30 18:02


1) HT-1080 猪肾细胞系 上皮样细胞
2）ST 猪睾丸细胞系 成纤维样细胞
3）IBRS-2 猪肾细胞系 上皮样细胞
作者: langlang    时间: 2012-8-30 18:03

还有一些猪细胞系
ESK-4 猪肾正常上皮细胞
PT-K75 猪鼻甲骨纤维原细胞
LLC-PK1 猪肾正常上皮细胞
LLC-PK1A 猪肾正常上皮细胞
PK-2a/CL 13 猪肾上皮细胞
PK13 猪肾上皮细胞
PK(D1) 猪未知组织细胞
以上细胞来源：
cuturl('www.atcc.org')

还有一些猪原代细胞:
1，猪冠状动脉内皮细胞(PCAEC)
2，猪肺动脉内皮细胞(PPAEC)
3，猪大动脉内皮细胞(PAOEC)
4，猪冠状动脉平滑肌细胞(PCASMC)
5，猪肺动脉平滑肌细胞(PPASMC)
6，猪大动脉平滑肌细胞(PAOSMC)
细胞来源：
cuturl('http://www.cellapplications.com/AnimalC.html')
作者: gogo    时间: 2012-8-30 18:03

我即将做细胞杀伤实验，虽然现在还没有NK92细胞，但是我想哪位大侠能够指导一下该细胞的培养条件有什么特点？
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 18:04



QUOTE:
原帖由 gogo 于 2012-8-30 18:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我即将做细胞杀伤实验，虽然现在还没有NK92细胞，但是我想哪位大侠能够指导一下该细胞的培养条件有什么特点？

自然杀伤 ( natural killer,NK)细胞系NK-92是1992年从非霍 奇金淋巴瘤患者的外周血淋巴细胞中分离出来并建系成功的一种自然杀伤细胞系,具有与人NK细胞相似的表面分子特征和功能特点,可在体外长期培养、大量扩增,并对多种肿瘤细胞具有杀伤活性。

NK292 细胞
培养条件：一般培养于α-MEM培养基(含12.5%新生牛血清、12.5%马血清、100 U /ml rh IL-2),
培养方法：常规，37℃、5% CO2 孵箱中培养。
作者: 二子    时间: 2012-8-30 18:04


我的试剂是今年5月份买的，现在它出现了沉淀，量不是很多，我用了两次往Vero转绿色荧光蛋白但是效率很低，不知道是不是这个原因，大家遇见过这种情况吗？试剂还能不能使用啊？还有大家有没有往Vero转绿色荧光蛋白的经验啊，能不能提示我一下关键步骤啊？我做过梯度用来确定质粒和试剂的最佳比例但是效率都很低，我的质粒的纯度很好，应该不是这方面的问题。很希望得到大家的帮助，谢谢了
作者: BUK    时间: 2012-8-30 18:04


你可以混合一下，看是否还能均质。如果不匀质，还是别用了，可以打电话问问试剂公司。
转染的最关键是比例，与质粒的大小有关系。
另外一个关键是转染液与细胞的接触时间不能太长。我一般3小时后，就每20分钟看次细胞，当细胞稍变圆时，就换上培养液。因为lipofection对细胞的毒性很大。说明书一般要6-8小时，我试过，转染很低。
作者: vcve    时间: 2012-8-30 18:06


质粒和脂质体结合的时间可以延长一点。它说的是6个小时稳定。所以建议时间延长到2个小时，然后再传
作者: one    时间: 2012-8-30 18:06


我现在在养 293T cell，有一些问题想请教：293T是不是传十代以上转染效率 就不好了 ，另外293T cell用什么试剂转染比较好（我看一些用磷酸钙转染，不知道它的优点是什么？）
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 18:07


传10代以上转染效率还行
我用脂质体2000转染，转染率跟头几代没差多少。

不过做转染以来细胞总是熬不到48h。无法收集病毒上清，借贴求教大侠！！
作者: 二子    时间: 2012-8-30 18:07


在20代后转染效率就下降很多，15代前最好。
我也用脂质体2000，但由于其毒性，要早4小时左右就换掉转染液。
作者: langlang    时间: 2012-8-30 18:07

在20代后转染效率就下降很多，15代前最好。
我也用脂质体2000，但由于其毒性，要早4小时左右就换掉转染液。

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我用lipo 2000转，24 h不换液也没有一点问题~是不是现在lipo 2000质量好了。
作者: moonlight45    时间: 2012-8-30 18:08


请问养该细胞有什么要求，我养的细胞贴壁困难，请问有什么办法？
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 18:08


Eahy926细胞培养没有什么特殊的，都是采用常规细胞培养条件：
RPMI-1640完全培养基（含10％FBS,青霉素100U/ml，链霉素100 微克/ml）。37℃、5% CO2 孵箱中培养。
当细胞呈亚融合后，用0.25%胰酶－0.02％EDTA消化。

至于你说细胞贴壁困难，我觉得如果你的培养方法没有问题，请确认以下几点：
1，细胞是否还活着；
2，如果还活着，是否有污染；
3，如果还活着，也没有污染，请确定消化是否时间过长，造成细胞受损，影响正常贴壁。
作者: mickeylin    时间: 2012-8-30 18:09


我正在养这种细胞，还是挺好养的，按一般的养贴壁细胞的方法就可以，不过培养基最好家ＨＴ（ＨＡＴ）如果不加的话，细胞要退化！
作者: ffooll    时间: 2012-8-30 18:10

你好！请问不加HAT要退化是什么意思？如何加？
作者: tieshazhang    时间: 2012-8-30 18:10


HAT是买的蓉海公司的，因为Eahy926细胞是杂交瘤，主要是抑制其转化。
作者: jkobn    时间: 2012-8-30 18:10


请教各位：你们的eahy926的细胞是从哪儿买的啊！楼上的战友能够提供线索，或者送或卖给俺一瓶吗？等着它做试验啊！
请战友们帮忙！
多谢！
作者: 大白菜    时间: 2012-8-30 18:11


我准备培养新生大鼠背根神经节的神经元细胞，但查的资料大多数是取的胚胎鼠请问各位大侠，为何不用新生鼠呢？是因为新生鼠的神经元已长出突起导致损伤吗？可否提供培养的步骤及注意事项？不胜感激！
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 18:13


正如楼主所言，培养大鼠背根神经节细胞确实很多人倾向于用胚胎鼠，主要原因是其更容易养活。但是也可以用新生大鼠的。另外也有很多人采用鸡胚，相对更容易操作，你可以查查看，相关文献不少。主要是看自己的试验平台如何，采用哪种更方便。

这里给提供出新生大鼠背根神经节神经细胞的分离和培养步骤，供参考：

取新生1 周的SD大鼠4 只, 无菌条件下取出背根神经节, 0. 25%的胰蛋白酶、0. 03%胶原酶消化法分散细胞, 加牛血清蛋白终止消化后, 以1 000 转/分离心5 分钟, 弃上清液, 沉淀加无血清PRM I21640 培养基后, 置于60mm 培养皿中60 分钟(37℃, 5% CO 2 的培养箱内) , 吸取未粘附部分, 细胞计数并调整细胞浓度至4 万个/m l。37℃ 5% CO 2 温箱内正常培养。
作者: 49888    时间: 2012-8-30 18:13


消化时间？--大致的
作者: viviwang1987    时间: 2012-8-30 18:13


消化时间一般37℃ 15～30 min。主要看经验，与组织多少及酶液体积大小都有关系。
作者: 3648755    时间: 2012-8-30 18:14


因为我们实验室简陋，没有解剖显微镜，请问在取材时，如何才能准确
找到呢？在肉眼下？
作者: 3648755    时间: 2012-8-30 18:14


请问培养这种细胞应用什么培养基？
用1周的新生鼠细胞的得率会不会低？
培养时不用包被底物吗？
作者: toy    时间: 2012-8-30 18:15



1)  用手术刀片刮去最表层软骨，削下软骨组织片，收集在PBS液体中，反复清洗除去软骨片表面的血液及误带的其他组织。
2)  将软骨组织片充分剪成1mm3以下的组织块，用PBS液清洗2次。
3)  软骨组织以0.25%胰酶在37℃水浴中轻微振荡消化1小时，PBS液清洗2次，然后加入0.3％原酶消化12小时，至软骨组织块基本消失，溶液变混浊。
4)  以1500r/min离心10min。收集细胞
5)  加入PBS清洗细胞。
6)  在细胞团中加入培养液体制成细胞混悬液，用200目铜网过滤，收集过滤液。
7)  计数细胞，调节细胞密度为1×105个/ml的 密度接种。
细胞接种：
1)  多聚赖氨酸包被培养瓶
l  PBS稀释多聚赖氨酸成0.05mg/ml，湿润培养瓶生长面，37℃下静置4小时。
l  倾去赖氨酸，以消毒3蒸水洗涤器皿数次。
l  接种细胞前，用培养液洗涤器皿一次。
2）打开培养瓶盖，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。
3）直接加盖封口，在培养箱中培养4小时。
4）待细胞黏附牢靠后再补加足量的培养液（培养液液面高度2-5mm）养液中含有10％胎牛血清、青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml，两性霉素B2.5ug/ml，谷氨酰氨2mmmol/L，1％维生素添加剂和维生素C50ug/ml, 放入37℃，5％CO2孵箱。每隔2-3d更换培养液。！
作者: vera+    时间: 2012-8-30 18:15


我已经养了9批人骨关节炎软骨细胞了，发现你的这个漏洞很多，我先来补几个。
1.PBS中应含有双抗液，浸泡超过10分钟。
2.胰酶消化后要用血清中和，这样才不会在以后的消化过程中损伤细胞。
3.要先过滤再收集细胞.
4.需要包被吗？！用进口的塑料瓶就行了。
作者: KGZ564    时间: 2012-8-30 18:16


我购买了SIGMA的5-AZA，说明书说该药在水中不稳定，我要用于细胞培养时的药物干预，24小时和72小时，我该如何配置该药，以及操作时如何保持药物溶液无菌，是否可以进行过滤，还有就是该药是否可以事先配置分装，请问其储存条件，谢谢 springpcy@yahoo.com.cn
作者: nn255    时间: 2012-8-30 18:16


你可以配成50mg/ml的浓度溶解在DMSO里或者0.25mg/ml溶解在水溶液里。最好是前者，这样stock 浓度大，做实验加药方便。不需要过滤，因为DMSO会溶解常用的滤膜，不用担心菌污染，没有什么细菌能在DMSO里生长，配制的时候在超净台里配制就可以了。这个东西不是很稳定，最好现用现配，用之前几个小时配，配好后放在冰上。如果实在要配储存液，最好分装储存在－80度。但不宜配制过多，一个月之内用完比较好。
作者: 轰轰    时间: 2012-8-30 18:17


我是做生殖免疫的，需要对小鼠的子宫内膜细胞进行培养，而这方面的资料很少，希望大家慷慨解囊，告知具体步骤，主要是细胞的采集，以及鉴定。
先谢谢大家。
作者: is2011    时间: 2012-8-30 18:17


小鼠子宫内膜细胞的培养和处理：

取受精后第4 d 的孕子宫,纵向剖开,用手术刀片小心刮取子宫内膜, 而后用0.5 %胰酶-0.2 %EDTA ,37 ℃消化30 min ,制成细胞混悬液,将细胞加入放有盖玻片的24 孔板(预先用0.1 %多聚赖氨酸处理24 h) ,每孔细胞浓度为2～3 ×105/ 孔。培养基为1∶1 F12/ DMEM含有10 %胎牛血清,培养24 h 后换液, 以后隔天换液。
作者: whitesheep    时间: 2012-8-30 18:18


在相关文献上看到过某种培养盒，可以调节盒内氧、二氧化碳和氮气浓度，然后放入一般培养箱培养的，小弟现制作细胞的缺氧模型，急需这个培养盒，可不知道哪里有，具体名称叫什么，有哪位达人知道能告诉一下吗？不胜感谢！
作者: kuaizige    时间: 2012-8-30 18:18


不知道你是否已经找到.长沙长锦科技有限公司有这种的.
产品名就叫培养盒,有两种规格.Ⅰ型: 1300 ml,价格:100,Ⅱ型: 2300 ml价格:120.密封的培养盒可充装任何混配气，再装入普通培养箱内，相当于一个“微型培养箱”。可耐120℃ 温度消毒。
作者: 2541    时间: 2012-8-30 18:18


多谢啊，我准备了梅里埃公司的厌氧培养盒，不过你提供的东西却是是最符合我需要的，我会长沙联系的，多谢多谢！
作者: 831226    时间: 2012-8-30 18:19


请教各位:我要培养眼角膜上皮细胞及基质细胞，初次接触，不知该怎么准备，如何培养，应该注意些什么问题，希望了解的详细一些，谢谢各位。
作者: cocacola    时间: 2012-8-30 18:19

我培养了兔角膜基质细胞，不知对你能否有帮助，具体方法如下：
1、原代培养
采用新西兰白色家兔，雌雄不限。兔采用耳缘静脉注入空气处死。0.5%庆大霉素冲洗结膜囊，无菌条件下摘出眼球，PBS液冲洗2-3遍后放入双抗溶液(青霉素10万单位/L，链霉素10万单位/L)中浸泡30~45 min。在超净工作台内用眼科剪沿角膜缘取下完整角膜（一定不能含有角巩膜缘），PBS液冲洗2遍，体式显微镜下撕掉上皮层、前基质层、后弹力层及内皮层。将剩下的基质层剪碎成1mm×1mm大小的组织片，接种于预先用胎牛血清处理的玻璃培养瓶中，加入少量培养基使液体刚好浸没组织块周围而不浸没组织块表面,以确保组织块不滑动或漂浮。然后将培养瓶置于5％CO2、37℃饱和湿度恒温孵箱内培养。于第二天再添加培养基约2ml,以后每周换液两次。约7~10天可见角膜基质细胞从组织块边缘爬出，此时将角膜组织块转移到具有相同条件的另外的培养瓶中，继续培养1周即可见角膜基质细胞组织块边缘爬出。这样反复转移可重复3~4次，然后将角膜组织块丢弃。
2、传代培养
原代培养的细胞在显微镜下观察发现角膜基质细胞生长至大部分（约80%）汇合时，小心倒掉培养液，PBS液缓慢冲洗培养瓶两遍。然后加入0.1%胰蛋白酶消化，在显微镜下观察贴壁生长的细胞回缩变圆，迅速加入适量DMEM（含胎牛血清）终止消化，反复吹打，使细胞悬浮，离心，弃上清，制成细胞悬液，以血球计数板计数细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于培养瓶（每瓶约2～3ml）继续培养，每3～4天更换1次培养液，一般约7天长满融合，可按上述方法再进行传代。实验所用细胞为传1~2代细胞。
作者: 987789    时间: 2012-8-30 18:20


我想楼上的战友肯定有许多关于角膜基质细胞或角膜干细胞培养的资料吧！能否不吝传给我一些（主要是国外的），行吗？在此先谢过！
作者: sunnyB    时间: 2012-8-30 18:20


我刚做辣椒细胞培养，不知用多大的孔径过滤？请指教
作者: dotaaa    时间: 2012-8-30 18:21

不同的植物细胞的大小差异较大,直径一般为20-100μm,也有更大的,如西红柿、西瓜的果肉细胞，可达1mm.辣椒细胞应该在20-100μm范围之内,你可以测一下直径.再参考下面这个表来确定所用孔径大小.
作者: fklo83    时间: 2012-8-30 18:24

【求助】是何污染？有何对策？急!!!!

