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标题: 【讨论帖】western blot问题解答 [打印本页]

作者: NBA 时间: 2013-1-16 15:10 标题: 【讨论帖】western blot问题解答

有关Western blot的问题请提问

我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-1-16 15:11

能不能给我解答以下问题
从组织提的蛋白，分子量180kd，上样量40ug，70v，110v电泳，300mA两小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，santa一抗 1：500TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。
第一张图是最开始曝的，第三张是过了一段时间曝的。中间一张是内参，似乎和目的蛋白是一样的情况。

图片附件: 22325011.snap.jpg (2013-1-16 15:11, 30.46 KB) / 该附件被下载次数 76
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14795

作者: NBA 时间: 2013-1-16 15:11

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-16 15:53

内参做成这样
说明操作上不是很严谨
或者说是整个步骤有问题

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-1-19 10:26

内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域，是不是过多的酶把底物消耗完的缘故？
还有个问题，压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间，而我合上塑料膜的时候，发现一些本来发光的区域不发光了，是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方？怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样？
今天把一抗，二抗的稀释度都翻了一番，变成1：1000，1：4000。试了santa 的ECL，结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥？怎么操作？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:28

你说的很有道理
二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉
在你加上ECL的时候会很亮
但是很快就会减弱了
首先要保证二抗的稀释度合适才行
才能保证压片时的效果

另外你为什么要干燥？

WB过程是要避免膜干燥的

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:28

还有就是在ECL孵育的过程中要避免金属等污染膜
会抑制HRP的活性

作者: 米囡 时间: 2013-1-19 10:29

最近去暗室曝光的时候，涂上发光液后膜上有很亮的一些点，曝光后的胶片上就成了麻点，非常难看，请楼主帮忙分析一下是什么原因啊

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:29

建议重换洗膜、稀释抗体用的缓冲液
前几天有个战友也有类似情况
她的问题是这样的：同一个抗体
一个用抗血清、一个用纯化后的抗体
结果抗血清的片子干净，纯化后抗体的片子和你说的一样

作者: wiwi 时间: 2013-1-19 10:30

最近做大分子200KD的蛋白，显色后条带不是窄条状的，而是沿着泳道散开成一片，成竖带状的了，原因分析下
因为是200KD的，我用的6%的胶，电泳2个小时到溴芬兰出了胶停止的
以前有次用10的胶跑下来条带很漂亮，难道因为6的胶比较稀，蛋白压缩不好，电泳时间长了蛋白弥散开了？/？？

选择湿转了2次，300ma/2.5h，转完预染marker都不是很清楚，立春红也没看见，转膜液是tris 25mM,Gly 192mM,Met 20%,SDS 0.1%,加水到1L，正负绝对没错，三明治也没问题，只好换半干1.5h, 预染marker转过去了，结果显色后就是楼上那样，郁闷

作者: pou 时间: 2013-1-19 10:31

请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:31

可能的问题在你做三明治的时候把胶压的太扁了
在300mA的电流下转缓是很热的
容易把胶压扁
我也出现过你说的这种条带情况
还要检查一下浓缩胶是否凝好
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:31

QUOTE:

原帖由 pou 于 2013-1-19 10:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！

如果做总蛋白的话不需要专门选择膜上的内参
用常用的三种内参就可以
膜上内参有Flotillin

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:32

QUOTE:

如果做总蛋白的话不需要专门选择膜上的内参
用常用的三种内参就可以
膜上内参有Flotillin

作者: 雪花子 时间: 2013-1-19 10:34

有时候做WB在显色的时候会出现方格样的条带，
不是每次都出，没有预见性的，我们做一般都是两块一起做的，做几次都只有一块膜会出格方格，电泳转膜条件都是一样的．不知道怎么引起的，各位有没有出现过这种问题啊？愿有经验的指点一下

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:34

很简单
第一：电泳缓冲液污染（是不是反复使用了？）
第二：转缓应该新配

作者: PPT 时间: 2013-1-19 10:35

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带（如图二），两种方法所得结果不同，请楼主指点！

作者: dreaming 时间: 2013-1-19 10:35

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

作者: seven7 时间: 2013-1-19 10:36

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:41

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带（如图二），两种方法所得结果不同，请楼主指点！

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应该全部选中
我用的是ImageQuant TL
最好用IOD值

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:42

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

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这几天我刚做了GFP的抗体检测与GFP标签蛋白裂解液的检测
我认为你请教的那个老师说的有道理
GFP有时会有小片段存在
另外一抗的稀释度调整下

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:42

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

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25mM tris
192mM glycine
20% methanol
0.1%SDS
配制完成后放置四度冰箱预冷
转膜时降温
130KD还是很好做的
300mA恒流 2h10min
祝你好运

作者: lixi559 时间: 2013-1-19 10:43

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

作者: wiwi 时间: 2013-1-19 10:44

如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:44

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

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抗体在中性环境下最稳定
pH5-8左右都可以
最稳定是7左右
另外稀释抗体的时候加了奶粉等
可以对抗体起一定的保护作用

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:45

如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

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相邻的条带都连在一起吗？
上样量多少ug？

作者: 冰儿0109 时间: 2013-1-19 10:46

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

作者: wmp1234 时间: 2013-1-19 10:48

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:48

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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APS与TEMED的加的量有什么变化？
现在温度升高了
这两者的量是随温度变化而变化的
温度高要少加一些
可能是凝胶速度快
另外插梳子的时候要注意看

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:49

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

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10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗

作者: 喇叭花 时间: 2013-1-19 10:50

您好我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答在线等待

作者: 如影随形 时间: 2013-1-19 10:50

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:51

您好我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答在线等待

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哇
1，上样量太大了，一般蛋白的上样量为20~40ug总蛋白
上样量的大小取决于电泳槽上样孔大小与凝胶的厚度
2，BCA测定蛋白浓度的时候想要准确的话应该至少做双管测定
想让内参很匀的话可以做一次WB，把条带的IOD值读出来，通过IOD值再来调整总蛋白的上样量
3，分离胶在配制的时候没有充分混匀
没有凝充分
浓缩胶与分离胶同样没有处理好
都会出现你说的这种情况
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:51

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

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1，浓缩胶的高度一般在1cm左右，太多了会影响分离胶的高度，进而影响分离胶的分辨率
2，电泳缓冲液是不用调整pH的
建议用双蒸水新配电泳缓冲液，别调整pH

作者: kswl870 时间: 2013-1-19 10:52

相关疾病：
肺癌
我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量，如何选择内参，查文献发现这些上清中不存在β-actin，β-tubulin等常用的内参，但看到有人提到可引入外源性的参照物，好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中，再进行western，由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的，因此，也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗？还有没有其它的办法比较？

作者: douding66 时间: 2013-1-19 10:53

我想问，我做小鼠的VEGF Western blot , 我该选择什么样的一抗呢？VEGF亚型比较多。

作者: 如影随形 时间: 2013-1-19 10:53

我们的浓缩胶高度是按照梳子孔一下1cm左右留的，现在的主要问题是蛋白在浓缩胶跟分离胶里都一直分离，就没有被压缩。
然后我们的电泳缓冲液是调成8.3，好像就是因为出过类似的问题，然后才强调要调pH的，5*，1*都这样调的，您认为这个可能是问题的所在是吧。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:54

相关疾病：
肺癌

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我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量，如何选择内参，查文献发现这些上清中不存在β-actin，β-tubulin等常用的内参，但看到有人提到可引入外源性的参照物，好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中，再进行western，由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的，因此，也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗？还有没有其它的办法比较？

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上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白？
加入纯化好的beta-actin？
我觉得行不通

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:55

我想问，我做小鼠的VEGF Western blot , 我该选择什么样的一抗呢？VEGF亚型比较多。

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我做过骨骼肌的VEGF，结果不错的
没有分亚型
亚型由你的研究目的决定啊
我用的抗体是santa cruz的

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:55

我们的浓缩胶高度是按照梳子孔一下1cm左右留的，现在的主要问题是蛋白在浓缩胶跟分离胶里都一直分离，就没有被压缩。
然后我们的电泳缓冲液是调成8.3，好像就是因为出过类似的问题，然后才强调要调pH的，5*，1*都这样调的，您认为这个可能是问题的所在是吧。

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电泳缓冲液的pH你调整他干嘛？不用调的
这么多年了重来没有在电泳缓冲液上出过问题
另外你测定一下你的浓缩胶储液现在的pH是多少
测定之前建议你校正pH计先

作者: pou 时间: 2013-1-19 10:56

相关疾病：
肿瘤
在文献中查不到在该肿瘤中VEGF具体是哪个亚型，我想找个能抗4个亚型的，在abcam公司有一个小鼠单抗，与人、小鼠反应，那几个都针对几个亚型，不知我是否可选这个小鼠单抗？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:56

QUOTE:

原帖由 pou 于 2013-1-19 10:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
肿瘤
在文献中查不到在该肿瘤中VEGF具体是哪个亚型，我想找个能抗4个亚型的，在abcam公司有一个小鼠单抗，与人、小鼠反应，那几个都针对几个亚型，不知我是否可选这个小鼠单抗？ ...

当然可以的

作者: qianqin1977 时间: 2013-1-19 10:57

上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白？
加入纯化好的beta-actin？
我觉得行不通

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我收集所有的培养液后，超滤离心浓缩。那如何设参照，还有什么办法比较吗？能不能在上量样相同的情况下，不要参照来比较？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:57

QUOTE:

原帖由 qianqin1977 于 2013-1-19 10:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白？
加入纯化好的beta-actin？
我觉得行不通

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我 ...

不好意思
分泌型蛋白我没这么做过
你要定量吗？
不定量的话不需要内参了

作者: NBA 时间: 2013-1-19 10:58

可以试试IP

作者: qianqin1977 时间: 2013-1-19 10:59

不好意思
分泌型蛋白我没这么做过
你要定量吗？
不定量的话不需要内参了

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不要内参的话，保证上样量一样，可以作为半定量吗

作者: 箭头儿 时间: 2013-1-19 11:00

我准备做细胞内的p-ERK和ERK，想问下磷酸化的蛋白跑时要注意些什么？还有胶的浓度要多少最佳？内参要用什么？可以用β-actin吗？但它和这两个蛋白分子量接近，我可以再加个样单独检测β-actin做为内参吗？也看到有用总ERK做为内参的，如果总的ERK量不变还要另外跑内参吗？
因为刚刚接触WB，有很多问题不是太明白，特请教，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:00

QUOTE:

原帖由 箭头儿 于 2013-1-19 11:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我准备做细胞内的p-ERK和ERK，想问下磷酸化的蛋白跑时要注意些什么？还有胶的浓度要多少最佳？内参要用什么？可以用β-actin吗？但它和这两个蛋白分子量接近，我可以再加个样单独检测β-actin做为内参吗？也看到有用总ERK做为内参 ...

1，你可以选择beta-tubulin或者GAPDH作为内参
2，磷酸化蛋白要注意在蛋白提取的时候在裂解液中加入磷酸酶抑制剂，这是很关键的
3，可以选择用12%分离胶，5%浓缩胶
4，总ERK是作为磷酸化ERK的内参，但是还需要内参来定量ERK

作者: 羊咩咩 时间: 2013-1-19 11:01

我看到您在回答不高兴和没头脑的问题时提到一抗和二抗都是用1倍TBST或PBS稀释。我们实验室里一抗用一抗稀释液稀释，二抗用5%牛奶稀释，这两种方法有区别么？是不是对结果影响不大？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:01

所谓的一抗稀释液主要成分也就是TBST之类的
在封闭液中稀释抗体效果会好一些

作者: 羊咩咩 时间: 2013-1-19 11:02

请问做WB的效价比度是不是越高越好啊

作者: 33号 时间: 2013-1-19 11:03

请问，我最近做了些western，
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是：上样总蛋白75ug，配10％的胶，电泳时最小为10kd的marker还留着，PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过，封闭后一抗过夜。TBST洗膜，二抗1.5h，TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21，bax，survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论：
对于转膜时间和电流大小没有一致的看法：有人认为半个小时，200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的，转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子，所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来，但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何？PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧？
我需要做怎样的调整。
我今天做，自己初步的调整如下：
1、胶配成12％
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:03

请问做WB的效价比度是不是越高越好啊

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1，一个是效价比
2，一个是特异性

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:04

请问，我最近做了些western，
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是：上样总蛋白75ug，配10％的胶，电泳时最小为10kd的marker还留着，PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过，封闭后一抗过夜。TBST洗膜，二抗1.5h，TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21，bax，survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论：
对于转膜时间和电流大小没有一致的看法：有人认为半个小时，200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的，转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子，所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来，但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何？PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧？
我需要做怎样的调整。
我今天做，自己初步的调整如下：
1、胶配成12％
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少？

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Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h，注意降温

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:04

一抗浓度应该多试几个
我一般常用3个浓度梯度来做预实验

作者: yonger 时间: 2013-1-19 11:12

我做得western的条带时好时坏，有时候能做出来比较规矩的一个棒状的条带，但有的时候条带形状非常不规则，蝌蚪型，哑铃型的，从中间断裂开的，只有半条的，上突下凹的什么都有，请教一下是什么原因，该注意些什么步骤以避免这种情况？

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我感觉不太像是电泳问题，因为使用的预染的marker，在SDS-PAGE的阶段条带还是比较整齐的，转膜缓冲液通常只重复用一次

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:12

QUOTE:

原帖由 yonger 于 2013-1-19 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我做得western的条带时好时坏，有时候能做出来比较规矩的一个棒状的条带，但有的时候条带形状非常不规则，蝌蚪型，哑铃型的，从中间断裂开的，只有半条的，上突下凹的什么都有，请教一下是什么原因，该注意些什么步骤以避免这种情况？

= ...

我认为就是电泳的问题
电泳之后染过胶吗？
如果有把图片放上来看看
中间断开或者哑铃型我认为是你转膜时胶与膜之间的气泡
另外杂交抗体的时候气泡没有赶好
在条带附近处孵育的时候留有了气泡
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:13

第二张图蛋白上样量太大
减低5倍上样

作者: yonger 时间: 2013-1-19 11:14

我还有个问题，我可以在同一块胶上一组样上检测ERK，再重复加样后检测β-actin做为内参吗？因为我手头正好有β-actin，而没有你说的另外两种内参，我经费又不多，想看怎么能充分利用起来，
谢谢！

作者: yonger 时间: 2013-1-19 11:15

非常感谢你的意见。
考染做得比较少，我下次试试看，以前偶尔染过一两次感觉还可以
通常我制样就是加PBS用细胞刮刀收集细胞，放-20备用，用的时候就加loading buffer煮3-5min, 超声一下超断DNA，然后离心12000rpm 5min，取上清上样

你觉得转膜的时候只用一层普通滤纸会不会可能导致这个呢？
因为biorad的厚滤纸比较贵，所以用的一般的滤纸，一般推荐说是要上下各用3层，但是我发现三层滤纸很容易在层与层之间带入气泡，所以我就只上下各用了一层
另外，膜的质量问题有没有可能呢？

非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 11:15

1，样品处理应该没有问题，但是胶凝的好不好可以通过电泳染胶看出来
2，湿转滤纸只起支持作用，不像半干作为电极，把气泡压出来就行
3，膜的质量有问题：我用Millipore的NC膜，现在用到最后了发现做dot blot时膜不容易吸附蛋白，因此要注意膜的保质期

作者: 羊咩咩 时间: 2013-1-19 11:17

我还有个问题，我可以在同一块胶上一组样上检测ERK，再重复加样后检测β-actin做为内参吗？因为我手头正好有β-actin，而没有你说的另外两种内参，我经费又不多，想看怎么能充分利用起来，
谢谢！

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ERK检测完成后用stripping buffer洗去一抗与二抗
然后封闭
再用beta-actin来孵育
很好的

作者: 轰轰 时间: 2013-1-19 11:18

你好，不知道有用人血浆做为一抗做western的同学吗？

血浆成分复杂，有什么办法可以减少非特异性反应的条带，如何使胶片背景更干净透亮？

谢谢！

作者: douding66 时间: 2013-1-19 11:19

QUOTE:

原帖由轰轰于 2013-1-19 11:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，不知道有用人血浆做为一抗做western的同学吗？

血浆成分复杂，有什么办法可以减少非特异性反应的条带，如何使胶片背景更干净透亮？

谢谢！ ...

用人的血浆做为一抗？
不是很了解
我做过血浆 Fibrinogen alpha，beta的WB
条件摸好没有非特异性条带
good luck

作者: 轰轰 时间: 2013-1-19 11:20

再请教老师一下：
最近我做了两次，没有条带，背景很脏。我想问一下：
1.封闭用常温摇两小时好还是四度过夜好(这两次我用的是4度过夜）
2.一抗使用5%的脱脂奶粉稀释好还是TBST好（这两次我用的是TBST)
3.我没有摸抗体浓度。抗体是国产的多抗，推荐浓度为1：100-1：400.我直接用1：300的。就是背景很脏，连杂带都看不见。
4.我的两个蛋白是20 Kd 和29Kd,用多大的胶跑好呢。我用的是12%的。感觉Marker跑的还可以，我的marker 有八条带，最好的时候跑出了七条带，一般都是六条，是不是我的胶浓度不行。
再次感谢老师回答！

作者: nn255 时间: 2013-1-19 11:20

请教领导,
我想半定量检测细胞外组织液中的蛋白,应该用什么样的内参啊?

作者: ero11 时间: 2013-1-19 11:23

再请教老师一下：
最近我做了两次，没有条带，背景很脏。我想问一下：
1.封闭用常温摇两小时好还是四度过夜好(这两次我用的是4度过夜）
2.一抗使用5%的脱脂奶粉稀释好还是TBST好（这两次我用的是TBST)
3.我没有摸抗体浓度。抗体是国产的多抗，推荐浓度为1：100-1：400.我直接用1：300的。就是背景很脏，连杂带都看不见。
4.我的两个蛋白是20 Kd 和29Kd,用多大的胶跑好呢。我用的是12%的。感觉Marker跑的还可以，我的marker 有八条带，最好的时候跑出了七条带，一般都是六条，是不是我的胶浓度不行。
再次感谢老师回答！

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1，封闭建议RT 30min或者4度过夜
2，建议用封闭液稀释抗体，这样在抗体孵育过程中还可以起封闭作用
3，多抗稀释度这么低啊，建议你换厂家
4，联杂带都没有的话可能是你的蛋白没有提出来抑或是降解了，如果是磷酸化的要加磷酸酶抑制剂
5，用15%的分离胶比较好

作者: ero11 时间: 2013-1-19 11:23

请教领导,
我想半定量检测细胞外组织液中的蛋白,应该用什么样的内参啊?

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蛋白是分泌到细胞培养液中还是什么？

作者: 婴儿脸 时间: 2013-1-19 11:24

APS与TEMED的加的量有什么变化？
现在温度升高了
这两者的量是随温度变化而变化的
温度高要少加一些
可能是凝胶速度快
另外插梳子的时候要注意看

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把TEMED的量降了，冬天加的20微升，现在加12左右，请问APS的量还需要调整吗？

作者: 婴儿脸 时间: 2013-1-19 11:25

把TEMED的量降了，冬天加的20微升，现在加12左右，请问APS的量还需要调整吗？

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APS的量也应该相应的减少

作者: purrr 时间: 2013-1-19 11:28

老师您好，我遇到了和“不高兴和没头脑”同样的问题了，用的也是santa cruz的p53的一抗，推荐稀释度1：100~1000，我试了1：400和1：200的一抗稀释度，用5%milk-TBST稀释的，二抗是进口的1：4000稀释的，也是整张膜都是亮的，就是没目的条带，挺郁闷人的。我做其它的蛋白，都用的是这个二抗稀释度，也还行啊。是一抗浓度太高的原因么。其它电泳，转膜，封闭，洗膜应该不会有问题的，因为做其它分子都还挺好的，准备做做这个p53的分子看看，结果出现了这个问题，盼解答，谢谢！

作者: PPT 时间: 2013-1-19 11:31

老师您好，我遇到了和“不高兴和没头脑”同样的问题了，用的也是santa cruz的p53的一抗，推荐稀释度1：100~1000，我试了1：400和1：200的一抗稀释度，用5%milk-TBST稀释的，二抗是进口的1：4000稀释的，也是整张膜都是亮的，就是没目的条带，挺郁闷人的。我做其它的蛋白，都用的是这个二抗稀释度，也还行啊。是一抗浓度太高的原因么。其它电泳，转膜，封闭，洗膜应该不会有问题的，因为做其它分子都还挺好的，准备做做这个p53的分子看看，结果出现了这个问题，盼解答，谢谢！

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P53还是很好做的
先确定二抗的稀释度
再做一抗的预实验

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-1-19 11:32

老师您好：我想做个P糖蛋白的western blot定量，查了很多国内外资料基本上都是c219的一抗，辣根过氧化物酶的二抗，ECL显色。但是学校这边就有常规的鼠、兔、羊（碱性磷酸酶）二抗，BCIP/NBT显色，这样一套。由于学校的价格便宜，想在学校做。不知道这两个路线有什么不同，是否可以用学校的做？原来以为这两个途径差别不大，可是现在一抗买了，也是推荐辣根过氧化物酶的二抗，ECL显色。所以正在发愁，希望老师给点意见。

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-1-19 11:33

糖蛋白有拖尾现象
最好用BSA来封闭
ECL显色灵敏度高
我也建议你用ECL显色

作者: purrr 时间: 2013-1-19 11:34

目前估计改ECL 不可能了经费不允许
问下用常规的鼠、兔、羊（碱性磷酸酶）二抗，BCIP/NBT显色，能否做P糖蛋白？除了注意BSA来封闭外还应该注意什么？

作者: jkobn 时间: 2013-1-19 11:34

蛋白是分泌到细胞培养液中还是什么？

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protein is in the wound fluid

作者: jkobn 时间: 2013-1-19 11:34

protein is in the wound fluid

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like in the serum

作者: biabiade 时间: 2013-1-19 11:46

不要内参的话，保证上样量一样，可以作为半定量吗

作者: finger 时间: 2013-1-19 11:55

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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分离胶灌完后是用蒸馏水液封的吗？我以前用乙醇封也出现类似的问题，后来用水封就解决了。如果气泡不大，不会有影响的，我染胶试过。

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-1-19 12:00

我在做小鼠脑蛋白的提取，用的是公司购买的RIPA裂解液，取一半脑组织约200mg，加1ml裂解液，10ul100mMPMSF，电动匀浆器，匀浆之后，冰上半小时，13，000rpm离心半小时，取上清，电泳
12%PAGE胶，电泳，考染后看不到15KD以下的条带，
请有经验的战友，指点一下，到底哪里操作有问题，提取小分子量蛋白有什么需要注意的地方，谢谢，我的目的蛋白11KD ，
另外我的小蛋白SUMO会和其他蛋白结合，也会杂下来我想同时看100以上的条带，是否该选择梯度胶，浓度范围应选择多少呢，期待解答，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:01

请教一下，我想配30%Acr-Bis（29：1），买回来的amresco的干粉标注的是40g，使用说明让蒸馏水溶解定容到100ml，这岂不是成了40%的溶液了？是否应该定容到120多ml？

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是的

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:01

请教一下，我想配30%Acr-Bis（29：1），买回来的amresco的干粉标注的是40g，使用说明让蒸馏水溶解定容到100ml，这岂不是成了40%的溶液了？是否应该定容到120多ml？

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应该120ml
不好定容
直接加120ml水溶解

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:01

我在做小鼠脑蛋白的提取，用的是公司购买的RIPA裂解液，取一半脑组织约200mg，加1ml裂解液，10ul100mMPMSF，电动匀浆器，匀浆之后，冰上半小时，13，000rpm离心半小时，取上清，电泳
12%PAGE胶，电泳，考染后看不到15KD以下的条带，
请有经验的战友，指点一下，到底哪里操作有问题，提取小分子量蛋白有什么需要注意的地方，谢谢，我的目的蛋白11KD ，
另外我的小蛋白SUMO会和其他蛋白结合，也会杂下来我想同时看100以上的条带，是否该选择梯度胶，浓度范围应选择多少呢，期待解答，谢谢

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裂解液的量有些少
一般用1：9或者1：10（组织重量：裂解液量）
100K不需要用梯度胶
15K以下条带本来就较少

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:02

分离胶灌完后是用蒸馏水液封的吗？我以前用乙醇封也出现类似的问题，后来用水封就解决了。如果气泡不大，不会有影响的，我染胶试过。

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正确的方法是用饱和的异丁醇来封
一般用蒸馏水封也挺好
染胶影响不大但是转膜后还是有影响的
看气泡的位置在那

作者: koook5695 时间: 2013-1-19 12:03

用人的血浆做为一抗？
不是很了解
我做过血浆 Fibrinogen alpha，beta的WB
条件摸好没有非特异性条带
good luck

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您能告诉我一下您跑 Fibrinogen 的具体情况吗？谢谢啊，我是新手，我以后也要跑，现在才刚刚开始试着跑内参，非常感谢！
包括电泳浓缩和分离胶的浓度和时间，转膜条件，上样量，一抗和二抗稀释度等等，谢谢啊！！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:04

QUOTE:

原帖由 koook5695 于 2013-1-19 12:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用人的血浆做为一抗？
不是很了解
我做过血浆 Fibrinogen alpha，beta的WB
条件摸好没有非特异性条带
good luck

================================================================================================== ...

1，测定蛋白浓度，把上样时的蛋白浓度调整至5mg/ml（蛋白浓度如果大的话变性时会有沉淀）
2，Fibrinogen alpha与beta用10%分离胶，5%浓缩胶
3，转膜半干 1.2mA每平方厘米膜面积，恒流时间 1h30min
4，上样量做这两个蛋白是20ug，因为这两个在血液中丰度较高，其他蛋白你要查查丰度
5，一抗、二抗稀释没法说，因为每个都不同，你先看说明书进行

作者: 米西11米西 时间: 2013-1-19 12:04

先确定二抗的稀释度
再做一抗的预实验

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老师您好，我试了二抗1：8000，一抗1：1000，结果背影稍微好点，但还是脏，而且连marker也出现条带了，如图所示。这种情况是继续稀释一抗呢还是继续稀释二抗呢？谢谢。

作者: 羊咩咩 时间: 2013-1-19 12:05

从条带来看你的电泳跑的不好
分离胶没有凝好
二抗用1：20000
你用什么ecl？

作者: bgf5 时间: 2013-1-19 12:05

谢谢楼主，受益匪浅。
我还有个问题Cell signaling的phospho-p38一抗，它的最佳稀释比例是多少？我是做细胞的，这个一抗稀释液可以用1%牛奶的TBST稀释吗？我在别的地方看见过，恳请回答！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:06

QUOTE:

原帖由 bgf5 于 2013-1-19 12:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢楼主，受益匪浅。
我还有个问题Cell signaling的phospho-p38一抗，它的最佳稀释比例是多少？我是做细胞的，这个一抗稀释液可以用1%牛奶的TBST稀释吗？我在别的地方看见过，恳请回答！ ...

cell signaling 的抗体一抗的起始稀释比例是1：1000（不同的抗体均不同：厂家，批次等）
我建议你做两个稀释度1：1000与1：2000的预实验
稀释比例的大小还要取决于二抗及ECL的敏感性
抗体稀释液最好用5%的奶粉或者BSA
与封闭液相同
你做的是磷酸化的蛋白，用BSA
good luck

作者: xyw5 时间: 2013-1-19 12:06

想请教一下：我做的蛋白SUMO本身大小很小12KD，但是它可以修饰别的蛋白，与泛素类似，因此会blot下来，大小就比较大>100KD,我现在想在一块胶上做，请教一下转膜的条件：用多大孔径的膜，小孔径膜对大蛋白会有影响吗？转膜时间怎么控制呢？保证大分子量蛋白转过去，小蛋白会不会转过了呢？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:07

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-1-19 12:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想请教一下：我做的蛋白SUMO本身大小很小12KD，但是它可以修饰别的蛋白，与泛素类似，因此会blot下来，大小就比较大>100KD,我现在想在一块胶上做，请教一下转膜的条件：用多大孔径的膜，小孔径膜对大蛋白会有影响吗？转膜时间怎么控制 ...

这样的目的就得考虑用梯度胶了
5%至15%的梯度
转膜时间300mA 1h
0.22um孔径膜

作者: 云端ing 时间: 2013-1-19 12:07

问下资料上报道的用过氧化物酶为二抗，可否改为碱性磷酸酶二抗，对试验结果有什么影响？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:08

QUOTE:

原帖由 kent 于 2013-1-19 12:08 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，什么叫外源性内参，以血浆为样品时，如何在血浆中引入外源性内参

HRP与AP在显色方法上不同
HRP采用ECL系统
AP采用BCIP/NBT系统
当然可以改用了
HRP的敏感性比AP要高

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:09

楼主，什么叫外源性内参，以血浆为样品时，如何在血浆中引入外源性内参

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血浆样品可以选择GAPDH作为内参

作者: summerxx 时间: 2013-1-19 12:10

血浆样品可以选择GAPDH作为内参

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血浆中GAPDH不恒定啊，有没有文章使用这个方法的，若研究培养液上清，应该取什么内参，谢谢。在线等

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:15

血浆中GAPDH不恒定啊，有没有文章使用这个方法的

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你可以搜索一下你研究课题的文献
看看他们做同样的蛋白用什么做内参
这样最保险
你也可以把目的蛋白名称告诉我
我帮你查

作者: DONT 时间: 2013-1-19 12:16

你可以搜索一下你研究课题的文献
看看他们做同样的蛋白用什么做内参
这样最保险
你也可以把目的蛋白名称告诉我
我帮你查

==============================================================================================================

谢谢。不是做什么蛋白的问题，就是想用western 比较一下不同培养液上清中某种蛋白水平，相关文献只是在上样量相同的情况下半定量对比。我也只是要初步比较一下，看6种蛋白质中哪种表达差异最大，在后续再用ELISA测这种差异最大的蛋白在不同人群中的表达情况

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:16

谢谢。不是做什么蛋白的问题，就是想用western 比较一下不同培养液上清中某种蛋白水平，相关文献只是在上样量相同的情况下半定量对比。我也只是要初步比较一下，看6种蛋白质中哪种表达差异最大，在后续再用ELISA测这种差异最大的蛋白在不同人群中的表达情况

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是这样啊
培养上清液中用什么样的内参我没有碰到过
不好意思
祝你好运

作者: seven7 时间: 2013-1-19 12:17

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

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您提到的检测二抗的稀释度，用的是新NC膜吗？并不是转过了蛋白的那个膜是吧，在一个膜上同时进行几个点杂交？谢谢啊

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:18

您提到的检测二抗的稀释度，用的是新NC膜吗？并不是转过了蛋白的那个膜是吧，在一个膜上同时进行几个点杂交？谢谢啊

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用点杂交
新的NC膜
一张膜上可以进行多个稀释度的检测

作者: zzzz 时间: 2013-1-19 12:18

从条带来看你的电泳跑的不好
分离胶没有凝好
二抗用1：20000
你用什么ecl？

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谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:19

谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！

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Marker也是蛋白
有时候就是能显出条带来的
一抗可以1：2000，1：4000
二抗稀释10倍以上

作者: 昙花花花 时间: 2013-1-19 12:19

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:20

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？

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糖基化蛋白有拖尾现象
一抗浓度可以调高一些
用1：100 4度孵育过夜
另外调整条件后仍有非特异性带只能说明抗体的特异性比较差了

作者: wu11998866 时间: 2013-1-19 12:20

楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2.转膜条件太强了吗，转过了？我看到过别人说这样的条件可以啊。
3.以前按这种条件做下来，冲片子出来条带贴别弥散，而且很浅很难看。是跑胶时的问题吗？
谢谢楼主！

作者: 羊咩咩 时间: 2013-1-19 12:21

QUOTE:

原帖由 wu11998866 于 2013-1-19 12:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2. ...

对于170K的蛋白来说转膜条件一点都不强
我都用恒流，170K的话 300mA 2h
条带弥散与盐浓度、胶凝固的好坏有关
还有就是Acr与Bis-的比例

作者: dream2013 时间: 2013-1-19 12:22

这里真热闹，我也有问题

1请问一抗和二抗的浓度怎么确定，请说的详细点
2我做western时，曝光后可以看出pvdf膜上有蛋白质条带，但确暴不出来（用同一批样品做过，可以曝出条带；我用的是酪氨酸磷酸化抗体，可以杂出十几kd，四十多kd，九十多kd，100多kd。）

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:22

QUOTE:

原帖由 dream2013 于 2013-1-19 12:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

这里真热闹，我也有问题

1请问一抗和二抗的浓度怎么确定，请说的详细点
2我做western时，曝光后可以看出pvdf膜上有蛋白质条带，但确暴不出来（用同一批样品做过，可以曝出条带；我用的是酪氨酸磷酸化抗体，可以杂出十几kd，四十多kd， ...

首先确定二抗的稀释度
然后用不同的一抗稀释度来做预实验（因为二抗浓度已经确定，这会就不需要调整二抗浓度了）
另外你说的爆不出条带是什么意思

作者: H2O 时间: 2013-1-19 12:24

请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！

作者: yjf1026 时间: 2013-1-19 12:24

心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:25

请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！

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上样量太大
另外你注意看胶有没有凝好
分离胶凝胶时间要2h左右
可以先跑电泳染胶看看
你的浓缩胶胶孔之间梳子有问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:25

请教fangweibin119……心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。

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心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

作者: H2O 时间: 2013-1-19 12:25

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成一条线的问题，非常郁闷，请楼主帮忙出出主意，问题出在哪里。非常感谢！蛋白是刚提的，用的是碧云天WB试剂！

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-1-19 12:26

QUOTE:

原帖由 H2O 于 2013-1-19 12:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成 ...