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是你的焦距不清楚还是什么原因，我看不清那些黑点。但告诉你一个让你高兴的消息，如果你怎么也调不清楚这些黑点的焦距，而且培养液没有变黄，没有浑浊，那么污染的可能不是你的细胞，而是你的显微镜——镜片之间可能有脏东西，如果换个物镜黑点消失，可能是在物镜上。

我的一台倒置显微镜也有同样的问题，有一个物镜下看到的景象和你照片上的一样：）

不知说的对错，希望能抛砖引玉。
作者: HPLC使者    时间: 2012-8-30 18:25

本人打算用流式细胞仪检测肝癌细胞的端粒长度，我现在正做动物实验，模型已经做出。因流式细胞检测要求检测对象必须是单细胞悬液，因此我想请教有哪些方法可以实现实体组织向单细胞悬液的转换，转换的过程中都有哪些需要注意的事项？
作者: 33号    时间: 2012-8-30 18:25


如果你是要得到单细胞悬液的话，也就是说你要从组织块中得到细胞的话，你可以用酶消化法（胰酶、纤维蛋白酶）将组织块消化后离心2000g/15min，还可以用机械法，将组织用眼科剪和7号尖刀剪切成小碎片，然后过滤网由粗到细第三种方法就是将剂两种方法结合起来。酶消化法容易破坏细胞的表面标志而机械法容易损伤细胞。具体的你可以看一下司徒镇南编著的细胞培养
作者: 66小飞侠    时间: 2012-8-30 18:29


要做一个实验，需要检测样品血液中肝癌细胞含量：大致看了文献里的几种检测方法，Papanicolaou or Giemsa stains、台盼蓝染色（Typan blue exclusion method）、流式细胞仪（Flow Cytometer）、AFP mRNA RT-PCR等，刚刚开始接触这个，不是很懂，希望大侠们帮忙分析分析，哪些方法好呢？多谢拉
作者: 33号    时间: 2012-8-30 18:33

台盼蓝染色是作为细胞活力的检测它有特异性吗?流式细胞仪（Flow Cytometer)可以检测，你需要有特异的标记使用流式细胞仪你可以做一个细胞的检测如果你的机器很好的话还可以在计数的同时进行分选从而进行下一步操作；另外，你可以用免疫分选磁珠，这需要有磁性分选器和免疫分选磁珠，它能过分离得到你想要的细胞你可以计数或者上流式进行检测，但是价钱不菲你可以询问一下dynal公司。
作者: 66小飞侠    时间: 2012-8-30 18:34


谢谢！我现在准备先提取单个核细胞，然后做AFP mRNA RTPCR,做做看。
作者: mimili_901    时间: 2012-8-30 18:34


我一直在体外培养淋巴细胞，培养18～24h后，最好的时候其成活率也就是20～30％左右，因为后面要做RT-PCR扩增IL2，可细胞一直培养不好，我想可不可以在体内刺激，比如在鸡体内用新城疫疫苗免疫后，从2h～72h 采血后分离淋巴细胞，直接抽mRNA，然后做RT-PCR，不知道有人这样做过吗？这种方法可行吗？请各位指点！谢谢！
作者: junhun    时间: 2012-8-30 18:35


是人的嘛？如果是的话你要的是B还是别的？是B淋巴细胞的话你可以试试：
一、检查一下你的培养基PH，换一下培养基，可以用液体的或者不含血清的，有专门的淋巴细胞培养液。如果你没有分离的话因为B能过作为APC进行抗原提呈可能会作为靶细胞被CTL杀死。
二、试一下分离磁珠对你想要的细胞进行纯化。
三、加入淋巴细胞增殖刺激剂如植物血凝素、刀豆蛋白和单克隆抗体等效果会好一些；
四、用小瓶或者孔板（24、12孔等）培养扩增效果还可以
希望对你有用！
作者: 911    时间: 2012-8-30 18:35


有哪位高手知道关于干7AAD的具体知识，怎样才能买到
作者: ffooll    时间: 2012-8-30 18:37


7-Amino-actinomycin D (7-AAD),7-氨基放线菌素D，是一种核酸染料，在流式细胞术中用于鉴定死细胞，这种作用与PI相似。但它较PI有一定优点，就是PI检测时同时占据FL-2和FL-3两个通道，如果要进行比较复杂的多色分析时不太方便，而7-AAD只占FL-3通道，这样在像FACSCalibur这样的仪器上还可以同时使用另外三种荧光标记。

很多公司有卖，比如BD，eBioscience等，找它们的代理商就行了。
作者: moonlight45    时间: 2012-8-30 18:39


请问使用的是组织直接培养还是酶消化培养？是什么酶，消化时间大概是多少？培养基的血清浓度是25％还是10％？谢谢！
作者: 04906    时间: 2012-8-30 18:39


据我所知，目前国内做这方面研究的还不多。第三军医大学附属西南医院耳鼻咽喉科张学渊组是目前国内做的较多的了。
他们采用的是组织块培养法进行体外培养。

具体方法是：

豚鼠耳蜗血管纹组织块的分离与培养：

　　选取重约300 g 的封闭群豚鼠10 只,雌雄兼有,均耳廓反射灵敏,耳镜检查正常。以1 %戊巴比妥纳(40 mg/ kg) 腹腔注射麻醉,断头,迅速取出双侧听泡,用75 %酒精浸泡2 min ,无菌等渗盐水冲洗后浸入D2Hanks 液中。解剖显微镜下剪去听泡骨壁,钩破蜗尖,自顶回至基底回完整剥离出耳蜗外侧壁软组织带,并仔细分离出含深色色素的血管纹,将血管纹组织块切碎,均匀平铺于两个35 mm 的培养皿底(事先加有鼠尾胶原) ,静置30 min ,向培养皿中加入含有25 %胎牛血清(Hyclone) 的DMEM培养液( Hyclone , 另加L2谷氨酰胺0. 9 g/ L , Hepes 20mmol/ L ,青霉素100 U/ ml ,链霉素100μg/ ml) ,置5 % CO2 ,37 ℃培养箱中培养 。有细胞生长后,每3 d 更换约1/ 2 的培养液,10 d 后进行首次传代:吸掉全部培养液,用D2Hanks 液冲洗培养皿3 次,用0. 25 %胰蛋白酶(含0. 01 % EDTA) 消化液消化,常温下约5 min 大部分细胞开始脱壁,中止消化,取出组织块,将细胞悬液离心,弃去上清液后加培养液,台盼蓝染色并计数,细胞成活率约90 %。将未染色的细胞悬液接种于培养瓶中继续培养,细胞密度为(2～3) ×105/ ml 。

　培养细胞纯化：

　　在细胞传代时,当加入消化液后,显微镜下只要观察到约3/ 4 的细胞回缩近圆形时即中止消化(经需5 min) ,轻轻吹打后将细胞悬液种入空白培养瓶,而脱壁慢的1/ 4 的细胞则弃掉,即每次传代只保留脱壁较快的约3/ 4 的培养细胞,当细胞悬液接种后,当观察到约3/ 4 的细胞贴壁后(约18 min) ,即吸掉培养
瓶中的培养液,连同尚未贴壁的1/ 4 的细胞一起弃掉,重新加入培养液置CO2 孵箱中培养。传代后12 h ,培养细胞已完全伸展,在倒置显微镜下刮去已贴壁的可疑杂细胞。上述操作在前三代细胞传代时连续进行。
作者: owanaka    时间: 2012-8-30 18:40


我知道的有matrigel、胶原lattice，这些似乎都要用相差显微镜观察、定量
还有别的简便一些的么？
战友们都用什么方法检测的呀？
作者: zwsyrt    时间: 2012-8-30 18:40


我知道的有：体外二维血管生成（使用内皮细胞）实验，体外三维血管生成实验（使用大、小鼠胸主动脉环，或者用内皮细胞包被微载体后进行实验），另外，还能使用鸡胚尿囊膜血管生成实验来考察在体情况下影响血管生成的因素。
你说的matrigel、胶原lattice应该是用来考察内皮细胞的运动能力的吧。这只是血管生成的一个方面。
体外二维血管生成（使用内皮细胞）实验：采用内皮细胞，将内皮细胞铺在已经凝固的fibronogen、matrigel等胶质上，加上培养基培养一段时间。倘若有血管生成，则在几天后显微镜下能观察到条索状的新生血管，这时你可以计数新生的血管数，然后将这些数据进行统计分析结果即可。同时，检测血管生成的相关因子和酶类是很有必要的。可以检测：bFGF、VEGF、MMP-2、MMP-9等等。这取决于你的课题要求。
体外三维血管生成实验：1.是将动物处死后迅速剪取主动脉，在预冷的PBS中将动脉周围的组织分离干净，切成1MM厚的动脉环，植入装有Fibronogen的48孔板中，加Thrombin凝固即可。加入培养基培养一段时间。可以在2-7天的考察芽生细胞数，7天后即可观察有无新生的血管生成（镜下观察可见内皮细胞聚集成一条线状，有管腔的结构），同样也测相应的生长因子和酶类
2.将内皮细胞包被在Beads上，然后植入装有Fibronogen的48孔板中，加Thrombin凝固即可。加入培养基培养考察芽生细胞数、新生血管数、生长因子和酶类
关于鸡胚的实验就比较经典了，不多说。
血管生成实验做起来要求较高，不容易一次成功，所以一定要有耐性！！我所讲的也就是以大概，具体方法、方案你要自己去查。可以找Angiogenesis Protocol （Human Press出版）看。你要在南京可以到南京中医药大学海洋中心药理毒理研究室。我就是在那里做完血管生成的毕业论文的。
作者: loli    时间: 2012-8-30 18:41

各位师哥师姐们，你们好！我现在做大鼠的肺转移癌模型，但我一直每成功，原因在于：1）鼠的尾静脉很细，注射很困难，你们用的是几号针头，2）是不是一定会转到肺上？直接诸如混有肿瘤的培养液就可以吗？需不需要凝胶海绵之类的，我很着急，希望能得到你们的指点，非常感谢。我的邮箱是：yj_wxj@yahoo.com.cn
作者: qqq111    时间: 2012-8-30 18:41


肺转移模型有两种：1.尾静脉注射法，将细胞悬液通过尾静脉注射入体内。一般可以用4、5号针头注射。影响因素有：细胞悬液的浓度、注射后大鼠饲养的时间、选择的细胞株。建议使用高转移的黑色素瘤B16BL6细胞，它是肺高转移率的。至于转移灶的出现在什么时候，你需要自己摸索悬液浓度、注射用量、饲养时间的问题了。还有一个重要的问题就是，你必须看看种植的肿瘤细胞是那种鼠来源的。B16BL6细胞应该接种在B6黑色小鼠的身上，不能接在小白鼠或大鼠的身上。有条件可以使用裸鼠试验，这样就不要考虑这个问题了。2.皮下注射法，将细胞悬液注入四肢的腋下皮肤下，饲养一段时间取肺计数肺转移结节数。其余考虑的问题都一样。
有肺转移特性的转移性肿瘤细胞，只要种植、饲养时间控制好时一定能够转移到肺上的。不要着急，试验要慢慢摸索，慢慢做的。祝顺利。
作者: loli    时间: 2012-8-30 18:41


非常感谢。
刚开始我选用大鼠，但不可能，后又换用小鼠，我用小白鼠扎尾静脉很容易，但我换用小黑鼠，几乎扎不进去，我都没信心做下去了。扎小黑鼠有什么特殊的技巧？

特别需要你的帮助，非常非常感谢。
看到你的帖子，心情突然很舒畅。还想请教：谈谈你的宝贵经验，我已经徘徊了一个多月了，实验没法进行下去。
作者: loli    时间: 2012-8-30 18:42


看到你的帖子，心里突然很舒畅。
我已经徘徊了一个多月了，刚开始我选用大鼠，但大鼠不可能，后来换用小鼠，小白鼠我可以扎进去，但小黑鼠尾经脉很难看清，我根本扎不进去，很长时间了，我的实验停滞不前，我都没信心做下去了。

还想请你谈谈你的宝贵经验，我已经浪费很长时间了，不能再耽搁了，非常非常感谢。
作者: 小螺号    时间: 2012-8-30 18:43

小鼠尾静脉注射确实比较困难，需要不断的实验积累。建议你还是先用小白鼠找感觉，打顺了以后再换黑鼠。药理实验没有捷径可走，只有依靠自己不断的动手实践以积累经验，慢慢练吧：）有一个“偏方”：实在不行，可以从眼眶静脉丛注射，但这有可能影响到你的实验结果。你还是好好练习才是！
作者: loli    时间: 2012-8-30 18:43

非常感谢你的指点，还想请教一下，你观察到的肺的病灶有多大啊，仅仅是通过病理证实的么，谢谢。我只能在显微镜下看到微小病灶，或是肉眼看到坏死组织，根本看不到瘤结节啊
作者: Ao7    时间: 2012-8-30 18:44


我最近准备做细胞试验，想向大家求教：
想知道原代提取的osteoblast和osteoblast的细胞系MC3T3-E1两种细胞之间在性质上有没有较大的差异。
谢谢了
作者: ladyhuahua    时间: 2012-8-30 18:45


肯定是有差别的，MC3T3-E1细胞系是一个传了50代以上的细胞，性质稳定，但丧失了一些表型，如碱性磷酸酶含量，原代成骨细胞表型突出，符合模拟实验要求，但性质不稳，细胞大小不一，重复实验结果差异性大。祝实验顺利！！！
作者: orangecake    时间: 2012-8-30 18:46

请教大侠，环氧合酶（COX）的活性一般用什么方法检测？
检测的花费如何？
作者: ladyhuahua    时间: 2012-8-30 18:46


一般用酶谱活性分析法，费用在900元左右。祝实验顺利！
作者: kuaizige    时间: 2012-8-30 18:47


我是一名新手，要作课题了。
请问鼠源性的目的基因能否转入人源性细胞（如JURKAT，293T）检测其对某些细胞因子的影响？该鼠源性的目的基因与人源的同源性达80%多。
谢谢前辈指点！
作者: 2541    时间: 2012-8-30 18:47


应该可以的。我研究生的课题是将人源性的基因（RAGE）转入到了大鼠的胸主动脉中去的。检测的指标是与这一基因相关的因子（bFGF、VEGF、MMP-2、MMP-9）。先是将人的RAGE基因构建入质粒，然后获得阳性质粒再将它扩增，然后将基因转入腺病毒的基因组内，转染293细胞，体外扩增获得阳性克隆，然后大量扩增阳性克隆，裂解细胞收集包装好的腺病毒，最后用这种腺病毒去感染你的目的细胞或组织就可以了。我想你的问题也应该可以这样解决。
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-8-30 18:48


大家好，我急需结肠癌低转移细胞株，但只查到一种HT-29P,不知其特性怎样，在那能够买到？如能提供其他更好的细胞株将不胜感激。
作者: qhyu    时间: 2012-8-30 18:49


我给你提供一个地方吧。南京中医药大学药理毒理研究室。025-86798154，找王老师就行。目前，该研究室拥有的与结肠相关的肿瘤细胞有：HCT-8 人结肠癌细胞、caco-2 人结肠腺癌细胞、Ls-174-T 人结肠腺癌细胞、LoVo 人结肠腺癌。还有很多肿瘤细胞株。你可以登陆他们的网站查阅：cuturl('http://ocean.njutcm.edu.cn/hyyl/res_2.as0p')。希望有用！
作者: IAM007    时间: 2012-8-30 18:50

请问哪里的测NOS活力的试剂盒好？
试验需要，急啊！ 请帮帮忙！
作者: BOSS2011    时间: 2012-8-30 18:50

NOS试剂盒国内：南京建成生物即有，若要用国外的试剂盒：R&D Systems
公司有售，国内晶美公司代理R&D Systems产品
作者: 我佛慈悲    时间: 2012-8-30 18:50


我们常用南京建成的试剂盒，我认为其质量还可以，但是敏感度似乎不够。无论选用国内还是国外的生化类试剂盒，我认为关键的是熟悉操作步骤，对每个标本的操作手法一致。
作者: XYZQ    时间: 2012-8-30 18:51

各位老师、同学们：
您们好！ 我是北京某医院的一名临床型的研究生，想测定血小板中内皮型一氧化氮合酶（eNOS)和诱导型一氧化氮合酶（iNOS)的活性，国内外的文献中均利用同位素3H (氚)来标记底物L-精氨酸，最后通过液闪仪测定中间产物3H-L-胍氨酸的量来反映酶的活性。 在此实验中需要用到同位素、液闪仪、10000转/分以上的低温高速离心机， 而我们医院实验室没有液闪仪，而且也不能使用 3H, 故试验无法进行。目前也有测上述两种酶的试剂盒，但都是测定血清和组织中的酶活性的，据本人片面了解还没有直接测定血小板中这两种酶活性的。 目前我正面临毕业，因此十分着急， 特向各位老师同学们求助，看哪里具备上述实验条件,并允许外单位人员进行试验，或者能直接帮我测定更好，有能测定血小板中此两种酶活性的试剂盒也可， 价钱可以商定， 真诚期待您们的答复。
作者: junjie05    时间: 2012-8-30 18:51

可以提取处理后细胞的胞浆蛋白，用Western Blot检查NOS的活性
作者: junhun    时间: 2012-8-30 18:51


Western检测的不是活性吧？
作者: any333    时间: 2012-8-30 18:52



我养的PC12细胞用来做分化前和分化后加入同种物质的比较实验，可每次买过来的细胞养不了多长时间原来是圆形的就长突了，使得分化前后形状不是太明显，请问怎样才能使不该分化的细胞维持圆形。谢谢！
作者: jrwyyplt    时间: 2012-8-30 18:52


PC12细胞本来就容易分化,需要养一段时间就换新的一批.所以买回来新的细胞传代后可以先冻存一部分,这样的话当细胞开始分化时还可以用原来冻的细胞.其实养细胞也没有什么,用15%的小牛血清,1640培养基就可以做到.
作者: zhezhe    时间: 2012-8-30 18:53


你要用马血清，牛血清会促进分化，而马血清会封闭牛血清作用的位点，从而保持细胞的未分化的状态。我用的是DMEM,10%HS,5%FBS。
作者: kuaizige    时间: 2012-8-30 18:54


要用马血清养才可以
作者: join    时间: 2012-8-30 18:54


PC12细胞培养：10%HS,5%FBS，1640培养基（DMEM也可以，但是长的比较快）
作者: 131415    时间: 2012-8-30 18:55


我养的胰岛细胞用RPMI1640培养5天后做葡萄糖刺激试验,低糖高糖刺激无结果.考虑是培养基含糖长期刺激胰岛细胞,细胞内胰岛素颗粒耗竭的原因.请问谁养过胰岛细胞,作过刺激试验,指导一下.谢谢
我养的是新生猪胰岛细胞,用RPMI1640培养5天后用PBS洗涤细胞三次后,分成两组,分别用含低糖2.7mmol/L,高糖16.7mmol/L的D-HANKS液培养4小时后收集上清液测胰岛素,结果低糖高糖刺激结果无差别.
作者: join    时间: 2012-8-30 18:55


我没有做过，但是我听说有无糖的培养基，我觉得你是不是可以先用无糖培养基培养，做实验的时候，换成不同糖浓度的培养基刺激。
作者: duoduo    时间: 2012-8-30 18:55


4h吗？我觉得时间不够啊，细胞要释放因子到能检测的程度，怎么也得24h吧。
作者: milkdog    时间: 2012-8-30 18:56


我在做原代皮质神经元培养的时候，取材做的挺好的，皮层组织收获的挺多的，但是在用胰酶消化以后，又加一部分胰酶抑制剂后再次离心，大部分组织都沉下去了（大块的），所以收获的上清里细胞数很少，做了好几次了都是这样，不知哪步弄的不合适，请战友们帮忙分析一下。不过接种以后细胞长的还可以，就是太少了，郁闷。
作者: ququer787    时间: 2012-8-30 18:56


胰酶消化以后,加血清中止，用吸管轻轻吹打，过200目筛，然后收集滤液离心，细胞应要离心后的沉淀，而不是上清。
作者: jkobn    时间: 2012-8-30 18:57


我也做过很多次尝试，总的经验总结如下：
1。枪头口径用剪刀剪大，约往上5mm处，快速过火抛光，对细胞损伤小。
2。万不得已不要离心和使用筛网，都对细胞有损伤。
3。消化最多两次，时间短些，组织松散即可。
4。消化后的组织用抛光枪头轻轻吹打，在离心管中静置5min，吸上清至另一离心管（少吸点以防小组织块），再次静置10min，留下1ml左右，其他吸走，计数。
5。按照4所说办法得到的细胞成活率很高
6。建议在后期使用专门的神经元培养基，再加因子培养（B27/N2），舍不得孩子套不到狼。
作者: jkobn    时间: 2012-8-30 18:57


再补充一下：
1。解剖胎鼠时要用含有糖的解剖液冰上操作，不要只用D-HANKS。
2。皮层取下后，稍加机械破碎即可，不要太碎，否则会有小组织块。
作者: 9900    时间: 2012-8-30 18:57


对于楼上的回答，我想补充一点：
我觉得在吹打组织块的时候，可以用吸管套一个乳胶头，作为吹打的工具，比较容易控制。
：）
作者: plaa    时间: 2012-8-30 18:58


我补充一下：
楼主所言大部分组织都沉下去了（大块的），所以收获的上清里细胞数很少，可能是神经元比较娇嫩，吹打太狠容易损伤细胞，细胞消化后不敢吹打所至。
所以取神经元时尽量要用剪刀把所获取的组织剪碎；胰酶消化大约十分钟（根据胰酶活性而定，有时不用那么久），用口径小的巴斯德管吹打分散细胞。当然吹打不能太狠，后用100目或200目筛网过滤，1500转离心3－5分钟，收集沉淀，用培养基约2ml吹打分散沉淀后，调至所需浓度，转移到培养瓶或培养板中培养即可。
作者: taoshengyijiu    时间: 2012-8-30 18:58


我养的胰岛细胞用RPMI1640培养5天后做葡萄糖刺激试验,低糖高糖刺激无结果.考虑是培养基含糖长期刺激胰岛细胞,细胞内胰岛素颗粒耗竭的原因.请问谁养过胰岛细胞,作过刺激试验,指导一下.谢谢
我养的是新生猪胰岛细胞,用RPMI1640培养5天后用PBS洗涤细胞三次后,分成两组,分别用含低糖2.7mmol/L,高糖16.7mmol/L的D-HANKS液培养4小时后收集上清液测胰岛素,结果低糖高糖刺激结果无差别.
作者: langlang    时间: 2012-8-30 18:59


我没有做过，但是我听说有无糖的培养基，我觉得你是不是可以先用无糖培养基培养，做实验的时候，换成不同糖浓度的培养基刺激。
作者: caihong    时间: 2012-8-30 18:59


请问用血清或者肾组织匀浆测定超氧化物歧化酶两者的值会相同吗？两者的意义？请问兔SOD的正常值，谢！
作者: yueban-1147    时间: 2012-8-30 18:59


首先，肯定地说，两者的值有可能一样，也可能不一样。你如果觉得这是废话，那就是我误解你的意思了，不过我真的不清楚你到底想问什么。理由：1）不同组织的检测结果所得到的检测值可能一样，也可能不一样，多数情况下不一样的发生率比较多；2）即使同一组织，其测定结果也经常不一样的。
我曾经做过狗的血清SOD的检测，结果组内值的偏差很大，以至于组间比较都没有得到统计学意义。您想想得到的值能相同吗。

SOD意义：SOD全名是超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase），SOD是广泛存在于生物体内的一种金属酶，它的量的多少可以反应该组织对超氧化物和自由基的清除能力。
有些报导吹的比较悬：“SOD主要功能是“一清四抗”，即清除体内多余的自由基，“四抗”为抗肿瘤，抗疲劳，抗病及抗衰老”； “超氧化物歧化酶（SOD）是机体超氧自由基的清除剂，广泛分布于细胞内和各种体液中，超氧自由基是由于氧代谢过程接收电子不足而形成的，对机体有毒性，与肿瘤、辐射、损伤、衰老，炎症等有重要关系，SOD能阻止并消除自由基的连锁反应，使机体免受损害。” 呵呵，这些都是SOD的意义。
至于你检测这个指标，应该有你自己想要的意义。

我没有找到兔的SOD的正常值，很遗憾。不过我估计即使找到相关的报导也没有多少参考价值。在实际的试验过程中，必须设置对照组以进行比较和统计分析，报导的正常值不能用来做科学试验的分析依据的，因为我们现在做的试验都是很小样本量的抽样调查，不能用来和正常值比较，况且做多少只兔子得到的值能算作正常值呢？1万只？10万只？或者更多几只？有谁会来做这个工作呢？意义会有多大呢？很难说。所以，即使有报导的正常值，也只能用来作为一个讨论内容的参考。
不知道是否回答你的问题。
作者: pencil菲    时间: 2012-8-30 19:00


请问哪位高手原代培养胃黏膜上皮细胞,能否告诉我胃黏膜上皮细胞的原代培养要注意些什么事情,比如培养基的选择,培养基的PH值,酶的选择及配制等等,谢谢您!
作者: baidukk    时间: 2012-8-30 19:00


准备养细胞，现在还不知道无血清培养液的配法。希望大家帮忙
作者: ritou1985    时间: 2012-8-30 19:01


人胚肺成纤维细胞取多少月龄的胎儿?文献上有3个月或4个月的.
如果再大月份的可以吗?老板说如果太大(如接近生产的)月份的就不能称胚胎肺成纤维细胞了.有没有限定如多少月的以下的?
另外成人肺成纤维细胞与胚胎肺成纤维细胞有什么区别吗?有谁培养过成人肺成纤维细胞?
在下先谢谢各位xdjm.
作者: orangecake    时间: 2012-8-30 19:01


我培养的McCoy细胞定期收集，可是一直找不到适合24/48孔板细胞的细胞铲，没办法我只能用采标本的棉拭子收，据说拭子对细胞有损伤，请教各位有过这方面经验的给予指点，谢谢了！
作者: 小鱼鱼    时间: 2012-8-30 19:02


准备买一套切向流超滤系统,但不知道pall和millipore哪家的好,请问谁用过,给一点意见,谢谢
作者: zzzz    时间: 2012-8-30 19:02