这和漏不漏影响不大
应该是你总体蛋白的上样量太大

作者: H2O 时间: 2013-1-19 12:26

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

作者: 张先生 时间: 2013-1-19 12:27

楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:27

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

==============

120ug总蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:28

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

================

用多大厚度的胶？
几孔的？
上样量太大了

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:31

楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！

===============

说的具体些

作者: zzzz 时间: 2013-1-19 12:32

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

=================================================================================================

用的是碧云天的SDS裂解液，提取后测蛋白浓度在14mg/ml的样子，胶倒是没染过……怎样判断蛋白是否提取完全？

作者: free 时间: 2013-1-19 12:33

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

作者: zzzz 时间: 2013-1-19 12:33

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

=============================================================================================================

另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:34

用的是碧云天的SDS裂解液，提取后测蛋白浓度在14mg/ml的样子，胶倒是没染过……怎样判断蛋白是否提取完全？

========================================

先通过电泳染胶
看目的分子量附近的条带怎样
另外看提取有没有完全就靠后续的实验步骤了

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:34

另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！

=====================

当然可以用总蛋白来做WB
裂解的时候注意在冰上操作

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:34

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

========================

呵呵
去年这个时候我做过VEGF
大鼠腓肠肌的
受体没做过
我用的santa 的一抗
效果我觉得还行

作者: JK.jon 时间: 2013-1-19 12:35

首先非常感谢你及时给大家这么多的帮助！我是新手，有个问题请教。我W的结果没有条带，自己将膜丽春红染色无蛋白条带，同时一起转膜的同学是有W的条带的，他的分子量是200KD，我的是110kd。前面电泳条件是100v，120V，湿转100v 2h，但电转液中没有0.1%SDS（不知是否影响，我们实验室常规是这样配的，其他成分同园子里的常规），请问是我的蛋白降解了吗？前几天看到丽春红染色都是要带的，包括110kd。请指点，万分感激！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 12:36

大分子量蛋白转移的时候是要加0.1%的SDS的
我一般用的转移缓冲液中用0.01%SDS这样大分子量与小分子量都用同样的转移缓冲液
蛋白是否降解你要了解一下你的蛋白的背景信息
另外在提取液中要尽可能多的加入抑制剂
good luck

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-19 14:34

太感谢楼主了，我想问一下有没有SW480结肠腺癌的照片？如果有将不胜感激。

作者: jujuba 时间: 2013-1-19 14:34

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非小细胞肺癌
[原创]：
1.细胞种类：人非小细胞肺癌A549细胞株
2.培养天数：对数生长期细胞；
3.放大倍数：荧光显微镜白片
4.培养基种类：MEM+10%胎牛血清
5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长，分散良好

作者: jujuba 时间: 2013-1-19 14:37

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非小细胞肺癌
[原创]：
1.细胞种类：人非小细胞肺癌A549细胞株
2.培养天数：对数生长期细胞；
3.放大倍数：荧光显微镜×400
4.培养基种类：MEM+10%胎牛血清
5.细胞状态与特征简述：胞质着色均匀，胞核较暗

作者: jujuba 时间: 2013-1-19 14:39

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caroline0701
[原创]：
1.细胞种类：人黑色素瘤细胞株A375p
2.培养天数：对数生长期细胞；
3.放大倍数：荧光显微镜×400
4.培养基种类：MEM+10%胎牛血清
5.细胞状态与特征简述：胞质染成亮绿色，胞核着色较暗淡，细胞多核

作者: ladyhuahua 时间: 2013-1-19 14:40

请问仁兄,这些都是那里来得,是自己养的拍的吗??谢过

作者: jujuba 时间: 2013-1-19 14:41

[原创]：
1.细胞种类：ht-1080
人皮肤纤维肉瘤细胞株
2.培养天数：传代后第3-4天；
3.放大倍数：倒置显微镜 X10；
4.培养基种类：MEM+10%胎牛血清
5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生长，不规则梭型

作者: jujuba 时间: 2013-1-19 14:43

[原创]：
1.细胞种类：人前列腺LNCaP细胞
2.培养天数：传代后第3天；
3.放大倍数：X10,倒置显微镜微分干涉；
4.培养基种类：RPMI-1640+10%胎牛血清
5.细胞状态与特征简述：贴壁生长，梭型

作者: JK.jon 时间: 2013-1-19 14:44

搂主有没有ATCC U-87 MG 的照片阿？

作者: wood533 时间: 2013-1-19 14:47

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有没有人肝癌BEL-7402及其5-FU耐药细胞株的图片啊?

作者: wood533 时间: 2013-1-19 14:47

有没有人口腔鳞癌KB和KB/V细胞株的图片啊?

作者: wood533 时间: 2013-1-19 14:47

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楼主,人肝癌BEL-7402及其5-FU耐药细胞株、人口腔鳞癌KB和KB/V细胞株图片有没有呀？或者上哪可以搜索到呢？

作者: yes4 时间: 2013-1-19 14:48

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YAC-1细胞在；小鼠淋巴瘤细胞，ATCC信息：悬浮生长，淋巴母细胞形态，生长介质：RPMI1640，10％FCS,2-3天换液。自己体会:细胞成团生长，轻晃后即可散开。
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作者: ritou1985 时间: 2013-1-19 14:48

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哪位有结肠癌细胞RKO的图片，发几张可以么？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-19 14:49

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我在前面好象没看到很多乳腺癌细胞的图片，这是我们实验室的乳腺癌细胞图片，不全，请大家包涵。这是T47D。

作者: wmp1234 时间: 2013-1-19 14:50

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这是我们实验室的MCF-7 乳腺癌细胞有所变异

作者: wmp1234 时间: 2013-1-19 14:50

经常用到的一种细胞 NIH 3T3

作者: flower-201 时间: 2013-1-19 14:51

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【原创】HepG2（药物诱导凋亡）；
1.细胞种类：HepG2（人肝癌细胞）；
2.培养的天数：药物诱导凋亡48小时；
3.放大倍速：荧光显微镜 X400；
4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；
5.细胞状态与特征简述:淡染的兰色为正常细胞,强染的兰色荧光为凋亡细胞,黄色箭头所指为凋亡细胞浓缩的核,红色箭头所指为凋亡小体

作者: flower-201 时间: 2013-1-19 14:53

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1.细胞种类：HepG2（人肝癌细胞）；
2.培养的天数：药物诱导凋亡48小时；
3.放大倍速：荧光显微镜 X400；
4.培养基种类：1640+10%胎牛血清；
5.细胞状态与特征简述:箭头所指为凋亡细胞碎裂的核

作者: 3N4G 时间: 2013-1-19 14:53

有没有HL-60细胞的图呀

作者: hold住 时间: 2013-1-19 14:53

相关疾病：
肝癌白血病前列腺癌骨肉瘤肿瘤嗜铬细胞瘤食管癌前列腺癌黑色素瘤乳腺癌
终于整理出来了，很有帮助的帖子，有个索引就更好了！
我整理一个目录，以方便大家的查找：

1\食管癌细胞株表达MMP－2：
2\SGC7901细胞
3\Hepg2
4\hepg22.1.5
5\hepg22.1.5
6\用Psuper-HIFSiRNA载体转染A549的细胞：
7\用Psuper-HIFSiRNA载体转染A549的细胞：
8\肝癌HepG2细胞株；
9\组织细胞淋巴瘤：U937
10\人前列腺癌细胞：PC－3
11\人原髓细胞白血病：HL-60
12\大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞：PC-12
13\人乳腺腺癌细胞：MCF-7
14\人肺癌细胞：A549；
15\ GH3细胞株(垂体瘤细胞)
16\SK-BR-3细胞
17\大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞
18\人肝癌细胞(原代)
19\人鳞癌细胞Tca8113
20\人腺样囊性癌细胞ACC-2
21\人成骨肉瘤细胞Saos-2细胞
22\ Daudi细胞
23\Caco-2细胞
24\PC-12
25\乳腺癌细胞表面超微结构，癌细胞利用表面的突起：丝状伪足（pseudopodia）完成对靶器官的侵袭转移功能。
26\小鼠黑色素瘤转移株（B16-F10）
27\小鼠黑色素瘤细胞（B16BL6）
28\Wistar大鼠肝癌细胞：传代后2～3天的细胞图片
29\ Hep-2细胞：
30\sp2/0
31\结肠癌CoLo320 细胞株
32\人膀胱癌T24细胞
33\ PC3前列腺癌细胞：
34\人肾癌癌细胞株
35\人宫颈癌细胞株Hela
36\人宫颈癌细胞株Hela
37\osteosarcoma cell line poorly metastatic FBJ-S1 cell obtained from an FBJ virus-induced osteosarcoma of a BALB/c mouse；
38\osteosarcoma cell line FBJ-S1 cell variant highly metastatic FBJ-LL cell
39\【原创】ccc-HPF-1
40\【原创】CTLL-2
41\【原创】HT-1080
42\人口腔皮样癌KB细胞株；
43\人骨肉瘤细胞株MG63；
44\DU-145
45\【原创】SMMC-7721
46\【原创】LS-174T
47\图片SPC-A1人肺腺癌细胞(继代)；
48\【原创】人前列腺癌细胞(继代)肿瘤株：DU145
49\【原创】白血病细胞(继代)肿瘤株：K562
50\（原创）人大肠癌扫描电镜图,正常的lovo细胞
51\人大肠癌扫描电镜图(凋亡)细胞株：lovo
52\（原创）人大肠癌透射电镜图处于凋亡早期的lovo细胞
53\（原创）人大肠癌透射电镜图处于凋亡中期的lovo细胞
54\【标准】鼠白血病肿瘤细胞：RAW 264.7
55\7721细胞系，肝癌细胞系
56\名称：人横纹肌肉瘤
57\A549：人肺癌细胞
58\BGC823：人胃腺癌细胞
59\C6：大鼠神经胶质瘤成纤维细胞
60\K562：人白血病细胞
61\L02：人正常胎肝细胞系
62\前列腺癌pc－3细胞株
63\HOS细胞系，人骨肉瘤细胞系
64\9901细胞系，人骨肉瘤细胞系
65\MGC803,人胃癌细胞
66\1.细胞种类：艾氏腹水癌细胞EAC；
67\1.细胞种类：人肉瘤细胞
68\1.细胞种类：人胚小肠细胞
69\稳定转染EYFP的MCF-7乳腺癌细胞
70\细胞种类：B16黑色素瘤细胞
71\K562细胞
72\K562细胞

作者: hold住 时间: 2013-1-19 14:54

73\【原创】PC12细胞
74\SNU-5细胞：
75\人非小细胞肺癌A549细胞株
76\人非小细胞肺癌A549细胞株
77\人黑色素瘤细胞株A375p
78\ht-1080人皮肤纤维肉瘤细胞株
79\人前列腺LNCaP细胞
80\再发一张本人原创的细胞图片，描述同上，放大20倍。
81\YAC-1细胞
83\L1210：小鼠淋巴细胞白血病细胞株
84\我们的HeLa细胞
85\乳腺癌细胞T47D。
86\这是我们实验室的MCF-7 乳腺癌细胞有所变异
87\经常用到的一种细胞 NIH 3T3
88\【原创】HepG2（药物诱导凋亡）；
89\【原创】HepG2（药物诱导凋亡）

作者: NBA 时间: 2013-1-19 14:55

您提到的检测二抗的稀释度，用的是新NC膜吗？并不是转过了蛋白的那个膜是吧，在一个膜上同时进行几个点杂交？谢谢啊

================================

用点杂交
新的NC膜
一张膜上可以进行多个稀释度的检测

作者: dongdongqiang 时间: 2013-1-19 14:55

从条带来看你的电泳跑的不好
分离胶没有凝好
二抗用1：20000
你用什么ecl？

============================================================================================================

谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！

作者: youyou99 时间: 2013-1-19 14:59

QUOTE:

原帖由 dongdongqiang 于 2013-1-19 14:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
从条带来看你的电泳跑的不好
分离胶没有凝好
二抗用1：20000
你用什么ecl？

============================================================================================================

谢谢，在国外试验室，用的fi ...

Marker也是蛋白
有时候就是能显出条带来的
一抗可以1：2000，1：4000
二抗稀释10倍以上

作者: lgm 时间: 2013-1-19 14:59

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:03

QUOTE:

原帖由 lgm 于 2013-1-19 14:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？ ...

糖基化蛋白有拖尾现象
一抗浓度可以调高一些
用1：100 4度孵育过夜
另外调整条件后仍有非特异性带只能说明抗体的特异性比较差了

作者: 8princess8 时间: 2013-1-19 15:03

楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2.转膜条件太强了吗，转过了？我看到过别人说这样的条件可以啊。
3.以前按这种条件做下来，冲片子出来条带贴别弥散，而且很浅很难看。是跑胶时的问题吗？
谢谢楼主！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:04

QUOTE:

原帖由 8princess8 于 2013-1-19 15:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好！我现在用western做分子量170KD左右的蛋白，电泳条件：100V，150V。转膜条件：100V，2h。染膜后，完全看不到条带，连marker也没了。
我有几个问题：
1.对高分子量的蛋白来说，是低电压比较合适吗？我的电压过高吧？那多少合适呢？
2. ...

对于170K的蛋白来说转膜条件一点都不强
我都用恒流，170K的话 300mA 2h
条带弥散与盐浓度、胶凝固的好坏有关
还有就是Acr与Bis-的比例

作者: JK.jon 时间: 2013-1-19 15:12

这里真热闹，我也有问题

1请问一抗和二抗的浓度怎么确定，请说的详细点
2我做western时，曝光后可以看出pvdf膜上有蛋白质条带，但确暴不出来（用同一批样品做过，可以曝出条带；我用的是酪氨酸磷酸化抗体，可以杂出十几kd，四十多kd，九十多kd，100多kd。）

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:13

首先确定二抗的稀释度
然后用不同的一抗稀释度来做预实验（因为二抗浓度已经确定，这会就不需要调整二抗浓度了）
另外你说的爆不出条带是什么意思

作者: glass 时间: 2013-1-19 15:15

请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！

作者: redbutterfly 时间: 2013-1-19 15:27

心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:33

请问楼主，曝光的结果条带之间都成一条直线，中间没有间隔。是什么原因啊！内参也是一条直线！
先谢谢楼主帮忙解答！

================================

上样量太大
另外你注意看胶有没有凝好
分离胶凝胶时间要2h左右
可以先跑电泳染胶看看
你的浓缩胶胶孔之间梳子有问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:39

心脏组织提取的蛋白，上样量分为20、30、40、50ug，跑胶的情况，浓缩胶中100v压得很扁，进入分离胶后200v溴酚蓝略有弥散，marker的条带清晰、细长，转膜后95-17kd的条带都很清晰，5%milk 4°C过夜，abcam的一抗稀释到起始浓度1：200，室温孵育2h，二抗1：5000+GAPDH(1:10000)室温90min，加入ECL后整张膜都是发光的，但强度不大，曝光后只看到一片灰色，形状与膜一致，可见marker的发白的条带，看不到目的条带（95kd）。洗去一抗、二抗之后，只用GAPDH（1：10000）孵育后显影，仔细辨别才能看到隐约的37kd左右的条带，平整、细长。不知道是什么原因，是否是变性过程出了纰漏，蛋白降解而使实际的上样量极少？打算重新准备样品再试试。

=================================================

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:39

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成一条线的问题，非常郁闷，请楼主帮忙出出主意，问题出在哪里。非常感谢！蛋白是刚提的，用的是碧云天WB试剂！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:40

QUOTE:

原帖由 H2O 于 2013-1-19 15:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主我补充下问题：
我做的是脑组织抽提蛋白的WB，几次发光后都发现胶片上显示的beta-actin连成一条线，各样品中间没有分隔，起初认为是因为加样时蛋白漏出，但是现在已经非常注意，基本没有漏出的问题了，但是还是没有解决连成 ...

这和漏不漏影响不大
应该是你总体蛋白的上样量太大

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:40

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

作者: tangxin_80 时间: 2013-1-19 15:41

楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:42

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

================

120ug总蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:42

楼主你好！我现在用western做分子量20KD和43KD的蛋白，电泳条件是50V，80V，然后用考马斯亮兰染色，但完全看不到条带（marker也看不见）。
请问可能是什么原因导致的？
谢谢楼主！

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说的具体些

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:43

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

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用的是碧云天的SDS裂解液，提取后测蛋白浓度在14mg/ml的样子，胶倒是没染过……怎样判断蛋白是否提取完全？

作者: 阿凡提 时间: 2013-1-19 15:44

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:45

心脏、肌肉等组织我做的太多了
首先第一点要注意就是确定组织中蛋白是否提取完全
肌肉、心脏组织的蛋白在20-120K，还有200K附近条带比较多
你染胶看过没？
另外二抗的稀释度可以继续降低，用1：10000试试

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另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:47

用的是碧云天的SDS裂解液，提取后测蛋白浓度在14mg/ml的样子，胶倒是没染过……怎样判断蛋白是否提取完全？

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先通过电泳染胶
看目的分子量附近的条带怎样
另外看提取有没有完全就靠后续的实验步骤了

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:48

另外，我的目的蛋白是膜蛋白，我是用SDS裂解液提了总蛋白来做western blot的，不知道这样是否合适？裂解的时候需要注意什么？谢谢！

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当然可以用总蛋白来做WB
裂解的时候注意在冰上操作

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:48

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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呵呵
去年这个时候我做过VEGF
大鼠腓肠肌的
受体没做过
我用的santa 的一抗
效果我觉得还行

作者: sunnyB 时间: 2013-1-19 15:54

首先非常感谢你及时给大家这么多的帮助！我是新手，有个问题请教。我W的结果没有条带，自己将膜丽春红染色无蛋白条带，同时一起转膜的同学是有W的条带的，他的分子量是200KD，我的是110kd。前面电泳条件是100v，120V，湿转100v 2h，但电转液中没有0.1%SDS（不知是否影响，我们实验室常规是这样配的，其他成分同园子里的常规），请问是我的蛋白降解了吗？前几天看到丽春红染色都是要带的，包括110kd。请指点，万分感激！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:54

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2013-1-19 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

首先非常感谢你及时给大家这么多的帮助！我是新手，有个问题请教。我W的结果没有条带，自己将膜丽春红染色无蛋白条带，同时一起转膜的同学是有W的条带的，他的分子量是200KD，我的是110kd。前面电泳条件是100v，120V，湿转100v 2h，但 ...

大分子量蛋白转移的时候是要加0.1%的SDS的
我一般用的转移缓冲液中用0.01%SDS这样大分子量与小分子量都用同样的转移缓冲液
蛋白是否降解你要了解一下你的蛋白的背景信息
另外在提取液中要尽可能多的加入抑制剂
good luck

作者: hold住 时间: 2013-1-19 15:54

相关疾病：
挫伤
我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:55

当然可以用总蛋白来做WB
裂解的时候注意在冰上操作

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谢谢指点，打算先染一下胶看看，不行再重新提蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 15:56

相关疾病：
挫伤

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我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！

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呵呵
抗体的好坏不是我们说了算
santa的我用了有三、四种了吧
感觉还行
你的caspase-3现在还没做出来？
我2006买过博奥森分装的
做出来过
抗体的选择是由自己来决定的
那都有不好的抗体

作者: H2O 时间: 2013-1-19 15:59

多谢！还有个菜问题：我如何判断转膜不成功、转过头了及短路了呢？感谢哈！

作者: standbyme 时间: 2013-1-19 15:59

你好，我跑了磷酸化的P38的条带，不知为何出现了两个条带，其中一条较淡，就好像磷酸化ERK一样，一抗用的是Cell signaling的，稀释比例为1：1000，想请问下您这有可能是哪方面的原因啊？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:00

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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呵呵
做过纯化后的蛋白
从组织或细胞提取的暂时没有做过

作者: ending 时间: 2013-1-19 16:01

多谢！还有个菜问题：我如何判断转膜不成功、转过头了及短路了呢？感谢哈！

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转膜后染色液染膜
染转移后的胶来判断

作者: ending 时间: 2013-1-19 16:03

你好，我跑了磷酸化的P38的条带，不知为何出现了两个条带，其中一条较淡，就好像磷酸化ERK一样，一抗用的是Cell signaling的，稀释比例为1：1000，想请问下您这有可能是哪方面的原因啊？谢谢

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看看抗体说明书
像你这样的问题我觉得是抗体本身的问题

作者: 神经侠 时间: 2013-1-19 16:03

前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！

作者: ha111 时间: 2013-1-19 16:04

前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！

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tricine胶没做过
我觉得这样的分子量用dot blot来做比较好

作者: ha111 时间: 2013-1-19 16:04

前辈，你好，我的课题要做CGRP　3.8kd的一个短肽的western. 我用的是16.5%的tricine的胶，但是跑出来条带和溴酚蓝本身一直很弥散。我的上样量比较多，因为用了冷冻干燥来浓缩，不知道又没有关系？我用的胶是单体丙烯酰胺30% 双体0.8%的成品，是不是交联度不够呢？多谢指点！

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胶的浓度差不多
另外转膜的时候膜的孔径要选择0.22um的

作者: zhenxin 时间: 2013-1-19 16:05

关于如何判断转膜不成功、转过头了及短路了？能麻烦前辈讲稍详细些吗？万分感谢啦！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:05

QUOTE:

原帖由 zhenxin 于 2013-1-19 16:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
关于如何判断转膜不成功、转过头了及短路了？能麻烦前辈讲稍详细些吗？万分感谢啦！

转完膜之后
用立春红染一下膜，看膜上有没有条带
把转移后的胶用考马斯亮蓝染一下看胶上有没有蛋白条带

作者: duoduo 时间: 2013-1-19 16:05

楼主你好!我转膜BUFFER是TRIS 2.9g,甘氨酸5.8g,SDS1.0g,甲醇200ml定容至1000ml,转小分子湿转60V 1小时,20-55KD的可以转上,膜是MILLIPORE的0.22微米的,100V1小时40KD的也在,其他的没看,我们缓冲液的PH9左右,这是分子克隆上的配方,但我看到大部分配方甘氨酸的量要比我们大很多是2或者3倍,PH可能会在8.3左右,这个PH应该是合适的,这两种配方的影响会很大吗?我们现在100多KD 的分子做的不好,是不是可以多加甘氨酸?能不能解释一下原理?

作者: duoduo 时间: 2013-1-19 16:06

你好,再问几个磷酸化蛋白的问题,裂解液里没有加氟化钠,是不是磷酸化蛋白做不出来?磷酸化蛋白和相应激酶分子量一样,怎么在同一张膜上曝光,不在同一张膜上曝光怎么来比较它们?举例,测P-AKT灰度,然后除以AKT灰度得到处理组是否有磷酸化蛋白增加从而判断是否有某一个通路的参与,多谢!

作者: 云端ing 时间: 2013-1-19 16:06

胶的浓度差不多
另外转膜的时候膜的孔径要选择0.22um的

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多谢指点，再请问个问题，如果条带拖尾会有什么可能？我跑胶的时候，溴酚蓝和显影后的条带都弥散。除了上样量多以外，还有什么可能？多谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:07

楼主你好!我转膜BUFFER是TRIS 2.9g,甘氨酸5.8g,SDS1.0g,甲醇200ml定容至1000ml,转小分子湿转60V 1小时,20-55KD的可以转上,膜是MILLIPORE的0.22微米的,100V1小时40KD的也在,其他的没看,我们缓冲液的PH9左右,这是分子克隆上的配方,但我看到大部分配方甘氨酸的量要比我们大很多是2或者3倍,PH可能会在8.3左右,这个PH应该是合适的,这两种配方的影响会很大吗?我们现在100多KD 的分子做的不好,是不是可以多加甘氨酸?能不能解释一下原理?

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增加0.1%SDS

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:07

你好,再问几个磷酸化蛋白的问题,裂解液里没有加氟化钠,是不是磷酸化蛋白做不出来?磷酸化蛋白和相应激酶分子量一样,怎么在同一张膜上曝光,不在同一张膜上曝光怎么来比较它们?举例,测P-AKT灰度,然后除以AKT灰度得到处理组是否有磷酸化蛋白增加从而判断是否有某一个通路的参与,多谢!

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不光是NaF
还要加多种磷酸酶抑制剂
首先用内参校正，再比较

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:08

多谢指点，再请问个问题，如果条带拖尾会有什么可能？我跑胶的时候，溴酚蓝和显影后的条带都弥散。除了上样量多以外，还有什么可能？多谢

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样品里离子浓度高
有沉淀

作者: zzzz 时间: 2013-1-19 16:15

我把目的蛋白连接到pEGFP-n1 中，
也就是表达的时候产生 N端-目的蛋白-GFP-C端融合表达。

但是质粒转染48h后，裂解蛋白做Western Blot ，
用GFP抗体检测只有融合蛋白（左边四个泳道）这一条带，但是用目的蛋白的抗体检测却有两条带（右边三条），
一条是跟GFP抗体检测的同样大小的带，另外一条好像是目的蛋白单独大小的条带，

请问这个怎么解释，难道翻译的时候没有终止密码也会出现提取终止的情况？还是表达完以后融合蛋白出现断裂的情况？请赐教！

附件左为GFP抗体右为目的蛋白特异性抗体

作者: owanaka 时间: 2013-1-19 16:16

请问10k和250k的湿转条件，谢谢。
PS:电转仪是北京君意的

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:16

QUOTE:

原帖由 owanaka 于 2013-1-19 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问10k和250k的湿转条件，谢谢。
PS:电转仪是北京君意的

250K用湿转：300mA 2h10min，恒流
10K建议用半干转：1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，30min

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:17

我把目的蛋白连接到pEGFP-n1 中，
也就是表达的时候产生 N端-目的蛋白-GFP-C端融合表达。

但是质粒转染48h后，裂解蛋白做Western Blot ，
用GFP抗体检测只有融合蛋白（左边四个泳道）这一条带，但是用目的蛋白的抗体检测却有两条带（右边三条），
一条是跟GFP抗体检测的同样大小的带，另外一条好像是目的蛋白单独大小的条带，

请问这个怎么解释，难道翻译的时候没有终止密码也会出现提取终止的情况？还是表达完以后融合蛋白出现断裂的情况？请赐教！

附件左为GFP抗体右为目的蛋白特异性抗体

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转染那一块我不懂
从条带来看你可以调整目的蛋白一抗的稀释度

作者: 66+77 时间: 2013-1-19 16:17

今天我坐WB的时候，加了发光剂以后整张膜上都是一条一条的条带，背景很合适，但是似乎把所有的蛋白条带都显出来了，胶片曝光以后也是这个样子，这到底是怎么回事呢？封闭不够？但是背景还是可以的，就是有一条条清晰的条带，希望能够帮我解答，歇息

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:18

今天我坐WB的时候，加了发光剂以后整张膜上都是一条一条的条带，背景很合适，但是似乎把所有的蛋白条带都显出来了，胶片曝光以后也是这个样子，这到底是怎么回事呢？封闭不够？但是背景还是可以的，就是有一条条清晰的条带，希望能够帮我解答，歇息

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封闭RT 30min 5%脱脂奶粉
把一抗继续稀释5倍

作者: xyw5 时间: 2013-1-19 16:19

我是新手，请前辈指点
二抗应该选择用辣根标记的还是用碱性磷酸酶标记的？是根据目的蛋白选择吗？

作者: xyw5 时间: 2013-1-19 16:26

请指点
我做16k的蛋白，分离胶用的15% ，半干转条件是100MA 70min 转后膜上有很清晰的MARKER 。奶粉封闭1小时，一抗4度过夜，二抗（磷酸酶标记）30min， DAB显色，结果没有任何条带产生。请问可能的原因是什么？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:26

我是新手，请前辈指点
二抗应该选择用辣根标记的还是用碱性磷酸酶标记的？是根据目的蛋白选择吗？

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如何选择要根据实验室条件来定
如果你实验室有暗室可以选择用HRP标记的二抗
反之选择AP标记
HRP比AP敏感性要高

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:27

请指点
我做16k的蛋白，分离胶用的15% ，半干转条件是100MA 70min 转后膜上有很清晰的MARKER 。奶粉封闭1小时，一抗4度过夜，二抗（磷酸酶标记）30min， DAB显色，结果没有任何条带产生。请问可能的原因是什么？

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你的100mA是怎么计算的？
用1.2mA每平方厘米膜面积
恒流，转移40min
膜用贵2um孔径
二抗室温孵育时间适当延长
你这个蛋白的丰度如何？
如果丰度低了DAB是检测不到的

作者: 2541 时间: 2013-1-19 16:29

请指点：
最近做Western blot，检测目的蛋白大小分别为110kd和120kd。分离胶为8%，浓缩胶5%。电泳100V 20 min，200V 20min。电转（湿转,Bio-rad)200mA 90-105min，电转液配方：Trs 5.8g，甘氨酸 2.9g,SDS 0.37g，甲醛 200ml，加水至1000ml.每次新鲜配。抗体均为单克隆抗体，为一家公司产品。
每次110kd条带很好，但120kd没有条带。请问可能的原因是什么？怎样调整液体配方，转膜条件？谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-1-19 16:32

样品里离子浓度高
有沉淀

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请问有什么方法能降低样本的盐浓度吗？　你所说的有沉淀，是指匀浆以后，离心不彻底产生的沉淀吗？多谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:33

请指点：
最近做Western blot，检测目的蛋白大小分别为110kd和120kd。分离胶为8%，浓缩胶5%。电泳100V 20 min，200V 20min。电转（湿转,Bio-rad)200mA 90-105min，电转液配方：Trs 5.8g，甘氨酸 2.9g,SDS 0.37g，甲醛 200ml，加水至1000ml.每次新鲜配。抗体均为单克隆抗体，为一家公司产品。
每次110kd条带很好，但120kd没有条带。请问可能的原因是什么？怎样调整液体配方，转膜条件？谢谢！

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查查这个蛋白的具体信息，同时看你的裂解液能否把它提取出来
在整个操作的过程中注意在冰上进行，加入抑制剂
每个蛋白的丰度及易降解程度不一样
120K的出不来还可以增加上样量

作者: NBA 时间: 2013-1-19 16:33

请问有什么方法能降低样本的盐浓度吗？　你所说的有沉淀，是指匀浆以后，离心不彻底产生的沉淀吗？多谢

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透析
沉淀是离心不彻底的
另外加入loading变性后有时也会有部分沉淀
需要再次用高速，短时间离心

作者: PINK 时间: 2013-1-19 17:03

本人初学WB，现请教
1.我将胞浆蛋白与胞核蛋白分开提，第一次提蛋白时浓度挺高，但胞浆蛋白跑出来后（80，120）用考蓝染色，只有中分子量的条带，比较清晰，我想要的小分子量的和高分子量的都没有条带，不知是什么原因？
2.昨天又提了一次，还用Bradford法定量，胞浆蛋白浓度也挺高，但同样条件跑出来后染色除了一道Marker什么都没有，什么原因？
3.有的蛋白提取试剂盒里带有磷酸酶抑制剂，是不是就不用另加了？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:06

1，是你自己配制的胞浆、胞核蛋白提取试剂？
2，我们的产品提取蛋白来条带很好，想看结果通过短消息把邮箱发给我
3，看试剂盒说明书，应该了解一下具体的磷酸酶抑制剂信息，我一般用roche的磷酸酶抑制剂cocktail
挺好

作者: PINK 时间: 2013-1-19 17:06

非常感谢前辈耐心的解答！还想问一下，我的蛋白是110kd，我用的条件是100v浓缩-----120V分离------100v湿转 2h，这些条件有需要改良的吗？另外，我还不明白如何恒压和恒流的选择？再次感谢哈！

作者: finger 时间: 2013-1-19 17:10

非常感谢前辈耐心的解答！还想问一下，我的蛋白是110kd，我用的条件是100v浓缩-----120V分离------100v湿转 2h，这些条件有需要改良的吗？另外，我还不明白如何恒压和恒流的选择？再次感谢哈！

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恒压与恒流的选择看个人习惯
我选择用恒流

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-19 17:12

多谢前辈指点，看了前面的帖子，又有个问题：怎么样测定蛋白丰度啊？我们实验室作ｗｅｓｔｅｒｎ前好像从没测过。

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:12

QUOTE:

原帖由 taoshengyijiu 于 2013-1-19 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢前辈指点，看了前面的帖子，又有个问题：怎么样测定蛋白丰度啊？我们实验室作ｗｅｓｔｅｒｎ前好像从没测过。

不用测
查查文献
看别人文献中WB结果条带怎样基本上就有数了

作者: qianqin1977 时间: 2013-1-19 17:13

请问大于175KD的蛋白分子量应该用多少浓度的胶老跑？
基本的实验条件是什么哪？

作者: october7 时间: 2013-1-19 17:14

几句话说不清楚
胶浓度可以选择7.5%或8%

作者: 66+77 时间: 2013-1-19 17:15

谢谢楼主帮我解答了难题，我现在又遇到了个难题！上次我减小加样量以后，条带果然是不成线了，内参出的很好！可是我的目的蛋白不出来了！请问下楼主怎么解决这个问题啊！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:16

谢谢楼主帮我解答了难题，我现在又遇到了个难题！上次我减小加样量以后，条带果然是不成线了，内参出的很好！可是我的目的蛋白不出来了！请问下楼主怎么解决这个问题啊！

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目的蛋白的丰度比较小
你可以这样做：维持原来的上样量，上样的时候隔孔上
good luck

作者: qhyu 时间: 2013-1-19 17:17

谢谢楼主的回答，今天的实验遇到了一个新的问题，就是内参的一个泳道不显影了，旁边的的一个泳道很淡，而且就一个泳道，其他的都没有什么问题。请问下楼主这可能是什么原因造成的，该如何去解决这个问题呢！
再次感谢！

作者: wiwi 时间: 2013-1-19 17:18

我最近做western blot跑电泳的时候
每次marker都跑一边去了，斜斜的
今天把marker放到第一个孔，结果，marker扭曲成（横着看的这种
另外一个板的marker放到第二个孔，却没有这种情况，但是，还是斜的
压片的时候，makrer这边都有点目的条带
不知道是怎么回事啊？

作者: 49888 时间: 2013-1-19 17:18

我最近也在跑wb，从细胞中提取的总蛋白，上样量为20ug，250mA 湿转55min，5%脱脂奶粉室温封闭1h，4度摇床孵一抗过夜，二抗1：6000（中杉进口分装），碧云天ECLplus发光，压片：
1 检测p53（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释）可检测到平行的两行条带，均清楚整齐，但并非每次都出现，是否封闭不足？
2 检测cyclinD1（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释），ECL曝光10min才见压片很弱的条带，是否蛋白上样量不足？
3 检测p21(bioworld国外原装小包装抗体，1：250稀释，推荐1：500-1：1000）始终无条带，是否转膜过度或应该用22um的PVDF?
4 用BCA检测蛋白浓度后，是将每个样品的浓度稀释至一致后再上同样体积还是调整每个样品的上样体积使总蛋白量一致？
Thank you!

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:19

谢谢楼主的回答，今天的实验遇到了一个新的问题，就是内参的一个泳道不显影了，旁边的的一个泳道很淡，而且就一个泳道，其他的都没有什么问题。请问下楼主这可能是什么原因造成的，该如何去解决这个问题呢！
再次感谢！

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说的清楚点
或者挂一张图片上来

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:19

我最近做western blot跑电泳的时候
每次marker都跑一边去了，斜斜的
今天把marker放到第一个孔，结果，marker扭曲成（横着看的这种
另外一个板的marker放到第二个孔，却没有这种情况，但是，还是斜的
压片的时候，makrer这边都有点目的条带
不知道是怎么回事啊？

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Marker有目的条带是因为上样量太大了
Marker在最边上的孔有边缘效应

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:20

我最近也在跑wb，从细胞中提取的总蛋白，上样量为20ug，250mA 湿转55min，5%脱脂奶粉室温封闭1h，4度摇床孵一抗过夜，二抗1：6000（中杉进口分装），碧云天ECLplus发光，压片：
1 检测p53（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释）可检测到平行的两行条带，均清楚整齐，但并非每次都出现，是否封闭不足？
2 检测cyclinD1（中杉分装的santa的单克隆抗体，1：250稀释），ECL曝光10min才见压片很弱的条带，是否蛋白上样量不足？
3 检测p21(bioworld国外原装小包装抗体，1：250稀释，推荐1：500-1：1000）始终无条带，是否转膜过度或应该用22um的PVDF?
4 用BCA检测蛋白浓度后，是将每个样品的浓度稀释至一致后再上同样体积还是调整每个样品的上样体积使总蛋白量一致？
Thank you!