大鼠脑微血管内皮细胞原代培养时一次需要几只大鼠，鼠龄要多大的？
作者: 铜雀    时间: 2012-8-30 19:02

一次性塑料瓶35mm的装一只
作者: avi317    时间: 2012-8-30 19:03


T细胞原代培养时贴壁吗？在显微镜下是什么形态？
作者: tieshazhang    时间: 2012-8-30 19:03


我用荧光蛋白标记细胞内线粒体，但是需要除去细胞表面吸附的荧光蛋白
一般用什么buffer洗好？据说是蛋白酶k，或者KAc什么的。。。
土问这个buffer 的配方
作者: xyw5    时间: 2012-8-30 19:04


我现在正在做SD乳鼠的胃黏膜上皮细胞的原代培养,文献上有初始的种板密度(例如每个皿种多少个细胞),但我实际做的时候发现初消化好的细胞有单个的也有小的细胞团,单个细胞很难贴壁继续生长,反倒是细胞团贴壁后会在周围长出细胞来,不知文献上的种板密度是怎么数的?那位高人有这方面经验请指点一下,另外细胞种在96孔板里很容易长成融合的单层细胞,但细胞在24孔板里总是集中在边缘,不往中间长,不知有没有办法可以解决?
作者: 8princess8    时间: 2012-8-31 10:51

请问哪位使用过葡聚糖T-500?有没有具体的配制方法(粉剂配成工作液).最好是有图解说明的.这厢有礼了!
作者: zranqi_1    时间: 2012-8-31 10:52

请问上海哪里有卖柠檬酸氢二钠的，用于提RNA
作者: ha111    时间: 2012-8-31 10:53

各位好，
我准备做关于wsitar大鼠海马神经干细胞的分离和体外培养，请具有相关经验的朋友多多指教哟！
北泉花园
作者: 911    时间: 2012-8-31 10:53


我用EBV转化淋巴细胞，2周前细胞转化且成团，但后来发生成团的细胞解体，不分裂，转化后的细胞变得很大，请教高手是何原因？我前期用COA处理过T细胞。
作者: 911    时间: 2012-8-31 10:54


我最近培养结肠癌(HCT116)细胞和胃癌(SGC7901)细胞,请教各位高手,不知道这两种细胞的是否有CEA高表达!多谢!
作者: utt0989    时间: 2012-8-31 10:54


我最近培养结肠癌(HCT116)细胞和胃癌(SGC7901)细胞,请教各位高手,不知道这两种细胞的是否有CEA高表达!多谢!
作者: one    时间: 2012-8-31 10:54


我最近用含10%FBS的DMEM（GIBCO）复苏B95a细胞，18小时后发现很多细胞贴壁后都是圆形，且似乎贴附不牢，我想请教养过B95a细胞的大虾，B95a细胞贴壁后是什么形态？
作者: bluelake    时间: 2012-8-31 10:55

我也在做这个细胞的培养，细胞在培养过程中是梭形和圆形两种的，如果细胞长得很密的时后，可以看到部分细胞悬浮状态。这个细胞株是EB病毒转化的，所以它会向细胞上清中分泌病毒，所以操作时一定要小心啊，应该在P2实验室里做啊。下面是我所照的一幅照片，

图片附件: 25076821.jpg (2012-8-31 10:55, 60.22 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13515

作者: IAM007    时间: 2012-8-31 10:55

请问，养B95a时，你用的是什么培养基？
作者: mimili_901    时间: 2012-8-31 10:56

我因实验需要,急需人肾的末端肾小管细胞系,不知道哪里有,知道的请告知,不胜感谢!
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-31 10:57


请问各位同志有谁做过细胞的普鲁士蓝反应试验吗？
我看过的文献里大多数是关于组织的，我只在一篇外文文献中见过，但是没有详细的方法，不知道细胞和组织的试验方法会不会有很大差别，希望能得到高手的指点，万分感谢！
作者: 吴才子    时间: 2012-8-31 10:58


我做的课题是研究枯否细胞抑制剂对其释放细胞因子的抑制作用，请问有什么更加特异性的指标能说明枯否细胞的活性被抑制了吗？比如电镜下其活性抑制后会有什么特异性改变？请各位赐教，急~ 谢谢！！！
作者: TAT    时间: 2012-8-31 10:59


想用神经酰胺诱导PC12细胞凋亡，请问有没有做过这方面实验的高手？如何溶解神经酰胺，我是从sigma买的，C2－ceramide。谢谢！
作者: junhun    时间: 2012-8-31 11:00

标记率是阳性率么？平均荧光蛋白强度做什么用？标本间怎样比较

图片附件: 43699048.snap.jpg (2012-8-31 11:00, 46.44 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13516

作者: IAM007    时间: 2012-8-31 11:01

有没有人用无血清培养基培养过肾小球系膜细胞？因为我要检测肾小球系膜细胞培养液中的纤维连接蛋白的含量，要用到ELISA试剂盒，但这个试剂盒的说明书中要求在培养基中不能含有血清，因此我必须要用无血清培养基进行培养，但不知道关于肾小球细胞细胞的无血清培养基的配方是什么？如果有人用过希望多多请教。
作者: glass    时间: 2012-8-31 11:02     标题: 回复 #237 IAM007 的帖子

呵呵！楼主有点误解！
ELISA要求只是在培养基中不能含有血清，并不是要求一直要用无血清的培养基培养。无血清的培养基培养细胞的话效果会很差的！我们以前做ELISA的时候平时就用普通的加了血清的培养基培养，一直要到最后要做实验的时候最后一次换液，用PBS洗干净，再用不加血清的培养基，这样就可以了！
肾小球系膜细胞我们培养的时候就用1640培养基加10％的胎牛血清！没什么特殊的！希望楼主实验成功！
作者: 66+77    时间: 2012-8-31 11:03


最近需要EC109，哪位正在养可以交换啊，我这儿有大鼠的成骨细胞MC3T3－E1、兔和人的平滑肌细胞SMCs、人的脐静脉微血管内皮细胞。
最好在北京，这样方便一点：）
作者: hyuu    时间: 2012-8-31 11:03

请教各路大侠:
请问有哪个朋友知道从哪里可以购买到黑素标准品?
谢谢!
作者: am10    时间: 2012-8-31 11:04


我是用 共聚焦做的FRET，标记的荧光蛋白是CFP－YFP，因为是活体内成像所以不打算用acceptor photobleaching 的方法，想用sensitized emission的方法测。因为是在蓝藻中做所以细胞的自身荧光（autofluorescence)非常强，利用资料上的校正方法,扣除自身荧光后双标细胞的信号基本没有，该怎么办啊？好急啊，请大家帮帮我！除了共聚焦外还有其他适合的测量方法吗？酶标仪可以吗？谢谢啊！！
作者: vera+    时间: 2012-8-31 11:05


请各位老师指点
水稻愈伤组织在什么时期适合做电镜切片观察细胞器？叶绿体能观察到吗？
作者: gmjghh    时间: 2012-8-31 11:05


听说肿瘤细胞都有很强的吞噬作用，请问k562细胞是否有吞噬作用？有资料证实吗？急！谢谢！
作者: caihong    时间: 2012-8-31 11:38


我有个人源蛋白想要做TAP实验,究竟应该怎样选择细胞系呢,它没有组织特异性 在不同组织的含量不一样 其中胸腺含量最高.我是应该选择内源表达高的组织细胞系呢,还是较低的或者很少表达的组织细胞系，要是选择内源表达高的，那么怎么判断转染的真核载体有表达呢？？
作者: xingyi08    时间: 2012-8-31 11:38

各位大侠:
如果你了解或做过犬细小病毒的MDCK培养,可否为在下指点迷津.提供一些资料和图片,不胜感激!!!
作者: zzzz    时间: 2012-8-31 11:39

求助：

有哪位大侠知道知道怎样分离Hantavirus RNPs或 intact virions又不用密度梯度离心的，麻烦告诉小弟一下，或者其它病毒也可以参考一下，谢过先！！
作者: 园丁##    时间: 2012-8-31 11:48


It was difficult to obtain a large quantity of intact virions by routine sucrose gradient centrifugation. After modifying the sucrose gradient by adding citrate sodium, you can obtain a large quantity of intact virions and nucleocapsids.

please read this reference:
一种改良的对虾白斑综合征病毒的提纯技术
【刊名】 中国病毒学, 2003年 04期

wish it be helpful!
作者: hot_hot_hot    时间: 2012-8-31 11:50


请问有人做细胞机械牵张实验的吗？牵张装置在哪买，国外有家公司flexcell在国内的代理商有谁知道联系方式吗?
作者: c86v    时间: 2012-8-31 11:50


我现在想做一下PMN趋化试验，想知道他的具体做法，请有做过的同仁帮一把！
作者: mickeylin    时间: 2012-8-31 11:51


我特别想知道怎样对玉米幼胚愈伤进行悬浮培养得到悬浮细胞体系。这一过程中需要哪些仪器设备，悬浮培养用什么培养基，培养条件是什么，多长时间继代，怎样去除培养过程中的死细胞和细胞碎片，收获时细胞浓度应到多少，怎样计算细胞浓度？这些问题都要向各位请教。
盼望回复！！Expecting your reply!!
作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-31 11:52


My dear friends,good evening , I am deadly need the basic knowledge of the bony structure of rats,if you would like to give me a hand ,i say thanks here firstly and email me pl. , and my mailbox is serpent65_2@hotmail.com
best wishes .
silly bulb from hlj
作者: kswl870    时间: 2012-8-31 11:52


请问哪里可以购得适用于鸡脂肪细胞培养的甲状腺素或三碘甲腺原氨酸？是否可用人或其他哺乳类的？谢谢！
作者: tangxin_80    时间: 2012-8-31 11:54


我是做细胞诱导分化试验的，哪位高人能给我提供一下关于B-巯基乙醇和全反式维甲酸的诱导分化机理，如果有新的进展那就更好了，在下将不胜感激，谢谢！！
作者: HPLC使者    时间: 2012-8-31 11:54

大虾好,老板要求我做一些淋巴细胞的培养,包括PBMC,脾脏淋巴细胞,小肠黏膜IEL.LPL等,我原来做过这些细胞的提取,感觉细胞出来已经状态很差了,我准备培养48小时,请教各位此细胞培养要做的一些实验准备和注意的事项.我原来养过滑膜细胞 ,很好养,现在的没有谱,急候回音!
作者: TNT    时间: 2012-8-31 12:15



QUOTE:
原帖由 HPLC使者 于 2012-8-31 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
大虾好,老板要求我做一些淋巴细胞的培养,包括PBMC,脾脏淋巴细胞,小肠黏膜IEL.LPL等,我原来做过这些细胞的提取,感觉细胞出来已经状态很差了,我准备培养48小时,请教各位此细胞培养要做的一些实验准备和注意的事项.我原 ...

外周血淋巴细胞短期培养失败的常见原因：
1.水质不合格，必须使用三蒸水
2.玻璃器皿，不能有酸残留
3.植物血凝素PHA失效
4.血清质量不佳
5.PH过高或过低，或培养过程中瓶塞不紧，导致CO2逸出，导致PH上升。
6.细菌污染，尤其在夏季是常见的失败原因；如不太严重，在72h收获时仍可得到一定数量的有丝分裂相细胞。
7.接种的细胞数目过少，或过多。
8.个体功能状况不佳：在相同条件下，某一受试者的血培养不成功，而对照实验培养结果正常，其原因有时无法查出。

希望对你还有用。
作者: misswu61    时间: 2012-8-31 12:17

【求助】急！我现在要培养杂交瘤细胞，但是不知道用高糖的还是低糖的DMEM培养基，请大家帮帮忙。谢谢！！

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我在文献上看到是用低糖的MEM培养基，如果你用DMEM的话，因为DMEM和MEM成分区别并不是糖的多少，二者都不含糖，所以建议你还是用低糖的DMEM。
作者: lagua123    时间: 2012-8-31 12:20


原代培养的细胞如何保持活性，有关键点吗，有谁知道？谢谢！
作者: star#room    时间: 2012-8-31 12:20     标题: 回复 #257 lagua123 的帖子

试着回答；
1.细胞接种密度。原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的相互影响还时存在的，而且这种相互影响对细胞能否存活时非常重要的，因为在这些细胞之间能产生出一些促生长的活性物质，使细胞彼此之间相互促进存活和生长。
如果接种密度过低，这种促生长作用很小，虽然营养物质充足，也很难使细胞适应独立的生存环境。
如果接种密度过高，这种作用很大，会导致营养物质供应不足，代谢废物积累较快要经常换液和传代。
2.对于贴壁依赖型细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是保持细胞活性的关键。
3.注意是否有细菌、真菌污染，一旦发现要及时清除，否则影响细胞生长。
4.随着培养的进程，要注意换液和传代。一般细胞2－3天换液一次，生长融合达到80％以后就要进行传代了。
欢迎讨论
作者: 49888    时间: 2012-8-31 12:21


哈哈，这关键要看是什么细胞了。
一般主要营养、密度，注意无菌操作就可以了。
另外取材要尽量避免细胞受损。
作者: bohe221    时间: 2012-8-31 12:22


如何建立高糖诱导HUVEC凋亡的模型？葡萄糖浓度还有作用时间是多长?
另外，就是建立模型时血清还有ECGs的浓度应该多大？
我尝试了很多方法，模型都没有成功，郁闷中。时间不多，请做过这方面实验的高手指导一下。
谢谢！！！
作者: xevin    时间: 2012-8-31 12:23     标题: 回复 #260 bohe221 的帖子

我早期实验中曾经使用过ecv304细胞，但是现在都否定了ecv304 是内皮细胞来源，所以首先如果您也想用ecv304，快快放弃；我阅读了大量这方面的文献，有以下几点：
1 一般诱导凋亡的浓度从15-40mmol/L,但是我认为如果研究内皮细胞凋亡在糖尿病血管病生理中的作用， 请不要用过高的浓度，因为这并不符合和模拟体内的情况，同时渗透压的改变就不能忽视；
2 诱导时间从24-96H均有；
3 我做细胞试验时，我掌握的原则是如果只是继代培养用于扩增，我会选择添加10-20% 的血清，但是在进行试验时，我会降低血清的浓度，维持细胞生存即可，目的是减少血清中各复杂成分的影响。
作者: u234    时间: 2012-8-31 12:23


有人做成功过的：
1.对培养的细胞鉴定为HUVEC的情况下，再将生长良好的内皮细胞以
2.5×105/ml接种于6孔板，2ml/孔，待细胞形成单层近融合后，换以细胞维持培养液24h。然后将培养细胞分为2组，一组为高糖组，加入33.3mmol/L葡萄糖，每组设5～6平行孔，培养72h后，就可以进行凋亡定量检测了。另一组为对照组加入葡萄糖5.5mmol/L。
2.建模型时所需的血清和ECGs的浓度应该是仍然维持原培养HUVEC的培养条件，看你是具体采取什么培养方法了，有文献中提到是DMEM培养基89％，胎牛血清10％，100×双抗1％，所加内皮细胞生长因子（ECGF）浓度为
200ng/ml。
不知道是不是你所要的
欢迎讨论，仅供参考。
作者: u234    时间: 2012-8-31 12:24

EPC培养,急切需要EBM-2 (Clonetic),但是不知道哪里可以买到.希望各位前辈帮忙!!!

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一般国外文献上提到的内皮祖细胞（EPC)培养基EBM-2,其实都是添加了
singlequote（一些细胞因子、胎牛血清、抗生素）的，称EGM-2.所以直接买EGM-2也是可以的，不过EBM-2和EGM-2，以及配套的singlequote北京毕特博生物技术有限责任公司都有代理。
作者: dongdongqiang    时间: 2012-8-31 12:24


在设计一课题时,想明白一下可能的情况,请有此经验的朋友帮忙提出些意见,谢谢!
请问:在体外培养的细胞时,当加入配体作用于细胞时,其膜上或核上的受体表达水平一般是上调的,还是下调?或者是呈一作用的抛物线,先高后低?或是?
比如:维生素D作用于VD受体时,甲状腺激素作用于其受体时,CK作用于其CKR时?哪里可以看到这方面的知识?
作者: ending    时间: 2012-8-31 12:25

要看具体受体与配体的吧？
作者: dotaaa    时间: 2012-8-31 12:25



QUOTE:
原帖由 dongdongqiang 于 2012-8-31 12:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

在设计一课题时,想明白一下可能的情况,请有此经验的朋友帮忙提出些意见,谢谢!
请问:在体外培养的细胞时,当加入配体作用于细胞时,其膜上或核上的受体表达水平一般是上调的,还是下调?或者是呈一作用的抛物线,先高后低 ...


谈一下：
配体作用于受体时，一般说来要看细胞外面配体的浓度，也即配体能够作用于受体的强度，如果一般是浓度高的，作用时间长又是连续性的，那相应受体表达就会下调；相反，配体浓度较低，作用时间短，又是间断作用于配体的，那么相应受体表达水平就会上调。一个明显例子就是甲亢病人的T3 和T4水平是下调的。
你可以多看看生理、生化有关这方面的内容，我的印象中。
个人拙见，欢迎讨论。
作者: junjie05    时间: 2012-8-31 12:29


最近在翻译一片文章，是关于z纳米技术在细胞毒理学方面的应用的。
不知下句如何翻译，请高手帮帮忙：
Nanoelectromechanical systems(NEMs) oscillators are resonant frequency-based detection sensors that sense changes in an established resonant frequency based on t..he mass applied.These sensors can be used as a mass-based biosensor by applying capture antibodies albe to bind a specific organism to the oscillator.
作者: eric930    时间: 2012-8-31 12:38     标题: 回复 #267 junjie05 的帖子

在翻译之前，要明白几个比较不常用的词：
1、nanoelectromechanial“纳米机电仪器”一个美国人新造的名词，参见
cuturl('http://www.cpenet.org.cn/cpe_news/news_show1.asp?newsid=123')
2、 mass-based ：以数量为基础的，参见
cuturl('http://www.ndu.edu.tw/new/koei/upload/%AB%E1%B6%D4%AA%F8%C3@%AE%C4%C0%B3.htm')
所以，整句话翻译成：纳米机电仪器系统传感器是以共振频率为基础的探测仪，能根据其适用范围内的物体的已知共振频率来检测物体的内部变化。这些传感器是以数量为基础的，可以被用来捕获结合在特定有机体上的抗体。
仅供参考。
作者: 2541    时间: 2012-8-31 12:38

我们用的是Nikon 2000U,观察的时候400倍下就有标尺，想给细胞照片上画上标尺，那么，照片上的一厘米是不是对应者目镜里一厘米的标尺？急盼回复！望高手指教！
作者: ROSE李    时间: 2012-8-31 12:40     标题: 回复 #269 2541 的帖子

显微镜标尺有两种，一种是目镜标尺，一种是物镜标尺。可以单独使用，也可以一起使用，用于校准显微镜。
我们常用的是目镜标尺。它的一厘米要乘以物镜的倍数，如你所说，在400倍的时候，物镜为40倍，那么你就是要把一厘米扩大了40倍。换句话说，你看到标尺上一厘米，实际细胞的大小为1/40厘米了。可以理解把
如果使用的是物镜标尺，标尺上的刻度就是细胞的实际大小了
作者: shenkunjie    时间: 2012-8-31 12:41


马上做实验了，心肌细胞分离过程中由于受经费的限制不能用流式细胞术进行分选和收集，请教有没有更便宜的方法进行这一工作呢，具体操作是怎样的呢？同时在分离后怎样对其进行除菌呢？小弟在此谢过了！
作者: 101010    时间: 2012-8-31 12:41     标题: 回复 #271 shenkunjie 的帖子

分离后进行除菌？
好像很难，最多只是抑菌而已。
作者: 911    时间: 2012-8-31 12:42


你可以使用percoll，是pharmacia公司生产的用于心肌细胞的分离纯化，价格大概360元/100ml 可以用10－20次，一般心肌细胞使用40％ 、60％两个剃度分离，2500rpm*30min纯化效果不错，但是有一个问题就是细胞容易丢失。
作者: 8964357    时间: 2012-8-31 12:43

我想做一个基因在子宫内膜中的表达调节，我看有人用hela细胞做实验的时候说是子宫内膜细胞，我也想用。但我有点糊涂，子宫颈癌细胞和子宫内膜细胞有什么关系。请各位大虾帮忙，在下万分感激。

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关系大了，子宫内膜细胞分上皮和基质细胞两类，你到底想在哪里转基因啊？？？

hela细胞和子宫内膜细胞还是不一样的你可以用他来做些前期的预实验，但如果要说明问题最好还是用子宫内膜细胞。好象香港大学有子宫上皮细胞来源的细胞系。

实在不行你就自己分离培养
作者: 8964357    时间: 2012-8-31 12:43

要做3T3细胞细胞生长曲线，开始种多少细胞？可以数6－7天啊

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抱着学习讨论的目的，
NIH3T3细胞体积形态比较大，如果考虑铺6－7天，3000－5000细胞即可，
作者: BUK    时间: 2012-8-31 12:43

培养瓶？面积？
多孔板？
作者: gemei0115    时间: 2012-8-31 12:44


可以用24孔板，每孔加3000－5000个细胞，或者用6孔板，一般用104个数量级。仅供参考！
作者: orangecake    时间: 2012-8-31 12:45


做生长曲线一般用MTT，96孔板，3000－5000细胞/孔
我不知道zfcingba铺24孔或者6孔是不是考虑用细胞计数，还是用什么别的方法？另外24孔板铺3000个细胞，明显比较少，
作者: pencil菲    时间: 2012-8-31 12:45

位战友
本人目前实验设计存在问题，请大家出手相助啊！
实验名称：生长抑素类似物善龙（sandostatin lar)对ＭＭＣＨ－９７（人潜在高能转移肝癌细胞株）作用的体外实验研究（目前国内没有见相关报道）
本人已经培养了ＭＭＣＨ－９７细胞
１＼拟做ＭＴＴ测细胞抑制率
拟分四组：空白对照＼善龙＼善龙＋５－ＦＵ\５－ＦＵ
但是本人没有查到９６孔板需要的细胞密度及加药浓度（善龙浓度），浓度太大可能所有组细胞都死亡．
２＼拟做细胞流式仪测凋亡
拟分四个样本
但不知瓶中细胞要求密度及所加药物浓度（善龙及５－ＦＵ的量，加药后需要培养多长时间？）
３＼拟做免疫组化，了解凋亡原因
目前在生长抑素类似物奥曲肽的研究中已经有资料证明其可以促进肿瘤细胞凋亡，我选择Fas/Fasl指标可以吗？
我是ＭＤ研究生，说句实话对实验没有什么兴趣，但是老板催的紧，有这方面经验的战友，或者可以查到相关外文文献的请发给我，本人愿意分相谢
谢谢了！
作者: skytree    时间: 2012-8-31 12:46



QUOTE:
原帖由 pencil菲 于 2012-8-31 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
位战友
本人目前实验设计存在问题，请大家出手相助啊！
实验名称：生长抑素类似物善龙（sandostatin lar)对ＭＭＣＨ－９７（人潜在高能转移肝癌细胞株）作用的体外实验研究（目前国内没有见相关报道）
本人已经培养了ＭＭＣＨ－９７细胞
１＼拟做ＭＴＴ测细胞抑制率
拟分四 ...


我对你这个药物也不是很了解，但我觉得你既然要考虑它对你细胞的作用，那么你就得自己去试验，试不同时间，不同浓度，如果国外做了，那只能对你提供参考，因为你们彼此的药物，细胞都不一样，不存在可比性。
几点建议：
1、你可以将药物浓度放到临床血药浓度，然后取浓度梯度降低，试出大致浓度，然后可以取精确浓度，做药物抑制试验的文献很多了，MTT，平板克隆都行。
2、把浓度、作用时间试出来以后，可以做流式，跑DNA ladder，TUNEl染色，电镜等形态学指标
3、目前在生长抑素类似物奥曲肽的研究中已经有资料证明其可以促进肿瘤细胞凋亡，别人的结果提示凋亡是什么途径？凋亡途径主要有细胞内线粒体途径和细胞膜信号转导途径，选FAS可能狭隘，你加上BCL和BAX，这几个上游分子，如果有兴趣，可以考虑caspase家族，另外做组化，可能不太合适，做western 把咯他吧，caspase可以做ELISA
作者: skytree    时间: 2012-8-31 12:46

各位大侠,我想养胃癌细胞株SCG7901,也是我第一次养细胞,请问哪位能告诉我该怎么做?当然是越详细越好啦,谢谢!

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很好养，让你充满信心，
细胞培养液，常规的1640即可
血清，四季青的新生牛血清10%
至于细胞培养过程，园子里很多了，按步就班来就行。
作者: KGZ564    时间: 2012-8-31 12:47


带一个本科生实验，观察线粒体的活体染色，我是用罗丹明123染色的，也用荧光显微镜拍了照，400倍下的。但一时忘了拍对照。做过的人，请帮我看一下，图中是否就是线粒体？另外，可否帖一下用RH123染色的步骤和原理？谢谢，google上查原理，只查到是：罗丹明123 (Rh123) 是阳离子染料, 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质, 而使其荧光猝灭。线粒体跨膜电位丧失后, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出荧光，但我需要给学生较详细的解释。不好意思，初次带这种实验，见谅。


图片附件: 60616845.snap.jpg (2012-8-31 12:47, 20.45 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13517

作者: rxcc33    时间: 2012-8-31 12:48


图的背景很高，细胞形态也无法辨认。线粒体一般是在核周围呈弥散的点状分布，因此，取出一部分细胞，用DAPI或者hochest将细胞核染色染色，分别用蓝色荧光和红色荧光拍照，然后两张图重叠起来，此时如果看到你的红色荧光是在蓝色的核周围呈现点状分布的话，断定它确实是线粒体的可能性会大一些。
作者: 小糖块    时间: 2012-8-31 12:48


作hES核型分析，目前我遇到这样的问题：

1。染色体高度凝集－－所有染色体看起来都是一个小短棒的形状，无法分辨配对。

2。染色体分散不开－－基本上聚集在小范围内，不太容易计数。

我的实验条件：秋水仙素0.15--0.20微克/毫升，作用时间3.5h－－7h，低渗浓度0.05--0.075M KCL，低渗时间15min－－30min，滴片高度1.2--2.0m，也作过涂片烤干，

但是，总是出现上述两种问题，请高人指点。
作者: wmp1234    时间: 2012-8-31 12:48     标题: 回复 #284 小糖块 的帖子

本科时候做过，但现在的确记得不是很清楚了，关于染色体分散不开是否考虑在往载玻片上滴的时候最好滴管口距离载玻片5-10cm，并且载玻片呈30度左右倾斜，此时滴上去的溶液在重力的作用下摔到载玻片上，并在一定的倾斜度下扩散均匀，然后观测的话可能会分散好一些。只记得这些了，具体操作还真记不起来，请见谅！
作者: zwsyrt    时间: 2012-8-31 12:49


我认为出现上述情况的原因可能是：
1、染色体高度聚集：秋水仙素处理过度。
2、染色体分散不开：低渗处理及固定得不好。
不知道你上面提到的实验条件是不是都试过了。我们做的是一种动物的核型，处理条件是秋水仙素0.4ug/ml，时间是5-6h。低渗液为0.4%KCl，37度低渗20min。固定两次，每次15分钟。最后滴片的时间跟meixsy说得差不多。做出来效果一般都不错。
作者: dragonkilly    时间: 2012-8-31 12:50



QUOTE:
原帖由 小糖块 于 2012-8-31 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

作hES核型分析，目前我遇到这样的问题：

1。染色体高度凝集－－所有染色体看起来都是一个小短棒的形状，无法分辨配对。

2。染色体分散不开－－基本上聚集在小范围内，不太容易计数。

我的实验条件：秋水仙素0.15--0.20微克/毫升，作 ...