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要调整每个样品的上样体积一样、总蛋白量一致
P21建议换抗体
P53的情况你要查你的样品的背景信息，有些就是很弱
cyclin D1 建议曝光时间延长至30min，应该就可以了

作者: yjf1026 时间: 2013-1-19 17:21

Marker有目的条带是因为上样量太大了
Marker在最边上的孔有边缘效应

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以前好像没这种情况啊
我的是组织里面的蛋白
大概是3.5mg/ml
加样20ul好像也不算太大吧？

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:22

以前好像没这种情况啊
我的是组织里面的蛋白
大概是3.5mg/ml
加样20ul好像也不算太大吧？

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组织里面的蛋白才3.5mg/ml？
如果是这个浓度的话
说明你提的不好
和你说的以前比裂解液你换了吗？

作者: yjf1026 时间: 2013-1-19 17:23

组织里面的蛋白才3.5mg/ml？
如果是这个浓度的话
说明你提的不好
和你说的以前比裂解液你换了吗？

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我们用的博彩生物的RIPA
原本是用一半量的裂解液，但是跑出来的条带每次都很难看
后来就用全量的，就是0.01g组织用100ul的裂解液，之前一直是0.01g用50ul的
浓度自然比以前的少一半，然后定量后，最小的浓度就是3.5mg
提取完之后，没有立即蛋白定量，-20放了三天后等第二批才定量不知道有没有影响
裂解液没有换过，一直用的这个，而且以前测浓度也是7mg~10mg左右

作者: wu11998866 时间: 2013-1-19 17:24

你的100mA是怎么计算的？
用1.2mA每平方厘米膜面积
恒流，转移40min
膜用贵2um孔径
二抗室温孵育时间适当延长
你这个蛋白的丰度如何？
如果丰度低了DAB是检测不到的

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我写错了是10MA 我用的是0.8MA每平方厘米膜面积
您建议的是用价钱贵一点膜是吗
我做的是SURVIVIN,但是我查不到它的丰度，楼主能否告知不胜感激

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:24

我们用的博彩生物的RIPA
原本是用一半量的裂解液，但是跑出来的条带每次都很难看
后来就用全量的，就是0.01g组织用100ul的裂解液，之前一直是0.01g用50ul的
浓度自然比以前的少一半，然后定量后，最小的浓度就是3.5mg
提取完之后，没有立即蛋白定量，-20放了三天后等第二批才定量不知道有没有影响
裂解液没有换过，一直用的这个，而且以前测浓度也是7mg~10mg左右

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不会有太大的影响
我觉得你前后时间长了可以考虑一下整个系统里面的一些试剂的改变
这个很重要

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:25

我写错了是10MA 我用的是0.8MA每平方厘米膜面积
您建议的是用价钱贵一点膜是吗
我做的是SURVIVIN,但是我查不到它的丰度，楼主能否告知不胜感激

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不好意思
膜的孔径用0.2um的
比正常的0.45um孔径膜要稍贵一点
另外survivin的丰度不是很大
先查已经发表的文献
看他们用什么裂解液提取蛋白来做WB
good luck

作者: 3N4G 时间: 2013-1-19 17:25

我想知道提取动物蛋白一般的浓度是多少呢？用UV计测OD用来计算浓度的时候最好稀释了再测才能符合线性关系是吗？还是影响不大？谢谢！

作者: mod=8048 时间: 2013-1-19 17:26

请问一下，我准备做PKC通道检测，是用WESTERNBLOT测含量好还是单单测活性好，两者有什么区别？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:26

我想知道提取动物蛋白一般的浓度是多少呢？用UV计测OD用来计算浓度的时候最好稀释了再测才能符合线性关系是吗？还是影响不大？谢谢！

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大鼠的做的比较多
肌组织一般在15~20mg/ml
总蛋白用UV测误差很大

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:27

请问一下，我准备做PKC通道检测，是用WESTERNBLOT测含量好还是单单测活性好，两者有什么区别？谢谢！

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这个我就不懂了
WB可以测定PKC的表达量

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-19 17:27

不会有太大的影响
我觉得你前后时间长了可以考虑一下整个系统里面的一些试剂的改变
这个很重要

、、、、、、、、、、、、、、、、

能不能说下大概哪些试剂改变下？

作者: avi317 时间: 2013-1-19 17:28

现在要做western，制作胶过程出了点问题，1堆积胶不凝，2胶特别粘，黏在两侧玻璃班上不好分开。目前已经重新配了所有液体，我们实验室之前做得还行，配方没变。改变了AP和TEMED的浓度也没变化。请指教

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:28

能不能说下大概哪些试剂改变下？

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那些试剂改变只有你知道啊
如tris-hcl及其ph
glycine
sds
都有可能会有影响的

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:29

现在要做western，制作胶过程出了点问题，1堆积胶不凝，2胶特别粘，黏在两侧玻璃班上不好分开。目前已经重新配了所有液体，我们实验室之前做得还行，配方没变。改变了AP和TEMED的浓度也没变化。请指教

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从别处取用新的AP和TEMED试试

作者: ukonptp 时间: 2013-1-19 17:30

那些试剂改变只有你知道啊
如tris-hcl及其ph
glycine
sds
都有可能会有影响的

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原来你说的这个= =
strip buffer就是自己配的,大概可以用几次？
marker如果加5u，样品加20u的话，是不是要把加marker的孔再加上1x上样缓冲液15u?
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-19 17:31

原来你说的这个= =

我还想问下，strip buffer就是自己配的

大概可以用几次？

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不建议你重复使用

作者: 小糖块 时间: 2013-1-26 11:12

marker如果加5u，样品加20u的话，是不是要把加marker的孔再加上1x上样缓冲液15u?
BCA测定蛋白浓度后，要把总蛋白调成一致，那么，选择调成一致的液体用什么呢？
我使用博彩生物的RIPA裂解液，是用这个调浓度后再加上样buffer煮么？

作者: 小糖块 时间: 2013-1-26 11:14

我请教个问题;
为什么同样条件下，第一次做western blot结果非常好，第二次ECL发光以后，曝光结果光板，什么都没有，没背景也没道的痕迹。
谢谢

作者: tuuu2 时间: 2013-1-26 11:14

您好！我想请教一下，我第一天跑蛋白梯度60、120、180，没有出带。第二天又跑了一个30、60、90、120的梯度。只有90和120的出了带。所以我接着跑了一个板，上样量120，一发光又什么都没有。一抗应该是没有问题的，因为别人用了出的带挺强的。一直找不到原因。能不能指教一下问题有可能出在哪里呢？
PS：蛋白大约50-60KD之间，转印100V3个小时（一般没有问题，实验室其他同胞也这样转的，更小分子量的蛋白都出来了）。封闭是2%-3%脱脂奶粉（用TBST稀释的）半个小时，2%-3%脱脂奶粉+一抗（1：400），4度过夜，2%-3%脱脂奶粉+二抗（1：5000）孵育2小时，洗膜用TBST7min3次。

作者: tuuu2 时间: 2013-1-26 11:14

我还想再补充一下，我第二天发出光来的那两个浓度，也是在暗房里蹲了很久（大概得一个半到两个小时）才发出荧光来，而且很微弱。别人大概浇个几分钟就出来了。这是什么原因呢？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-26 11:17

LZ你好，我要做的蛋白parvalbumin分子量只有12KD，我用12%的分离胶和70V的电压，仍然没有做出，丽春红染膜可以看到蛋白条带，但是上时间（20min )也发不出荧光，同样一张膜上的内参倒是曝地很清楚。请LZ给点建议吧，谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:18

marker如果加5u，样品加20u的话，是不是要把加marker的孔再加上1x上样缓冲液15u?
BCA测定蛋白浓度后，要把总蛋白调成一致，那么，选择调成一致的液体用什么呢？
我使用博彩生物的RIPA裂解液，是用这个调浓度后再加上样buffer煮么？

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1，Marker与样品之间加一个空，上20ul 1倍缓冲液，再上样品。如果没有空余泳道首先保证样品，Marker泳道5ul的话不会有太多的影响

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:18

marker如果加5u，样品加20u的话，是不是要把加marker的孔再加上1x上样缓冲液15u?
BCA测定蛋白浓度后，要把总蛋白调成一致，那么，选择调成一致的液体用什么呢？
我使用博彩生物的RIPA裂解液，是用这个调浓度后再加上样buffer煮么？

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2，BCA测定浓度后调整蛋白浓度可以用PBS或者RIPA
调整到需要的浓度后加buffer变性5~10min
-20度保存待测

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:19

我请教个问题;
为什么同样条件下，第一次做western blot结果非常好，第二次ECL发光以后，曝光结果光板，什么都没有，没背景也没道的痕迹。
谢谢

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这个问题挺难的
没碰到过
能说的详细点不

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:20

您好！我想请教一下，我第一天跑蛋白梯度60、120、180，没有出带。第二天又跑了一个30、60、90、120的梯度。只有90和120的出了带。所以我接着跑了一个板，上样量120，一发光又什么都没有。一抗应该是没有问题的，因为别人用了出的带挺强的。一直找不到原因。能不能指教一下问题有可能出在哪里呢？
PS：蛋白大约50-60KD之间，转印100V3个小时（一般没有问题，实验室其他同胞也这样转的，更小分子量的蛋白都出来了）。封闭是2%-3%脱脂奶粉（用TBST稀释的）半个小时，2%-3%脱脂奶粉+一抗（1：400），4度过夜，2%-3%脱脂奶粉+二抗（1：5000）孵育2小时，洗膜用TBST7min3次。

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蛋白你跑过胶，染过胶吗？
我觉得你的蛋白样品可能有问题

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:20

我还想再补充一下，我第二天发出光来的那两个浓度，也是在暗房里蹲了很久（大概得一个半到两个小时）才发出荧光来，而且很微弱。别人大概浇个几分钟就出来了。这是什么原因呢？

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目的蛋白含量太低或者你的整个系统与你同学不一样
而且我认为曝光超过30min就没有意义了

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:21

LZ你好，我要做的蛋白parvalbumin分子量只有12KD，我用12%的分离胶和70V的电压，仍然没有做出，丽春红染膜可以看到蛋白条带，但是上时间（20min )也发不出荧光，同样一张膜上的内参倒是曝地很清楚。请LZ给点建议吧，谢谢了！

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内参当然会很漂亮了，内参的分子量要大于你的目的蛋白
Parvalbumin分子量才12K
需要改变的条件是：1，改用0.22um孔径的膜
2，用15%的分离胶

作者: eric930 时间: 2013-1-26 11:21

今天跑WB遇到一些问题，请教您，谢谢！
10%胶，fermentas 预染marker7ul，蛋白样品35ul，电泳marker条带清晰，将72-17KD的胶切下，Biorad湿转250mA 63min，PVDF膜及胶上均无marker条带，将胶考染后无条带，电转液为临用前新配，惟一不同的是今天电转是和另一同学同时用一个电泳仪串联两个槽子进行的，电流均为250mA，但电压仅为平时的一半（50v）左右，不知这个是否有影响?
Thank you!

作者: fei1226com 时间: 2013-1-26 11:28

跑蛋白胶时浓缩胶里溴芬兰为什么不能压成直线

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:28

QUOTE:

原帖由 fei1226com 于 2013-1-26 11:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
跑蛋白胶时浓缩胶里溴芬兰为什么不能压成直线

一般在分离胶压成一条直线

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:29

今天跑WB遇到一些问题，请教您，谢谢！
10%胶，fermentas 预染marker7ul，蛋白样品35ul，电泳marker条带清晰，将72-17KD的胶切下，Biorad湿转250mA 63min，PVDF膜及胶上均无marker条带，将胶考染后无条带，电转液为临用前新配，惟一不同的是今天电转是和另一同学同时用一个电泳仪串联两个槽子进行的，电流均为250mA，但电压仅为平时的一半（50v）左右，不知这个是否有影响?
Thank you!

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应该选择稳流或者稳压
你说的这种情况我没碰到过

作者: ququer787 时间: 2013-1-26 11:30

蛋白降解问题：
以前用RIPA加cocktail，-80度保存，没有问题，后来在-20度就降解了；再后来，cocktail没有了，用PMSF，-80度，还是降解了。现在还在等待订购cocktail，不知道降解的真正原因是什么？
另外，请问有没有用过尿素裂解液啊，我试用过，老是发现有一团很粘稠的东西，很不好用！
谢谢，期待解答！

作者: ququer787 时间: 2013-1-26 11:31

再问一个问题，封闭用的脱脂奶粉从超市买一包行不行啊，有没有专门的厂家，能否告知联系方式？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:31

蛋白降解问题：
以前用RIPA加cocktail，-80度保存，没有问题，后来在-20度就降解了；再后来，cocktail没有了，用PMSF，-80度，还是降解了。现在还在等待订购cocktail，不知道降解的真正原因是什么？
另外，请问有没有用过尿素裂解液啊，我试用过，老是发现有一团很粘稠的东西，很不好用！
谢谢，期待解答！

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RIPA放在4度就可以
一年稳定
cocktail在用RIPA时再加入，尽快使用
PMSF用异丙醇溶解后-20度保存就可以
在加入PMSF至RIPA中时，稳定时间为30min
尿素裂解液可以用，看你的目的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-1-26 11:32

再问一个问题，封闭用的脱脂奶粉从超市买一包行不行啊，有没有专门的厂家，能否告知联系方式？谢谢！

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可以从超市买
脱脂奶粉就可以
如果你觉得不妥可以从试剂公司买专门的脱脂奶粉
good luck

作者: flower-201 时间: 2013-1-26 11:33

RIPA放在4度就可以
一年稳定
cocktail在用RIPA时再加入，尽快使用
PMSF用异丙醇溶解后-20度保存就可以
在加入PMSF至RIPA中时，稳定时间为30min
尿素裂解液可以用，看你的目的蛋白

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我说的是用RIPA和蛋白酶抑制剂裂解的蛋白的降解，不是说裂解液本身！

作者: mamamiya 时间: 2013-1-26 11:34

80KDa的蛋白，用总蛋白抗体标，能否根据分子量变化判定磷酸化变化。

作者: kuohao17 时间: 2013-1-26 12:01

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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我也在做VEGFR2，今天条带出来了，跟你分享一下：）
我用的是Cell signaling的抗体，做了三个浓度1：1000，1：800，1：600都出来了，推荐浓度1：1000还是不错的。个人感觉转膜是关键，第一次失败就出在转膜上，转膜条件我采纳fangweibin119前辈的意见，300mA，2.5h，转膜液里加了20%的甲醇（小分子我用的10%）和0.1%的SDS，希望对你有帮助。

作者: TAT 时间: 2013-1-26 12:01

相关疾病：
头痛
你好，最近遇到个比较头疼的问题，希望你能帮我分析下原因，明天要开始做了，希望这次结果会好！
大分子条带还行，就是小分子的条带很分散，拉得比较长，不是一个条带一样，一团黑的感觉，电泳没问题，因为Marker条带很直很清楚，就是转膜后条带不直了，不知道是什么原因，条件都跟以前一样的，就是换了一张新的膜，但还是跟以前用的是同一盒的膜，不知道会不会是膜的问题呢，打算这次换膜试试，还会不会有其他的原因呢？谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 12:02

QUOTE:

原帖由 TAT 于 2013-1-26 12:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
头痛
你好，最近遇到个比较头疼的问题，希望你能帮我分析下原因，明天要开始做了，希望这次结果会好！
大分子条带还行，就是小分子的条带很分散，拉得比较长，不是一个条带一样，一团黑的感觉，电泳没问题，因为Marker条带很直 ...

小于20K用0.22um孔径的膜
膜也会过期
另外胶浓度多少？
不要说什么胶没有问题
对这些问题要认真分析
因为Marker是纯蛋白，条带当然会没有问题

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-26 12:02

你好。请问，做的时垂直电泳，上样时会看到刚加完的样品会跑到下一个上样孔中了，最后会导致两个孔中的样品体积不一样多，怎样才能避免啊。加样时也尽量的慢了~~

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-26 14:46

小于20K用0.22um孔径的膜
膜也会过期
另外胶浓度多少？
不要说什么胶没有问题
对这些问题要认真分析
因为Marker是纯蛋白，条带当然会没有问题

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很有道理，不要主观认为这个没问题，那个没问题，要逐一排除！曾经1瓶12元的甲醇，不知道怎么回事出问题了，我从来没怀疑过它，花了一个月时间找原因，尽然就是甲醇出问题了！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 14:47

很有道理，不要主观认为这个没问题，那个没问题，要逐一排除！曾经1瓶12元的甲醇，不知道怎么回事出问题了，我从来没怀疑过它，花了一个月时间找原因，尽然就是甲醇出问题了！

=====================

任何东西的变动都要注意

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-26 14:49

我想请教，电泳跑到分离胶怎么还是可以发现每个泳道的样品是分开的，而不是很均一的压成一条带呢，还有电转时间和你的分子量大小有关吗，我一般是90mA,4h.先谢谢啦！

作者: yjf1026 时间: 2013-1-26 14:50

小于20K用0.22um孔径的膜
膜也会过期
另外胶浓度多少？
不要说什么胶没有问题
对这些问题要认真分析
因为Marker是纯蛋白，条带当然会没有问题

=============================================================================================================

我的分离胶浓度是7.5%，浓缩胶浓度是3.9%，转的蛋白是250KD的，用的是PVDF膜，不过那盒膜用了很久了，可能有两年多了吧！不知道两年多会不会过期呢？打算这次换盒新膜试试了。谢谢哈！

作者: yjf1026 时间: 2013-1-26 14:54

很有道理，不要主观认为这个没问题，那个没问题，要逐一排除！曾经1瓶12元的甲醇，不知道怎么回事出问题了，我从来没怀疑过它，花了一个月时间找原因，尽然就是甲醇出问题了！

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谢谢哈！我这次就打算转一张膜，染色一张看看是不是胶的问题，还有换张新膜，希望结果会好！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 14:55

我想请教，电泳跑到分离胶怎么还是可以发现每个泳道的样品是分开的，而不是很均一的压成一条带呢，还有电转时间和你的分子量大小有关吗，我一般是90mA,4h.先谢谢啦！

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电转与电转方式：半干与湿转
分子量大小
胶浓度有关

压不成一条带你测测系统的pH

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:12

我的分离胶浓度是7.5%，浓缩胶浓度是3.9%，转的蛋白是250KD的，用的是PVDF膜，不过那盒膜用了很久了，可能有两年多了吧！不知道两年多会不会过期呢？打算这次换盒新膜试试了。谢谢哈！

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2年不好保证有没有过期
另外膜暴露在空气中，高温会加速膜的老化
还有就是膜的最外侧最容易老化
前段时间用NC膜
用到最后一点就出现这样的问题

作者: loli 时间: 2013-1-26 15:12

请问用什么方法测总蛋白浓度误差小些呢？我的标本是大鼠肾脏，目的蛋白是110kd核蛋白，对裂解液有特殊要求吗？用RIPA可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:12

请问用什么方法测总蛋白浓度误差小些呢？我的标本是大鼠肾脏，目的蛋白是110kd核蛋白，对裂解液有特殊要求吗？用RIPA可以吗？

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核蛋白可以选择胞浆/胞核蛋白提取试剂盒
用RIPA对目的蛋白提取的效果不是很好
如果目的核蛋白丰度比较高的话可以选择用RIPA
用BCA法吧
对很多离子有兼容性

作者: 小糖块 时间: 2013-1-26 15:13

我想问一下，浓缩胶的tris是1.0M还是0.5M有什么区别么？

作者: am10 时间: 2013-1-26 15:13

大家好，我刚开始做western，一头雾水...看见有这么多的高手在，很是高兴！感谢大家聚集在这里，为我们这些初学者排忧解难。我有一个问题想请教各位师兄学姐，我做的目的蛋白的分子量是28kd，但是跑出条带的分子量却是52kd，这是怎么回事呢？是我的检测因子的二聚体吗？可是二聚体的分子量都是28~50kd之间啊？能排除是我一抗的问题吗?请大家试着为我分析一下，谢谢大家了！呵呵

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:14

我想问一下，浓缩胶的tris是1.0M还是0.5M有什么区别么？

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浓缩胶的终浓度要求不同
对酸碱的缓冲能力也不同

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:14

大家好，我刚开始做western，一头雾水...看见有这么多的高手在，很是高兴！感谢大家聚集在这里，为我们这些初学者排忧解难。我有一个问题想请教各位师兄学姐，我做的目的蛋白的分子量是28kd，但是跑出条带的分子量却是52kd，这是怎么回事呢？是我的检测因子的二聚体吗？可是二聚体的分子量都是28~50kd之间啊？能排除是我一抗的问题吗?请大家试着为我分析一下，谢谢大家了！呵呵

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查查你所做蛋白的具体资料
另外在WB中50K与52K是没有明显区别的
分子量的分辨率没有那么高

作者: dongdongqiang 时间: 2013-1-26 15:17

2年不好保证有没有过期
另外膜暴露在空气中，高温会加速膜的老化
还有就是膜的最外侧最容易老化
前段时间用NC膜
用到最后一点就出现这样的问题

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呵呵，果然是膜的问题，就是在最外边的最后一张膜可能过期了，这次换了张新膜用的结果就不错，再次感谢！这个帖子真是好啊！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:18

呵呵，果然是膜的问题，就是在最外边的最后一张膜可能过期了，这次换了张新膜用的结果就不错，再次感谢！这个帖子真是好啊！

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客气
能解答问题
大家实验顺利才是真的好啊

作者: ROSE李 时间: 2013-1-26 15:18

你好，我想请教一下，我做出来的带为什么都散开来？就好像烧糊了一样，刚开始怀疑是样品坏了。但用了新样品后还是有一点散开，而且加了九个孔只出了一个孔的带，其他的都没出来。这是什么原因呢？谢谢指导！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:19

你好，我想请教一下，我做出来的带为什么都散开来？就好像烧糊了一样，刚开始怀疑是样品坏了。但用了新样品后还是有一点散开，而且加了九个孔只出了一个孔的带，其他的都没出来。这是什么原因呢？谢谢指导！

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是不是糖蛋白？
如果是的话会有拖尾现象
也就是上下散开
另外要注意处理样品的过程
WB中最重要的步骤是目的蛋白的提取与处理

作者: ROSE李 时间: 2013-1-26 15:19

是不是糖蛋白？
如果是的话会有拖尾现象
也就是上下散开
另外要注意处理样品的过程
WB中最重要的步骤是目的蛋白的提取与处理

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不是糖蛋白，是细胞信号蛋白，不应该出现这样的。关键是加了三个高剂量的孔，却只出来一个孔的带。很奇怪。有同学做不同组织的这个蛋白出来的都挺好的。

作者: cwcwcww 时间: 2013-1-26 15:19

我是新手上路，进口的beta actin大概2000块钱左右吧，我经费有限，想买国产的，您能给推荐一个产品不错的厂家吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:20

不是糖蛋白，是细胞信号蛋白，不应该出现这样的。关键是加了三个高剂量的孔，却只出来一个孔的带。很奇怪。有同学做不同组织的这个蛋白出来的都挺好的。

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那你就得看看你的样品处理了

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:20

我是新手上路，进口的beta actin大概2000块钱左右吧，我经费有限，想买国产的，您能给推荐一个产品不错的厂家吗？谢谢！

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在这不方便说厂家

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:22

不是糖蛋白，是细胞信号蛋白，不应该出现这样的。关键是加了三个高剂量的孔，却只出来一个孔的带。很奇怪。有同学做不同组织的这个蛋白出来的都挺好的。

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在这之前你跑过电泳
染过胶吗？
有没有看SDS-PAGE的结果？

作者: shenkunjie 时间: 2013-1-26 15:22

急求出现问题的答案
今天WB是实验以来最不顺利的一次。
大概情况如下，一抗4度过夜后，今天又在室温作用了4个小时，由于其他事，没顾上管，然后二抗2小时，洗两遍x5min，然后加发光底物等，结果在暗室整个膜很灿烂，全部发白光，GAPDH非常亮，目的蛋白根本看不清楚，试着暴了一下光，仅20秒，结果胶片显影定影后一片黑色。奇怪的是，我把膜提起来晾了一会，结果发现干了，立即放到TBST里面，发现膜上出现了一层粉末装的悬浮物，难道是膜上的蛋白干了后脱落了？
浸泡一会后，悬浮粉末不见了，我打算把膜洗一下后再杂交一次，不知行不行。我想问的问题是：
1，背景极强是不是因为一抗室温作用时间太长了？
2，那些白色的悬浮粉末到底是什么（需要注明，这一次我在一抗中加了0.05%的NaN3，一抗后TBST洗了3次x10min）
3，对常规的WB还有一些不清楚：封闭的作用是什么，封闭后需要再洗吗？一抗稀释液和封闭液一样的成分，为什么要洗？
在线等答案，谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-1-26 15:54

急求出现问题的答案
今天WB是实验以来最不顺利的一次。
大概情况如下，一抗4度过夜后，今天又在室温作用了4个小时，由于其他事，没顾上管，然后二抗2小时，洗两遍x5min，然后加发光底物等，结果在暗室整个膜很灿烂，全部发白光，GAPDH非常亮，目的蛋白根本看不清楚，试着暴了一下光，仅20秒，结果胶片显影定影后一片黑色。奇怪的是，我把膜提起来晾了一会，结果发现干了，立即放到TBST里面，发现膜上出现了一层粉末装的悬浮物，难道是膜上的蛋白干了后脱落了？
浸泡一会后，悬浮粉末不见了，我打算把膜洗一下后再杂交一次，不知行不行。我想问的问题是：
1，背景极强是不是因为一抗室温作用时间太长了？
2，那些白色的悬浮粉末到底是什么（需要注明，这一次我在一抗中加了0.05%的NaN3，一抗后TBST洗了3次x10min）
3，对常规的WB还有一些不清楚：封闭的作用是什么，封闭后需要再洗吗？一抗稀释液和封闭液一样的成分，为什么要洗？
在线等答案，谢谢了！

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1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

作者: yonger 时间: 2013-1-26 16:02

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！另外还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

作者: NBA 时间: 2013-1-26 16:02

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！另外还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

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谢谢你的回复
免疫组化我不懂
检测不出来可能与抗体孵育等操作有关
希望能和你继续讨论这个问题

作者: summerxx 时间: 2013-1-26 16:03

1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

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谢谢精彩回复！
我以前二抗一直反应2小时，背景情况还好吧，这次有点异常。
ECL以前作用1.5-2min，看了哈佛的WB录像，他们用5min，今天我尝试用了3min，不知道是不是原因所在。

作者: bamboo16 时间: 2013-1-26 16:03

不好意思，刚看到您的建议是20-40Ug蛋白上样量，这样子的话我那0.07ug/ul的浓度肯定是不行了，请问有什么好的建议没有啊？我是用25平方厘米的培养瓶养的细胞，怎么样蛋白浓度能高一些呢？谢谢！在线等～

作者: bamboo16 时间: 2013-1-26 16:05

怎样判定蛋白降解了？
从结果看，如果位置比目的蛋白低，并有多条产物带，是不是降解了？
如果位置比目的蛋白位置高，甚至高出好多，也许成倍，那又是什么情况？蛋白耦合？二聚体？蛋白质修饰？
如果内参正常表达，又能说明什么？

作者: 831226 时间: 2013-1-26 16:06

求助！
请教：我现在做98KD 和90KD 的两个胞膜蛋白，上样量60-80ug，电转40v240min，5%奶粉+0.1%TBST 室温封闭一小时，一抗1:200(Santa Cruz),4度过夜和室温1小时都试过，洗膜0.1%TBST12min*3次，二抗1：2000，室温1小时，洗膜0.1%TBST10min*3次，ECL发光。曝光5秒到两天，条带特别淡，背景倒是很浅。
请教问题出在哪里？做何改进？
感激不尽！

作者: kuaizige 时间: 2013-1-26 16:07

非常感谢版主及时的帮助！我遇到和四眼看科学有点类似的情况。前几天W出了110kd目的蛋白的，后来重复第3次的时候就有了70kd的杂带，再后来只剩下了70kd蛋白带了。重复的时候我是重新从-70取出的样本。用丽春红染色后110kd是有蛋白条带的。其余条件都是一样的。我想知道如何确定是抗体的原因还是其他？

作者: NBA 时间: 2013-1-28 15:21

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

作者: 66+77 时间: 2013-1-28 16:06

从组织提的蛋白，分子量180kd，上样量40ug，70v，110v电泳，300mA两小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，santa一抗 1：500TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。
第一张图是最开始曝的，第三张是过了一段时间曝的。中间一张是内参，似乎和目的蛋白是一样的情况。

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:06

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:09

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14125883&sty=1&tpg=1&age=0')

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内参做成这样
说明操作上不是很严谨
或者说是整个步骤有问题

作者: 66+77 时间: 2013-1-28 16:10

内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域，是不是过多的酶把底物消耗完的缘故？
还有个问题，压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间，而我合上塑料膜的时候，发现一些本来发光的区域不发光了，是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方？怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样？
今天把一抗，二抗的稀释度都翻了一番，变成1：1000，1：4000。试了santa 的ECL，结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥？怎么操作？

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:31

你说的很有道理
二抗浓度高了HRP会把ECL中的底物消耗掉
在你加上ECL的时候会很亮
但是很快就会减弱了
首先要保证二抗的稀释度合适才行
才能保证压片时的效果

另外你为什么要干燥？

WB过程是要避免膜干燥的

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:31

还有就是在ECL孵育的过程中要避免金属等污染膜
会抑制HRP的活性

作者: jkobn 时间: 2013-1-28 16:32

最近去暗室曝光的时候，涂上发光液后膜上有很亮的一些点，曝光后的胶片上就成了麻点，非常难看，请楼主帮忙分析一下是什么原因啊

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:34

建议重换洗膜、稀释抗体用的缓冲液
前几天有个战友也有类似情况
她的问题是这样的：同一个抗体
一个用抗血清、一个用纯化后的抗体
结果抗血清的片子干净，纯化后抗体的片子和你说的一样

作者: redbutterfly 时间: 2013-1-28 16:35

最近做大分子200KD的蛋白，显色后条带不是窄条状的，而是沿着泳道散开成一片，成竖带状的了，原因分析下
因为是200KD的，我用的6%的胶，电泳2个小时到溴芬兰出了胶停止的
以前有次用10的胶跑下来条带很漂亮，难道因为6的胶比较稀，蛋白压缩不好，电泳时间长了蛋白弥散开了？/？？

选择湿转了2次，300ma/2.5h，转完预染marker都不是很清楚，立春红也没看见，转膜液是tris 25mM,Gly 192mM,Met 20%,SDS 0.1%,加水到1L，正负绝对没错，三明治也没问题，只好换半干1.5h, 预染marker转过去了，结果显色后就是楼上那样，郁闷

作者: 阿k 时间: 2013-1-28 16:51

请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！

作者: NBA 时间: 2013-1-28 16:52

可能的问题在你做三明治的时候把胶压的太扁了
在300mA的电流下转缓是很热的
容易把胶压扁
我也出现过你说的这种条带情况
还要检查一下浓缩胶是否凝好
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-28 17:01

请问做western-blot时，目的蛋白是膜蛋白，内参也应该是膜上组成性表达的蛋白吧，应该选什么呢？谢谢啦！

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如果做总蛋白的话不需要专门选择膜上的内参
用常用的三种内参就可以
膜上内参有Flotillin

作者: bs4665 时间: 2013-1-28 17:03

有时候做WB在显色的时候会出现方格样的条带，如图
不是每次都出，没有预见性的，我们做一般都是两块一起做的，做几次都只有一块膜会出格方格，电泳转膜条件都是一样的．不知道怎么引起的，各位有没有出现过这种问题啊？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 10:55

很简单
第一：电泳缓冲液污染（是不是反复使用了？）
第二：转缓应该新配

作者: u234 时间: 2013-1-29 10:55

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带，两种方法所得结果不同，请楼主指点！

作者: kuohao17 时间: 2013-1-29 10:56

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-1-29 10:56

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

作者: NBA 时间: 2013-1-29 10:59

我用的是BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，内参用的GAPDH，最后用AlphaEaseFC分析，半定量分析的时候应该尽可能把蛋白条带圈进去（如图一）还是应该所选的范围内全部充满蛋白条带（如图二），两种方法所得结果不同，请楼主指点！

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应该全部选中
我用的是ImageQuant TL
最好用IOD值

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:00

你好！我这有个结果想让你帮忙看一眼。
这个图上有野生型和重组型两种的细胞蛋白，一抗分别是针对GFP的多抗和针对m2 tag的多抗（这个是鸡多抗，故背景很多杂带），二抗是抗兔或抗鸡的。我的蛋白是融合的M2-EYFP，为什么图中都是三条带呢？请教过有个老师，他分析是isoform，你怎么认为？
谢谢先

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这几天我刚做了GFP的抗体检测与GFP标签蛋白裂解液的检测
我认为你请教的那个老师说的有道理
GFP有时会有小片段存在
另外一抗的稀释度调整下

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:02

六一的电泳仪湿转，仪器说明书上说是80mA 两小时之内完成，转65kD的时候可以做出来，但是同样条件做130kD没有条带，转膜时间延长至3小时，还是没有条带，麻烦指导一下。不胜感激！
电流能否改成100mA或者更大？
时间三小时还是再长一些？

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25mM tris
192mM glycine
20% methanol
0.1%SDS
配制完成后放置四度冰箱预冷
转膜时降温
130KD还是很好做的
300mA恒流 2h10min
祝你好运

作者: one 时间: 2013-1-29 11:04

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

作者: PINK 时间: 2013-1-29 11:06

如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:07

TBST的PH值6.0是不是对抗体结合有影响？

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抗体在中性环境下最稳定
pH5-8左右都可以
最稳定是7左右
另外稀释抗体的时候加了奶粉等
可以对抗体起一定的保护作用

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:07

如果曝光出来,泳道之间是黑色的,就是相邻泳道之间都是黑色的,什么原因呢?
是非特异性结合么,特异性不好导致?,为什么会在泳道之间曝出条带?
请指教.