我做过几次，也遇到过你的情况，后来改变以下面的条件做了几次，效果不错，希望对你有所帮助。细胞状态很重要，我一般在传代48小时后，增值旺盛时期。
1。秋水仙素浓度40ug/ml,作用2.5-3小时。
2。低渗30－40 分钟。37度
3。固定液预冷，重复冰上固定三次。
4。载玻片预冷，50CM 滴片。
5。室温放置两天，染色。
另外，载玻片应该是处理过的，未涂胶的，给我感觉你的问题在于秋水仙素浓度和低渗时间和细胞时期的选择，其他条件都是次要的。
作者: dragonkilly    时间: 2012-8-31 12:51

大家好，我欲购P53 null saos-2细胞，有哪位战友知道哪个公司代理的比较好，价格比较合理，售后服务较好。有知道请信箱回复lixinmin1999@163.com
盼回音！多谢了。

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此细胞系国内文献还未见到，但国外文献中见到过
题目：A Genomic Map of p53 Binding Sites Identifies Novel p53 Targets
Involved in an Apoptotic Network
出处：Cancer Res 2005; 65: (12).
另外我想知道的是，H1299细胞也是p53 null细胞，如果没有saos-2细胞，可否选择H1299呢？这个细胞很常见的啊！
我这里有，你可以拿别的我感兴趣的细胞交换哦。呵呵
作者: 66+77    时间: 2012-8-31 12:51


各位大佬,本人现在急需帮助!!!

我想看蛋白在水稻中的亚细胞定位,预期是在细胞质中表达,要求必须排除在细胞核及线粒体中表达,我用Rhodamin 123染色,Leica的confocal, 以愈伤做材料,问:
1, 是不是一定要做切片或者分离单细胞才能得到好片子?
2, Rhodamine 123染色时间多长为好, Dulbecco's PBS漂洗有什么具体的要求没有,例如时间等条件?
3,如果可能的话,能否推荐一个理想的制片方法及confocal条件?本人是这方面的菜鸟!

哪位热心人能否给点建议呀,能给我留个联系方式最好,我好再次联系!

多谢了!
作者: avi317    时间: 2012-8-31 12:52     标题: 回复 #289 66+77 的帖子

线粒体膜电位和线粒体肿胀度是观察线粒体膜通透性和流动性功能，进而评价线粒体功能的敏感指标。线粒体对Rhodamin 123的摄取过程是依赖膜电位差与逆向扩散的综合效应，故检测Rhodamin 123的荧光强度可间接反映线粒体膜电位。而我不明白的是楼主做的是亚细胞的定位，而并非检测线粒体膜电位的变化，因此楼主拿Rhodamin 123染色为何？我想要说的是，如果你要检测你的目的蛋白是否在胞质中表达而又要排除细胞核与线粒体，我想最好的办法就是荧光观测，你的目的蛋白可以构建有带有绿色荧光的标签，表达后的细胞分别用mito tracker（线粒体marker，有红色的）标记线粒体，DAPI或者Hochest染核（蓝色），然后三张图重叠起来比较一下马上就能辨别。不知道说清楚没有？
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 12:52

大家好，我欲购P53 null saos-2细胞，有哪位战友知道哪个公司代理的比较好，价格比较合理，售后服务较好。有知道请信箱回复lixinmin1999@163.com

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此细胞系国内文献还未见到，但国外文献中见到过
题目：A Genomic Map of p53 Binding Sites Identifies Novel p53 Targets
Involved in an Apoptotic Network
出处：Cancer Res 2005; 65: (12).
另外我想知道的是，H1299细胞也是p53 null细胞，如果没有saos-2细胞，可否选择H1299呢？这个细胞很常见的啊！
我这里有，你可以拿别的我感兴趣的细胞交换哦。呵呵
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 12:53

要做3T3细胞细胞生长曲线，开始种多少细胞？可以数6－7天啊

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做生长曲线一般用MTT，96孔板，3000－5000细胞/孔
我不知道zfcingba铺24孔或者6孔是不是考虑用细胞计数，还是用什么别的方法？另外24孔板铺3000个细胞，明显比较少，
作者: loli    时间: 2012-8-31 12:53


各位高手你们好，我要用tunel法检测细胞凋亡， 但是试剂盒里的说明书全是英文的，有些看不懂。各位有知道此方法的详细步骤的吗？包括培养细胞和动物模型的，试剂盒购于晶美生物科技有限公司的。望各位高人加以指点，谢谢！！！
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 12:54     标题: 回复 #293 loli 的帖子

搜索一下，有很多相关帖子，并且对你试验很有帮助
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2661552_1.html')
作者: fklo83    时间: 2012-8-31 12:55

求Quoirin and Lepoivre培养基配方
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 12:56



QUOTE:
原帖由 fklo83 于 2012-8-31 12:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
求Quoirin and Lepoivre培养基配方

NH4NO3 0.4
KNO3 1.8
CA(NO3)2 x 4H2O 1.2
MgSO4 x 7H2O 0.36
KH2PO4 0.27

Boxus. Ph., Terzi, J.M., Lievens, Ch., Plyser, M., Ngaboyamahina, P., Duhem,
K. (1991) Improvement and perspectives of micropropagation techniques
applied to some hot climate plants. Acta Horticulturae 289:55-64

此培养基配方源自以下文献：
Quoirin, M., Lepolvre, P., and Boxus, P., 1977. Un premier bilan de 10 annees de recherches sur les cultures de meristemes et la multlplcatlon in vitro de fruitiers ligneux. In C.R. Rech. 1976-1977 et Rapports de synthese Stat. Cult. Fruit, et Maralch. Gembloux. Belgium:93-117
作者: HPLC使者    时间: 2012-8-31 12:56


我需做6-OHDA对多巴胺神经细胞的毒性实验，可能6-OHDA需溶解于维生素C的溶液中，请问需要多大浓度的维生素C溶液，储存条件和时间有限制吗？多谢!
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 12:56



QUOTE:
原帖由 HPLC使者 于 2012-8-31 12:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我需做6-OHDA对多巴胺神经细胞的毒性实验，可能6-OHDA需溶解于维生素C的溶液中，请问需要多大浓度的维生素C溶液，储存条件和时间有限制吗？多谢!

6－OHDA用含盐溶液溶解为7ug/ul，vitC浓度为0.02％。
作者: wsll    时间: 2012-8-31 12:57

无糖earls液的配制？
作者: tieshazhang    时间: 2012-8-31 12:58     标题: 回复 #299 wsll 的帖子

无糖Earles（mmol/l）：NaCl 143；KCl 5.4；CaCL2：1.8；NaH2PO4:1.0;HEPES 2.4,PH 7.4~~
希望对你有用～～
作者: u234    时间: 2012-8-31 12:58

培养试剂中的二型胶原酶能否用一型胶原酶替代？两种胶原酶成分差在哪里？谢谢
作者: yysr238    时间: 2012-8-31 12:59     标题: 回复 #301 u234 的帖子

有文献报道消化时可以用一型胶原酶消化（如果你需要相关文献再联系），两种胶原酶消化的靶组织是不一样的，一型胶原酶消化内皮的胶原基质，二型消化软骨等胶原，但是不是绝对的，因为我们知道一种组织通常含有两种以上的胶原成分，所以没有绝对的限制＆区别那种组织一定要用那种类型的胶原，不过你可以针对组织中为主的胶原来选择胶原酶。有问题再联系
作者: xue258    时间: 2012-8-31 12:59


直接用刀豆蛋白A刺激大鼠脾细胞悬液，然后再用CD3抗体分选出T细胞，分选出T细胞后如何维持它的增殖，请教各位高手
作者: cocacola    时间: 2012-8-31 13:00     标题: 回复 #303 xue258 的帖子

常规的方法是加IL-2，培养来建立T细胞系。
也有采用SV40 T以及端粒酶（TERT）抗原转染来永生化的。
作者: yhz1973    时间: 2012-8-31 13:01

如题，请教那位战友做过，还望不吝赐教。Search过园子里的帖子，想过用有限稀释法做，可是觉得每孔1~2个细胞，这么少的数量细胞怎么好长得起来呢，我养的是小鼠淋巴细胞，也不是那种增殖能力比较强的细胞系。还有，刺激抗原量加多少合适呢？盼复，甚谢！！
作者: S6044    时间: 2012-8-31 13:01     标题: 回复 #305 yhz1973 的帖子

所谓克隆，就是指获得单一细胞来源的细胞群。所以，为了保证您得到的是克隆，还是应该加一个细胞。

一般的做法是调解细胞浓度至0.5-1个细胞/孔。至于抗原的量加多少，您应该有类似的预试验，在克隆化之前test一下。
作者: ffooll    时间: 2012-8-31 13:01

请问诱导大鼠的间充干细胞能不能用人或其他类的生长因子，还是一定要用大鼠的。谢谢各位大侠
作者: S6044    时间: 2012-8-31 13:02



QUOTE:
原帖由 ffooll 于 2012-8-31 13:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问诱导大鼠的间充干细胞能不能用人或其他类的生长因子，还是一定要用大鼠的。谢谢各位大侠

我没有具体做过。
一般情况下，细胞因子有向下的兼容性，也就人的细胞因子可以作用于猿、猴、鼠等，但倒过来不行。
作者: zranqi_1    时间: 2012-8-31 13:02


有不分泌甲胎蛋白且能在皮下移植的鼠肝癌细胞吗？谢谢各位站友
作者: S6044    时间: 2012-8-31 13:03



QUOTE:
原帖由 zranqi_1 于 2012-8-31 13:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有不分泌甲胎蛋白且能在皮下移植的鼠肝癌细胞吗？谢谢各位站友

AFP-negative human hepatoma cell line (SMMC-7721)
可以在裸鼠皮下建立模型。
其它的afp-negative 的肝癌细胞系还有：HLE，HCC和SK-Hep1
作者: yysr238    时间: 2012-8-31 13:03


我正在做小鼠肝细胞原代培养,做了几次,都不是很好,方法为肝组织切成1mm小块,洗,胶原酶Ⅳ消化(2min,5min,8min,12min,20min都试过),DMEM+10%FBS+PS+SIT培养。希望有经验的战友给予帮助。
作者: yychen    时间: 2012-8-31 13:04     标题: 回复 #311 yysr238 的帖子

我把我整理和收集战友的一些资料供你分享：

材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物,转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液l-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。

肝细胞生长不良涉及到细胞的取材、分离、纯化、培养条件，现分别介绍如下，首先介绍原代肝细胞的分离。
目前肝细胞的分离主要采用经典的改良的Salgon经门静脉插管两步灌流法分离肝细胞。具体操作步骤如下：
1: 供体肝脏的游离：选择Mercedes手术切口，即人字型切口，进入腹腔，暴露肝脏，分离肝脏镰状韧带、左、右三角韧带（为了便于手术，可以用生理盐水纱布将肝脏轻柔的向下牵引，并向两侧移动，显露膈下空间），解剖肝十二指肠韧带，确认胆总管，应尽可能靠近远心端结扎（从十二指肠后面进行）。分离肝动脉，确认胃十二指肠动脉，并将其仔细结扎，但切勿影响肝动脉腔。追踪肝总动脉的行程，直至脾动脉、胃左动脉显露，结扎离断脾动脉、胃左动脉，显露腹腔动脉干。轻轻抬起肝脏，显露其下的门静脉，将其从周围的淋巴组织中分离出来，注射肝素100U。缝扎胃左静脉以及来自胰腺的第一分支，以获取足够长度的门静脉。在胰腺颈部分别用力行两道结扎，并于结扎线间将其离断，这样就可显露脾静脉与肠系膜上静脉的会合处。将灌注导管插入门静脉，并结扎牢靠，在远心端离断肝上下腔静脉，准备肝脏灌注。迅速切除肝脏，术中连同肝上下腔静脉周围膈肌组织缘一并切除以移动肝脏，最终将肝脏在腹膜后切除，获取肝脏。之后行门静脉插管，准备行肝脏灌注，分离肝细胞。
作者: yychen    时间: 2012-8-31 13:04     标题: 回复 #311 yysr238 的帖子

2:灌注液的配置：
Perfusion Solution 1（g/L）：
NaCL 8.000
NaH2PO4•2H2O 0.078
KCL 0.400
Na2HPO4•12H2O 0.151
NaHCO3 0.350
EDTA 0.190
HEPES 2.380
Glucose 0.900
磁力搅拌器使固体成分充分溶解，用1M HCL或1M NaOH调定pH 7.2～7.4（使用pH计）， 0.45及0.22双层滤膜负压过滤除菌，4℃保存，使用时液体温度维持在37℃（应用水浴箱）。
Perfusion Solution 2（g/L）：
NaCL 8.000
KCL 0.400
CaCL2 0.560
NaH2PO4•2H2O 0.078
Na2HPO4•12H2O 0.151
HEPES 2.380
NaHCO3 0.350
Collagenase Ⅳ 0.500
搅拌器使固体成分充分溶解，4℃冰箱过夜，以后同上。
4:灌注步骤：
4.1 37℃Perfusion Solution 1沿门静脉插管灌注肝脏，流速20－30ml /min，灌洗10min左右，至肝脏呈现灰白色为止
4.2 Hanks液80ml 短时间灌注，约2min，冲出EDTA
4.3 37℃Perfusion Solution 2 沿门静脉插管灌注肝脏，流速20mL/min，灌洗10min左右，循环使用
4.4 肝脏变软，塌陷后用无菌镊钝性分离肝细胞，去除肝包膜及血管等结缔组织，将含有胶原酶的肝细胞悬液放入250ml无菌烧杯中（杯口用无菌锡纸包裹），37℃水浴5min
4.5加入无指示剂的DMEM基培，双层无菌纱布过滤
4.6将滤液放入50ml离心管中，应用无指示剂的DMEM基培，4℃、50g、3min洗涤肝细胞3次
5:获得的细胞经过以下的纯化，应用特定的培养基培养。

提供几篇文章
1. Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Chacko, J., and Trump, B. F. (1981). Mouse liver cell culture 1. hepatocyte isolation. IN VITRO Vol.17.No.10 October, 913-925.
2. Kreamer, B. L., Staecker, J. L., Sawada, N., Sattler, G. L., Hsia, M. T. S., and Pitot, H. C. (1986) Use of low-speed ,iso-density percoll centrifugation method to increase the viability of isolated rat hepatocyte preparations. IN VITRO CELLULAR & DEVELOPMENTAL BIO. Volume 22,Number 4,April 201-211.
3. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., (1989) Lysis of cultured mammalian cells. Molecular Cloning. 18.34
作者: xingyi08    时间: 2012-8-31 13:04