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相邻的条带都连在一起吗？
上样量多少ug？

作者: 3648755 时间: 2013-1-29 11:10

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

作者: kuohao17 时间: 2013-1-29 11:10

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:10

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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APS与TEMED的加的量有什么变化？
现在温度升高了
这两者的量是随温度变化而变化的
温度高要少加一些
可能是凝胶速度快
另外插梳子的时候要注意看

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:11

我这两天做的结果背景较脏，并且有的时候没有信号。今天做封闭的时候发现前两次的封闭液配成了10%的脱脂奶粉。我想问一下，10%的脱脂奶粉对western 有什么样的影响。

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10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗

作者: 831226 时间: 2013-1-29 11:11

您好我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答在线等待

作者: zzzz 时间: 2013-1-29 11:12

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:13

您好我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度，用曲线计算后大约是10毫克每毫升，上样量是20微升，GAPDH的条带特别宽相邻的泳道，染色后都连在一起，是不是上样量太多？
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确，该怎样调平？
3、我跑的条带有的呈锯齿状，还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样，是怎麽回事?
谢谢回答在线等待

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哇
1，上样量太大了，一般蛋白的上样量为20~40ug总蛋白
上样量的大小取决于电泳槽上样孔大小与凝胶的厚度
2，BCA测定蛋白浓度的时候想要准确的话应该至少做双管测定
想让内参很匀的话可以做一次WB，把条带的IOD值读出来，通过IOD值再来调整总蛋白的上样量
3，分离胶在配制的时候没有充分混匀
没有凝充分
浓缩胶与分离胶同样没有处理好
都会出现你说的这种情况
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:13

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

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1，浓缩胶的高度一般在1cm左右，太多了会影响分离胶的高度，进而影响分离胶的分辨率
2，电泳缓冲液是不用调整pH的
建议用双蒸水新配电泳缓冲液，别调整pH

作者: october7 时间: 2013-1-29 11:14

你好，我想请教一下，我做出来的带为什么都散开来？就好像烧糊了一样，刚开始怀疑是样品坏了。但用了新样品后还是有一点散开，而且加了九个孔只出了一个孔的带，其他的都没出来。这是什么原因呢？谢谢指导！

作者: NBA 时间: 2013-1-29 11:14

QUOTE:

原帖由 october7 于 2013-1-29 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我想请教一下，我做出来的带为什么都散开来？就好像烧糊了一样，刚开始怀疑是样品坏了。但用了新样品后还是有一点散开，而且加了九个孔只出了一个孔的带，其他的都没出来。这是什么原因呢？谢谢指导！ ...

是不是糖蛋白？
如果是的话会有拖尾现象
也就是上下散开
另外要注意处理样品的过程
WB中最重要的步骤是目的蛋白的提取与处理

作者: october7 时间: 2013-1-29 11:15

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-1-29 11:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是不是糖蛋白？
如果是的话会有拖尾现象
也就是上下散开
另外要注意处理样品的过程
WB中最重要的步骤是目的蛋白的提取与处理

不是糖蛋白，是细胞信号蛋白，不应该出现这样的。关键是加了三个高剂量的孔，却只出来一个孔的带。很奇怪。有同学做不同组织的这个蛋白出来的都挺好的。

作者: bamboo16 时间: 2013-1-29 15:31

急求出现问题的答案
今天WB是实验以来最不顺利的一次。
大概情况如下，一抗4度过夜后，今天又在室温作用了4个小时，由于其他事，没顾上管，然后二抗2小时，洗两遍x5min，然后加发光底物等，结果在暗室整个膜很灿烂，全部发白光，GAPDH非常亮，目的蛋白根本看不清楚，试着暴了一下光，仅20秒，结果胶片显影定影后一片黑色。奇怪的是，我把膜提起来晾了一会，结果发现干了，立即放到TBST里面，发现膜上出现了一层粉末装的悬浮物，难道是膜上的蛋白干了后脱落了？
浸泡一会后，悬浮粉末不见了，我打算把膜洗一下后再杂交一次，不知行不行。我想问的问题是：
1，背景极强是不是因为一抗室温作用时间太长了？
2，那些白色的悬浮粉末到底是什么（需要注明，这一次我在一抗中加了0.05%的NaN3，一抗后TBST洗了3次x10min）
3，对常规的WB还有一些不清楚：封闭的作用是什么，封闭后需要再洗吗？一抗稀释液和封闭液一样的成分，为什么要洗？
在线等答案，谢谢了！

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1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

作者: kuohao17 时间: 2013-1-29 15:32

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！另外还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:32

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！另外还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

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谢谢你的回复
免疫组化我不懂
检测不出来可能与抗体孵育等操作有关
希望能和你继续讨论这个问题

作者: 987789 时间: 2013-1-29 15:33

1，背景强与一抗孵育时间之间的关系不是很大
建议你二抗的孵育时间缩短至40min到1h，洗膜次数适当增加
2，你说的白色悬浮物我不知道是什么东西
是不是加ECL的时候污染了？
NaN3应该不会出现这样的情况，但是我个人认为在孵育抗体的时候最好不要加入NaN3
3，NC及PVDF膜都有吸附蛋白的能力，用过量的蛋白质封闭的时候是让膜全部吸附上蛋白质，防止抗体结合的时候非特异的吸附在膜上（抗体也是蛋白质啊）
不知道说的清不清楚，继续交流

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谢谢精彩回复！
我以前二抗一直反应2小时，背景情况还好吧，这次有点异常。
ECL以前作用1.5-2min，看了哈佛的WB录像，他们用5min，今天我尝试用了3min，不知道是不是原因所在。

作者: 131415 时间: 2013-1-29 15:33

我是一名新手，一般做Western blot 蛋白上样量多少比较好呢？我测的细胞总蛋白浓度只有0.07ug/ul,这个浓度可以做Western blot 吗？
谢谢等您的好消息

作者: 8princess8 时间: 2013-1-29 15:34

不好意思，刚看到您的建议是20-40Ug蛋白上样量，这样子的话我那0.07ug/ul的浓度肯定是不行了，请问有什么好的建议没有啊？我是用25平方厘米的培养瓶养的细胞，怎么样蛋白浓度能高一些呢？谢谢！在线等～～

作者: S6044 时间: 2013-1-29 15:34

怎样判定蛋白降解了？
从结果看，如果位置比目的蛋白低，并有多条产物带，是不是降解了？
如果位置比目的蛋白位置高，甚至高出好多，也许成倍，那又是什么情况？蛋白耦合？二聚体？蛋白质修饰？
如果内参正常表达，又能说明什么？

作者: xingyi08 时间: 2013-1-29 15:34

求助！
请教：我现在做98KD 和90KD 的两个胞膜蛋白，上样量60-80ug，电转40v240min，5%奶粉+0.1%TBST 室温封闭一小时，一抗1:200(Santa Cruz),4度过夜和室温1小时都试过，洗膜0.1%TBST12min*3次，二抗1：2000，室温1小时，洗膜0.1%TBST10min*3次，ECL发光。曝光5秒到两天，条带特别淡，背景倒是很浅。
请教问题出在哪里？做何改进？
感激不尽！

作者: bamboo16 时间: 2013-1-29 15:35

非常感谢版主及时的帮助！我遇到和四眼看科学有点类似的情况。前几天W出了110kd目的蛋白的，后来重复第3次的时候就有了70kd的杂带，再后来只剩下了70kd蛋白带了。重复的时候我是重新从-70取出的样本。用丽春红染色后110kd是有蛋白条带的。其余条件都是一样的。我想知道如何确定是抗体的原因还是其他？

作者: wood533 时间: 2013-1-29 15:35

您好，我做得目的蛋白分子量在40kd左右，电泳完考马斯亮蓝可以染出清晰的条带，转膜我用的是NC膜，转完丽春红染色也能看见清晰的条带，然后常温封闭1.5小时，一抗4度过夜，二抗常温孵育一小时，可总是显色的时候只有ACTION 能显出条带，目的蛋白总是显不出来，不知道是哪一步出了问题？我想请教下您，能不能给我点建议？谢谢了
> 另外我的一抗是按说明书上最大稀释的一倍稀释的，一比一百。二抗是一比一万

作者: loli 时间: 2013-1-29 15:36

请教楼主：我在跑一个蛋白后出现了在目的蛋白分子量附近的两条带，一粗一细，而且在同一细胞应用了不同的处理方法后，这两条带的粗细还是相反的，所以感觉不应该是非特异形结合，好像磷酸化会使蛋白在SDS胶中跑的更快些，那么下面的条带会不会是这个蛋白的磷酸化形式啊？
附上图，请求解答
左边是marker，最上面是105，下面一条是71.我的目的蛋白94kd，
第一个泳道是未做任何处理，第二条是对照组，第三条是实验组(剪膜时被剪掉一半）
前两组都是上粗下细，第三组是上细下粗。
用的是多抗

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:37

原来请教过您条带呈锯齿状的原因，我发现在提蛋白时，离心后上清的上面还有絮状物，如果不把他吸上去，就不会有锯齿状条带了！另外还想请教您：western检测到了蛋白，为什么免疫组化就检测不出来呢？

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一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:48

不好意思，刚看到您的建议是20-40Ug蛋白上样量，这样子的话我那0.07ug/ul的浓度肯定是不行了，请问有什么好的建议没有啊？我是用25平方厘米的培养瓶养的细胞，怎么样蛋白浓度能高一些呢？谢谢！在线等～～

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减少裂解液的量
延长裂解液时在冰上的孵育时间

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:52

怎样判定蛋白降解了？
从结果看，如果位置比目的蛋白低，并有多条产物带，是不是降解了？
如果位置比目的蛋白位置高，甚至高出好多，也许成倍，那又是什么情况？蛋白耦合？二聚体？蛋白质修饰？
如果内参正常表达，又能说明什么？

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1，以前你做过的蛋白有很强的条带，但是现在没有了
2，有时候有很多条带并不一定是降解的，有可能是抗体制备时选择的多肽序列具有同源性，以致你做WB时会有很多非特异性条带
3，有可能是二聚体，比如BSA就有这样的情况，而且蛋白修饰比如糖基化也会使位置发生变化
4，内参的表达量很大，表达正常只能说明你做WB时的体系没有出现问题

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:52

求助！
请教：我现在做98KD 和90KD 的两个胞膜蛋白，上样量60-80ug，电转40v240min，5%奶粉+0.1%TBST 室温封闭一小时，一抗1:200(Santa Cruz),4度过夜和室温1小时都试过，洗膜0.1%TBST12min*3次，二抗1：2000，室温1小时，洗膜0.1%TBST10min*3次，ECL发光。曝光5秒到两天，条带特别淡，背景倒是很浅。
请教问题出在哪里？做何改进？
感激不尽！

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上样量够了，整个操作没有什么问题
而且曝光时间我认为超过30min就没有太大的意义了
我建议你改变ECL的敏感性
你可以试试康为世纪的ECL超敏产品，有试用装（但是超敏的ECL需要加大二抗的稀释度）
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:53

非常感谢版主及时的帮助！我遇到和四眼看科学有点类似的情况。前几天W出了110kd目的蛋白的，后来重复第3次的时候就有了70kd的杂带，再后来只剩下了70kd蛋白带了。重复的时候我是重新从-70取出的样本。用丽春红染色后110kd是有蛋白条带的。其余条件都是一样的。我想知道如何确定是抗体的原因还是其他？

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严格来说立春红染膜110k左右肯定是有条带的
抗体的稀释度你是不是改变了（比如直接稀释了，或者用了第一次又用第二次，都会降低抗体的稀释度）
抗体质量的好坏也有影响
另外在蛋白提取的时候一定要注意加蛋白酶抑制剂以及操作的时候在冰上进行

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:53

您好，我做得目的蛋白分子量在40kd左右，电泳完考马斯亮蓝可以染出清晰的条带，转膜我用的是NC膜，转完丽春红染色也能看见清晰的条带，然后常温封闭1.5小时，一抗4度过夜，二抗常温孵育一小时，可总是显色的时候只有ACTION 能显出条带，目的蛋白总是显不出来，不知道是哪一步出了问题？我想请教下您，能不能给我点建议？谢谢了
> 另外我的一抗是按说明书上最大稀释的一倍稀释的，一比一百。二抗是一比一万

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能告诉你做的是什么蛋白及组织或者细胞吗？
我可以帮你查查信息
再告诉你建议

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:55

请教楼主：我在跑一个蛋白后出现了在目的蛋白分子量附近的两条带，一粗一细，而且在同一细胞应用了不同的处理方法后，这两条带的粗细还是相反的，所以感觉不应该是非特异形结合，好像磷酸化会使蛋白在SDS胶中跑的更快些，那么下面的条带会不会是这个蛋白的磷酸化形式啊？
附上图，请求解答
左边是marker，最上面是105，下面一条是71.我的目的蛋白94kd，
第一个泳道是未做任何处理，第二条是对照组，第三条是实验组(剪膜时被剪掉一半）
前两组都是上粗下细，第三组是上细下粗。
用的是多抗

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看看抗体说明书
有很多抗体的说明书上的图就是有及条带并存的

作者: dongdongqiang 时间: 2013-1-29 15:56

你好，我也是新手，今天第一次做WB，我的蛋白是180KD的免疫球蛋白，我采用半湿转膜的，胶浓度是6%，压缩还可以，我的膜是7.5平方厘米，采用7.5毫安转了半小时，结果胶干了，染色后出现了一团蛋白，不是条带，将膜进行DAB显色后，出现一个泛白的团状，跟转膜后凝胶上的蛋白团形状一样，不知道是不是转膜条件不对，蛋白横向扩散了。

作者: orangecake 时间: 2013-1-29 15:57

看看抗体说明书
有很多抗体的说明书上的图就是有及条带并存的

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说明书上只有一条带，该考虑是什么原因啊？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 15:58

你好，我也是新手，今天第一次做WB，我的蛋白是180KD的免疫球蛋白，我采用半湿转膜的，胶浓度是6%，压缩还可以，我的膜是7.5平方厘米，采用7.5毫安转了半小时，结果胶干了，染色后出现了一团蛋白，不是条带，将膜进行DAB显色后，出现一个泛白的团状，跟转膜后凝胶上的蛋白团形状一样，不知道是不是转膜条件不对，蛋白横向扩散了。

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IgG丰度较大
你试试这个条件
先降低上样量
转膜采用1.2mA每平方厘米膜面积，你自己可以算一下
恒流转移2h
半干肯定在转移过程中滤纸及胶会干，没有太大关系

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:09

说明书上只有一条带，该考虑是什么原因啊？

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如果多次改变实验条件仍得不到很好的条带
就可以确证抗体本身有问题

作者: tuuu2 时间: 2013-1-29 16:20

我的胶含水量较大，转的时间过长会不会使胶变硬，贴在膜上，另外，是不是冷却系统必须要好？

作者: gogo 时间: 2013-1-29 16:21

Biorad 7.5%的预制胶，100v电转70min, 每次转膜后部分胶总是粘在pvdf上，不好去除，请问是什么原因，谢谢。

作者: 831226 时间: 2013-1-29 16:21

非常感谢你的回答，但我用的是Santa Cruz的ECL了，质量和敏感性应该不差了吧。我是怀疑膜蛋白提取的问题，就是膜蛋白没有提出来或是膜蛋白量太低，请问有什么好的膜蛋白提取的方法吗？
谢谢！

作者: utt0989 时间: 2013-1-29 16:21

膜用牛奶封闭了之后，要一周后才有时间做免疫反应，但怕时间长了牛奶会变质，要怎样保存才好呢？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:22

我的胶含水量较大，转的时间过长会不会使胶变硬，贴在膜上，另外，是不是冷却系统必须要好？

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胶含水量比较大？
是不是分离胶浓度比较小啊？
如果湿转的话必需要有很好的冷却系统
把转移模块放至4度冰箱，同时还要加冰块在模块周围，这样效果很更好

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:22

Biorad 7.5%的预制胶，100v电转70min, 每次转膜后部分胶总是粘在pvdf上，不好去除，请问是什么原因，谢谢。

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告诉我你的转移缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:23

Biorad 7.5%的预制胶，100v电转70min, 每次转膜后部分胶总是粘在pvdf上，不好去除，请问是什么原因，谢谢。

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我认为问题可能出现在转移缓冲液及转膜时降温的问题上

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:24

非常感谢你的回答，但我用的是Santa Cruz的ECL了，质量和敏感性应该不差了吧。我是怀疑膜蛋白提取的问题，就是膜蛋白没有提出来或是膜蛋白量太低，请问有什么好的膜蛋白提取的方法吗？
谢谢！

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santa cruz的ECL质量肯定没有问题
但是敏感性是不一样的
你查查ECL的敏感性，这一块是值得学习和摸索的（其实在WB中这一块非常重要）
膜蛋白的提取可以增加脱氧胆酸钠的比例

作者: NBA 时间: 2013-1-29 16:24

膜用牛奶封闭了之后，要一周后才有时间做免疫反应，但怕时间长了牛奶会变质，要怎样保存才好呢？

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加入叠氮钠或者硫柳汞防腐，4度保存
或者把膜取出，用滤纸上下夹好-20度保存

作者: ritou1985 时间: 2013-1-29 16:42

一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

不太同意你这个观点哦！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-29 16:43

我是新手上路，进口的beta actin大概2000块钱左右吧，我经费有限，想买国产的，您能给推荐一个产品不错的厂家吗？谢谢！

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我现在用的是上海康成的GAPDH，感觉还不错。联系方式在网上查查，价格比较便宜。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-29 16:43

一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

不太同意你这个观点哦！

呵呵
说说你的观点啊

我也遇到这样的问题，WB没问题，ICC却有问题，当然也有ICC可以，但WB做不出来的。不知怎么回事。

作者: wood533 时间: 2013-1-29 16:45

我现在用的是上海康成的GAPDH，感觉还不错。联系方式在网上查查，价格比较便宜。

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呵呵
内参一般都没有什么问题

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:03

一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

不太同意你这个观点哦！

呵呵
说说你的观点啊

我也遇到这样的问题，WB没问题，ICC却有问题，当然也有ICC可以，但WB做不出来的。不知怎么回事。

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IHC做的少，偶有接触
所以不懂

作者: ladyhuahua 时间: 2013-1-29 17:03

老师您好，我做WB也出现了问题，恳请您的指点，现在把我实验的一些步骤我有点怀疑的列出：

1，细胞总蛋白的提取：裂解液我用的是同实验室师姐的，不过我的细胞和她们的不一样。蛋白浓度测定没有问题。裂解液里加了磷酸酶抑制剂，但我提的不是磷酸化蛋白，这应该对我的目的蛋白提取没有影响吧

2，我的目的蛋白分子量是17 23 26 55，总蛋白上样量是40ug，分离胶15%，电泳后Marker条带全部显示。转膜100V，90min，立春红染膜有清楚的蛋白条带。这程序也应该没有问题。请问，我可不可以根据预染Marker转到膜上的量来判断蛋白转移的效率而不需染胶或膜？

3，我一抗选择Santa的，推荐1：100-1：400，我用的是1：200，内参是Tubulin（国产的），推荐1：100-1：400，我使用1：200。二抗稀释比是1：2000，二抗和ECL液试过应该没有问题。但是这两种一抗都做不出来，cell signal的一抗能出来，做了两次，实验条件都基本相同。是不是抗体有问题？我应该怎么办？

急切盼望您的回复，谢谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-1-29 17:04

跑胶时，显示预染蛋白明显滞后是怎么回事，以哪个为准？
5xloading buffer 是根据最后lysate体积算吗？比如10ul lysate，加5xloading buffer 2.5ul？
这样总体积就是12.5ul，预染蛋白也必须加12.5 ul吗？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:04

老师您好，我做WB也出现了问题，恳请您的指点，现在把我实验的一些步骤我有点怀疑的列出：

1，细胞总蛋白的提取：裂解液我用的是同实验室师姐的，不过我的细胞和她们的不一样。蛋白浓度测定没有问题。裂解液里加了磷酸酶抑制剂，但我提的不是磷酸化蛋白，这应该对我的目的蛋白提取没有影响吧

2，我的目的蛋白分子量是17 23 26 55，总蛋白上样量是40ug，分离胶15%，电泳后Marker条带全部显示。转膜100V，90min，立春红染膜有清楚的蛋白条带。这程序也应该没有问题。请问，我可不可以根据预染Marker转到膜上的量来判断蛋白转移的效率而不需染胶或膜？

3，我一抗选择Santa的，推荐1：100-1：400，我用的是1：200，内参是Tubulin（国产的），推荐1：100-1：400，我使用1：200。二抗稀释比是1：2000，二抗和ECL液试过应该没有问题。但是这两种一抗都做不出来，cell signal的一抗能出来，做了两次，实验条件都基本相同。是不是抗体有问题？我应该怎么办？

急切盼望您的回复，谢谢

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1，加了磷酸酶抑制剂对普通蛋白质没有影响
2，小分子量的选择0.22um孔径的膜
3，一抗的稀释比例加大到1：50和1：100试试

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:04

跑胶时，显示预染蛋白明显滞后是怎么回事，以哪个为准？
5xloading buffer 是根据最后lysate体积算吗？比如10ul lysate，加5xloading buffer 2.5ul？
这样总体积就是12.5ul，预染蛋白也必须加12.5 ul吗？
谢谢！

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1，预染蛋白偶联了染料，电泳时比非预染的要滞后
这是不可避免的，以非预染电泳染胶为准
2，操作是这样的
你可以预染蛋白上10ul，中间上一个1倍buffer12.5ul，再上样12.5ul，这样对样品的泳动影像小一些

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:06

一般做WB的抗体都可以做IHC
但是能做IHC的不一定能做WB

不太同意你这个观点哦！

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IHC与WB中抗体的应用从原来来说应该是一样的
但是WB涉及到抗原的提取
可能抗原提取不出来
这样的话WB检测肯定检不出来

作者: bring 时间: 2013-1-29 17:07

5%脱脂奶粉封闭多长时间比较合适？
封闭完后可以不洗直接加一抗吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:07

5%脱脂奶粉封闭多长时间比较合适？
封闭完后可以不洗直接加一抗吗？

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RT 30min~1h
封闭完之后用缓冲液冲洗干净
然后加抗体
屡试不爽

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:08

国产抗体tubulin 1：400的话稀释度好低

作者: tie8 时间: 2013-1-29 17:08

是的啊，真有点后悔买国产的了。而且商家让我用1：100再试试。
顺便请问，抗体稀释后加入叠氮钠后，是不是能保存较长时间不坏？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:09

是的啊，真有点后悔买国产的了。而且商家让我用1：100再试试。
顺便请问，抗体稀释后加入叠氮钠后，是不是能保存较长时间不坏？

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国产的也有很好的
可能是买的这个不好吧

作者: ending 时间: 2013-1-29 17:10

选择一个好的抗体真是太重要了 5555

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:10

选择一个好的抗体真是太重要了 55555

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呵呵
当然很重要

作者: wmp1234 时间: 2013-1-29 17:11

抗体稀释液（缓冲液）一定要用脱脂奶粉或者BSA吗？TBST行不行？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:12

抗体稀释液（缓冲液）一定要用脱脂奶粉或者BSA吗？TBST行不行？

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可以
但是在封闭体系中稀释抗体并孵育效果会更好

作者: 66+77 时间: 2013-1-29 17:14

请教楼主，有尿素裂解液的配方吗？我需要裂解动物细胞。
尿素裂解液和RIPA比较有什么优缺点？
蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF只需要其中一种还是两种可以同时加？抑制剂加多了会有什么不良后果？
谢谢！

作者: 66+77 时间: 2013-1-29 17:18

抗体的问题还是细胞的问题？
目的蛋白17kDa，曝光结果是约70kDa，基本上是目的蛋白的4倍。四聚体？
细胞的可能不大，因为我的处理组有10多个不同细胞，结果都一样，这样的情况怎么处理？可以找代理商索赔吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:28

请教楼主，有尿素裂解液的配方吗？我需要裂解动物细胞。
尿素裂解液和RIPA比较有什么优缺点？
蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF只需要其中一种还是两种可以同时加？抑制剂加多了会有什么不良后果？
谢谢！

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有
没用过
但是哺乳动物细胞用尿素配方干嘛？
蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF要同时加
没有不良后果

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:28

抗体的问题还是细胞的问题？
目的蛋白17kDa，曝光结果是约70kDa，基本上是目的蛋白的4倍。四聚体？
细胞的可能不大，因为我的处理组有10多个不同细胞，结果都一样，这样的情况怎么处理？可以找代理商索赔吗？

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你可以先摸摸不同的条件
不行再投诉

作者: 987789 时间: 2013-1-29 17:28

请问一下，24孔板和6孔板提蛋白时Ripa的用量是多少？
我的细胞一般2天就要传代，种板浓度为1*105/ml，1ml/孔，之前用了100ul的ripa在6孔板上提，按照说明书冰上作用了30min后4度离心30min，结果浓度才1ug/ul。
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:33

请问一下，24孔板和6孔板提蛋白时Ripa的用量是多少？
我的细胞一般2天就要传代，种板浓度为1*105/ml，1ml/孔，之前用了100ul的ripa在6孔板上提，按照说明书冰上作用了30min后4度离心30min，结果浓度才1ug/ul。
谢谢！

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具体的说要看细胞数量而定
一般1乘以10的6次方细胞加100ulRIPA
但是有些细胞较小，建议加一半的裂解液

作者: 987789 时间: 2013-1-29 17:34

有
没用过
但是哺乳动物细胞用尿素配方干嘛？
蛋白酶抑制剂cocktail和PMSF要同时加
没有不良后果

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能否分享一下尿素裂解液配方啊，动物细胞不需要吗？为什么？
非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-29 17:34

哺乳动物细胞的我没用过
尿素配方一般用来溶解一些包涵体蛋白

作者: 笑弯了腰 时间: 2013-1-30 10:36

我做WESTERN 遇到奇怪的问题。

要做一个100左右大小的蛋白，提取蛋白后，先煮沸，后－20度冻存。常规跑胶转膜，加抗体曝光，在需要的位置看到明显的条带，另外50－70左右还有另外一条较弱的条带。后来蛋白又重新解冻，煮沸，重做WESTERN. 这次虽然还是2条条带，可是变成了100左右较弱，50－70左右的那条较强。

问题1 为什么2次结果不一样？
2 上样前煮沸，或者提取蛋白后立刻煮沸冻存，上样前再解冻再次煮沸有区别吗？

还有一个怪现象

我曾经作过几个分泌性蛋白，如IL-10。抗体说明书上指示目标蛋白在20KB左右，可是我做出来在50KB左右有明显条带，20左右没有看到。追溯文献，几乎所有文献都是用ELISA来检测。极少看到用WESTERN的报道。

问题1 为什么我的条带的位置不对？
2 是不是有些蛋白不适合WESTERN？怎样判定适合不适合？

谢谢

作者: nn255 时间: 2013-1-30 10:36

你好，我现在在做western，暴光后发现目的带与marker标记的大小不在同一个位置，要比marker标记的偏小约10kd,请问是什么原因引起的，是不是蛋白有可能被降解了，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:37

QUOTE:

原帖由 nn255 于 2013-1-30 10:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我现在在做western，暴光后发现目的带与marker标记的大小不在同一个位置，要比marker标记的偏小约10kd,请问是什么原因引起的，是不是蛋白有可能被降解了，谢谢 ...

如果条带非常特异，偏小约10K我认为没有问题
同时参考抗体说明书上的条带位置
看看你的参考文献里是否有偏小10K的
另外你要注意的是Marker问题
Marker不是你想像的那样准确
Marker在不同的体系中位置是不一样的
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:38

QUOTE:

原帖由 笑弯了腰 于 2013-1-30 10:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做WESTERN 遇到奇怪的问题。

要做一个100左右大小的蛋白，提取蛋白后，先煮沸，后－20度冻存。常规跑胶转膜，加抗体曝光，在需要的位置看到明显的条带，另外50－70左右还有另外一条较弱的条带。后来蛋白又重新解冻，煮沸，重做WESTER ...

你的目的蛋白是不是二聚体？
或许是降解了
分泌型的蛋白质做WB的是不多
我做过PDGF，细胞分泌的，做了细胞裂解液，没有阳性条带
WB首先要确定抗原能通过SDS-PAGE后转移到膜上

作者: loli 时间: 2013-1-30 10:39

谢谢。有道理。

我做的是磷酸化蛋白。看来蛋白提取后立刻煮沸有利于保护蛋白。实际上，我做了2次试验，一次提取蛋白－－立刻煮沸－－冻存－－测完蛋白浓度后再解冻上样，一次先测蛋白浓度－－冻存－－解冻煮沸上样，结果就是前一次100KB比70KB浓，后一次正好相反。有意思的是，如同我上文描述，前一次的样本，解冻后再次煮沸上样，得到了和后一次相同的结果。

关于第二个问题，为什么50KB有条带？可以认识这个条带是阳性的马？我用的单克隆抗体，

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:39

QUOTE:

原帖由 loli 于 2013-1-30 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢。有道理。

我做的是磷酸化蛋白。看来蛋白提取后立刻煮沸有利于保护蛋白。实际上，我做了2次试验，一次提取蛋白－－立刻煮沸－－冻存－－测完蛋白浓度后再解冻上样，一次先测蛋白浓度－－冻存－－解冻煮沸上样，结果就是前一次100KB比70KB浓 ...

查看蛋白信息
另外查抗体的说明信息然后确定条带

作者: www.1 时间: 2013-1-30 10:39

western问题求助
蛋白分子量6.9KD，等电点12左右，有磷酸化和非磷酸化两种形式，每次做western只能杂到磷酸化的15KD左右条带，这与文献上讲的磷酸化后的大小一致，但是总是杂不到正常大小即6.9KD左右的条带，一抗是用肽段做的抗体，应该是同时能杂到磷酸化和分磷酸化的，郁闷死了，技术瓶颈，试验拖了大半年，楼主有没有建议

作者: www.1 时间: 2013-1-30 10:40

我用的是caps转膜buffer，查过网上说小分子量蛋白转膜要加甲醇，而且甲醇浓度要稍高，利于小分子量蛋白的转膜，但是碱性蛋白转膜是不能用甲醇的，我就被郁闷到了，像我做这个蛋白，分子量又小，等电点又高，到底转膜该用什么进行转膜？

作者: www.1 时间: 2013-1-30 10:40

补充一下，我用的是15%的分离胶，电泳1个小时，caps buffer转膜液，100mA,一个小时左右，只能看到15kd的条带，看不到6.9kd的条带

作者: vivian4123 时间: 2013-1-30 10:41

请教：
我用贴壁细胞BMN作western，24孔板培养，处理之后用碧云天的RIPA裂解液裂解细胞，然后用来做western，我要杂的抗体是4ebp磷酸化，结果什么都没有，但是我的阳性对照组织样品有我的目的条带，表明western操作没有错误，但是为什么细胞样品没有呢？我测了细胞样品的蛋白浓度非常低，0.2~0.6ug/ul，我上样30ul左右。请问是不是因为细胞样品的蛋白含量过低造成的。
还有一个很奇怪的问题，在杂4ebp磷酸化（15kd）的同时，我把膜剪成两半，另一半用来杂actin(45kd),结果是actin一条条带都没有，组织的也没有。我用的actin抗体是1：4000稀释的，转膜30v过夜。请问这是什么原因。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:41

western问题求助
蛋白分子量6.9KD，等电点12左右，有磷酸化和非磷酸化两种形式，每次做western只能杂到磷酸化的15KD左右条带，这与文献上讲的磷酸化后的大小一致，但是总是杂不到正常大小即6.9KD左右的条带，一抗是用肽段做的抗体，应该是同时能杂到磷酸化和分磷酸化的，郁闷死了，技术瓶颈，试验拖了大半年，楼主有没有建议

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6.9K不好做
用Tricine系统
我没做过这么小的
不好意思

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:41

我用的是caps转膜buffer，查过网上说小分子量蛋白转膜要加甲醇，而且甲醇浓度要稍高，利于小分子量蛋白的转膜，但是碱性蛋白转膜是不能用甲醇的，我就被郁闷到了，像我做这个蛋白，分子量又小，等电点又高，到底转膜该用什么进行转膜？

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要查有关这个蛋白已经发表的正式文献
看人家用的什么系统及buffer
我经常上Highwire搜

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:42

请教：
我用贴壁细胞BMN作western，24孔板培养，处理之后用碧云天的RIPA裂解液裂解细胞，然后用来做western，我要杂的抗体是4ebp磷酸化，结果什么都没有，但是我的阳性对照组织样品有我的目的条带，表明western操作没有错误，但是为什么细胞样品没有呢？我测了细胞样品的蛋白浓度非常低，0.2~0.6ug/ul，我上样30ul左右。请问是不是因为细胞样品的蛋白含量过低造成的。
还有一个很奇怪的问题，在杂4ebp磷酸化（15kd）的同时，我把膜剪成两半，另一半用来杂actin(45kd),结果是actin一条条带都没有，组织的也没有。我用的actin抗体是1：4000稀释的，转膜30v过夜。请问这是什么原因。

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你上样的时候总蛋白含量太低了
另外这么小的蛋白用0.22um孔径的膜
转膜建议用半干转

作者: mamamiya 时间: 2013-1-30 10:42

请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白为组成型

大小二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5％
转膜条件为：400mA 80分钟（转膜效果差）

5％脱脂奶粉封闭 RT 1 h

洗脱3次每次5分钟

一抗为1：200－1：1000
二抗为1：4000
ECL 反应2 min
曝光2 min-overnight
不能看到二聚体或者亚基的任何一条带
请问我的问题出现在那里？怎么解决？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:43

QUOTE:

原帖由 mamamiya 于 2013-1-30 10:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白为组成型

大小二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5 ...