请问你说的研磨玻片是什么样子的，在哪里可以买到？谢谢！
作者: 04906    时间: 2012-8-31 13:04


没有研磨玻片，我在操作是这样的：在剪碎肝脏组织时，应尽量剪碎，一般要十几分钟以上，随后加入少量的D-Hank's液，用吸管移入离心管，离心后，去上清，加入3-5倍的0.25%胰酶。消化的时间可以延长到30-60分钟。随后的操作基本与上贴资料所述相同。
作者: ending    时间: 2012-8-31 13:05


研磨会使细胞破碎吗？
作者: 大白菜    时间: 2012-8-31 13:05


我科室新近了一台流式细胞仪，但使用的一直不好。现主任要求我做组织中抗原的检测，不知如何将组织分解成单细胞较好，具体检测的步骤怎样？
望各位高手赐教。
作者: one    时间: 2012-8-31 13:06     标题: 回复 #317 大白菜 的帖子

单细胞悬液得制作很多书上都有啊。
样品制备的一般步骤如下：
1. 切片：厚片4-5片。
2. 脱脂：二甲苯脱脂，室温，1-2天，弃二甲苯。
3. 水化：100%，95%，70%，50%酒精，每一步10分钟，
去酒精，加双蒸水，5分钟后弃水。
4. 消化：胃蛋白酶( pH=1.5，浓度为0.5% )，
37℃，30分钟，每隔5-10分钟振荡一次。
5. 终止消化：用PBS液或生理盐水稀释酶液。
6. 过滤：300目过滤，未消化完可作第二次消化。
7. 收集细胞悬液：PBS漂洗1-2次，低速离心去除碎片。
8. 单细胞悬液用70%酒精固定保存或染色上机检测
作者: qumm1985    时间: 2012-8-31 13:06


我正在做3T3-L1诱导分化，所用的地塞米松是怎么配制的？是不是用无水乙醇配吗？三种试剂配好后都保存在-20度吗？
作者: leifengta    时间: 2012-8-31 13:06

地塞米松水溶性较差,无水乙醇和DMSO都可以溶解.按照一定浓度溶解在里面就可以了,不需要过滤.IBMX和-地塞米松需-20度保存,胰岛素4度保存就可
作者: junhun    时间: 2012-8-31 13:07

EX我一般是用无水乙醇配制，因为DEX需要得浓度比较低，所以可以先配制成10倍得母液，需要用得时候取一点稀释10倍再用，10倍的母液－20度保存，工作液4度保存就可以了。
作者: whitesheep    时间: 2012-8-31 13:07


可以直接上医院买针剂得啊，方便又实用，还省老板的money！
作者: abc816    时间: 2012-8-31 13:08


各位老师我查了一下关于KRP缓冲液的标准配置方法，也参考了一下其他师兄师姐的配方，发现有很多种不同的方法，不知道采用哪种比较好，有没有标准的配置方法？我是用来做葡萄糖吸收实验的。
谢谢各位老师和师兄师姐的帮忙！
作者: 缘yuan    时间: 2012-8-31 13:09     标题: 回复 #323 abc816 的帖子

没有标准配方,对于不同细胞和组织配方都不一样.你可以查阅一下别人做过的用什么配方.我也是做葡萄糖吸收的,所用配方如下,仅供参考
1*KRP buffer: NaCl 131.2mM
KCl 4.71 mM
CaCl2 2.47mM
MgSO4 1.24 mM
磷酸钠 2.48 mM
HEPES 10 mM
作者: jkobn    时间: 2012-8-31 13:10


我做微核实验，使用自配培养基
RPMI－1640 80ml
胎牛血清 20ml
青、链霉素各10000U
PHA 4ml(2.5mg/ml)
但是，经过全血培养，细胞长势不好，请各位帮忙，看是不是培养基中PHA的量不够，导致不能有效刺激细胞生长。我是新手，请多指教！急待回复！
作者: XYZQ    时间: 2012-8-31 13:11     标题: 回复 #325 jkobn 的帖子

有可能PHA的效价太低了，可以提高浓度，最好做一个梯度。
作者: misswu61    时间: 2012-8-31 13:11

细胞不长也可能是血清的问题 血清的质量有的时候是很关键的，特别是做原代培养 ，还有酸碱度的调整，一般来讲是宜酸不宜碱
作者: nn255    时间: 2012-8-31 13:12


用的是20％的牛血清？？？我不知道你的细胞是不是就要求这个浓度，我们一般细胞培养使用的都是10％浓度的牛血清，37℃ 5％二氧化碳浓度。另外，1640培养液中要加入碳酸氢钠，以维持PH。
作者: zhezhe    时间: 2012-8-31 13:12


我在培养中呢遇到过类似的情况！！！你可以从几个方面去考虑，第一培养基的PH是否适合，第二细胞的接种量是否适合。第三血清是否质量可靠。多方面的去分析的话呢，也许会找到一定的答案。今年我刚培养细胞，开始的时候就出现了这样的情况，后来我找到了原因，是因为我的细胞接种良不够。现在克服了。
作者: kuaizige    时间: 2012-8-31 13:13


采血时选用肝素抗凝。
作者: 49888    时间: 2012-8-31 13:13

借楼主的帖子也问下我的问题，呵呵～

准备养单核细胞（THP-1)

看师兄的文章里提到他在配制RPMI-1640培养基时加入了2 mML-谷氨酰胺、1.5g/L 碳酸氢钠、10mM HEPES, 1.0mM 丙酮酸钠、5×10-5 M 2-巯基乙醇、

可是我查阅网上RPMI-1640（粉剂）的说明书里说包含了上述的东西

我想请教一下各位，我还需要加这些东西吗？

谢谢～
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 13:13


还有一点相说的是＊＊＊＊＊＊＊＊＊非机动化血清。如果medium里面碳源，PH值都没有问题的化，请考虑以下，事非应该将血清非机动化。
以前在培养细胞的时候遇到类似的情况，在使用了非机动化血清后细胞的生长情况得到好转。
作者: zsxan1990    时间: 2012-8-31 13:14


各位老师：
我现在想做一种中药的细胞毒性，这种中药有心脏毒性，做细胞毒性应该选择哪种细胞呢？能不能用肿瘤细胞，这样的细胞好像比较好养？做过这方面试验的老师能不能传授一些！先谢谢了！
作者: 3648755    时间: 2012-8-31 13:14



QUOTE:
原帖由 zsxan1990 于 2012-8-31 13:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位老师：
我现在想做一种中药的细胞毒性，这种中药有心脏毒性，做细胞毒性应该选择哪种细胞呢？能不能用肿瘤细胞，这样的细胞好像比较好养？做过这方面试验的老师能不能传授一些！先谢谢了！ ...


个人认为，最好不要用肿瘤细胞来进行中药细胞毒性的筛选。因为肿瘤细胞表面的蛋白质（受体、标记性蛋白等）是与正常细胞不一样的，这样就会造成药物对它们的作用也不一样，所以你还是应该用正常细胞来做细胞毒。你查文献，肯定能查到原代心肌细胞的培养。我就知道用乳鼠、家兔的心脏做原代培养的。
作者: pencil菲    时间: 2012-8-31 13:14


请问Hela细胞和hela S3细胞有什么区别?
生物学的特征(尤其是与apoptosis相关的)及培养上的区别?
作者: 阿k    时间: 2012-8-31 13:15     标题: 回复 #335 pencil菲 的帖子

HeLa cells are positive for keratin by immunoperoxidase staining.
HeLa cells have been reported to contain human papilloma virus 18 (HPV-18) sequences.
P53 expression was reported to be low, and normal levels of pRB (retinoblastoma suppressor) were found.

HeLa S3 is a clonal derivative of the parent HeLa line (see ATCC CCL-2). S3 was cloned in 1955 by T.T. Puck, P.I. Marcus, and S.J. Cieciura. [22814]
The HeLa S3 clone has been very useful in the clonal analysis of mammalian cell populations relating to chromosomal variation, cell nutrition, and plaque-forming ability.
This line can be adapted to grow in suspension. [25952]
The cells are positive for keratin by immunoperoxidase staining.
A culture at approximately passage 400 was submitted to the American Type Culture Collection in February, 1972.
HeLa cells have been reported to contain human papilloma virus 18 (HPV-18) sequences. [23180]
作者: hyuu    时间: 2012-8-31 13:15


HeLa贴壁性更好，细胞较薄，显得较大，但相同生长面积数量少。
S3也贴壁，但是可以悬浮培养。细胞可以长得比较密。
作者: woshituzhu    时间: 2012-8-31 13:16

我原代培养了人正常胃黏膜上皮细胞，最近要做细胞的鉴定，想看下有没有谁有这个细胞的图片，我想做个对照，非常着急，万分感激各位大侠帮帮忙！！
作者: woshituzhu    时间: 2012-8-31 13:16     标题: 回复 #338 woshituzhu 的帖子

如下：

请简单对图片做一介绍
如：图片来源，是否原创，细胞有无经过鉴定，图片中细胞做过如何处理等，谢谢
作者: jrwyyplt    时间: 2012-8-31 13:16


我用流式检测细胞周期，想用Modfit 分析，但不会用，请高手教教我
作者: am10    时间: 2012-8-31 13:17     标题: 回复 #340 jrwyyplt 的帖子

本来我的是PDF 格式的，不过有1.8M，懒得分卷压缩，就转换成word 格式的了，是繁体中文的，不过我相信你还是能看懂的！！
作者: ritou1985    时间: 2012-8-31 13:18

因为课题需要，本人需要计算大鼠心梗模型的缺血面积，现在还没有查到计算方法，希望有经验的战友能够给予帮助，谢谢！
作者: DDD    时间: 2012-8-31 13:18     标题: 回复 #342 ritou1985 的帖子

介绍三种可以 用于计算心肌梗塞的方法：

1 。摘取心脏,用生理盐水冲洗,除去血污,将心脏切成0. 1～0. 3 cm厚的心肌片,用2片新鲜心肌横断面进行NBT染色,37 ℃温孵15 min,梗死心肌不着色,正常心肌染成蓝色,用C IMA2400图像分析仪测量心肌梗死面积和整个心肌横断面面积,计算心肌梗死部分占心肌横断面面积的百分比。

2 由上述取下的左心室从心底部开始约每间隔2mm 切一片,将左心室平均切成5～6片 。每片标本常规脱水、透明后石蜡包埋,均水平包埋,心尖方向一面朝向包埋框底部。每片标本切片一张,HE 染色。在图像分析仪(OPTON VIDS21 ,西德) 上分析各个截面的梗塞面积、心腔半径、室间隔厚度。各项数据均用算术均数±标准差( X ±SD) 表示,显著性检验采用t 检验。
3 取出心脏，盐水冲洗，剔除脂肪，血管等组织，并沿冠状沟切除心房，右心室，仅留下左心室肌称重，然后将心室切成0.1cm厚的心肌片,将其放在0.1%NBT溶液中,在37摄氏度分别温孵10min以便染色.剪去个心肌片被染色非梗死心肌,把未染色的梗死心肌称重,除以左心室重,计算出梗死范围占左心室重的百分比.
作者: fei1226com    时间: 2012-8-31 13:19


冻融法融解的细胞如何测定蛋白含量？3ks a lot
作者: yhz1973    时间: 2012-8-31 13:19     标题: 回复 #344 fei1226com 的帖子

蛋白含量测定有多种方法，我们通常采用BCA法（PIERCE, cat # 23225）
作者: xue258    时间: 2012-8-31 13:20

请问，鉴定细胞分化的NBT还原实验的原理是什么呢？好多文献中都只有方法，但是没有原理，在哪里才能找到呢？
谢谢
作者: newway    时间: 2012-8-31 13:21



QUOTE:
原帖由 xue258 于 2012-8-31 13:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问，鉴定细胞分化的NBT还原实验的原理是什么呢？好多文献中都只有方法，但是没有原理，在哪里才能找到呢？
谢谢


鉴定细胞分化的NBT还原实验即为硝基四氮唑蓝还原实验，其原理是通过测定硝基四氮唑蓝的还原能力来鉴定细胞的分化！

在细胞的分化过程中耗氧量随之相应增加，磷酸己糖旁路代谢活力增强，葡萄糖6-磷酸氧化脱氢，此时加入的NBT中的四氮唑基可接受所脱的氢，生成甲朊基，使原先呈淡黄包的NBT还原成点状或块状甲朊颗粒并沉积在胞浆内。

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作者: qqq111    时间: 2012-8-31 13:21

我预作肺泡2型细胞培养，不知从哪入手，请大家指教，有参考文献更好
谢谢！
作者: newway    时间: 2012-8-31 13:22     标题: 回复 #348 qqq111 的帖子

原文请见：
cuturl('http://www.xqxwk.com/article/xb000530.htm')

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养和鉴定

郝嘉　李永旺　肖颖彬

　　提　要： 目的　建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（简称AT-Ⅱ）的改良体外原代培养法，并比较其鉴定方法的优劣。方法　AT-Ⅱ分离、用胰蛋白酶消化法并用IgG包被的培养瓶粘附纯化，原代培养后通过鞣酸多彩、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AKP）、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)免疫组化三种染色法和电镜鉴定 AT-Ⅱ。结果　胰酶消化加IgG粘附纯化后所得的 AT-Ⅱ纯度为90%,AKP染色鉴定最好。结论　采用IgG粘附纯化能提高 AT-Ⅱ纯度，AKP染色简便实用。
　　关键词： 大鼠；肺泡Ⅱ型上皮细胞；培养；鉴定
　　中图法分类号： R329　　　文献标识码： B
　　文章编号：1000-5404(2000)05-0500-02

Culture and identification of rat alveolar type Ⅱ cell in vitro

　　AT-Ⅱ对维持正常的肺功能发挥着极重要的作用。体外培养AT-Ⅱ是研究其特性的重要手段，由于它培养后表型丧失快，基本不传代，并且培养难度较大，不易获得较高纯度，故本研究采用一种改良方法培养并比较了四种鉴定方法的优劣。