蛋白上样前需要加buffer后煮，变性
最大的可能就是你的膜蛋白没有提取出来

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:43

QUOTE:

建议你用提膜的试剂盒

作者: ritou1985 时间: 2013-1-30 10:44

你好，用NC膜点样的方法检测一抗是否失效具体该如何操作？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:45

你好，用NC膜点样的方法检测一抗是否失效具体该如何操作？谢谢

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点上样品
室温干燥
孵育一抗，二抗，曝光或者显色

作者: 49888 时间: 2013-1-30 10:45

老师，我做的是“还原胶电泳”我要看该蛋白“脱偶联”情况，蛋白上样前不不能煮的

作者: 49888 时间: 2013-1-30 10:46

请教老师帮我分析下问题出在那里

我的蛋白为膜蛋白为组成型

大小二聚体为260 KD 亚基为130KD

细胞用RIPA buffer抽提

我做的western blot是低温的SDS-PAGE,

上样前要求总蛋白未煮
上样50－200ug

凝胶浓度为7.5％
转膜条件为：400mA 80分钟（转膜效果差）

5％脱脂奶粉封闭 RT 1 h

洗脱3次每次5分钟

一抗为1：200－1：1000
二抗为1：4000
ECL 反应2 min
曝光2 min-overnight
不能看到二聚体或者亚基的任何一条带
请问我的问题出现在那里？怎么解决？
谢谢

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既然你的总蛋白要求不能煮，就代表不能用变性胶跑电泳，所以是不是应该用Native page胶。个人意见，仅供参考。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:46

老师，我做的是“还原胶电泳”我要看该蛋白“脱偶联”情况，蛋白上样前不不能煮的，

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还原怎么不能煮？
还原一般都是要煮的
我不清楚你的目的蛋白信息
建议你多查查相关文献

作者: 49888 时间: 2013-1-30 10:47

你上样的时候总蛋白含量太低了
另外这么小的蛋白用0.22um孔径的膜
转膜建议用半干转

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请问用0.22um孔径的膜和0.45um孔径的膜对15KD有什么区别？我们实验室只有0.45um的膜。我们实验室也没有半干转设备。

作者: tangxin_80 时间: 2013-1-30 10:48

弱弱的问下，EQU307转膜仪怎么用啊，BBI产的。它的冷却系统跟BIO-RAD的不一样。我不知道怎么用？请高手指点！

作者: lgm 时间: 2013-1-30 10:48

我网上查过tricine系统，好像有些用的是2004年暨南大学曹老师的一篇文献里的配方，但是很多都出现了不同状况的问题，楼主有没有用过tricine系统？谢谢

作者: 131415 时间: 2013-1-30 10:49

你好，我现在在做的是大鼠大脑中的NMDAR,用的是抗NMDAR2A/B的抗体，分子量是165kd。可是就是不出结果，我在想是不是因为我的目的蛋白表达的量本来就比较少啊！期待你的答案，很着急

作者: 987789 时间: 2013-1-30 10:49

您好，我想向您请教一下糖基化蛋白的western 问题，我做一种糖基化蛋白，有高糖型和低糖型，但是每次ecl显色都会发生不同的结果，有的时候两种糖型都能够出现，有的时候反而只能发出高糖型，不知道是ECL的问题还是抗体的问题，我的一抗用的是santa的。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:50

请问用0.22um孔径的膜和0.45um孔径的膜对15KD有什么区别？我们实验室只有0.45um的膜。我们实验室也没有半干转设备。

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0.45um孔径的膜与0.22um膜的截留能力不同
15KD的蛋白，用0.45um的膜容易使蛋白穿透

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:50

弱弱的问下，EQU307转膜仪怎么用啊，BBI产的。它的冷却系统跟BIO-RAD的不一样。我不知道怎么用？请高手指点！

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非常不好意思
我没用过这个仪器

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:51

我网上查过tricine系统，好像有些用的是2004年暨南大学曹老师的一篇文献里的配方，但是很多都出现了不同状况的问题，楼主有没有用过tricine系统？谢谢

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没用过
但是看过相关的文献
问题应该不是很大
仔细研读文献
最好看英文的

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:51

你好，我现在在做的是大鼠大脑中的NMDAR,用的是抗NMDAR2A/B的抗体，分子量是165kd。可是就是不出结果，我在想是不是因为我的目的蛋白表达的量本来就比较少啊！期待你的答案，很着急

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首先要查找文献
确认你的目的蛋白能够提取出来

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:52

您好，我想向您请教一下糖基化蛋白的western 问题，我做一种糖基化蛋白，有高糖型和低糖型，但是每次ecl显色都会发生不同的结果，有的时候两种糖型都能够出现，有的时候反而只能发出高糖型，不知道是ECL的问题还是抗体的问题，我的一抗用的是santa的。谢谢！

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抗体反复用了吗？
我认为最大的可能是一抗反复用
另外是样品的冻融

作者: duoduo 时间: 2013-1-30 10:53

楼主你好，
我跑了P-ERK，不知为何结果出现三条带，一抗用的是CST 的，1：1000，4度过夜，第二天摇了两小时后，二抗1：1000，摇了3个半小时，
结果如下，MAKE是上面的55，下面的35，感觉最下面的应该是非特异的，但它条带这么深，不知道什么原因？请求帮助。

作者: duoduo 时间: 2013-1-30 10:53

还有这个是我前几天跑的也有这样的情况，区别就是下面的一抗不是新的，反复用过几次，但我早些时候跑的下面的那个条带就谈一些，不知道是原因，请求帮助中

作者: utt0989 时间: 2013-1-30 10:54

请问,我做这个蛋白17kd.我原来用的是30%的ACR/BIS,也试过40%的。我想问一下对这种小蛋白用哪一个好？还有就是单克隆抗体是在封闭液里面稀释好还是在TBST里面稀释好？最后一个问题：我用的是NC膜，一抗孵育之后洗膜有什么需要值得注意的地方？

作者: 131415 时间: 2013-1-30 10:54

插一个问题，封闭夜是不是要同时加脱脂奶粉和BSA？

作者: avi317 时间: 2013-1-30 10:55

我的抗体是单抗，丰度不高，一抗用TBST稀释相同浓度和封闭液比较，前者有条带，后者没有。稀释液中有叠氮化钠之类的，有防腐等作用，但是影响抗体的活性。个人建议：如果是多抗用封闭液稀释好些，如单抗，丰度低者用TBST稀释好些，因封闭液封闭后背景不会很高的，这样可能更容易W出结果。个人观点，仅供参考，我也是新手，这是一小点经验吧，你批判接受就好，希望有用！

呵呵
稀释液中有叠氮钠你就敢下这样的结论？

让楼主见笑啦。这样的结论也是在园子里和文献中学到的，也许偏驳吧！但是我的实验的确证实抗体稀释液对抗体活性有影响，在组化及W中我都对照过，当然具体机制可能不是叠氮化钠。不过任何实验都只是无穷可能中一种，我是新手，实践的可能性更少，仅供参考吧，希望有用！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:55

楼主你好，
我跑了P-ERK，不知为何结果出现三条带，一抗用的是CST 的，1：1000，4度过夜，第二天摇了两小时后，二抗1：1000，摇了3个半小时，
结果如下，MAKE是上面的55，下面的35，感觉最下面的应该是非特异的，但它条带这么深，不知道什么原因？请求帮助。

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一抗用1：2000试试
二抗孵育时间用40min

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:55

我做这个蛋白17kd.我原来用的是30%的ACR/BIS,也试过40%的。我想问一下对这种小蛋白用哪一个好？还有就是单克隆抗体是在封闭液里面稀释好还是在TBST里面稀释好？最后一个问题：我用的是NC膜，一抗孵育之后洗膜有什么需要值得注意的地方？

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30%的就可以，用15%的分离胶
转移时间要缩短
我选用抗体稀释到封闭液里
NC膜不能干燥

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:56

插一个问题，封闭夜是不是要同时加脱脂奶粉和BSA？

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单一的
用脱脂奶粉
或者BSA

作者: huifeng0516 时间: 2013-1-30 10:56

您好！我再做NADPH oxidase 中的GP91蛋白一个月多了，内参GADPH很容易做出，但是GP91很难做出来，通常曝光时没有，就是有也要曝光10-15分钟片子上，条带比较弱，因为曝光时内参肉眼清晰可见，但是目标蛋白处肉眼看不出，所以曝光10分钟以上。我认为自己操作还是有问题，请您指教，万分感谢！！！！
1 提蛋白，BCA测浓度，按30 UG上样，
2浓缩胶80V,30分钟，分离胶150V，60分钟以上
3转膜，350MA,100分钟，
4牛奶封闭过夜
5一抗：内参0.2UG,GP91:10UG 摇床4小时
6二抗：都是2UG
7 ECL显影，显影液和定影液都是柯达的

作者: shenkunjie 时间: 2013-1-30 10:57

17kd的蛋白，200ma 30min和100ma 1h湿转，那个好一点？如果目的蛋白丰度不高的话可不可以直接曝光30min?

作者: shenkunjie 时间: 2013-1-30 10:57

还有一个问题 ABCAMPROTOCOL讲到叠氮化钠会影响HRP抗体活性，而我的ABCAM一抗就是用PBS+叠氮化钠稀释的，对结果影响大不？

作者: standbyme 时间: 2013-1-30 10:58

一抗用1：2000试试
二抗孵育时间用40min

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我准备最近按你提供的条件再跑一次

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:58

您好！我再做NADPH oxidase 中的GP91蛋白一个月多了，内参GADPH很容易做出，但是GP91很难做出来，通常曝光时没有，就是有也要曝光10-15分钟片子上，条带比较弱，因为曝光时内参肉眼清晰可见，但是目标蛋白处肉眼看不出，所以曝光10分钟以上。我认为自己操作还是有问题，请您指教，万分感谢！！！！
1 提蛋白，BCA测浓度，按30 UG上样，
2浓缩胶80V,30分钟，分离胶150V，60分钟以上
3转膜，350MA,100分钟，
4牛奶封闭过夜
5一抗：内参0.2UG,GP91:10UG 摇床4小时
6二抗：都是2UG
7 ECL显影，显影液和定影液都是柯达的

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说明你的目的蛋白还是有结果的
加大上样量试试
应该就可以了
分子量多大？
如果分子量与GAPDH差不多
减少转移时间至40min
封闭40min至1h RT
一抗4度过夜
二抗RT 40min至1h
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:59

17kd的蛋白，200ma 30min和100ma 1h湿转，那个好一点？如果目的蛋白丰度不高的话可不可以直接曝光30min?

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200ma 30min会好一些
丰度不高的话加大上样量
延长一抗在4度孵育的时间（过夜）

作者: NBA 时间: 2013-1-30 10:59

还有一个问题 ABCAMPROTOCOL讲到叠氮化钠会影响HRP抗体活性，而我的ABCAM一抗就是用PBS+叠氮化钠稀释的，对结果影响大不？

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呵呵
抗体保存的时候有很多是用0.09%叠氮钠来保存的
防腐
在孵育的时候稀释抗体了，在整个体系中叠氮钠浓度就比较低了
不会影响活性

作者: applebook=213 时间: 2013-1-30 10:59

电泳时上样蛋白不向下跑,甚至MARKER也不动,是什么原因?电压为100V。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:00

电泳时上样蛋白不向下跑,甚至MARKER也不动,是什么原因?电压为100V。

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这个问题就大了
测定一下缓冲液的pH
包括电泳缓冲液、Tris-HCl等

作者: zhenxin 时间: 2013-1-30 11:00

老师你好，
我做的那个蛋白是eNOS，该蛋白具有SDS抗性，我所见资料都用Low Temperature-SDS-PAGE的方法做的，她们也都是“非煮的”，因为一煮的话，该蛋白二聚体就回变性解聚成单体（130KDa）。现在还没解决问题，头发都要白了。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:01

老师你好，
我做的那个蛋白是eNOS，该蛋白具有SDS抗性，我所见资料都用Low Temperature-SDS-PAGE的方法做的，她们也都是“非煮的”，因为一煮的话，该蛋白二聚体就回变性解聚成单体（130KDa）。现在还没解决问题，头发都要白了。

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把文献发给我看看
这种情况的蛋白我没做过
但是iNOS我以前做过

作者: 831226 时间: 2013-1-30 11:01

TMB显色法所用溶液的配方是什么？

作者: mamamiya 时间: 2013-1-30 11:01

为什么我的条带连成一条线？除了加样时间长和电泳时间长外还有其它原因吗？

作者: ququer787 时间: 2013-1-30 11:02

你好，
1、我的MARKER只出来四条带，在溴酚蓝下面还有两条带，是不是降解了？胶肯定没问题。
2、上样缓冲液我用的是DBI公司的，比以前用的颜色浅，是不是质量问题？开盖后不好闻。
3、我用的是1.5MM的胶，以前用1.0MM的能作出来,现在换成厚的反而出不来结果了，厚度有影响么？
4、有没有用过BIO-RAD的MINI PROTEIN的仪器？转膜的条件是什么?
5、用的蛋白酶抑制剂是ROCHE的COCKTAIL，提蛋白后忘了加丄样缓冲液就变性了，变性完再加的上缓。染胶后发现大分子量蛋白特别少，是蛋白酶抑制剂不行，还是组织在低温冰箱时间长（5个月），还是丄样缓冲液没有变性？
自从实验室换了这个仪器后我都没有作出来过，现在连胶都跑不好了，真郁闷！忘楼主不吝赐教：）

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:02

TMB显色法所用溶液的配方是什么

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不好意思
这个我没有用过

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:03

为什么我的条带连成一条线？除了加样时间长和电泳时间长外还有其它原因吗？

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上样量大
样品中离子浓度不合适

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:03

你好，
1、我的MARKER只出来四条带，在溴酚蓝下面还有两条带，是不是降解了？胶肯定没问题。
2、上样缓冲液我用的是DBI公司的，比以前用的颜色浅，是不是质量问题？开盖后不好闻。
3、我用的是1.5MM的胶，以前用1.0MM的能作出来,现在换成厚的反而出不来结果了，厚度有影响么？
4、有没有用过BIO-RAD的MINI PROTEIN的仪器？转膜的条件是什么?
5、用的蛋白酶抑制剂是ROCHE的COCKTAIL，提蛋白后忘了加丄样缓冲液就变性了，变性完再加的上缓。染胶后发现大分子量蛋白特别少，是蛋白酶抑制剂不行，还是组织在低温冰箱时间长（5个月），还是丄样缓冲液没有变性？
自从实验室换了这个仪器后我都没有作出来过，现在连胶都跑不好了，真郁闷！忘楼主不吝赐教：）

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1，Marker条带位置与胶浓度大小有关，反复冻融会降解
2，上样缓冲液有没有质量问题就不好说了。不好闻是beta-巯基乙醇
3，胶厚度对结果的影响很大
4，没用过你说的这个仪器，但是对于转膜条带来说应该是一样的
5，没加样品缓冲液就变性的话蛋白质直接可能就结块了，没有SDS不行。组织在低温冰箱-80度，放一年对很多蛋白都没有影响

作者: remenb 时间: 2013-1-30 11:04

请问：
15的胶电泳液用过一次，10 17的marker在电泳2/3的时候出现弥散的情况，曝光出来目的蛋白也是很宽很弥散。还有一个问题我是用的预染MARKER，曝光10分钟，目的条带的marker也貌似也显像了？

作者: remenb 时间: 2013-1-30 11:04

补充一下，电泳的时候没看见10的marker 转膜之后可以看见但是不是一条带也是分开弥散的

作者: 987789 时间: 2013-1-30 11:04

你好我是新手我买的是ABCOM的一抗体但是他没有提供做WB的适合浓度只是提供了这样一句话 Use at a concentration of 1-2μg/ml, 两个抗体的concentration 分别为2.20mg/ml 0.5mg/ml 请问这种情况如何确定1抗的浓度
感激

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:05

请问：
15的胶电泳液用过一次，10 17的marker在电泳2/3的时候出现弥散的情况，曝光出来目的蛋白也是很宽很弥散。还有一个问题我是用的预染MARKER，曝光10分钟，目的条带的marker也貌似也显像了？

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Marker中有些蛋白会显条带
我个人认为是预染M中的有些蛋白会与抗体结合
延长凝胶时间试试

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:06

你好我是新手我买的是ABCOM的一抗体但是他没有提供做WB的适合浓度只是提供了这样一句话 Use at a concentration of 1-2μg/ml, 两个抗体的concentration 分别为2.20mg/ml 0.5mg/ml 请问这种情况如何确定1抗的浓度
感激

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第一个：1：1000~1：2000稀释
第二个：1：250~1：500稀释
good luck

作者: 3648755 时间: 2013-1-30 11:09

Marker中有些蛋白会显条带
我个人认为是预染M中的有些蛋白会与抗体结合
延长凝胶时间试试

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我是按照BIORAD上面推荐的分离胶和浓缩胶都是45分钟凝胶的啊原来我们的MARKER10和17的都不是这样好像是我用了实验室公用的TRIS和甘氨酸配胶和这个有关不？另外一个同学也是15的胶曝出来也是条带很宽

作者: 3648755 时间: 2013-1-30 11:25

还有一个问题我原来用的是1M的8.8和6.8 这次换成是1.5的8.8和0.5的6.8 和这个有关吗？

作者: 49888 时间: 2013-1-30 11:41

请问：western blot 用半干转好还是用湿转好，正要买一个做转膜的仪器。蛋白质的大小20－50kD

作者: 04906 时间: 2013-1-30 11:42

请教两个问题：
1，跑胶时溴酚蓝下线位置表示多大分子量，蛋白会不会跑在溴酚蓝前面？
2，一抗4度过夜和室温杂交1小时甚至更长有什么区别，效果差异显著吗？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:42

请问：western blot 用半干转好还是用湿转好，正要买一个做转膜的仪器。蛋白质的大小20－50kD

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分子量在100K一下建议用半干

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:43

请教两个问题：
1，跑胶时溴酚蓝下线位置表示多大分子量，蛋白会不会跑在溴酚蓝前面？
2，一抗4度过夜和室温杂交1小时甚至更长有什么区别，效果差异显著吗？
谢谢！

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溴酚蓝的分子量好像是8K左右
有很多小蛋白当然会跑在前面
效果的差异要看目的蛋白的丰度

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-30 11:45

两种蛋白分子量分别为15kD、50kD，用湿转和半干转的电流和时间应如何控制

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:47

两种蛋白分子量分别为15kD、50kD，用湿转和半干转的电流和时间应如何控制

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15K 湿转 300mA，20min，0.22um 膜
50K 湿转 300mA，1h
15K 半干转1.2mA每平方厘米膜面积，30min，0.22um 膜
50K 半干转1.2mA每平方厘米膜面积，1h

作者: ukonptp 时间: 2013-1-30 11:48

今天刚学了western blot，就过来看看，这么多高手，以后有问题就不怕了，呵呵太好了……

作者: ukonptp 时间: 2013-1-30 11:48

我有几个问题请教：一抗、二抗选用的原则是什么？依据什么确定所需电泳分离胶浓度？如果某一蛋白质的存在量足以用染色法直接显示，是否仍然会有必要应用蛋白质印迹实验？为什么？谢谢

作者: vivian4123 时间: 2013-1-30 11:49

你好，我做了一段时间的WB，有两个抗体一直做的不太好，1 其中一个抗体是第一次做能出来条带，后来再做的时候除了条带出来了，背景也很复杂，不知道是怎么回事？
2 另外一个就是每次加ECL后膜的边缘就闪闪发光，还是很亮的那种，条带到时还有的，不知道是怎么回事？

我的抗体一般都重复用，不知道是不是抗体问题，但有时新配的抗体好像也出现过这种条件，有时干脆就什么条带都没有，不知道怎么回事，我的抗体都是用5%的脱脂奶粉配的，用TBST配的，不知道这样配一般能放多久，怎样确定牛奶有没有变质，抗体还能不能重复再用，请指教一下，谢谢。

作者: langlang 时间: 2013-1-30 11:50

请问楼主，一张膜可以做多次磷酸化的抗体吗？
做完一个磷酸化的抗体后，strip,再加另外一种磷酸化抗体，效果会不会受到影响？好像很多磷酸化的抗体比较娇气。

谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:51

我有几个问题请教：一抗、二抗选用的原则是什么？依据什么确定所需电泳分离胶浓度？如果某一蛋白质的存在量足以用染色法直接显示，是否仍然会有必要应用蛋白质印迹实验？为什么？谢谢

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1，选用原则：1）与自己目的蛋白的种属有甲叉反应，2）自己实验室的条件：用的是什么二抗之类
2，依据目的蛋白的分子量大小确定分离胶浓度
3，什么染色法？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:51

我做了一段时间的WB，有两个抗体一直做的不太好，1 其中一个抗体是第一次做能出来条带，后来再做的时候除了条带出来了，背景也很复杂，不知道是怎么回事？
2 另外一个就是每次加ECL后膜的边缘就闪闪发光，还是很亮的那种，条带到时还有的，不知道是怎么回事？

我的抗体一般都重复用，不知道是不是抗体问题，但有时新配的抗体好像也出现过这种条件，有时干脆就什么条带都没有，不知道怎么回事，我的抗体都是用5%的脱脂奶粉配的，用TBST配的，不知道这样配一般能放多久，怎样确定牛奶有没有变质，抗体还能不能重复再用，请指教一下，谢谢。

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1，重复用的抗体不能保证是否污染
2，我不建议重复使用抗体
3，延长在4度封闭的时间，减少二抗孵育时间
4，一抗稀释度要变稀
5，用TBST配制的抗体4度一般可以放置一周
6，新配的抗体浓度有些高所以有时不出条带，第二次用的浓度降低了能出条带，从此确定你的一抗浓度太高，建议稀释2~4倍后使用
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:52

请问楼主，一张膜可以做多次磷酸化的抗体吗？
做完一个磷酸化的抗体后，strip,再加另外一种磷酸化抗体，效果会不会受到影响？好像很多磷酸化的抗体比较娇气。

谢谢

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你可以试试
磷酸化的我是每次跑电泳或者不同分子量的剪开膜
Strip的原则是：从丰度小到丰度大的

作者: mimili_901 时间: 2013-1-30 11:52

我做的分子量23K，26K两种蛋白，剪膜时竟然能够剪开，显影时条带还可以。不是说一般分子量相差6K以上才容易剪吗？我用的是15%的胶

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:53

我做的分子量23K，26K两种蛋白，剪膜时竟然能够剪开，显影时条带还可以。不是说一般分子量相差6K以上才容易剪吗？我用的是15%的胶

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水平很高
我不敢这么做
欢迎你提供经验啊

作者: tuuu2 时间: 2013-1-30 11:54

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，真是急啊，请帮我出出主意，谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-1-30 11:57

呵呵关于我的第三个问题中如果用丽春红之类染色显示，是否仍然会有必要应用蛋白质印迹实验？为什么？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:58

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，真是急啊，请帮我出出主意，谢谢！

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内参都做不出来
说明你的整个系统有问题
说具体点你的条件

作者: NBA 时间: 2013-1-30 11:58

先谢了，呵呵关于我的第三个问题中如果用丽春红之类染色显示，是否仍然会有必要应用蛋白质印迹实验？为什么？

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立春红染得是总蛋白
免疫印迹要检测特定的蛋白
按照你这么理解的话通过SDS-PAGE就可以解决问题了
何必还要用抗体呢
查查WB的目的

作者: pengke1983 时间: 2013-1-30 11:58

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，谢谢您帮我出出主意，！
我的条件是：
1.目的蛋白68KDa,59KDa,用10％分离胶，5％浓缩胶。分别80V,110V电泳。
2.60V，120min湿转。转膜完毕丽春红染色可见PVDF膜有明显的蛋白条带
3. 5％ TBST配置脱脂奶粉封闭1h,5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗，4度过夜，TBST洗两次，TTBS洗一次，每次10min,上相关二抗1h，洗膜同上，ECL显色。读片。

在这个过程中以前都这么做的，都能做得出，就是这次换转移缓冲液，但蛋白也转到膜上了，换了几个抗体及内参都没作出来，不知道问题出在哪里。
十分感谢您的指导！

作者: S6044 时间: 2013-1-30 11:59

0.75mm和1.0mm的胶，在电泳和转移的时间和电流方面有什么不同要求吗？

作者: ending 时间: 2013-1-30 11:59

marker也一起出来条带了，怎么回事啊？该怎么解决呢？

作者: huifeng0516 时间: 2013-1-30 11:59

您好。
我的目的条带是97kd左右，但杂交后条带在72附近，问题出在哪里呢？谢谢

作者: one 时间: 2013-1-30 12:00

单一的
用脱脂奶粉
或者BSA

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对，果然是这样效果更好，谢谢！还想请教个问题：样品在分离胶出现弥散现象——比如在泳道呈模糊柱状，不知是什么原因？样品下面见一亮红线

作者: 131415 时间: 2013-1-30 12:29

问一下大家，最近做western ，PVDF膜用完了，发现实验室有一卷新的N+尼龙膜，我想问一下，能不能用这个膜做western啊，用过的高手指点。谢谢

作者: PINK 时间: 2013-1-30 12:33

你好，我做western的次数不多，但是我的问题是我的目的蛋白做出来了，内参却没做出来，第一次的时候我和师姐都对没做出来，我们换了一个内参，后来她做出来了我仍然没做出来。我可以确定我绝没有把内参剪掉。内参是β-actin，分子量43KD。用的PVDF膜，电泳：90分钟，110v.转膜：200ma，90分钟。一抗用1：1000稀释，二抗用1：400稀释的。我反复比较过我们之间的操作差别，也没发现原因，希望高手给我指点一二。
另外我做出来的条带有一些弥散但不拖尾，我看了一些网上有关弥散的原因，貌似我都没有啊，电泳液是新配的，不过转膜液里没有加SDS。我的蛋白浓度很低，没办法定量的加，所以没有严格按孔定量只是想做个预实验了解能否做出来。条带弥散会不会跟这个有关啊？

作者: jkobn 时间: 2013-1-30 12:33

相关疾病：
肿瘤
我做肿瘤细胞中TLR4的表达，常规方法提取细胞总蛋白，2*上样缓冲液变性，未作蛋白定量，上样25ul，电泳，转膜后丽春红染色可见蛋白条带，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗为santa cruz TLR4抗体（1/100--1/500都做过）4℃过夜，TBST 10min 3遍，二抗（1/10000)孵育2h，TBST 10min 3遍，加碧云天ECL plus未见荧光，压片30min未见内参及TLR4条带，用PIERCE增强剂后30s见内参条状荧光，加TLR4 Ab的NC膜上见很强的片状荧光（压片如下），请教：
1、TLR4为跨膜蛋白，是否需要提取膜蛋白来做？我见大部分检测TLR4是用流式抗体做流式检测，也有提取细胞总蛋白做western blot的。
2、做了不下于10次，总是出现这样的结果,是不是抗体有问题呢？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:34

问一下大家，最近做western ，PVDF膜用完了，发现实验室有一卷新的N+尼龙膜，我想问一下，能不能用这个膜做western啊，用过的高手指点。谢谢

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带正电的尼龙膜我只用它做过EMSA
没做过WB
不好意思

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:34

你好，我做western的次数不多，但是我的问题是我的目的蛋白做出来了，内参却没做出来，第一次的时候我和师姐都对没做出来，我们换了一个内参，后来她做出来了我仍然没做出来。我可以确定我绝没有把内参剪掉。内参是β-actin，分子量43KD。用的PVDF膜，电泳：90分钟，110v.转膜：200ma，90分钟。一抗用1：1000稀释，二抗用1：400稀释的。我反复比较过我们之间的操作差别，也没发现原因，希望高手给我指点一二。
另外我做出来的条带有一些弥散但不拖尾，我看了一些网上有关弥散的原因，貌似我都没有啊，电泳液是新配的，不过转膜液里没有加SDS。我的蛋白浓度很低，没办法定量的加，所以没有严格按孔定量只是想做个预实验了解能否做出来。条带弥散会不会跟这个有关啊？

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1，你别剪膜试一试
2，抗体的稀释度需要自己摸索调整
3，拖尾有很多影响因素，比如电压太高，电泳时温度太高没有采用降温措施，转膜时没有降温等
4，不同的上样量会影响两孔之间的条带整齐性
good luck

作者: zhenxin 时间: 2013-1-30 12:35

我的23K，26K两种蛋白剪开的步骤：我用的胶是15%的，根据预染MARKER（10，17，26，34，43。。。）来观测电泳情况，尽量让17和26两个条带拉开，泳道两旁都加MARKER的。转膜后根据两边的MARKER来确定目的蛋白的位置，用刀片划开。我的一抗是单抗。
请指教可有问题。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:36

相关疾病：
肿瘤

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我做肿瘤细胞中TLR4的表达，常规方法提取细胞总蛋白，2*上样缓冲液变性，未作蛋白定量，上样25ul，电泳，转膜后丽春红染色可见蛋白条带，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗为santa cruz TLR4抗体（1/100--1/500都做过）4℃过夜，TBST 10min 3遍，二抗（1/10000)孵育2h，TBST 10min 3遍，加碧云天ECL plus未见荧光，压片30min未见内参及TLR4条带，用PIERCE增强剂后30s见内参条状荧光，加TLR4 Ab的NC膜上见很强的片状荧光（压片如下），请教：
1、TLR4为跨膜蛋白，是否需要提取膜蛋白来做？我见大部分检测TLR4是用流式抗体做流式检测，也有提取细胞总蛋白做western blot的。
2、做了不下于10次，总是出现这样的结果,是不是抗体有问题呢？

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跨膜蛋白确实不是很好做
我做过比如LHR，GLUT-4等
首先要确保蛋白提取了出来
我用的是提取总蛋白的方法提取的
抗体有没有问题就不好说了
可以加大总蛋白的上样量继续试试
另外流式我不懂，没做过

作者: october7 时间: 2013-1-30 12:37

我的目的条带是97kd左右，但杂交后条带在72附近，问题出在哪里呢？谢谢

作者: wu11998866 时间: 2013-1-30 12:37

你好，我做western blot，最后内参出来了，目的蛋白均未出，全是白的一片，不知是何原因，望解答，一个蛋白一抗(IGG)是sata 的，半年前买的，未到期，已经加到1：100了，达到推荐的最大浓度，二抗是中杉(IGG)的，另一个蛋白一抗是abcam(IGM)的，买了一个月左右，说明书上给了明确的浓度，按那个来的，二抗也是中杉的(IGM)

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:38

我的目的条带是97kd左右，但杂交后条带在72附近，问题出在哪里呢？谢谢

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如果条带特异的话就认为它就是目的条带
目的蛋白有时候位置有些变化不会影响结果

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:38

你好，我做western blot，最后内参出来了，目的蛋白均未出，全是白的一片，不知是何原因，望解答，一个蛋白一抗(IGG)是sata 的，半年前买的，未到期，已经加到1：100了，达到推荐的最大浓度，二抗是中杉(IGG)的，另一个蛋白一抗是abcam(IGM)的，买了一个月左右，说明书上给了明确的浓度，按那个来的，二抗也是中杉的(IGM)

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首先查文献确定你的裂解液能裂解液出目的蛋白
另外在整个蛋白处理的过程中不要让目的蛋白降解
比如在操作在冰上进行、加蛋白酶抑制剂等

作者: c86v 时间: 2013-1-30 12:39

如果条带特异的话就认为它就是目的条带
目的蛋白有时候位置有些变化不会影响结果

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谢谢您的回复。
条带是特异的，但是跟分子量差别也太大了，我看过santa提供该抗体的WB图谱，条带在90KD，跟我做的不一样。
另，请教，我10％的胶，100V电泳4小时，50mA半干转膜2小时，这个条件对我这90KD的蛋白合适么？

谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2013-1-30 12:40

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，谢谢您帮我出出主意，！
我的条件是：
1.目的蛋白68KDa,59KDa,用10％分离胶，5％浓缩胶。分别80V,110V电泳。
2.60V，120min湿转。转膜完毕丽春红染色可见PVDF膜有明显的蛋白条带
3. 5％ TBST配置脱脂奶粉封闭1h,5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗，4度过夜，TBST洗两次，TTBS洗一次，每次10min,上相关二抗1h，洗膜同上，ECL显色。读片。

在这个过程中以前都这么做的，都能做得出，就是这次换转移缓冲液，但蛋白也转到膜上了，换了几个抗体及内参都没作出来，不知道问题出在哪里。
十分感谢您的指导！

作者: fsdd817 时间: 2013-1-30 12:40

你好！我做WB开始电泳转膜都很好，上样总蛋白40ug/10ul，考马斯亮兰条带清晰，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗三种4度过夜：1/actin 1:1000，2/santa 的一抗1:1000，3/血清1:250，二抗1:5000常温1h，ECL显色后发现背景高，X光片上目的条带出现空洞，在膜上目的条带位置依稀可辩黄色条带。第二次做采用封闭过夜，一抗常温3h，二抗浓度增大为1:20000常温1h，显色后发现actin的背景降低了，条带清晰，但另外两个一抗的背景仍很高，目的条带处仍出现空洞，请问我下一步该怎样调整实验条件呢？是一抗过高么？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:41

我的PVDF膜丽春红染色有蛋白，而所有的目的蛋白和内参都作不出来，以前都能做的出来，我也考察了溶解抗体的含5％脱脂奶粉的TBST,二抗也重新换过，内参也重新换过，但是还是做不出来，请问还可能哪个环节出问题，谢谢您帮我出出主意，！
我的条件是：
1.目的蛋白68KDa,59KDa,用10％分离胶，5％浓缩胶。分别80V,110V电泳。
2.60V，120min湿转。转膜完毕丽春红染色可见PVDF膜有明显的蛋白条带
3. 5％ TBST配置脱脂奶粉封闭1h,5％脱脂奶粉的TBST稀释一抗，4度过夜，TBST洗两次，TTBS洗一次，每次10min,上相关二抗1h，洗膜同上，ECL显色。读片。

在这个过程中以前都这么做的，都能做得出，就是这次换转移缓冲液，但蛋白也转到膜上了，换了几个抗体及内参都没作出来，不知道问题出在哪里。
十分感谢您的指导！

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一抗多长时间了
一抗可能过期了吧

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:41

你好！我做WB开始电泳转膜都很好，上样总蛋白40ug/10ul，考马斯亮兰条带清晰，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗三种4度过夜：1/actin 1:1000，2/santa 的一抗1:1000，3/血清1:250，二抗1:5000常温1h，ECL显色后发现背景高，X光片上目的条带出现空洞，在膜上目的条带位置依稀可辩黄色条带。第二次做采用封闭过夜，一抗常温3h，二抗浓度增大为1:20000常温1h，显色后发现actin的背景降低了，条带清晰，但另外两个一抗的背景仍很高，目的条带处仍出现空洞，请问我下一步该怎样调整实验条件呢？是一抗过高么？谢谢！

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减少上样量

作者: tianmei001 时间: 2013-1-30 12:42

天气高温对电泳在分离胶弥散有没有影响？

作者: vera+ 时间: 2013-1-30 12:42

想请教下老师，我做的分子量是38、42、55KD的，我应该用百分之多少的分离胶啊？用10%的对结果影响大吗？另外在做的过程中，我遇到了以下一些问题想请您帮助下。首先，我蛋白跑完电泳后，做了考马氏染色，蛋白条带很清楚，于是第二天接着用这批蛋白样品做western（蛋白负20保存）。转膜条件我用的是200ma60分钟，电转仪是BIORAD的。转完后，我把膜用丽春红染色，什么都没有。转完膜的胶我考马氏染色后发现还有很多蛋白条带，我考虑是否是我时间短了，于是第二次转了100分钟，膜用丽春红染色还是什么都没有看到，转完的胶条做考马氏染色，发现仍有一根非常清楚的蛋白条带。第三次，我用了0.22的膜转75分钟，立春红染色还是什么都没有！我觉得非常疑惑，不知该怎么调整！同实验室的做42的分子量，200ma45分钟，膜经立春红染色后条带都很清楚，可是我之前也试过45分钟，胶上的marker都超清楚。这究竟是怎么回事啊？请您帮我分析下吧！电转液我也是新配的啊！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:43

天气高温对电泳在分离胶弥散有没有影响？

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电泳时温度高会影响条带
但是室温不会高的那个程度吧

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:43

想请教下老师，我做的分子量是38、42、55KD的，我应该用百分之多少的分离胶啊？用10%的对结果影响大吗？另外在做的过程中，我遇到了以下一些问题想请您帮助下。首先，我蛋白跑完电泳后，做了考马氏染色，蛋白条带很清楚，于是第二天接着用这批蛋白样品做western（蛋白负20保存）。转膜条件我用的是200ma60分钟，电转仪是BIORAD的。转完后，我把膜用丽春红染色，什么都没有。转完膜的胶我考马氏染色后发现还有很多蛋白条带，我考虑是否是我时间短了，于是第二次转了100分钟，膜用丽春红染色还是什么都没有看到，转完的胶条做考马氏染色，发现仍有一根非常清楚的蛋白条带。第三次，我用了0.22的膜转75分钟，立春红染色还是什么都没有！我觉得非常疑惑，不知该怎么调整！同实验室的做42的分子量，200ma45分钟，膜经立春红染色后条带都很清楚，可是我之前也试过45分钟，胶上的marker都超清楚。这究竟是怎么回事啊？请您帮我分析下吧！电转液我也是新配的啊！

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1，用12%或者15%的胶
2，检查你转移的时候电流是否通好
3，电转液可能有问题
建议问你同学

作者: 969 时间: 2013-1-30 12:44

您好，

想请教个问题，这个问题已经困扰我２个月了，心急如焚！

用全细胞裂解液裂解Molt-4 细胞，加入裂解液后马上看到白色成团物质，像鼻涕状，反复冻融8次后取上清，用考马斯亮蓝法测蛋白浓度为0.4ug/ ul（1*10^6个细胞/50ul裂解液中），蛋白含量过低
裂解液方子为：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1%SDS，0.5%去氧胆酸钠，1%NP-40，1g/ml Aprotinin，1g/ml Leupeptin，1g/ml Pepstatin，1mM PMSF，pH 8.0

重复多次依然是这个结果，希望做过Molt-4 细胞裂解的高手，给我指条明路。

白色成团物质在显微镜下观察为表面不平整的球状

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:44

用你的裂解液孵育后
加入loading buffer，煮5min
离心取上清试试

作者: youyou99 时间: 2013-1-30 12:45

老师：
我先前做了一次westernblot ，抗体是国产博士德的，目标蛋白也做出来了，可是其他的地方背景太深，虽然不影响定量分析，但是感觉图片的结果不理想，现准备重做，请各位老师指导一下问题出在哪里了？谢谢啊！
是不是因为抗体是国产的原因啊？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:45

QUOTE:

原帖由 youyou99 于 2013-1-30 12:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老师：
我先前做了一次westernblot ，抗体是国产博士德的，目标蛋白也做出来了，可是其他的地方背景太深，虽然不影响定量分析，但是感觉图片的结果不理想，现准备重做，请各位老师指导一下问题出在哪里了？谢谢啊！
是不是因为抗体是国产 ...

一抗会有影响
延长一下封闭时间

作者: 8princess8 时间: 2013-1-30 12:46

前辈想请教一下，加了发光剂要完全吸干表面残余的发光剂吗？加发光剂要避光或是封闭起来吗？还是就裸在空气中？不胜感激！！！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:46

QUOTE:

原帖由 8princess8 于 2013-1-30 12:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈想请教一下，加了发光剂要完全吸干表面残余的发光剂吗？加发光剂要避光或是封闭起来吗？还是就裸在空气中？不胜感激！！！

不用完全吸干
把膜放在保鲜膜上，提起一角，吸水纸在膜的一侧把ECL吸走，注意吸水纸不要放在膜上
加了发光剂在正常情况下进行就可以

作者: 8princess8 时间: 2013-1-30 12:48

那么如果完全吸干会有什么后果呀？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:50

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原帖由 8princess8 于 2013-1-30 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
那么如果完全吸干会有什么后果呀？

荧光会消失

作者: am10 时间: 2013-1-30 12:50

啊，是这样啊，难怪我跑的是空白，就是把保鲜膜上的发光剂吸掉就可以了，膜的表面还是要留一层发光剂是吧，然后用另一层保鲜膜夹好就可以显影了是吧？
另外问个可能比较弱智的问题，你们说的染膜和染胶是什么呀？我们这边好像都不染的呢，染过后继续做会影响结果吗？
抗体可以重复使用吗？
非常感谢哦。。。

作者: bamboo16 时间: 2013-1-30 12:51

各位高手大家好
我从组织提的蛋白，分子量18kd，电泳后200mA 1小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，一抗 1：100（师兄以前做出来的多抗）室温孵育2h/4°C孵过夜，二抗1：2000稀释室温孵育1小时，最后用DAB显色，做过十多遍了，marker带都转上了，但目的带始终没转上，转完膜后对胶染色未见蛋白条带，电泳后胶染色可以看到目的带

请各位帮忙分析一下，是什么原因，谢谢大家了！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:52

啊，是这样啊，难怪我跑的是空白，就是把保鲜膜上的发光剂吸掉就可以了，膜的表面还是要留一层发光剂是吧，然后用另一层保鲜膜夹好就可以显影了是吧？
另外问个可能比较弱智的问题，你们说的染膜和染胶是什么呀？我们这边好像都不染的呢，染过后继续做会影响结果吗？
抗体可以重复使用吗？
非常感谢哦。。。

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染膜：指用立春红等染NC、PVDF膜
染胶：指用考马斯亮蓝R-250等染料染PAGE胶
我不建议重复使用抗体

作者: NBA 时间: 2013-1-30 12:56

各位高手大家好
我从组织提的蛋白，分子量18kd，电泳后200mA 1小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，一抗 1：100（师兄以前做出来的多抗）室温孵育2h/4°C孵过夜，二抗1：2000稀释室温孵育1小时，最后用DAB显色，做过十多遍了，marker带都转上了，但目的带始终没转上，转完膜后对胶染色未见蛋白条带，电泳后胶染色可以看到目的带

请各位帮忙分析一下，是什么原因，谢谢大家了！！！！

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转移时间缩短至30min
换0.22um的膜

作者: cwcwcww 时间: 2013-1-30 12:56

想请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？

作者: glass 时间: 2013-1-30 13:00

各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:00

很感谢你的耐心回答，想请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？

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你的结果没有问题

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:01

各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~

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最好的确定方法是看你的方向的专业文献
影响因子高的
你的蛋白定位在那呢？

作者: 987789 时间: 2013-1-30 13:10

请教一个问题，我要检测的目的蛋白是30KDA，会不会出现目的条带出现在26KDA（依据MARKER）的位置？

作者: wood533 时间: 2013-1-30 13:10

各位大侠，我是一新手，想请教大家一个问题。我需要提测定的指标是：磷酸甘油酸酯激酶1,为了尽量让western能得到较好的结果，从细胞当中提取蛋白时，我应该是提取总蛋白、胞浆蛋白还是核蛋白呢？有没有类似“库”这样的资源指导我们应该提取哪种蛋白？不知道表述清楚了没有，万分感谢~~~~

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:11

求助：BIO-RAD的电泳仪，100V恒压，电泳时电泳槽出现大量雾气，marker的95和72条带老是跑不开，两条带连在一起。电泳液和胶都和以前一样，以前marker的10条带清晰可见。求助原因。谢谢各位！

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电泳时温度太高

作者: memory 时间: 2013-1-30 13:11

求助：BIO-RAD的电泳仪，100V恒压，电泳时电泳槽出现大量雾气，marker的95和72条带老是跑不开，两条带连在一起。电泳液和胶都和以前一样，以前marker的10条带清晰可见。求助原因。谢谢各位！

作者: nut6694 时间: 2013-1-30 13:12

你好：我想看看转染了基因的细胞株中cyclinD1和CDK4的表达情况，因为这两个都是核表达的，不知道用RIPA常规提取的蛋白能不能用？还是非要提核蛋白来做呢？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:12

QUOTE:

原帖由 nut6694 于 2013-1-30 13:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好：我想看看转染了基因的细胞株中cyclinD1和CDK4的表达情况，因为这两个都是核表达的，不知道用RIPA常规提取的蛋白能不能用？还是非要提核蛋白来做呢？非常感谢！ ...

我刚做了CyclinD1
用胞浆、胞核蛋白提取试剂盒做的
效果还行
而且Cyclin D1丰度不是很高
应该加大上样量
可以短消息联系

作者: 3648755 时间: 2013-1-30 13:13

请问抗体说明书上洗膜条件是TBST洗后，在用TBS洗1次，在加抗体孵育。
做试验时没有按说明书，没有用TBS洗，结果没有条带。可能是此原因导致的么？TBS和TBST对实验结果的影响是什么。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:13

QUOTE:

原帖由 3648755 于 2013-1-30 13:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问抗体说明书上洗膜条件是TBST洗后，在用TBS洗1次，在加抗体孵育。
做试验时没有按说明书，没有用TBS洗，结果没有条带。可能是此原因导致的么？TBS和TBST对实验结果的影响是什么。谢谢 ...

这个对结果基本上不会有影响
你要考虑其他影响因素
比如目的蛋白有没有提取出来、降解、抗体浓度是否合适等

作者: yjf1026 时间: 2013-1-30 13:14

用ECL进行化学发光显色，当化学发光试剂与膜培育5min后，吸走化学发光液，NC需要用水或其它试剂洗吗？

在曝光时，膜干燥对曝光有没有影响？如果有，怎么防止膜干燥？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:14

用ECL进行化学发光显色，当化学发光试剂与膜培育5min后，吸走化学发光液，NC需要用水或其它试剂洗吗？

在曝光时，膜干燥对曝光有没有影响？如果有，怎么防止膜干燥？

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吸走ECL后不能用水洗
用保鲜膜作为防止干燥的东西
同时作为支持物
不知道说的清楚不

作者: lgm 时间: 2013-1-30 13:14

老师，请问我需要做的目的蛋白有90kd,150kd,200kd的，内参用的是GAPDH，
以前转膜后，考染看到72KD以下的几乎没有剩余什么条带，而其上却残余很多，因此今天配转膜液时里面加了SDS。
配方是Tris 3.02g,甘氨酸14.4g，SDS 0.375g，甲醇200ml，加ddH2O至1000ml，用的Bio-rad的电转系统，湿转，恒流350mA,150分钟，结果marker条带，仅剩余72KD以上的4条，以下条带全没有，而且这几条marker条带颜色也非常淡，跟以前的相差很大，以前我也是这样的条件，就是buffer里没有加SDS，
是不是加了SDS以后要改变转膜条件了呢？
我最大的蛋白分子量是200kd，GAPDH仅36Kd,那么转膜时，需要怎么兼顾呢，谢谢啊！

作者: woshituzhu 时间: 2013-1-30 13:15

问一下老师，最近我做western ，每次做出来的条带都非常细，不知道是什么原因。我见别人做的带都“胖胖的”很好看。我用的是12%的胶，大小为40Kd。请老师解释一下啊。还有就是膜与ECL作用多长时间啊，我都是一分钟，是不是太短了啊。谢谢了

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:15

老师，请问我需要做的目的蛋白有90kd,150kd,200kd的，内参用的是GAPDH，
以前转膜后，考染看到72KD以下的几乎没有剩余什么条带，而其上却残余很多，因此今天配转膜液时里面加了SDS。
配方是Tris 3.02g,甘氨酸14.4g，SDS 0.375g，甲醇200ml，加ddH2O至1000ml，用的Bio-rad的电转系统，湿转，恒流350mA,150分钟，结果marker条带，仅剩余72KD以上的4条，以下条带全没有，而且这几条marker条带颜色也非常淡，跟以前的相差很大，以前我也是这样的条件，就是buffer里没有加SDS，
是不是加了SDS以后要改变转膜条件了呢？
我最大的蛋白分子量是200kd，GAPDH仅36Kd,那么转膜时，需要怎么兼顾呢，谢谢啊！

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湿转建议用25mM tris，192mM glycine，0.1%SDS，20% 甲醇
300mA 转膜时间 200KD，2h，150KD，1h40min，90KD，1h30min，建议用beta-tubulin作为内参（分子量55KD）

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:16

问一下老师，最近我做western ，每次做出来的条带都非常细，不知道是什么原因。我见别人做的带都“胖胖的”很好看。我用的是12%的胶，大小为40Kd。请老师解释一下啊。还有就是膜与ECL作用多长时间啊，我都是一分钟，是不是太短了啊。谢谢了

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不同厂家ECL孵育时间不同
看说明书
加大上样量会“变胖”
另外细细的条带如果非常清楚的话也是非常不错的结果
呵呵

作者: KGZ564 时间: 2013-1-30 13:16

吸走ECL后不能用水洗
用保鲜膜作为防止干燥的东西
同时作为支持物
不知道说的清楚不

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用保鲜膜将整张NC膜包起来？这样对照相效果有没有影响。

为什么要作为支持物

作者: qianqin1977 时间: 2013-1-30 13:17

请问一下老师，背景比较深是由于一抗还是二抗浓度高造成的呢？
我的一抗是1：500 1：1000 1：2000 4度 4h
二抗是1：1200 孵育室温 2h
显影时加了AB液后就能看见目的带，但是很快目的带的荧光消失了，但周围的背景有很亮的荧光。这是问什么？

作者: vivian4123 时间: 2013-1-30 13:17

湿转建议用25mM tris，192mM glycine，0.1%SDS，20% 甲醇
300mA 转膜时间 200KD，2h，150KD，1h40min，90KD，1h30min，建议用beta-tubulin作为内参（分子量55KD）

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今天仍然用加了SDS的转膜液，恒流300mA，2h,结果和上次一样全部都转过了，pvdf膜上仅有很淡的72KD以上的marker,以下的marker条带全没有，估计都转过了吧，怎么回事吗？还有谁转膜时加了SDS的吗？具体什么条件？效果如何？谢谢

作者: junjie05 时间: 2013-1-30 13:18

相关疾病：
头痛
您好，我现在有碰到新的问题了，期望您的回复
我之前做的WB结果很好的，条带很清晰背景也很浅（做了两次结果都满意），可是这几天做的结果却很糟糕，目的条带很浅背静却很深，样品及抗体稀释度和之前是一样的，条件没有变，更头痛的是内参竟然不出来了。抗体都是新买的，只用了5次，-20度保存，因为有甘油抗体我没有分装。
我封闭3h，一抗过夜，二抗两小时，洗30分钟。
为什么这几次和前两次差别这么的大啊？困惑中，我应该怎么解决？

作者: star#room 时间: 2013-1-30 13:18

楼主你好~~我现在简直是欲哭无泪啊~
我现在在做本科毕业课题，之前也从来没接触过这方面知识，但是导师直接让我自己做WB~我在完全不了解得情况下开始准备~看了视频，下载了很多资料~按着其中一份实验步骤准备了所需的试剂然后开始摸索着做了两次,但结果一塌糊涂~我又看了很多介绍，个人觉得做这个WB很灵活，其实验条件和试剂完全要取决于具体情况~像我这种完全照搬别人的实验步骤及所用溶液比例应该做不出来~但是我又不知道应该怎么样建立适合自己的实验方法，比如说SDS-PAGE的浓度和比例,电泳条件，封闭液种类，一抗二抗的稀释倍数孵育时间等等~还有你们说所的预染marker，内参对照是什么意思呢？现在我将自己的实验要求大概介绍一下：
导师要求我将一种名叫OVA的质粒转染进DC.24细胞或HePG2细胞，表达出蛋白后将贴壁细胞裂解后制成蛋白质样品然后做WB检验表达出来的蛋白究竟是不是正确的。我买了OVA表达出的标准蛋白做对照，一抗二抗都是师兄帮我选择的~
请楼主指点一下我该怎样建立正确的实验方法，谢谢！

还有我前两次实验中有一次的结果然我很困惑~
当我使用化学发光的方法来检测时发现膜上什么都没有（电转后用李春红染色没有发现条带但我还是硬着头皮往下做了），而电转过后的SDS凝胶上用G250染色后也没看见条带~于是我又用李春红染这张膜（在我的理解中既然这张膜封闭过它就应该整张都被染红）但是却意外的发现了条带！！！这个结果着实让我很费解，请楼主再指点一下~

万分感激！！！

作者: H2O 时间: 2013-1-30 13:19

请教：我现在做低氧培养细胞，western 检测有关蛋白的表达，手头有GAPDH内参，可GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，低氧培养下糖酵解过程可能会发生变化，GAPDH的表达会不会变化呢，如果变化是不是就不能作为内参？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:19

用保鲜膜将整张NC膜包起来？这样对照相效果有没有影响。

为什么要作为支持物

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是的
没有影响
这样可以避免污染啊
同时你可以用手拿

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:19

请问一下老师，背景比较深是由于一抗还是二抗浓度高造成的呢？
我的一抗是1：500 1：1000 1：2000 4度 4h
二抗是1：1200 孵育室温 2h
显影时加了AB液后就能看见目的带，但是很快目的带的荧光消失了，但周围的背景有很亮的荧光。这是问什么？

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延长封闭时间
二抗稀释度加大到1：5000至1：10000试试

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:20

今天仍然用加了SDS的转膜液，恒流300mA，2h,结果和上次一样全部都转过了，pvdf膜上仅有很淡的72KD以上的marker,以下的marker条带全没有，估计都转过了吧，怎么回事吗？还有谁转膜时加了SDS的吗？具体什么条件？效果如何？谢谢

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把SDS浓度减低至0.01%
转膜时间1h30min
300mA

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:20

您好，我现在有碰到新的问题了，期望您的回复
我之前做的WB结果很好的，条带很清晰背景也很浅（做了两次结果都满意），可是这几天做的结果却很糟糕，目的条带很浅背静却很深，样品及抗体稀释度和之前是一样的，条件没有变，更头痛的是内参竟然不出来了。抗体都是新买的，只用了5次，-20度保存，因为有甘油抗体我没有分装。
我封闭3h，一抗过夜，二抗两小时，洗30分钟。
为什么这几次和前两次差别这么的大啊？困惑中，我应该怎么解决？

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考虑一下你的样品是否降解
如果其他条件都没变的话

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:21

楼主你好~~我现在简直是欲哭无泪啊~
我现在在做本科毕业课题，之前也从来没接触过这方面知识，但是导师直接让我自己做WB~我在完全不了解得情况下开始准备~看了视频，下载了很多资料~按着其中一份实验步骤准备了所需的试剂然后开始摸索着做了两次,但结果一塌糊涂~我又看了很多介绍，个人觉得做这个WB很灵活，其实验条件和试剂完全要取决于具体情况~像我这种完全照搬别人的实验步骤及所用溶液比例应该做不出来~但是我又不知道应该怎么样建立适合自己的实验方法，比如说SDS-PAGE的浓度和比例,电泳条件，封闭液种类，一抗二抗的稀释倍数孵育时间等等~还有你们说所的预染marker，内参对照是什么意思呢？现在我将自己的实验要求大概介绍一下：
导师要求我将一种名叫OVA的质粒转染进DC.24细胞或HePG2细胞，表达出蛋白后将贴壁细胞裂解后制成蛋白质样品然后做WB检验表达出来的蛋白究竟是不是正确的。我买了OVA表达出的标准蛋白做对照，一抗二抗都是师兄帮我选择的~
请楼主指点一下我该怎样建立正确的实验方法，谢谢！

还有我前两次实验中有一次的结果然我很困惑~
当我使用化学发光的方法来检测时发现膜上什么都没有（电转后用李春红染色没有发现条带但我还是硬着头皮往下做了），而电转过后的SDS凝胶上用G250染色后也没看见条带~于是我又用李春红染这张膜（在我的理解中既然这张膜封闭过它就应该整张都被染红）但是却意外的发现了条带！！！这个结果着实让我很费解，请楼主再指点一下~

万分感激！！！

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把你的问题写具体点
分开问
你的理解是对的
WB是很灵活
对每个蛋白都不一样

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:21

请教：我现在做低氧培养细胞，western 检测有关蛋白的表达，手头有GAPDH内参，可GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，低氧培养下糖酵解过程可能会发生变化，GAPDH的表达会不会变化呢，如果变化是不是就不能作为内参？

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你问的很对
很多情况对内参的表达量其实都是有影响的（低氧、癌症、药物刺激等）
但是现在大家对这些不是很讲究（有人已经开始研究这些东西对常用内参的影响了）
查看与你最相关的一些文献，看人家用什么做内参
欢迎继续交流
你可以告诉我细胞内型、具体做什么蛋白
我可以帮你查查

作者: xue258 时间: 2013-1-30 13:21

相关疾病：
胰腺癌
我检测的是低氧培养下胰腺癌细胞系中HIF-1α的表达，我查了好像很多都是用的β-action，可是当初买内参是没有考虑到这些，就买了GAPDH，现在突然想到了这个问题，请问是不是现在GAPDH就不能用了，一定要换用β-action呢？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 13:22

我检测的是低氧培养下胰腺癌细胞系中HIF-1α的表达，我查了好像很多都是用的β-action，可是当初买内参是没有考虑到这些，就买了GAPDH，现在突然想到了这个问题，请问是不是现在GAPDH就不能用了，一定要换用β-action呢？

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如果说没有看到别人的文献用GAPDH的话
那么我建议你用beta-actin
我做大鼠骨骼肌低氧训练模型的时候也用的是beta-actin

作者: wmp1234 时间: 2013-1-30 13:22

我的蛋白保存在-80度，加了PMSF的，提了一个月不到，不会怎么快降解了吧？如果降解，背景会很脏吗？我的二抗稀释比是1：2000，说明书上是1：5000--1：10000。之前用的是1：2000做的很好的。 55555

作者: gogo 时间: 2013-1-30 13:23

一抗用1：2000试试
二抗孵育时间用40min

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谢谢楼主，我按你提供的条件跑了一下，结果出来了，还算满意，下面那个非特异条带淡了很多几乎看不见了，非常感谢您！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-30 14:32

我的蛋白保存在-80度，加了PMSF的，提了一个月不到，不会怎么快降解了吧？如果降解，背景会很脏吗？我的二抗稀释比是1：2000，说明书上是1：5000--1：10000。之前用的是1：2000做的很好的。 55555

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除了PMSF你还应该加入一些抑制剂
我喜欢用Roche的cocktail
另外二抗你现在要增加到1：5000
你换ECL没有？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-30 14:32

谢谢楼主，我按你提供的条件跑了一下，结果出来了，还算满意，下面那个非特异条带淡了很多几乎看不见了，非常感谢您！！

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呵呵
不用客气
减少曝光时间
这样非特异带就会没有了

作者: orangecake 时间: 2013-1-30 14:33

看过不少fangweibin119 的精彩解答，能不能给我解答以下问题
从组织提的蛋白，分子量180kd，上样量40ug，70v，110v电泳，300mA两小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，santa一抗 1：500TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。
第一张图是最开始曝的，第三张是过了一段时间曝的。中间一张是内参，似乎和目的蛋白是一样的情况。

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=14125883&sty=1&tpg=1&age=0')

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说明你的ecl发光液是没问题的啊
只是你的背景太彪悍了^_^

作者: xyw5 时间: 2013-1-30 14:34

老师您好，想问一下，我跑电泳的时候条带成了一个弧形是为什么呀，而且在上层胶里面跑得好慢的，以前都没有这样哦。谢谢老师。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:44

老师您好，想问一下，我跑电泳的时候条带成了一个弧形是为什么呀，而且在上层胶里面跑得好慢的，以前都没有这样哦。谢谢老师。

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电流太大了
需要降温

作者: 04906 时间: 2013-1-30 14:45

关于WB一些统计学的问题请教您：
1、细胞蛋白提取：我用的是细胞瓶养细胞，经过药物处理一定时间后提蛋白，别人说，最少提三批以上，请问这三批可以一次性提吗？（相当是重复），还是一次提一批，在不同时间提三批。
2、WB结果用软件分析时，上面三批蛋白中，每一批选一个满意结果（共三个）用于统计学分析？
谢谢

作者: tuuu2 时间: 2013-1-30 14:45

有个问题一直想知道，请教老师：
0.75mm和1.0mm的胶，在电泳和转移的时间和电流方面有什么不同要求吗？
谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2013-1-30 14:46

不好意思老师，我太心急了，所以说话没什么调理，现在我将我的问题整理一下：
1.如何能够选择正确的实验条件（如胶的比例浓度，电泳大小、时间，一抗二抗孵育条件......）从而建立适合我的蛋白质的实验方法呢？（我的标准蛋白是Albumin Egg，MW44287Da）。
2.你们说所的预染marker，内参对照是什么意思呢？具体如何操作？
3.前两次的实验结果都让我有些困惑:电转之后的膜用李春红染色后没有发现条带，而凝胶用G250染色后也没有条带（电转之前是有的），我怀疑是三明治没有做好跑到溶液中去了~但是我还是继续往下做了封闭接一抗二抗最后用ECL显色~最后还是什么都看不见~我又试探性的将膜再次用李春红染色，结果竟然出现了条带......老师能解释一下为什么吗？
4.我使用的是PVDF膜，有的资料上说预处理说是用双蒸水单面浸泡两小时，有的说用甲醇处理两三分钟就可以了，到底哪种更适合我呢？
以上就是我的问题，谢谢^^

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:47

您好，关于WB一些统计学的问题请教您：
1、细胞蛋白提取：我用的是细胞瓶养细胞，经过药物处理一定时间后提蛋白，别人说，最少提三批以上，请问这三批可以一次性提吗？（相当是重复），还是一次提一批，在不同时间提三批。
2、WB结果用软件分析时，上面三批蛋白中，每一批选一个满意结果（共三个）用于统计学分析？
谢谢

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第一个问题：正常的做法是同时培养多瓶细胞，同一药物处理三至四瓶细胞做平行对照，避免只做一管引起的误差。
要同时刺激，同时提取
提取蛋白后这几个平行对照要做三次重复
这是最严谨的做法
供你参考
二：做统计是需要样本数的
选一个你怎么做统计？
建议至少3个平行对照

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:47

有个问题一直想知道，请教老师：
0.75mm和1.0mm的胶，在电泳和转移的时间和电流方面有什么不同要求吗？
谢谢！

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电泳时基本没差别
由于胶厚度的不同转膜时如果相同的电流那么转移时间要缩短
这是要根据不同的胶厚度做预实验的

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:47

不好意思老师，我太心急了，所以说话没什么调理，现在我将我的问题整理一下：
1.如何能够选择正确的实验条件（如胶的比例浓度，电泳大小、时间，一抗二抗孵育条件......）从而建立适合我的蛋白质的实验方法呢？（我的标准蛋白是Albumin Egg，MW44287Da）。
2.你们说所的预染marker，内参对照是什么意思呢？具体如何操作？
3.前两次的实验结果都让我有些困惑:电转之后的膜用李春红染色后没有发现条带，而凝胶用G250染色后也没有条带（电转之前是有的），我怀疑是三明治没有做好跑到溶液中去了~但是我还是继续往下做了封闭接一抗二抗最后用ECL显色~最后还是什么都看不见~我又试探性的将膜再次用李春红染色，结果竟然出现了条带......老师能解释一下为什么吗？
4.我使用的是PVDF膜，有的资料上说预处理说是用双蒸水单面浸泡两小时，有的说用甲醇处理两三分钟就可以了，到底哪种更适合我呢？
以上就是我的问题，谢谢^^

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1，标准蛋白？测试蛋白浓度用的标准品？我问你的目的蛋白分子量多大？
2，预染Marker是电泳及转膜后肉眼可见的蛋白分子量标准
内参你可以上网搜一下（内容比较多，你查到看一下就明白了）
3，呵呵，注意正负极。如果正负极没有问题，第二次用立春红染出来，说明你第一次染得不好
4，不同厂家PVDF膜活化方式不一样，比如Millipore的PVDF是无水甲醇浸泡15S就ok了
我就用这个条件活化PVDF膜
最后祝你实验顺利

作者: wsll 时间: 2013-1-30 14:48

谢谢你上次对我问题的回复.
我用的一抗是抗his-tag单抗，wb同时另做了一胶，跑page，page考染后在相应位置是有条带的，但wb没有结果。我们以前用相同条件做过wb，是用自制的血清，也是有带，只是表达量低，杂带较多。所以想用抗-his-tag进一步确定一下。沿用以前条件，换了一抗和二抗，却无结果。可能原因，请帮忙分析一下。十分感谢！

作者: utt0989 时间: 2013-1-30 14:49

不好意思说错了~我的意思就是目的蛋白~分子量是：44287Da

作者: qhyu 时间: 2013-1-30 14:49

老师您好，我做了几次WB，结果都不好，我是做的FABP蛋白和beta-actin，分别是17KD和43KD，电泳条件是70V和120V，转膜两个小时，我怕转不上去，用的两张膜，转完膜marker上有清晰的彩虹条带，然后用一抗1：2000和1：500.二抗1：5000分别孵育4小时和1小时，洗膜3次，但是加了AB液后根本看不到荧光，压出的片子什么都没有，请问下是什么原因呀？谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:51

谢谢你上次对我问题的回复.
我用的一抗是抗his-tag单抗，wb同时另做了一胶，跑page，page考染后在相应位置是有条带的，但wb没有结果。我们以前用相同条件做过wb，是用自制的血清，也是有带，只是表达量低，杂带较多。所以想用抗-his-tag进一步确定一下。沿用以前条件，换了一抗和二抗，却无结果。可能原因，请帮忙分析一下。十分感谢！

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要考虑一下蛋白降解的影响
另外要有His的阳性对照样品

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:51

不好意思说错了~我的意思就是目的蛋白~分子量是：44287Da

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12%分离胶
半干转膜：1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，1h20min
湿转：300mA，恒流，1h

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:52

不好意思说错了~我的意思就是目的蛋白~分子量是：44287Da

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重新检查你的蛋白提取buffer
回检一下看看你的目的蛋白有没有降解

作者: NBA 时间: 2013-1-30 14:52

老师您好，我做了几次WB，结果都不好，我是做的FABP蛋白和beta-actin，分别是17KD和43KD，电泳条件是70V和120V，转膜两个小时，我怕转不上去，用的两张膜，转完膜marker上有清晰的彩虹条带，然后用一抗1：2000和1：500.二抗1：5000分别孵育4小时和1小时，洗膜3次，但是加了AB液后根本看不到荧光，压出的片子什么都没有，请问下是什么原因呀？谢谢。

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1，beta-actin出结果了吗？如果没出结果说明你整体系统都还存在这问题
2，转膜时间太长，17K的目的蛋白与43K的beta-actin我建议你用半干转膜，30min
3，调整一抗的浓度至1：500和1：1000做预实验
祝你好运

作者: redbutterfly 时间: 2013-1-30 14:54

beta-actin也没有结果哦。。。现在我都灰心得不行了，之前还做出来过，这几次就做不出来了。蛋白没有问题，做了BCA蛋白测定的。
您说的调整一抗的浓度是FABP用1：500，actin用1：1000吗？
什么叫半干转膜呀，老师能说得详细些吗？
非常感谢老师！

作者: 3648755 时间: 2013-1-30 14:57

谢谢老师对我前面的指教，今天看了考染的结果，大家一致认为是我提取的组织蛋白没提好
（我想可以能问题出在以下我的操作步骤里吧：
1，我提的是大鼠足底皮肤蛋白，方法是剪取长方形1.5X1.5cm皮肤表皮组织置500ulRIPA+7ul PMSF 玻璃匀浆器中匀浆40分钟，
2，4度12000转离心20分钟，取上清，
3，上清：上样缓冲液=4：1混合，
4，80-90度开水煮10分钟，
5，-20度分装保存，）
这里想请教老师：我加的裂解液和蛋白抑制剂有问题吗（我的目的蛋白是BETA内啡肽和IL-1BETA）？离心时间上有问题吗？还有煮蛋白有没有问题？盼老师给予解答，不胜感谢！

作者: duoduo 时间: 2013-1-30 14:58

请问WB电泳电压，转膜电压可有一个大体估计原则？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:00

beta-actin也没有结果哦。。。现在我都灰心得不行了，之前还做出来过，这几次就做不出来了。蛋白没有问题，做了BCA蛋白测定的。
您说的调整一抗的浓度是FABP用1：500，actin用1：1000吗？
什么叫半干转膜呀，老师能说得详细些吗？
非常感谢老师！

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半干转膜是什么你要自己上网查查
这些东西很好查的
先做beta-actin
等这个做出来之后再做目的蛋白
要不然你同时做的话还要浪费很多试剂、抗体和时间

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:02

谢谢老师对我前面的指教，今天看了考染的结果，大家一致认为是我提取的组织蛋白没提好
（我想可以能问题出在以下我的操作步骤里吧：
1，我提的是大鼠足底皮肤蛋白，方法是剪取长方形1.5X1.5cm皮肤表皮组织置500ulRIPA+7ul PMSF 玻璃匀浆器中匀浆40分钟，
2，4度12000转离心20分钟，取上清，
3，上清：上样缓冲液=4：1混合，
4，80-90度开水煮10分钟，
5，-20度分装保存，）
这里想请教老师：我加的裂解液和蛋白抑制剂有问题吗（我的目的蛋白是BETA内啡肽和IL-1BETA）？离心时间上有问题吗？还有煮蛋白有没有问题？盼老师给予解答，不胜感谢！

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你算是问对人了
我刚提了人的皮肤组织蛋白
今天刚跑了电泳
觉得提的很不错
你的匀浆时间太长了，另外匀浆的时候是在冰水混合物环境中吗？
PMSF 1~3mM就可以
后续步骤没什么大问题
在匀浆前把组织剪碎
你的组织称重了吗？
我觉得你个组织加500ul裂解液有些少了

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:02

请问WB电泳电压，转膜电压可有一个大体估计原则？

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原则是有的
要根据经验来调整条件
具体的说起来太多了
表达不清楚

作者: 2541 时间: 2013-1-30 15:04

你算是问对人了
我刚提了人的皮肤组织蛋白
今天刚跑了电泳
觉得提的很不错
你的匀浆时间太长了，另外匀浆的时候是在冰水混合物环境中吗？
PMSF 1~3mM就可以
后续步骤没什么大问题
在匀浆前把组织剪碎
你的组织称重了吗？
我觉得你个组织加500ul裂解液有些少了

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是啊，我上次匀浆过程中忘了提前打开离心机，等离心机降温等了好久，
我是在冰上匀浆的
组织没有称，我也不知道有多重，感觉就是表皮组织太硬了，要匀浆好长时间，我是先剪碎的，很想请教老师你是怎样加裂解液和蛋白酶抑制剂的？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:06

是啊，我上次匀浆过程中忘了提前打开离心机，等离心机降温等了好久，
我是在冰上匀浆的
组织没有称，我也不知道有多重，感觉就是表皮组织太硬了，要匀浆好长时间，我是先剪碎的，很想请教老师你是怎样加裂解液和蛋白酶抑制剂的？

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皮肤组织是很硬，称重，剪碎后加入裂解液至玻璃匀浆器匀浆
匀浆后孵育20min
离心

作者: 00无名指00 时间: 2013-1-30 15:10

下图是我作的western blot图片。目的蛋白是含His tag的重组蛋白，SDS-PAGE显示均没有任何问题。western blot条件：（1）电泳上样10ul（1ml菌液离心后加100ul 上样缓冲液）；（2）NC膜为密里博产品；（3）转膜为60v转2h；（4）5％脱脂奶粉 RT 封闭1h；（5）PBS洗4次，每次10min；（6）加1抗（抗His tag单抗，天根生化）1:5000，4度，过夜；（7）PBST洗4次，每次10min；（8）加2抗（HPR标记，天根生化）1：500，RT，1h；（9）PBST洗4次，每次10min；（10）HRP-DAB显色试剂盒显色（天根生化）。结果：（1）有很多杂带；（2）目的带弱（SDS-PAGE显示目的蛋白表达水平占40％左右）。请问该如何优化条件？

作者: lgm 时间: 2013-1-30 15:12

我现在做的目的蛋白是膜蛋白，分子量110KD，
我上的总蛋白，浓缩胶6%，分离胶8%，转膜1mA/cm2，2h，转过去了，因为marker有。5%脱脂奶封闭2h，一抗4度过夜（一抗是一美国公司合成的多抗,1:1000),二抗1：4000，1h,ECL显色，脱脂奶,二抗用PBS配的，一抗用脱脂奶稀释的，洗膜用的PBST。
结果，很郁闷，整个本底都亮一大片，勉强辨认，也是小分子有非特异的带。可以说，想要得带没有，其他地方倒是亮了一片，请您帮我分析一下可能的原因，改进的方法，在这先谢谢您了。热切盼望您的回复。

作者: huifeng0516 时间: 2013-1-30 15:27

你好，请教一下：我要做450kd的蛋白，配多少浓度的胶合适？转膜条件如何？
之前做了一次，用的6%的胶，看到250kd的maker跑到胶中间了停止电泳；200ma转膜2小时，可看到marker转到了NC膜上（没有买450kd的maker，只用了最大到250kd的maker）。曝光后未见条带，丽春红染膜也未见红色蛋白条带，难道是蛋白样品的问题？
提取蛋白后保存于液氮罐液氮平面以上，一周内使用保存时需要加蛋白酶抑制剂吗？
谢谢！

作者: 2541 时间: 2013-1-30 15:28

下图是我作的western blot图片。目的蛋白是含His tag的重组蛋白，SDS-PAGE显示均没有任何问题。western blot条件：（1）电泳上样10ul（1ml菌液离心后加100ul 上样缓冲液）；（2）NC膜为密里博产品；（3）转膜为60v转2h；（4）5％脱脂奶粉 RT 封闭1h；（5）PBS洗4次，每次10min；（6）加1抗（抗His tag单抗，天根生化）1:5000，4度，过夜；（7）PBST洗4次，每次10min；（8）加2抗（HPR标记，天根生化）1：500，RT，1h；（9）PBST洗4次，每次10min；（10）HRP-DAB显色试剂盒显色（天根生化）。结果：（1）有很多杂带；（2）目的带弱（SDS-PAGE显示目的蛋白表达水平占40％左右）。请问该如何优化条件？

1，蛋白上样量有点大，减小一倍
2，分子量多大？
3，加大一抗稀释比例至1：10000到1：20000

作者: 2541 时间: 2013-1-30 15:29

我现在做的目的蛋白是膜蛋白，分子量110KD，
我上的总蛋白，浓缩胶6%，分离胶8%，转膜1mA/cm2，2h，转过去了，因为marker有。5%脱脂奶封闭2h，一抗4度过夜（一抗是一美国公司合成的多抗,1:1000),二抗1：4000，1h,ECL显色，脱脂奶,二抗用PBS配的，一抗用脱脂奶稀释的，洗膜用的PBST。
结果，很郁闷，整个本底都亮一大片，勉强辨认，也是小分子有非特异的带。可以说，想要得带没有，其他地方倒是亮了一片，请您帮我分析一下可能的原因，改进的方法，在这先谢谢您了。热切盼望您的回复。

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稀释抗体用5% PBST奶粉
二抗稀释一倍以上
浓缩胶建议用4%
祝你实验顺利

作者: 2541 时间: 2013-1-30 15:29

你好，请教一下：我要做450kd的蛋白，配多少浓度的胶合适？转膜条件如何？
之前做了一次，用的6%的胶，看到250kd的maker跑到胶中间了停止电泳；200ma转膜2小时，可看到marker转到了NC膜上（没有买450kd的maker，只用了最大到250kd的maker）。曝光后未见条带，丽春红染膜也未见红色蛋白条带，难道是蛋白样品的问题？
提取蛋白后保存于液氮罐液氮平面以上，一周内使用保存时需要加蛋白酶抑制剂吗？
谢谢！

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提取蛋白的时候切记要加蛋白酶抑制剂
如果想保留内参的话用梯度胶合适一些4~10%
转膜 300mA 2h30min，湿转
祝你实验顺利

作者: 8s5g 时间: 2013-1-30 15:29

你好我遇到一个很乌龙的问题
我的marker 买的是未预染的marker 结果跑胶的时候我根本不知道跑到什么地方了
我想请教遇到这种未预染的marker怎么使用怎么能可以不用买新的marker 就能解决这样的问题
十分急切

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:30

用染胶的方法把胶染了啊
比如考马斯亮蓝法、银染等

作者: S6044 时间: 2013-1-30 15:30

上样量的大小取决于上样孔大小，一般蛋白的上样量为40-75UG.