1　材料和方法

1.1　原代培养
　　参照Dobbs［1］的方法加以改进。Wistar大鼠麻醉、抗凝，气管插管，放血活杀。经肺动脉用溶液Ⅱ(液Ⅰ、Ⅱ配法见文献［1］)灌洗肺,气管通气8次，用溶液Ⅰ、Ⅱ分别经气管插管灌洗肺，用溶液Ⅱ灌洗胸腔。取出心肺、气管，经气管插管注入0.25%胰蛋白酶20 ml, 37℃水浴20 min。去大气道、心脏，在含有4 ml DNase的小烧杯中剪碎肺。5 ml小牛血清灭活胰酶，补足溶液Ⅱ20 ml后倒入烧瓶，37℃水浴并晃动5 min。120、200目滤网过滤，离心后弃上清，细胞重悬并计数。将悬液加入已用大鼠IgG包被的培养瓶中培养。1 h后倒出培养液，离心后弃上清，取少量细胞行电镜鉴定。培养23 h换培养液。
1.2　细胞鉴定
1.2.1鞣酸多彩染色　　参照Mason等［2］的方法略加改进：取出培养有AT-Ⅱ的盖玻片，PBS冲洗，1.5%戊二醛固定15 min,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%锇酸（校电镜室）固定1.5 h,PBS(pH 6.8)冲洗2次,1%鞣酸中过夜,用PBS(pH 6.8)和水各洗涤2次,将蓝染液（蓝染液和红染液配法见文献［2］）与水按1∶4稀释后染色8 s。1％NaOH 洗涤30 s，红染液染色2 s,酸乙醇液洗涤3次,用红染液染2 s,水洗3次,干燥后封片。
1.2.2　AKP染色　　参照Cunningham等［3］的方法略加改进：取出盖玻片后用TBS液洗涤5 min×4次；在1 mlTBS浓缩缓冲液中加20 μl BCIP/NBT显色盒（博士德公司）并混匀,待标本风干后加至标本上，室温避光显色20 min，水洗后核固红复染1 min，梯度脱水，干燥封片。
1.2.3　肺表面活性物质相关蛋白A（Pulmonary surfactant A,SP-A）免疫组化染色　　按中山公司SP免疫组化试剂盒说明书操作，SP-A抗体浓度为1∶800(美国Sheldon I.Feinsein教授惠赠)。
1.2.4　电镜　　用3%戊二醛固定细胞后行透射电镜检查。

2　结果

2.1　细胞产量、纯度
　　原代培养AT-Ⅱ可收获3×107个/鼠，纯度可达90%。
2.2　细胞鉴定
　　鞣酸多彩染色、AKP染色和SP-A免疫组化染色结果见图1、2。

图1　培养5 d的AT-Ⅱ(鞣酸染色×400)
可见不均匀地分布在核周的大小不一的褐色的嗜锇
小体(板层小体)，细胞聚集成小岛状

图2　培养2 d的AT-Ⅱ(AKP染色×400)
胞浆中有较多分布不均，大小不一的蓝色颗粒

3　讨论

　　尽管国外对AT-Ⅱ分离和培养的报道较多，但国内此方面的工作仍较少。较常用的密度梯度离心法因细胞间密度重叠使细胞产量下降。我们的体会如下：①使用IgG后细胞纯度可提高10%，产量提高12%。由于IgG可与含IgGFc受体的淋巴细胞、肺泡巨噬细胞和中性粒细胞牢固结合，因此绝大多数杂细胞被粘附清除。但此方法清除肺泡Ⅰ型细胞和支气管上皮细胞仍较困难;②培养时用小牛或胎牛血清培养效果类似;③有人在过滤肺剪碎块时先用四层纱布过滤［4］，然后用铜网过滤，我们认为纱布吸收过多细胞悬液而造成细胞量损失，本研究定做了120、200目不锈钢滤网，效果好且易操作。鉴定方法少有使用SP-A免疫组化鉴定该细胞的报道［5］。电镜鉴定仍为最可靠方法，但因其价格贵而应用受限。鞣酸多彩染色法最常用，其嗜锇小体较为特异,但AM也可着色，且该法耗时长，试剂繁多且价格与AKP染色相似。SP-A免疫组化鉴定法为一种新颖的方法，国内尚无类似报道。因AT-Ⅱ中SP-A含量最多，易于检出，但该抗体来源困难，故而推广受限。AKP是Ⅱ型细胞分化的特异标志物，也是膜标志酶。AKP染色明显优点是耗时短,BCIP/NBT显色盒还可在本实验的原位杂交中综合利用，从而节约试剂，值得推荐。

(编辑　刘　鹏)

作者简介：郝　嘉(1973-)，男，四川省荣县人，硕士研究生，医师，助教，主要从事体外循环肺保护方面的研究。电话：(023)65218768
郝嘉（第三军医大学附属新桥医院心血管外科）
李永旺（麻醉科，重庆 400037）
肖颖彬（第三军医大学附属新桥医院心血管外科）

参考文献：

［1］　Dobbs L G, Gonzalez R, Williams M C. An improved method for isolating type Ⅱ cells high yield and purity［J］. Am Rev Respir Dis,1986,134(1):141-145.
［2］　Mason R J, Walker S R, Shields B A, et al.Identification of rat alveolar type Ⅱ epithelial cells with a tannic acid and polychrome stain［J］. Am Rev Respir Dis, 1985，131(5):786-788.
［3］　Cunningham A C, Milne D S, Wilkes J, et al. Constitutive expression of MHC and adhesion molecules by alveolar epithelials(type II pneumocytes)isolated from human lung and comparison with immunocytochemical findings［J］. J Cell Sci,1994,107(Pt 2):443-447.
［4］　崔社怀，郭先健，钱桂生.鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、鉴定和培养［J］.第三军医大学学报，1997,19:548-550.
［5］　刘新民.肺泡上皮AT-Ⅱ研究进展［J］.国外医学：呼吸系统分册，1994,14(2):88-91.
作者: ero11    时间: 2012-8-31 13:22


那位仁兄知道UVA损伤角质形成细胞模型制作方法，最好说明紫外线的剂量，紫外线发射装置。
还有超净工作台中的紫外灯的波长范围是多少，能否用来制作损伤模型？
作者: newway    时间: 2012-8-31 13:23



QUOTE:
原帖由 ero11 于 2012-8-31 13:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那位仁兄知道UVA损伤角质形成细胞模型制作方法，最好说明紫外线的剂量，紫外线发射装置。
还有超净工作台中的紫外灯的波长范围是多少，能否用来制作损伤模型？  ...


UVA损伤角质形成细胞模型制作：
将细胞放入完全角质形成细胞基础培养基后置于37 ℃、5 % CO2 孵箱。UV 照射前,将2 ×105 个细胞接种到3. 5 cm Pet ri 组织培养板后置于1 ml 完全基础培养基中孵育过夜,无菌磷酸盐缓冲液( PBS) 冲洗后放入1. 5 ml PBS 中照射。照射后,细胞置于1ml 含1 %胎牛血清( FCS) 基础培养基中孵育。

其中所用的紫外线一般采用专用的 UVA 型紫外线辐射仪 (波长320～400 nm ,峰值波长365 nm)
照射剂量为：5 J / cm2

超净工作台中的紫外灯 要求紫外线杀菌作用最强，故采用人工制造的低压水银灯，波长在260nm左右，能辐射出波长主要为253.7nm的紫外线，杀菌能力强而且较稳定。不能用来制作 UVA损伤角质形成细胞模型。
作者: zzzz    时间: 2012-8-31 13:24

请问哪些人做过这种细胞的永生化.大家一起交流吧.期待你的快速回答!!
作者: newway    时间: 2012-8-31 13:25     标题: 回复 #352 zzzz 的帖子

做过骨髓细胞的永生化。用人的端粒酶转染小鼠骨髓细胞，然后用G418筛选，最后得到了抗性细胞，当hTERT并未能使小鼠骨髓细胞永生化，也未出现恶性表型。抗性细胞可以不依赖造血因子而生长，但仍然会发生凋亡。

细胞永生化的最常用方法，是转染SV40的大T抗原，这是一种常规的方法。也有同时转染hTERT的报导。有些细胞公司单单采用hTERT来使细胞永生化，不知他们是怎么做得。
希望对您有些帮助。
作者: ALALA    时间: 2012-8-31 13:25


最近在作关于细胞周期方面的实验，涉及到了细胞周期中各个时相的共聚焦，这个技术上没什么问题，能够得到好的图像，但是自己对于结果的判断却始终是模糊的，查了一些文献，给出的图片也都看得云山雾罩。特向各位大侠求助

那位能给出prophase ,metaphase,anaphase 的共聚焦图片，并解释一下。实在是自己搞不定了，希望有高人指点一下！！

多谢！！
作者: cocacola    时间: 2012-8-31 13:28

最近在作关于细胞周期方面的实验，涉及到了细胞周期中各个时相的共聚焦，这个技术上没什么问题，能够得到好的图像，但是自己对于结果的判断却始终是模糊的，查了一些文献，给出的图片也都看得云山雾罩。特向各位大侠求助

那位能给出prophase ,metaphase,anaphase 的共聚焦图片，并解释一下。实在是自己搞不定了，希望有高人指点一下！！

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多谢！！
请问您是通过哪些染料来观察细胞周期呢？DAPI和a-tubulin吗？具体的protocol是怎么样的啊，请指教！
作者: 911    时间: 2012-8-31 13:29


本人用fluo-3/AM标记细胞内钙，严格按照步骤清洗细胞，但在上镜观察时在细胞的周围总有一些红色的物质，照成照片后就变为绿色的，显得细胞及其不干净，开始以为负载后未冲洗干净，后来加大冲洗力度，细胞损失了不少可还是有这些红色的物质，不只何原因？如何能解决？
另外 ，我即时加入了一种可以增加细胞内钙的药物，但是未见细胞亮度明显改变，排除药物的原因，有人认为是因为细胞外环境中的钙离子浓度太小，所以建议我在细胞外环境中加入钙离子，不知有道理否？如何加入？
作者: join    时间: 2012-8-31 13:29


我用Boyden Chamber法检测细胞侵袭能力，检测的细胞是乳腺癌MDA-MB-231细胞，我已经购买的是24孔板和12 um膜孔直径的Millicell chamber，我要计数的是穿过聚碳酸酯膜的细胞数。但是我的师兄说我不该买这么大孔径，请问是不是应该根据MDA-MB-231细胞的直径来选择膜的孔径大小呢，有没有谁做过这个实验，能告诉我吗？我应该买多大um 的Millicell chamber呢？
作者: daod    时间: 2012-8-31 13:30     标题: 回复 #361 join 的帖子

肿瘤的侵袭能力一般选用8 um的膜。这里有关Transwell的应用指南，上面有各种实验的不同的膜的选择标准。
cuturl('http://www.sciequip.com.cn/product.asp?SubProductID=1657')
我本来想直接复制下来贴上来，可是那个网页不支持复制；只有你自己去看了。
作者: 我佛慈悲    时间: 2012-8-31 13:31


我最近用含10%FBS的DMEM（GIBCO）复苏B95a细胞，18小时后发现很多细胞贴壁后都是圆形，且似乎贴附不牢，我想请教养过B95a细胞的大虾，B95a细胞贴壁后是什么形态？
作者: yychen    时间: 2012-8-31 13:31



QUOTE:
原帖由 我佛慈悲 于 2012-8-31 13:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近用含10%FBS的DMEM（GIBCO）复苏B95a细胞，18小时后发现很多细胞贴壁后都是圆形，且似乎贴附不牢，我想请教养过B95a细胞的大虾，B95a细胞贴壁后是什么形态？ ...


我也在做这个细胞的培养，细胞在培养过程中是梭形和圆形两种的，如果细胞长得很密的时后，可以看到部分细胞悬浮状态。这个细胞株是EB病毒转化的，所以它会向细胞上清中分泌病毒，所以操作时一定要小心啊，应该在P2实验室里做啊。下面是我所照的一幅照片，

图片附件: 25076821 (1).jpg (2012-8-31 13:31, 60.22 KB) / 该附件被下载次数 22
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=13522

作者: kewanqi2011    时间: 2012-8-31 13:32


请问，养B95a时，你用的是什么培养基？
作者: tangxin_80    时间: 2012-8-31 13:32

在六孔板中转染。lipofectamine2000。
说明书上说是4ug质粒/10ul lipofectamine
可是我的质粒小抽出来的浓度都不高，4ug质粒往往已经是40ul甚至更多了。做了两次发现细胞会溶胀死亡。不是是否渗透压的问题。
新手上路，各位大侠帮帮忙。另外，我尝试浓缩质粒，用0.1v NaAc，2.2v无水乙醇，－20度过夜，可是最后质粒溶解后里面有白色的悬浮物。大家给点建议。
作者: gemei0115    时间: 2012-8-31 13:33     标题: 回复 #366 tangxin_80 的帖子

我现在正在做转染，经过几次的摸索条件，觉得已经可以顺利的完成这个过程了。转染的时候，我使用的是qiagen公司的大提kit（tip100）,主要是靠重力来收获质粒，它的纯化级别可以达到转染，量度可以达到800ng/ul以上。我在附件中会附它的使用说明书，你可以仔细阅读。我自己也曾经试过用omega公司的小提质粒kit，但是转染效果很差的，因为质粒的纯度会严重影响的效率。只要你的质粒浓度达到500ng/ul就可以转染了，你的小提浓度太小，根本就不行。
当然你尝试作的浓缩质粒也是可以的，自我认为你质粒溶解后的白色悬浮物应该是你的质粒抽提蛋白的时候不彻底，很多都是蛋白，这样的质粒对于转染很不利，除了内毒素，蛋白和RNA的存在影响也很大。

质粒大提kit，可能有点贵噢。
作者: 18832629160    时间: 2019-11-1 11:25     标题: 细胞加药培养 纠结

细胞加药培养  纠结加液体药所占培养基的最大百分比是多少？？？？  是种营养成分，PH7.15-7.96.感谢各位！！
作者: 18832629160    时间: 2019-11-1 11:25     标题: 细胞加药培养 纠结

细胞加药培养  纠结加液体药所占培养基的最大百分比是多少？？？？  是种营养成分，PH7.15-7.96.感谢各位！！



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