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:31

上样量的大小取决于上样孔大小，一般蛋白的上样量为40-75UG.

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你说的很对
不同的孔数与胶厚度都会影响上样量大小

作者: KGZ564 时间: 2013-1-30 15:31

1，蛋白上样量有点大，减小一倍
2，分子量多大？
3，加大一抗稀释比例至1：10000到1：20000

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（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

作者: KGZ564 时间: 2013-1-30 15:32

（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

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确认你的Marker是否正确

作者: KGZ564 时间: 2013-1-30 15:32

（1）我的蛋白分子量约26kd，不知转膜时间是否不合适？
（2）我们曾经将一抗的稀释比例到1：8000，结果是我们的目的条带更淡了。

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不知道你的Tag转染的如何

作者: remenb 时间: 2013-1-30 15:34

请教一下，同样的样品，用尿素和RIPA分别裂解，然后同样的条件做western，结果出来怎么差别那么大？该以哪个为准？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:37

请教一下，同样的样品，用尿素和RIPA分别裂解，然后同样的条件做western，结果出来怎么差别那么大？该以哪个为准？
谢谢！

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我认为两种差不多
曝光时间稍长一点
RIPA的结果就会与Urea的一样
看你是什么样品了
我一般是用RIPA

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:37

下图是我作的western blot图片。目的蛋白是含His tag的重组蛋白，SDS-PAGE显示均没有任何问题。western blot条件：（1）电泳上样10ul（1ml菌液离心后加100ul 上样缓冲液）；（2）NC膜为密里博产品；（3）转膜为60v转2h；（4）5％脱脂奶粉 RT 封闭1h；（5）PBS洗4次，每次10min；（6）加1抗（抗His tag单抗，天根生化）1:5000，4度，过夜；（7）PBST洗4次，每次10min；（8）加2抗（HPR标记，天根生化）1：500，RT，1h；（9）PBST洗4次，每次10min；（10）HRP-DAB显色试剂盒显色（天根生化）。结果：（1）有很多杂带；（2）目的带弱（SDS-PAGE显示目的蛋白表达水平占40％左右）。请问该如何优化条件？

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我认为你的marker有问题
那么宽的条带怎么确认位置啊

作者: greenbee 时间: 2013-1-30 15:37

最近WESTERN 65kD的目的条带老是在它的下方约50kD的位置出现更强信号的条带。不知道出了什么问题。以前都只有一条带。开始我怀疑是变性时间长了，导致的蛋白降解，所以从以前的95度10min变成了5min。但是仍旧如此。难道是抗体的问题，放久了？从santa cruz买了约半年

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:38

QUOTE:

原帖由 greenbee 于 2013-1-30 15:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近WESTERN 65kD的目的条带老是在它的下方约50kD的位置出现更强信号的条带。不知道出了什么问题。以前都只有一条带。开始我怀疑是变性时间长了，导致的蛋白降解，所以从以前的95度10min变成了5min。但是仍旧如此。难道 ...

哇噻
你的图太有震撼了
总蛋白上样量太大
另外看看santa cruz的说明书目的蛋白的标注在那
一抗的稀释度加大

作者: pengke1983 时间: 2013-1-30 15:39

最近做的目的蛋白，一个很多杂带，一个背景很深，居然整膜都发亮，这两个都是一样的条件啊，老师您说过先确定二抗稀释度，我这两个用的二抗一样的，比例也一样的，结果却不同，是一抗的问题吗？封闭二者都是室温一小时，孵育一抗时间都是4度过夜的，谢谢

作者: 8s5g 时间: 2013-1-30 15:39

最近做的目的蛋白，一个很多杂带，一个背景很深，居然整膜都发亮，这两个都是一样的条件啊，老师您说过先确定二抗稀释度，我这两个用的二抗一样的，比例也一样的，结果却不同，是一抗的问题吗？封闭二者都是室温一小时，孵育一抗时间都是4度过夜的，谢谢

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一抗的质量会影响背景与杂带
确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度
洗膜：一般是5分钟三次，可以延长到5min，6次

作者: 8s5g 时间: 2013-1-30 15:41

最近做的目的蛋白，一个很多杂带，一个背景很深，居然整膜都发亮，这两个都是一样的条件啊，老师您说过先确定二抗稀释度，我这两个用的二抗一样的，比例也一样的，结果却不同，是一抗的问题吗？封闭二者都是室温一小时，孵育一抗时间都是4度过夜的，谢谢

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一抗
二抗洗膜都要增加
祝你实验顺利

作者: mimili_901 时间: 2013-1-30 15:42

今天我跑了胶做了考马斯亮蓝染色，我发现上样量要是很大（20ul），蛋白条带就呈有波浪样，越靠近下部越明显。我蛋白浓度是1-2ug/ul.帮我分析下吧！

作者: flower-201 时间: 2013-1-30 15:43

一抗的质量会影响背景与杂带
确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度
洗膜：一般是5分钟三次，可以延长到5min，6次
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我们洗膜一般都是10min，3次啊，有个抗体是Chemicon的多抗，背景很深，不知道是没摸对一抗稀释度，还是抗体有问题呢，条带还是有的。那么我用的都是一种二抗，难道不同的一抗，相同的二抗浓度吗？谢谢啊

[ 本帖最后由 flower-201 于 2013-1-30 15:46 编辑 ]

作者: flower-201 时间: 2013-1-30 15:47

我们知道转膜后，丽春红染色判断转膜的效果，一般情况下泳道从上到下都是一些横条纹组成的，就比较好，但是我的转出来的效果没有明显的横条纹，分析应该是样品的原因，请楼主帮忙分析具体的原因与措施。
正常转膜的代表

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:48

我们洗膜一般都是10min，3次啊，有个抗体是Chemicon的多抗，背景很深，不知道是没摸对一抗稀释度，还是抗体有问题呢，条带还是有的。那么我用的都是一种二抗，难道不同的一抗，相同的二抗浓度吗？谢谢啊

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二抗我用的同一种的话都是相同的浓度
但是换了ECL的话是要换稀释度的
洗膜要多换液
稀释抗体的时候用封闭液

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:49

下吧！

检查你的上样孔拔梳子的时候是不是不平整

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:49

不好的实片

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这样的膜能做出结果来确实不易
电泳后考马斯亮蓝染过胶吗？
我觉得你的电泳有问题

作者: 98776langtao 时间: 2013-1-30 15:50

每次做实验的条件是一样的（配胶材料，样品，电泳条件等），为什么最近电泳时间变长，包括在浓缩胶和分离胶中，请教这可能是什么原因？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-30 15:51

你好，我想请问一下上样蛋白可不可以不经过煮沸这个程序，因为我怀疑我的蛋白在煮沸的过程中解聚了，由聚合形式转变为非聚合的。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-30 15:51

每次做实验的条件是一样的（配胶材料，样品，电泳条件等），为什么最近电泳时间变长，包括在浓缩胶和分离胶中，请教这可能是什么原因？

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条件是一样
但是你能保证电泳缓冲液之类的试剂你没有换过？
看看配胶的储液有没有污染

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-30 15:52

你好，我想请问一下上样蛋白可不可以不经过煮沸这个程序，因为我怀疑我的蛋白在煮沸的过程中解聚了，由聚合形式转变为非聚合的。

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如果你要做变性的话
应该要加热

作者: 98776langtao 时间: 2013-1-30 15:53

我刚学WB，我照导师说的用AP标记的二抗后在膜上显色以后膜还能用来显色吗？不敢为这个去问老师，只好来这里求助了！

我上次用AP标记的b-actin在膜上显色，我就是想在显色后的膜上再次显色，可不可以用上次用的NBT再次显色，如果可以的话用不用特殊处理。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:54

我刚学WB，我照导师说的用AP标记的二抗后在膜上显色以后膜还能用来显色吗？不敢为这个去问老师，只好来这里求助了！

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说具体点你要做什么啊
然后我才能告诉你怎么做

作者: windy+++ 时间: 2013-1-30 15:56

条件是一样
但是你能保证电泳缓冲液之类的试剂你没有换过？
看看配胶的储液有没有污染

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最近做了几次考染结果，发现蛋白条带在分离胶上部跑不开，不知道是什么原因？由于我发现现在的4%浓缩胶阻力特别大，溴芬兰条带要跑近2小时才进入分离胶，所以我怀疑可能是配胶的两种缓冲液出了问题，或是10%SDS溶液出了问题（这三种溶液是2月份配的），请帮忙分析下原因，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 15:57

最近做了几次考染结果，发现蛋白条带在分离胶上部跑不开，不知道是什么原因？由于我发现现在的4%浓缩胶阻力特别大，溴芬兰条带要跑近2小时才进入分离胶，所以我怀疑可能是配胶的两种缓冲液出了问题，或是10%SDS溶液出了问题（这三种溶液是2月份配的），请帮忙分析下原因，谢谢！

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10%SDS一般不会有问题
检查Tris-HCl的pH

作者: DONT 时间: 2013-1-30 15:57

最近半个月做WB，连B-actin 都出不来。之前用15%和10%的分离胶都试过bio-rad 半干转10v,15min ;10v 12min;10v 10min 丽春红染完后都有条带，就是具体的小条带不是很清晰。
后来又用12%的分离胶，北京六一厂的半干转仪器，按1mA/cm2 16mA转2小时，条带较之前有较清楚，但还是没有结果。actin拿给别人有做出来，我现在怀疑不知道蛋白有没有问题？膜用NC膜小孔径的0.22um.一抗1：1000过夜，二抗1：1000 2h TBST洗膜3*10min.
期待您的答复，谢谢。

作者: DONT 时间: 2013-1-30 15:58

我的蛋白上样量是100ug

作者: wood533 时间: 2013-1-30 15:59

尊敬的楼主，您好！能否麻烦您帮分析一下以下结果，我采用封闭过夜，一抗和二抗各孵育1h。蛋白上样量为40ug。但是目的蛋白（85kd）和内参蛋白（39kd）总是很淡。非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:00

最近半个月做WB，连B-actin 都出不来。之前用15%和10%的分离胶都试过bio-rad 半干转10v,15min ;10v 12min;10v 10min 丽春红染完后都有条带，就是具体的小条带不是很清晰。
后来又用12%的分离胶，北京六一厂的半干转仪器，按1mA/cm2 16mA转2小时，条带较之前有较清楚，但还是没有结果。actin拿给别人有做出来，我现在怀疑不知道蛋白有没有问题？膜用NC膜小孔径的0.22um.一抗1：1000过夜，二抗1：1000 2h TBST洗膜3*10min.
期待您的答复，谢谢。

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转膜时间调整：半干，1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜1h
别人能做出来说明你的蛋白没有问题
内参还是不容易降解的
调整你的一抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:00

我的蛋白上样量是100ug

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你做什么目的蛋白啊
上样量不需要这么大

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:00

尊敬的楼主，您好！能否麻烦您帮分析一下以下结果，我采用封闭过夜，一抗和二抗各孵育1h。蛋白上样量为40ug。但是目的蛋白（85kd）和内参蛋白（39kd）总是很淡。非常感谢！

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蛋白定量有问题吗？
如果蛋白定量没有问题，上样量40ug的话内参应该很亮了
调整内参的一抗稀释度
先做好内参再做目的蛋白
你的样品有没有反复冻融？
看GAPDH的条带感觉有点降解
转膜是什么条件？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:01

再发一张图片给您，麻烦您帮忙分析一下！谢谢！

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加大一点上样量至60或者80ug

作者: 911 时间: 2013-1-30 16:02

我是做脑组织的，目的蛋白是17kd 和46kd 左右。
因为之前内参都出不来，所以上次只是先把actin拿给被人做而已，蛋白是用别人的，不是用我自己的。他们一抗用1：1000就出来了。

NBA老师之前有没有用过bio-rad的仪器啊？我这边实验室的老师说他们都是用电压转。而且它那个时间都比较短。

半干，1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜1h 。这个条件我今天在试下。谢谢。

作者: 911 时间: 2013-1-30 16:03

如果我同时转两张膜的话，电流是不是要加起来啊？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:04

如果我同时转两张膜的话，电流是不是要加起来啊？谢谢！

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要加起来
膜多大就要算多大的电流

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:04

如果我同时转两张膜的话，电流是不是要加起来啊？谢谢！

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用0.22um的膜
17K转膜时间 30min就够了

作者: TAT 时间: 2013-1-30 16:05

说具体点你要做什么啊
然后我才能告诉你怎么做

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我上次用AP标记的b-actin在膜上显色，我就是想在显色后的膜上再次显色，可不可以用上次用的NBT再次显色，如果可以的话用不用特殊处理。

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:07

我上次用AP标记的b-actin在膜上显色，我就是想在显色后的膜上再次显色，可不可以用上次用的NBT再次显色，如果可以的话用不用特殊处理。

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应该是可以的
我做过ECL发光后的膜
冻在-20度几个月了
拿出来重新用ECL孵育后照样能曝出条带

作者: huifeng0516 时间: 2013-1-30 16:07

现跑一细胞蛋白样，电用完之后（肉眼可见溴酚蓝已经跑到胶下缘），用考马斯亮蓝染色过夜后，结果发现蛋白条带都在胶上边（靠近基层胶端），胶的下半面空白。---------这是怎么回事？？？
基层胶电压80v，20多毫安，分离胶120v，50-70毫安之间，共约2小时，基层胶压缩的自认为还可以，可以看到压得比较紧。
请高手指点一下，本人要做的是十几kd的小分子量蛋白，对于以上的情况给与解答？万分感谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:08

现跑一细胞蛋白样，电用完之后（肉眼可见溴酚蓝已经跑到胶下缘），用考马斯亮蓝染色过夜后，结果发现蛋白条带都在胶上边（靠近基层胶端），胶的下半面空白。---------这是怎么回事？？？
基层胶电压80v，20多毫安，分离胶120v，50-70毫安之间，共约2小时，基层胶压缩的自认为还可以，可以看到压得比较紧。
请高手指点一下，本人要做的是十几kd的小分子量蛋白，对于以上的情况给与解答？万分感谢！

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我没碰到过这种情况
但是我感觉是你的分离胶与浓缩胶用的缓冲液出了问题

作者: eric930 时间: 2013-1-30 16:09

老师您好
最近我在做3个蛋白。大小大概是80.90.110，用HepG2细胞提的。浓度2-3UG/UL,每孔加的15UL左右。
我的试验条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时

B -ACTIN跑出来过，但是这三个蛋白只做出来一次，还是80的。90，110的都没跑出来。一直在预试验摸条件，以前没做过，想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方？膜选用PVDF会更好吗？封闭前需要对膜做正反标记么？

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:12

老师您好
最近我在做3个蛋白。大小大概是80.90.110，用HepG2细胞提的。浓度2-3UG/UL,每孔加的15UL左右。
我的试验条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时

B -ACTIN跑出来过，但是这三个蛋白只做出来一次，还是80的。90，110的都没跑出来。一直在预试验摸条件，以前没做过，想请您针对我的蛋白给个好的试验条件。转移液配方甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000.您说得加转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?
还有我的TBST用得是0.5ML的吐温加1000ML的TBS。
谢谢您给点意见。尤其是我的试验条件有没有需要改进的地方？膜选用PVDF会更好吗？封闭前需要对膜做正反标记么？

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呵呵
真有缘
我正在做HepG2细胞的实验
已经做完一批，现在做第二批，72个样品
我做AMPK与phospho-AMPK
要做膜的正反标记
应该在转膜的时候做
我现在用NC，以前用PVDF膜几年
膜没有什么大的区别
转膜后染膜了？
另外一抗的厂家与建议稀释比例是多少？

作者: 101010 时间: 2013-1-30 16:14

新手上路，请帮忙

问题：
1.我做gapdh做内参，样品十五个，第一次跑的时候和一个目的蛋白同时孵育，目的蛋白出来少部分且条带较淡，gapdh出来了，但分不清十几个了，连在一起且条带较浓，我单独跑gapdh减少上样量一半以后（10微克）后跑出来后条带还是较浓，但仍然不能全部跑出来。为了看看是不是样品的体，我使用一种样品点了15个泳道，结果还是不能全部做出来，只能跑出一部分，怎样改善才能全部做出来，谢谢。另外怎样使目的带更清晰一些？
2.我使用的PVDF膜孵育过一个抗体后（已经用ECL显色且效果可以），换能重新封闭膜后孵育另一个抗体吗？我想看看同一张膜上这几种蛋白的变化，因为在如果同一张膜看两个蛋白的变化，对照性更可靠些（个人观点）
3.我的部分蛋白分子量在35----45之间，bio-red半干转 PVDF膜一般转多长时间比较合适啊，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:16

QUOTE:

原帖由 101010 于 2013-1-30 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
新手上路，请帮忙

问题：
1.我做gapdh做内参，样品十五个，第一次跑的时候和一个目的蛋白同时孵育，目的蛋白出来少部分且条带较淡，gapdh出来了，但分不清十几个了，连在一起且条带较浓，我单独跑gapdh减少上样量一半以后（10微克）后跑出 ...

1，转膜的时候胶与膜之间有气泡
2，孵育抗体的时候液体没有完全覆盖膜表面
3，如果你用stripping buffer洗掉抗体的话要重新封闭
否则直接加抗体即可
4，转膜时间，半干 1.2mA每平方厘米膜面积，1h
good luck

作者: DNA 时间: 2013-1-30 16:17

1，转膜的时候胶与膜之间有气泡
2，孵育抗体的时候液体没有完全覆盖膜表面
3，如果你用stripping buffer洗掉抗体的话要重新封闭
否则直接加抗体即可
4，转膜时间，半干 1.2mA每平方厘米膜面积，1h
good luck

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感谢解答,
1.每次做赶气泡工作做得很好，转膜后染胶后发现，目的带基本都染在膜上了
2.孵育抗体液体绝对充分，用量双面覆盖应该也没问题了。
还有其他因素吗？或者是膜边缘的原因，因为每次边上两个跑的都不死很好。

作者: windy+++ 时间: 2013-1-30 16:19

感谢解答,
1.每次做赶气泡工作做得很好，转膜后染胶后发现，目的带基本都染在膜上了
2.孵育抗体液体绝对充分，用量双面覆盖应该也没问题了。
还有其他因素吗？或者是膜边缘的原因，因为每次边上两个跑的都不死很好。

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检查一下膜是否过期
如果这些原因都排除了把样品顺利调换一下试试

作者: 131415 时间: 2013-1-30 16:20

呵呵
真有缘
我正在做HepG2细胞的实验
已经做完一批，现在做第二批，72个样品
我做AMPK与phospho-AMPK
要做膜的正反标记
应该在转膜的时候做
我现在用NC，以前用PVDF膜几年
膜没有什么大的区别
转膜后染膜了？
另外一抗的厂家与建议稀释比例是多少？

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谢谢老师的解答，一抗我用的博士德的，建议比例是1：100-500，STAT1针对84和91KD,STAT2针对110KD的，我染了，用丽春红染的，不明显，但是今天曝光时暴出来了，在80-95之间，只有一条，应该是2条，会不会84和91过于接近不好跑开呢。
还有个很重要的问题希望老师解答就是我的实验条件有没有大的问题？
条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时
转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?转移液需要改进吗？我的是甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:20

谢谢老师的解答，一抗我用的博士德的，建议比例是1：100-500，STAT1针对84和91KD,STAT2针对110KD的，我染了，用丽春红染的，不明显，但是今天曝光时暴出来了，在80-95之间，只有一条，应该是2条，会不会84和91过于接近不好跑开呢。
还有个很重要的问题希望老师解答就是我的实验条件有没有大的问题？
条件是浓缩100V.30MIN，分离150 60MIN
转膜湿转350MA恒流一个半小时。用得NC膜。
TBST100 ML +5g脱脂奶封闭2小时
一抗1：100 STAT1和STAT2过夜4度,分别做的
二抗1：3000 1小时
转移液中加0.1%的SDS是直接取代此处的0.37么?还是另加?转移液需要改进吗？我的是甘氨酸2.9 TRIS 5.8, SDS 0.37,甲醇200ML，总体积1000

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你的实验条件没有大问题，建议你细化每个步骤
我觉得已经很好了
不知道你的结果如何
可以发给我看看
另外你有没有染胶，跑完SDS-PAGE的胶
看看总蛋白提取的如何
条带挨着很近可能是电泳没有分开，取决于分离胶浓度，电泳时间等
祝你顺利

作者: 98776langtao 时间: 2013-1-30 16:21

老师，我今天做的目的条带弱，marker却有很亮的条带，怎么回事啊？还有一个蛋白是整膜都亮，目的条带还是有的，不知道怎么能不让整张膜都发光呢，二抗已经用到了1：8000，做GAPDH同样的二抗用的1：2000呢，谢谢啊

作者: 8s5g 时间: 2013-1-30 16:21

延长封闭时间
二抗稀释度加大到1：5000至1：10000试试

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谢谢老师，我现在又碰见新问题了，不知道什么原因，我显不出目的带。
10%牛奶封闭过夜，
1：500 1：1000 1：2000 1：3000一抗孵育过夜。洗一个半小时。
二抗 1：2000 孵育1小时。洗1个小时
显影片子上又MARK都现出一条带来了。但是目的蛋白没有。
是不是洗的时间太长了？

作者: u234 时间: 2013-1-30 16:22

麻烦你再帮我分析下WB哪里出问题了，昨天把我的蛋白拿给一个师兄跟他的一起做，结果他帮我曝出条带了，证明我的蛋白是没问题的。
我之前的操作如下：（只做actin 43KD ，上样100ug）
1. 12%的分离胶 80v 40min-1h左右，改120v跑至底部结束电泳。
2. NC膜 0.2um 滤纸上下4层（北京六一厂的转膜仪）1 mA/cm2 ，2h。
3.丽春红染出条带，ddH2O洗干净，5%脱脂奶粉封闭1h，加一抗 1：1000
4°C孵育过夜。（抗体孵育都是放于透明邮袋封口膜内反应）
4. 洗膜TBST 3*10min .加二抗 1：1000 孵育2h
5. 洗膜TBST3*10min .
6. A液、 B液1：1 （各150ul)于EP管中混匀，均匀滴于铺在薄膜上的NC膜，反折盖上，反应约1-2min,(这部没有在完全暗室操作) 暗室下取胶片于压片盒中，把NC膜正面放于胶片上压片5-10min ，显影1min ,定影1min。

希望老师帮我分析下，不知哪个环节出错了，为什么actin老是出不来。
师兄已经帮我证明蛋白和抗体都没问题了。A,B液，二抗也没有问题。

作者: xue258 时间: 2013-1-30 16:22

请教：
1：做膜蛋白时，上样电泳前是否需要煮沸？有资料讲膜蛋白不易煮沸，因要影响其进入PAGE胶。如果不煮，怎么办？煮沸时100度，5分钟行不行？
2：如果我有三个实验组，每组十个样品，是不是每组每个样品都要做WB，还要重复三次，然后光密度分析，才能算是结果？
3：每次WB时是不是都需要阴性和阳性对照？如何选择阴性和阳性对照品？
4：做内参时是不是应该每次每块胶都同时做内参，有人讲整体做一次内参即可，那这样分开做岂不是没能保障每次上样量的一致性和操作的一致性？
谢谢！

作者: am10 时间: 2013-1-30 16:23

老师，我今天做的目的条带弱，marker却有很亮的条带，怎么回事啊？还有一个蛋白是整膜都亮，目的条带还是有的，不知道怎么能不让整张膜都发光呢，二抗已经用到了1：8000，做GAPDH同样的二抗用的1：2000呢，谢谢啊

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整膜发光也就是背景与一抗质量，二抗浓度，ECL敏感性与质量有关
不知道你有没有换用ECL?
多洗几次膜

作者: u234 时间: 2013-1-30 16:24

谢谢老师，我现在又碰见新问题了，不知道什么原因，我显不出目的带。
10%牛奶封闭过夜，
1：500 1：1000 1：2000 1：3000一抗孵育过夜。洗一个半小时。
二抗 1：2000 孵育1小时。洗1个小时
显影片子上又MARK都现出一条带来了。但是目的蛋白没有。
是不是洗的时间太长了？

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奶粉用5%的就可以了
封闭建议采用室温1h左右或者4度过夜
不建议室温长时间封闭
你做的什么蛋白？
确认目的蛋白提取出来没有

作者: u234 时间: 2013-1-30 16:24

谢谢老师，我现在又碰见新问题了，不知道什么原因，我显不出目的带。
10%牛奶封闭过夜，
1：500 1：1000 1：2000 1：3000一抗孵育过夜。洗一个半小时。
二抗 1：2000 孵育1小时。洗1个小时
显影片子上又MARK都现出一条带来了。但是目的蛋白没有。
是不是洗的时间太长了？

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或者加大样品上样量
另外洗的时候不用那么长
建议3~5min，6次
你用什么ECL？

作者: u234 时间: 2013-1-30 16:25

麻烦你再帮我分析下WB哪里出问题了，昨天把我的蛋白拿给一个师兄跟他的一起做，结果他帮我曝出条带了，证明我的蛋白是没问题的。
我之前的操作如下：（只做actin 43KD ，上样100ug）
1. 12%的分离胶 80v 40min-1h左右，改120v跑至底部结束电泳。
2. NC膜 0.2um 滤纸上下4层（北京六一厂的转膜仪）1 mA/cm2 ，2h。
3.丽春红染出条带，ddH2O洗干净，5%脱脂奶粉封闭1h，加一抗 1：1000
4°C孵育过夜。（抗体孵育都是放于透明邮袋封口膜内反应）
4. 洗膜TBST 3*10min .加二抗 1：1000 孵育2h
5. 洗膜TBST3*10min .
6. A液、 B液1：1 （各150ul)于EP管中混匀，均匀滴于铺在薄膜上的NC膜，反折盖上，反应约1-2min,(这部没有在完全暗室操作) 暗室下取胶片于压片盒中，把NC膜正面放于胶片上压片5-10min ，显影1min ,定影1min。

希望老师帮我分析下，不知哪个环节出错了，为什么actin老是出不来。
师兄已经帮我证明蛋白和抗体都没问题了。A,B液，二抗也没有问题。

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1，上样量太大了
2，用0.45um孔径的膜就可以
3，转膜时间1h就可以，1.2mA每平方厘米膜面积（要计算你的膜大小），恒流
4，膜全部都浸在抗体稀释液中了吗？
5，洗没有问题
6，ECL孵育没有问题
建议你注意一下抗体孵育时的膜有没有全部都浸在抗体稀释液中
看看你师兄的操作

作者: u234 时间: 2013-1-30 16:25

请教：
1：做膜蛋白时，上样电泳前是否需要煮沸？有资料讲膜蛋白不易煮沸，因要影响其进入PAGE胶。如果不煮，怎么办？煮沸时100度，5分钟行不行？
2：如果我有三个实验组，每组十个样品，是不是每组每个样品都要做WB，还要重复三次，然后光密度分析，才能算是结果？
3：每次WB时是不是都需要阴性和阳性对照？如何选择阴性和阳性对照品？
4：做内参时是不是应该每次每块胶都同时做内参，有人讲整体做一次内参即可，那这样分开做岂不是没能保障每次上样量的一致性和操作的一致性？
谢谢！

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1，不是煮沸，是95到100度变性，5min可以了
2，SDS-PAGE当然要变性了，除非你的蛋白要求不一样
3，不用每次都要阴、阳对照，这些对照是为了证明你的WB整个过程没有问题、抗体没有问题、你的样品中通过你的处理后有没有这个蛋白的表达
4，严谨的方法是所有样品都重复三次，视实验条件与经费而定
5，每次都要做内参
祝你实验顺利
节日快乐

作者: 49888 时间: 2013-1-30 16:26

最近我提取的脑组织蛋白样品，在做sds-page电泳时，老是会在上样孔里看到不溶的沉淀，这是怎么回事？结果染胶发现，条带比较少。

作者: mimili_901 时间: 2013-1-30 16:27

我最近做WESTERN 出现了很奇怪的问题，ing想请教您，各位大侠也可以指点指点我啊，我显影的条带经常出现很粗，很模糊的条带，下面的这两个条带上面是目的蛋白，下面是ACTIN，是两块胶跑的结果，目的条带却却缺失了两个条带，对应左边的那两个没有，用的样品也是一样的，而且条带很粗很模糊，但是我上样的蛋白量用BCA试剂盒定量只上了15ul，做ACTIN的时候，发现ACTIN的条带在暗室闪闪发光，很强烈，我的目的蛋白就不是那么回事了。我很想知道为什么显影的条带为什么这么模糊，这么粗？谢谢回复！我在园子里也看了大家的讨论，有的地方改了，一抗，二抗浓度我都降低了，做了四次还是显很粗很模糊的条带，所以想请教您。

作者: www.1 时间: 2013-1-30 16:43

你的实验条件没有大问题，建议你细化每个步骤
我觉得已经很好了
不知道你的结果如何
可以发给我看看
另外你有没有染胶，跑完SDS-PAGE的胶
看看总蛋白提取的如何
条带挨着很近可能是电泳没有分开，取决于分离胶浓度，电泳时间等
祝你顺利

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老师您好，遗憾的是我STAT2还是没做出来，说明书上STAT2是1：100-400都可以，我用的1：100,二抗羊抗兔我用的1：3000,曝光时还是什么都没有，需要调整抗体浓度吗？如果调，该怎么调呢？我怀疑是不是转膜或者电泳时间短了110的蛋白没上去啊？
另外我的分子大小84，91，110，好像是用得10%胶跑的，有问题吗？
我分子量大小和跑胶和转膜的时间应该没问题吧，如果想调整，该怎么调整让条带跑的更好

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:44

最近我提取的脑组织蛋白样品，在做sds-page电泳时，老是会在上样孔里看到不溶的沉淀，这是怎么回事？结果染胶发现，条带比较少。

==========

加点SDS

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:46

我最近做WESTERN 出现了很奇怪的问题，ing想请教您，各位大侠也可以指点指点我啊，我显影的条带经常出现很粗，很模糊的条带，下面的这两个条带上面是目的蛋白，下面是ACTIN，是两块胶跑的结果，目的条带却却缺失了两个条带，对应左边的那两个没有，用的样品也是一样的，而且条带很粗很模糊，但是我上样的蛋白量用BCA试剂盒定量只上了15ul，做ACTIN的时候，发现ACTIN的条带在暗室闪闪发光，很强烈，我的目的蛋白就不是那么回事了。我很想知道为什么显影的条带为什么这么模糊，这么粗？谢谢回复！我在园子里也看了大家的讨论，有的地方改了，一抗，二抗浓度我都降低了，做了四次还是显很粗很模糊的条带，所以想请教您。

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1，目的蛋白有拖尾现象，是不是糖蛋白之类的？
2，目的蛋白转移气泡没有赶好
3，从结果来看你可以减少一倍的上样量，那样条带会漂亮一些
4，条带模糊没关系，和你的目的蛋白有关

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:47

老师您好，遗憾的是我STAT2还是没做出来，说明书上STAT2是1：100-400都可以，我用的1：100,二抗羊抗兔我用的1：3000,曝光时还是什么都没有，需要调整抗体浓度吗？如果调，该怎么调呢？我怀疑是不是转膜或者电泳时间短了110的蛋白没上去啊？
另外我的分子大小84，91，110，好像是用得10%胶跑的，有问题吗？
我分子量大小和跑胶和转膜的时间应该没问题吧，如果想调整，该怎么调整让条带跑的更好

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110的蛋白你可以选择用8%的胶
转膜用的是半干还是湿转？
半干 1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转移 1h30min
湿转：300mA 恒流，转移1h30min
good luck

作者: XYZQ 时间: 2013-1-30 16:47

楼主你好,请问你做的bcl-2用的一抗和二抗各是什么,谢谢?

作者: NBA 时间: 2013-1-30 16:48

楼主你好,请问你做的bcl-2用的一抗和二抗各是什么,谢谢?

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一抗鼠单抗
二抗羊抗鼠
都是santa cruz的

作者: 3N4G 时间: 2013-1-30 16:49

您好，我想问一下为什么要有上层胶和下层胶之分啊？它们分别起了什么作用呢？谢谢

作者: newway 时间: 2013-1-30 16:50

尊敬的楼主，您好！我之前跑Western内参和目的条带都很淡，当时的实验条件是：蛋白上样量是40ug，转膜1h，封闭过液，一抗1：800，二抗：1000，各孵育1h。之后我将实验条件加以调整，主要的变化为：将目的蛋白的一抗浓度增加至1：500，并且剪膜后分别孵育目的和内参。这次的结果内参（39kd）是更明显了，但目的条带（85KD）则看不见了，且这次的背景比以前更脏。为了对比我给出两次实验的结果图，请帮忙分析一下原因，非常感谢！

作者: 8s5g 时间: 2013-1-30 16:51

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

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怎么样的结果算是合适的二抗稀释度呢？

作者: wood533 时间: 2013-1-30 16:52

这是改变实验条件后的结果，请帮忙分析一下，谢谢！

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二抗浓度还是有些高
建议到1：2000和1：4000试试
另外封闭时间稍微延长一些

作者: wood533 时间: 2013-1-30 16:53

怎么样的结果算是合适的二抗稀释度呢？

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比如1：1000，1：2000，1：4000
要是这三个稀释度中都能出结果1：1000强，1：2000中等，1：4000弱
那就要选择一个浓度比较合适的，在这选择1：2000
实际WB中如果选择1：4000可能会出不了结果，1：1000浓度又太高
这个点膜实验可以测定ECL的敏感性与二抗的稀释度
说的不是很清楚，不知道怎么表达
建议你自己实际做了之后再讨论

作者: cj_mondy 时间: 2013-1-30 16:54

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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我觉得是胶板夹得太紧了的原因，是不是在转移胶板的时候才会出现气泡

作者: cj_mondy 时间: 2013-1-30 16:54

上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白？
加入纯化好的beta-actin？
我觉得行不通

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很多人用过柱子的方法浓缩培养上清的蛋白，效果还不错

作者: xyw5 时间: 2013-1-30 16:55

请问：我现在用的一抗Caspase-3（cell signaling），可以检测酶原和激活后的片段17KD。但是我做出来的32KD条带比较细，17KD条带做不出来，其他目的蛋白条带还是很粗的。跑胶转膜没有问题。请问怎样使Caspase-3条带变粗？我加大上样量延长暴光时间还是不行。我按说明书上用1：1000稀释比。请问我该怎么办？

作者: 芙蓉宫主 时间: 2013-1-31 10:51

你好,在电泳后要转膜时,切胶老是切不好,在显影后发现泳道上不对,该如何解决此问题?有时发现预染MARKER的周围就是自己需要的条带,切下转膜加抗体后,发现有多条带?该如何选择是哪一条呢?为什么有多条带?谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-31 10:52

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-1-30 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问：我现在用的一抗Caspase-3（cell signaling），可以检测酶原和激活后的片段17KD。但是我做出来的32KD条带比较细，17KD条带做不出来，其他目的蛋白条带还是很粗的。跑胶转膜没有问题。请问怎样使Caspase-3条带变粗？我加大上样 ...

用1：500试试了
另外你要考虑下你的样品在处理过程中有没有可能使caspase-3 17K降解

作者: NBA 时间: 2013-1-31 10:53

你好,在电泳后要转膜时,切胶老是切不好,在显影后发现泳道上不对,该如何解决此问题?有时发现预染MARKER的周围就是自己需要的条带,切下转膜加抗体后,发现有多条带?该如何选择是哪一条呢?为什么有多条带?谢谢

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多条带的原因主要与一抗有关
加大一抗的稀释度，让一抗变稀
另外你要想切得准确的话要把预染M与非预染M同时作比较，看两者的位置
预染M的泳动位置只能作为参考
要用非预染M来确认具体位置
祝你实验顺利

作者: ququer787 时间: 2013-1-31 10:53

我想做一个8KDa的蛋白，请问分离胶用15％的行吗？15％的胶的配方是什么？转膜时湿转应该用多大电压，多长时间？非常感谢！

作者: 66+77 时间: 2013-1-31 10:55

请问，Westen Blot的灰度值结果需要做统计学分析吗？如何分析呢？
谢谢~

作者: 3N4G 时间: 2013-1-31 10:58

请问LZ有没有跑过neurocan 这类蛋白，如果我要跑150kDa的蛋白，跑胶和转膜的条件怎么选择？多谢！

作者: ritou1985 时间: 2013-1-31 10:58

相关疾病：
感染性心内膜炎
老师您好！我现在遇到一个问题。原来用普利莱的发光液能够做出比较好的结果。前不久换了PIERCE 的专利发光液，现在连内参都无法曝光出来。请问是怎么回事？还有一个情况就是我师弟孵育了2分钟内参在5分钟的时候还有，15分钟内参反而没条带了。我曝光那次按PIERCE的说明孵育了5分钟，什么条带都没有了。我查了一下，觉得好像是HRP消耗了发光液里面的底物过多引起的？如果是这样的话怎么解决？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-31 10:59

相关疾病：
心肌梗死
楼主你好，还有问题请您指点！
我用WB检测一个复合体中的亚基。亚基A约为30KD，B为55－60KD，一共做了三次WB，都是在30KD和55－60KD处有条带，但是条带很模糊，而且背景很深，我不确定这是不是我要证明的那个目的蛋白，还是非特异条带，第三次做的时候曝光后背景很深就又洗了一小时,曝光的时候竟然什么都没有了，背景也很干净。因为重复了三次，条带大小都差不多，所以从心里盼望这就是我的目的蛋白。所以想楼主请教一下，一是这是不是一个特异条带，二是如何优化条件。
我的实验条件是（同短消息）
上样，前两次5ul/泳道，第三次10ul，因为是定性试验，所以蛋白没有定量
电泳：80V30min，120V70-75min
转膜：buffer14.4g甘氨酸，3.02gTris,100ml甲醇，定容到1L。
恒流200ma，1h,millipore的PVDF
封闭：5％脱脂奶粉TBST
一抗：分别用A,B的抗血清在两块膜上杂，1：5000,1%脱脂奶粉TBST1.5h(第三次是5％脱脂奶粉TBST 2h)
洗：每次15ml,10min,x6
二抗：中衫，1：10000，1%脱脂奶粉TBST1.5h (第三次是5％脱脂奶粉TBST )
洗：每次15ml,10min,x6

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-1-31 10:59

因为两张膜上在60处均有一条带，虽然很浓，但是我判断这是非特异条带，但是在B中，除了60KD处的那条带，其下一点也有一条带，分子量符合理论值，不知道这是不是特异性条带呢，还是也是非特异的？

拿这么可怕的图出来吓唬人真不好意思！

作者: fsdd817 时间: 2013-1-31 11:00

相关疾病：
心肌梗死

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我想做一个8KDa的蛋白，请问分离胶用15％的行吗？15％的胶的配方是什么？转膜时湿转应该用多大电压，多长时间？非常感谢！

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你可以试一下
我没有做过这么小的蛋白
用0.22um膜
转膜时建议用半干转，15min
我喜欢用恒流：1.2mA每平方厘米膜面积

作者: fsdd817 时间: 2013-1-31 11:00

请问，Westen Blot的灰度值结果需要做统计学分析吗？如何分析呢？
谢谢~

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现在常用的应该是IOD值，积分光密度
用软件读取目的蛋白与内参蛋白的IOD值
然后用目的蛋白除以内参的IOD
后作分析
在做分析的时候一般有对照，把对照一般设定为1，其他的与对照做比较

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:01

请问LZ有没有跑过neurocan 这类蛋白，如果我要跑150kDa的蛋白，跑胶和转膜的条件怎么选择？多谢！

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没有
分离胶选择8%，浓缩4%
电泳多跑一会
但注意把内参留住
转膜：湿转恒流300mA 转膜2h

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:01

请问LZ有没有跑过neurocan 这类蛋白，如果我要跑150kDa的蛋白，跑胶和转膜的条件怎么选择？多谢！

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你的这个蛋白比较新
我查了下抗体也很少
祝你实验顺利

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:02

老师您好！我现在遇到一个问题。原来用普利莱的发光液能够做出比较好的结果。前不久换了PIERCE 的专利发光液，现在连内参都无法曝光出来。请问是怎么回事？还有一个情况就是我师弟孵育了2分钟内参在5分钟的时候还有，15分钟内参反而没条带了。我曝光那次按PIERCE的说明孵育了5分钟，什么条带都没有了。我查了一下，觉得好像是HRP消耗了发光液里面的底物过多引起的？如果是这样的话怎么解决？

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稀释一抗与二抗至少两倍

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:05

老师您好！我现在遇到一个问题。原来用普利莱的发光液能够做出比较好的结果。前不久换了PIERCE 的专利发光液，现在连内参都无法曝光出来。请问是怎么回事？还有一个情况就是我师弟孵育了2分钟内参在5分钟的时候还有，15分钟内参反而没条带了。我曝光那次按PIERCE的说明孵育了5分钟，什么条带都没有了。我查了一下，觉得好像是HRP消耗了发光液里面的底物过多引起的？如果是这样的话怎么解决？

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我也碰到过这样的问题
换发光液的时候要做预实验的
每个公司的发光液敏感性不一样
祝你实验顺利

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:05

楼主你好，还有问题请您指点！
我用WB检测一个复合体中的亚基。亚基A约为30KD，B为55－60KD，一共做了三次WB，都是在30KD和55－60KD处有条带，但是条带很模糊，而且背景很深，我不确定这是不是我要证明的那个目的蛋白，还是非特异条带，第三次做的时候曝光后背景很深就又洗了一小时,曝光的时候竟然什么都没有了，背景也很干净。因为重复了三次，条带大小都差不多，所以从心里盼望这就是我的目的蛋白。所以想楼主请教一下，一是这是不是一个特异条带，二是如何优化条件。
我的实验条件是（同短消息）
上样，前两次5ul/泳道，第三次10ul，因为是定性试验，所以蛋白没有定量
电泳：80V30min，120V70-75min
转膜：buffer14.4g甘氨酸，3.02gTris,100ml甲醇，定容到1L。
恒流200ma，1h,millipore的PVDF
封闭：5％脱脂奶粉TBST
一抗：分别用A,B的抗血清在两块膜上杂，1：5000,1%脱脂奶粉TBST1.5h(第三次是5％脱脂奶粉TBST 2h)
洗：每次15ml,10min,x6
二抗：中衫，1：10000，1%脱脂奶粉TBST1.5h (第三次是5％脱脂奶粉TBST )
洗：每次15ml,10min,x6

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1，抗血清容易有较高的背景，建议纯化抗体
2，适当延长封闭的时间
3，如果是刚开始做WB，建议先做内参
4，整个过程基本没什么问题
5，蛋白是磷酸化的吗？如果是用5%BSA-TBST封闭、孵育一抗二抗
6，确认Marker的位置，预染只能看大致的位置，确认位置应该用预染与非预染同时电泳染胶确定
good luck

作者: 8princess8 时间: 2013-1-31 11:06

相关疾病：
骨关节炎

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你的这个蛋白比较新
我查了下抗体也很少
祝你实验顺利

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恩，是啊。
今天我用的是7.5%分离胶，跑浓缩胶70V，发现loading连成一片，这个是不是跟我上的量有关？

作者: 8princess8 时间: 2013-1-31 11:11

没有
分离胶选择8%，浓缩4%
电泳多跑一会
但注意把内参留住
转膜：湿转恒流300mA 转膜2h

=============================================================================================================

对了，有一个问题我一直想咨询，就是转膜的时候海绵、滤纸、胶、膜的大小问题，是否应该是海绵>滤纸>胶>膜,滤纸比胶大很多是不是会造成短路，但实际转膜的过程中，我们发现滤纸大很多也没关系，还是能很好的转到膜上，所以说滤纸大小问题是不是不是那么关键。

另外，如果转膜的时候散热没做好，导致整个系统过热，对转膜有什么影响？条带会变散？转膜效率降低？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 11:12

1，抗血清容易有较高的背景，建议纯化抗体
2，适当延长封闭的时间
3，如果是刚开始做WB，建议先做内参
4，整个过程基本没什么问题
5，蛋白是磷酸化的吗？如果是用5%BSA-TBST封闭、孵育一抗二抗
6，确认Marker的位置，预染只能看大致的位置，确认位置应该用预染与非预染同时电泳染胶确定
good luck

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谢谢楼主的建议
其中一个用过纯化抗体，还是背景深
封闭是过夜4度封闭
没有内参
蛋白用在线工具分析有一个磷酸化位点，不知道是否有影响？请教楼主，磷酸化对WB有什么影响呢？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 11:13

不好意思，这张图也就是看最初的曝光胶片才能隐约看见条带，扫描以后就看不清了

另外，转膜后把胶又考染了，发现有条带，虽然比较淡，但是以前没有，转膜条件也没有变，只是上样量加倍了，请问楼主这是怎么回事，有影响吗？

作者: wsll 时间: 2013-1-31 11:13

我想问一下，我做的分子量是17kd的，β-actin是很正常的，但是目的蛋白没有显出来，以为是不小心剪掉了，于是重跑，10kd的marker距下缘三分之一就停了，还是没有，最有可能是什么原因？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:14

相关疾病：
骨关节炎

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恩，是啊。
今天我用的是7.5%分离胶，跑浓缩胶70V，发现loading连成一片，这个是不是跟我上的量有关？

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loading中的溴酚蓝连成一片没有关系啊
上样量大小通过你测定的蛋白浓度可以知道啊
1mm的胶40ug左右是没有问题的

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:15

对了，有一个问题我一直想咨询，就是转膜的时候海绵、滤纸、胶、膜的大小问题，是否应该是海绵>滤纸>胶>膜,滤纸比胶大很多是不是会造成短路，但实际转膜的过程中，我们发现滤纸大很多也没关系，还是能很好的转到膜上，所以说滤纸大小问题是不是不是那么关键。

另外，如果转膜的时候散热没做好，导致整个系统过热，对转膜有什么影响？条带会变散？转膜效率降低？

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大小一致是最好的
在湿转中大小有差别没有关系
在半干转中大小尽可能一致
湿转一定要降温

作者: NBA 时间: 2013-1-31 11:15

谢谢楼主的建议
其中一个用过纯化抗体，还是背景深
封闭是过夜4度封闭
没有内参
蛋白用在线工具分析有一个磷酸化位点，不知道是否有影响？请教楼主，磷酸化对WB有什么影响呢？

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从论坛的帖子及我自己的实际经验来看磷酸化的蛋白比较容易有背景
你用的是什么封闭液及稀释抗体的体系？
建议用5%BSA-TBS，Tween 0.1%

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:29

不好意思，这张图也就是看最初的曝光胶片才能隐约看见条带，扫描以后就看不清了

另外，转膜后把胶又考染了，发现有条带，虽然比较淡，但是以前没有，转膜条件也没有变，只是上样量加倍了，请问楼主这是怎么回事，有影响吗？

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转膜条件不变的情况下你加倍了上样量
那么在相同的条件下蛋白肯定不可能完全转移过去
因为在相同点上的蛋白多了

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:29

我想问一下，我做的分子量是17kd的，β-actin是很正常的，但是目的蛋白没有显出来，以为是不小心剪掉了，于是重跑，10kd的marker距下缘三分之一就停了，还是没有，最有可能是什么原因？

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转膜条件是什么
多大孔径的膜？

作者: www.1 时间: 2013-1-31 14:38

1、我想请教一下，我在用封闭液洗膜的时候，发现PVDF膜表面变花了，如墙壁的石灰脱落，完全脱落后就变得透明，请问这是什么原因引起的？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:39

QUOTE:

原帖由 www.1 于 2013-1-31 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、我想请教一下，我在用封闭液洗膜的时候，发现PVDF膜表面变花了，如墙壁的石灰脱落，完全脱落后就变得透明，请问这是什么原因引起的？

膜过期了
或者是没有活化好
用无水甲醇活化 10s即可

作者: newway 时间: 2013-1-31 14:41

相关疾病：
肺癌类风湿关节炎
最近准备做western blot ，在配制不连续转移缓冲液的时候需要CAPS这一试剂，但这个试剂好像很少，不大有得买，而且据说很贵。
听说可以用甘氨酸代替，如果可以用甘氨酸代替，那配制时各成分的浓度是多少？是60 mM Tris,40 mM 甘氨酸,pH 9.6吗？
请教fangweibin119老师，不胜感激！
To prepare 100 ml of each working buffer from the 5x stock solution
(final concentration 60 mM Tris,40 mM CAPS,pH 9.6):
Anode (bottom) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
15 ml MeOH
65 ml water

Cathode (top) buffer:
20 ml 5x Tris/CAPS
1 ml 10% SDS
79 ml water

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:41

QUOTE:

原帖由 newway 于 2013-1-31 14:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
肺癌类风湿关节炎
最近准备做western blot ，在配制不连续转移缓冲液的时候需要CAPS这一试剂，但这个试剂好像很少，不大有得买，而且据说很贵。
听说可以用甘氨酸代替，如果可以用甘氨酸代替，那配制时各成分的浓度是 ...

你做什么蛋白啊
能把文献发给我看看吗？

作者: tuuu2 时间: 2013-1-31 14:42

你好,我内参是贝塔actin,目的蛋白分子量为59KD，内参是小鼠抗大鼠，目的蛋白也是小鼠抗大鼠，我在加一抗时能否一起加。我的二抗都是羊抗小鼠的，也能一起加吗？因为我想将内参与目的蛋白在一张膜上显影。行吗？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:45

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

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你好,我内参是贝塔actin,目的蛋白分子量为59KD，内参是小鼠抗大鼠，目的蛋白也是小鼠抗大鼠，我在加一抗时能否一起加。我的二抗都是羊抗小鼠的，也能一起加吗？因为我想将内参与目的蛋白在一张膜上显影。行吗？

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beta-actin分子量是45KD
可以一起做
但是要两个分别摸条件

作者: ritou1985 时间: 2013-1-31 14:49

我想请教您一些问题：
关于蛋白marker，我用的是ferments的1811，有两条红色带的那种，跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶，在电泳的时候，marker只有40多及以上的能分开，28及以下的marker全都挤在一起，跑不开，即使是跑到底了也没有分开，跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题，后来重新滴定调整，也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白，但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开，明天就跑不开了，根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的，并没有大的变化。

谢谢您的指点。

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:50

我想请教您一些问题：
关于蛋白marker，我用的是ferments的1811，有两条红色带的那种，跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶，在电泳的时候，marker只有40多及以上的能分开，28及以下的marker全都挤在一起，跑不开，即使是跑到底了也没有分开，跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题，后来重新滴定调整，也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白，但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开，明天就跑不开了，根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的，并没有大的变化。

谢谢您的指点。

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28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少？
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离？

作者: fox_79 时间: 2013-1-31 14:50

我最近开始做WB，但是结果很不好，特来请教。
1.同样的样品，我做点杂交是有显影的，做Wetern则没有信号，抗体和ECL显影系统应该没有问题的，实验室其他人用同样的系统结果就很不错。可能的原因是什么呢？我怀疑是蛋白降解了，我用的是尿素方法抽提的蛋白。
2.另外一个问题，一开始做不都是要模索条件嘛，二抗的点杂交做起来应该比较简单。那一抗的稀释比例怎么摸呢？
具体一点，是用同样的蛋白样品，分别点在几张不同的NC膜上，这些膜再在不同一抗条件下孵育吗

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:51

我最近开始做WB，但是结果很不好，特来请教。
1.同样的样品，我做点杂交是有显影的，做Wetern则没有信号，抗体和ECL显影系统应该没有问题的，实验室其他人用同样的系统结果就很不错。可能的原因是什么呢？我怀疑是蛋白降解了，我用的是尿素方法抽提的蛋白。
2.另外一个问题，一开始做不都是要模索条件嘛，二抗的点杂交做起来应该比较简单。那一抗的稀释比例怎么摸呢？
具体一点，是用同样的蛋白样品，分别点在几张不同的NC膜上，这些膜再在不同一抗条件下孵育吗？

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1，点杂交只能作参考，假阳性比较多
2，一抗的稀释度要通过完整的WB来确定
样品转膜后把膜剪成小条，每条用不同的一抗稀释度
good luck

作者: TNT 时间: 2013-1-31 14:52

谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少，后又在超声体系中加入PMSF，仍然没有改善。比较奇怪的是，同样的样本做2-D电泳时却有很多点，请帮忙分析一下可能的原因，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:52

QUOTE:

原帖由 TNT 于 2013-1-31 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少，后又在超声体系中加入PMSF，仍然没有 ...

加PMSF是为了防止蛋白降解
建议改用合适的蛋白提取试剂

作者: NBA 时间: 2013-1-31 14:53

谢谢你的这么多精彩解答.
我在实验中碰到一个关于样本处理的问题,我们的样本是分支杆菌,因其胞壁的特殊结果,较其他细菌致密一些.我们使用超声处理后的样本来做sds-page结果条带很少，后又在超声体系中加入PMSF，仍然没有改善。比较奇怪的是，同样的样本做2-D电泳时却有很多点，请帮忙分析一下可能的原因，谢谢！

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测过浓度没有？
是不是上样量很低？

作者: qqq111 时间: 2013-1-31 14:54

最近在做western遇到一个奇怪的问题，检测细胞上清蛋白，actin泳道为细胞裂解，上清中没有杂到actin正常。目的蛋白为14kd,但是试验中检测到目的蛋白约24kd,而且买的标准品也在24kd上面有条带。而下面整个成一条线，但理论上目的蛋白大致在成一条线的位置，但是这又与实验处理相矛盾。因为只有右面4个泳道会有条带
1.蛋白偏大（24kd)是什么原因?
2.下面整个成一条线是什么原因照成（抗体是多抗）。
3.实验条件该怎样优化？
4.发表文章的话下面那整个一条线剪切掉可以吗？把其它地方背景减弱这属于学术不端吗？谢谢！

作者: vera+ 时间: 2013-1-31 14:54

大家好！
我们实验室最近遇到这样的问题：
实验条件：上样305ul/泳道，电泳：80V30min，120V70-75min。buffer14.4g甘氨酸，3.02gTris,10%SDS10ml，定容到1L。
预染Marker，170、130、100、72、55、40、33、*、14.4。
电泳过程中，溴芬兰指示标记进入分离胶很整齐，marker分离也没问题。随着电泳时间的增加，marker越来越淡，最后72及其以上的条带均丢失。
郁闷，同一个实验体系，这种现象时有时无。

作者: pengke1983 时间: 2013-1-31 14:55

我想请教您一些问题：
关于蛋白marker，我用的是ferments的1811，有两条红色带的那种，跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶，在电泳的时候，marker只有40多及以上的能分开，28及以下的marker全都挤在一起，跑不开，即使是跑到底了也没有分开，跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题，后来重新滴定调整，也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白，但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开，明天就跑不开了，根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的，并没有大的变化。

谢谢您的指点。

=================================================================================

28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少？
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离？

谢谢您的指点，
分离胶的高度很大，因为浓缩胶只在梳子以下一厘米，所以我也觉得很奇怪，不知道是哪里出了问题。

作者: mamamiya 时间: 2013-1-31 14:55

请教一westernblot问题，上样时上样缓冲液的最终浓度应该是x 多少倍？我的总体系是20微升，因为我组织蛋白含量较高，组织蛋白体积为5微升，我该如何办？上样时蛋白的含量最好为多少？不胜感谢！

作者: yonger 时间: 2013-1-31 14:57

您好，想请教您个问题，无论加多大的抗体，出来的结果都在55KD的位置。考马斯染过之后，蛋白是完整的。请问是什么原因呢？谢谢！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-1-31 14:58

请问，我最近做了些western，
小分子量的比如说21kd、20kd和16kd的P21、bax、survivin就都没有作出来。很迷惑。
我的条件是：上样总蛋白75ug，配10％的胶，电泳时最小为10kd的marker还留着，PVDF转膜湿转300mA 1h或350mA 1.5h都试过，封闭后一抗过夜。TBST洗膜，二抗1.5h，TBST洗膜。而后ECL显影。

内参37KD的GAPDH没有问题。条带很浓。但是小分子的P21，bax，survivin都没有出来。

我仔细搜索了版内大家的讨论：
对于转膜时间和电流大小没有一致的看法：有人认为半个小时，200mA就够了。也有人转2h。有人用恒压转。
我一直都用恒流350mA转膜1.5h的，转30kd以上都没有问题。因为现在要做的是小分子，所以调成300mA 1h试过,虽然GAPDH可以出来，但目的蛋白没有。想问转膜条件到底应该如何？PVDF膜理论上应该不会使得蛋白转过头吧？
我需要做怎样的调整。
我今天做，自己初步的调整如下：
1、胶配成12％
2、加大上样蛋白量150ug
3、转膜时间是否也需要再减少？

Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h，注意降温

你好,我现在也要做bcl-2,我想问一下.1.提蛋白的试剂是用提总蛋白,还是用其它的.
2.一抗用rabbit抗人的,mouse抗人的有没有区别.3,你的二抗用的是什么标记的,效果怎么样.
谢谢!

作者: eric930 时间: 2013-1-31 15:01

在wb过程中发现我的条带连在一起了并且加marker的那孔中也有目的蛋白检出
我配置的蛋白胶是10%的
分离胶：
H2O 4ml
4XBuffer(Tris-SDS pH 8.8) 2ml
40%丙烯酰胺 2ml
10%APS 100ul
TEMED 10ul

浓缩胶：
H2O 2.5ml
4XBuffer pH6.8 1ml
40%丙烯酰胺 0.5ml
10%APS 40ml
TEMED 4ul

电泳100V
转膜 300mA 90min

我上样量为15ug总蛋白差不多没孔是12ul左右
我觉得好像不是上样量的问题以前没有遇到过这个状况
而且用了santa的抗体出现了两条带

我做了2次了都是这样
请老师在百忙之中指点迷津
万分感谢

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:02

很简单
第一：电泳缓冲液污染（是不是反复使用了？）
第二：转缓应该新配

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你好，我是上面问那个问题的！就是显色的时候出现竖条带方格状的，有点不清楚为什么电泳缓冲液污染会造成这样呢？

作者: qhyu 时间: 2013-1-31 15:05

请教版主：转膜的时候三明治夹子上下放置有区别没？如果有区别是什么？

作者: kulee 时间: 2013-1-31 15:05

你好老师，我的内参44kd，我的目的蛋白却170kd，而这很难在同一张膜上啊。因为内参跑到底的时候，目的还没有抛开呢，怎么办啊？需要用大分子量的内参吗？我问了一下实际上，大的内参也就55kd左右。我应该怎么办呢？
谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:06

最近在做western遇到一个奇怪的问题，检测细胞上清蛋白，actin泳道为细胞裂解，上清中没有杂到actin正常。目的蛋白为14kd,但是试验中检测到目的蛋白约24kd,而且买的标准品也在24kd上面有条带。而下面整个成一条线，但理论上目的蛋白大致在成一条线的位置，但是这又与实验处理相矛盾。因为只有右面4个泳道会有条带
1.蛋白偏大（24kd)是什么原因?
2.下面整个成一条线是什么原因照成（抗体是多抗）。
3.实验条件该怎样优化？
4.发表文章的话下面那整个一条线剪切掉可以吗？把其它地方背景减弱这属于学术不端吗？谢谢！

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1，蛋白偏大的话首先要确认你的Marker，你是用预染得还是非预染的？
确定准确的位置需要用非预染的Marker
2，多抗有可能会有多条带，可以通过加大上样量，减小一抗浓度来调整
3，当然可以减掉，你可以通过调整对比度来改变美观程度，这又不是作假！

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:06

大家好！
我们实验室最近遇到这样的问题：
实验条件：上样305ul/泳道，电泳：80V30min，120V70-75min。buffer14.4g甘氨酸，3.02gTris,10%SDS10ml，定容到1L。
预染Marker，170、130、100、72、55、40、33、*、14.4。
电泳过程中，溴芬兰指示标记进入分离胶很整齐，marker分离也没问题。随着电泳时间的增加，marker越来越淡，最后72及其以上的条带均丢失。
郁闷，同一个实验体系，这种现象时有时无。

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没碰到这样的情况
你的浓缩胶有多高？（从梳孔底部到分离胶界面之间的距离）

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:06

我想请教您一些问题：
关于蛋白marker，我用的是ferments的1811，有两条红色带的那种，跑胶的时候用的是10%的分离胶和4%的浓缩胶，在电泳的时候，marker只有40多及以上的能分开，28及以下的marker全都挤在一起，跑不开，即使是跑到底了也没有分开，跟溴酚兰是一个水平线。
开始以为是配胶的时候Tris缓冲液pH值的问题，后来重新滴定调整，也还是出现同样的情况。
本来认为是不是因为胶的浓度低了多以分不开小分子量的蛋白，但是后来有试过12%的也同样跑不开。
有个同学是今天跑得开，明天就跑不开了，根本没办法分开低分子量的蛋白。
但是所有的条件基本是一样的，并没有大的变化。

谢谢您的指点。

28K左右的蛋白不能算是很小的蛋白
10K以上在12%的分离胶是可以很好的分开的
你的分离胶高度有多少？
是不是因为分离胶高度太小引起的不能完全分离？

谢谢您的指点，
分离胶的高度很大，因为浓缩胶只在梳子以下一厘米，所以我也觉得很奇怪，不知道是哪里出了问题。

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不客气
我觉得问题还是出现在分离胶
你用15%的试了吗

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:06

请教一westernblot问题，上样时上样缓冲液的最终浓度应该是x 多少倍？我的总体系是20微升，因为我组织蛋白含量较高，组织蛋白体积为5微升，我该如何办？上样时蛋白的含量最好为多少？不胜感谢！

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样缓终浓度为1倍
以终体积20ul体系为列：你现在有组织蛋白5ul，加入PBS或者你的蛋白提取裂解液（最好选择裂解液）11ul，然后加入4ul 5倍样缓
如果你用的是2倍的样缓：你现在有组织蛋白5ul，加入PBS或者你的蛋白提取裂解液（最好选择裂解液）5ul，然后加入10ul 2倍样缓
上样量一开始选择40ug左右比较好，看预实验结果后再行调整
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:07

您好，想请教您个问题，无论加多大的抗体，出来的结果都在55KD的位置。考马斯染过之后，蛋白是完整的。请问是什么原因呢？谢谢！

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？？
重组蛋白？
不清楚你的意思

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:21

你好,我现在也要做bcl-2,我想问一下.1.提蛋白的试剂是用提总蛋白,还是用其它的.
2.一抗用rabbit抗人的,mouse抗人的有没有区别.3,你的二抗用的是什么标记的,效果怎么样.
谢谢!

======================================================

1，总蛋白提取试剂
2，rabbit一般为多抗（现在也有rabbit的单抗），小鼠的一般为单抗
区别主要在于二抗的选择
3，用HRP标记的二抗做的
效果还行吧，把邮箱给我可以发给你看看
我做的是骨骼肌

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:22

我在wb过程中发现我的条带连在一起了并且加marker的那孔中也有目的蛋白检出
我配置的蛋白胶是10%的
分离胶：
H2O 4ml
4XBuffer(Tris-SDS pH 8.8) 2ml
40%丙烯酰胺 2ml
10%APS 100ul
TEMED 10ul

浓缩胶：
H2O 2.5ml
4XBuffer pH6.8 1ml
40%丙烯酰胺 0.5ml
10%APS 40ml
TEMED 4ul

电泳100V
转膜 300mA 90min

我上样量为15ug总蛋白差不多没孔是12ul左右
我觉得好像不是上样量的问题以前没有遇到过这个状况
而且用了santa的抗体出现了两条带

我做了2次了都是这样
请老师在百忙之中指点迷津
万分感谢

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1，两条带的问题首先要看抗体如何，有很多多抗就会有两条带，看看说明书及相关文献发表的图片
2，延长分离胶的凝固时间
3，我个人认为上样量有些大，建议减半

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:23

你好，我是上面问那个问题的！就是显色的时候出现竖条带方格状的，有点不清楚为什么电泳缓冲液污染会造成这样呢？

=====================

因为我出现过这样的问题
具体原因我也不清楚
可能蛋白污染吧

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:23

请教版主：转膜的时候三明治夹子上下放置有区别没？如果有区别是什么？

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没有区别
注意点在：膜与胶的正负极位置，膜在正侧，胶在负侧
good luck

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:24

你好老师，我的内参44kd，我的目的蛋白却170kd，而这很难在同一张膜上啊。因为内参跑到底的时候，目的还没有抛开呢，怎么办啊？需要用大分子量的内参吗？我问了一下实际上，大的内参也就55kd左右。我应该怎么办呢？
谢谢！！

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选用55K的beta-tubulin是可取的
170K的完全可以在一张膜上做
8%的胶可以让170K的跑开，而且55K的仍在胶上
转膜的时候一170K的条件来进行
因为beta-tubulin量比较大
转过了一些没有关系
如果转过了大家转过的比例理论上是相同的

作者: wood533 时间: 2013-1-31 15:27

你好,我现在也要做bcl-2,我想问一下.1.提蛋白的试剂是用提总蛋白,还是用其它的.
2.一抗用rabbit抗人的,mouse抗人的有没有区别.3,你的二抗用的是什么标记的,效果怎么样.
谢谢!

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1，总蛋白提取试剂
2，rabbit一般为多抗（现在也有rabbit的单抗），小鼠的一般为单抗
区别主要在于二抗的选择
3，用HRP标记的二抗做的
效果还行吧，把邮箱给我可以发给你看看
我做的是骨骼肌

作者: 831226 时间: 2013-1-31 15:28

摸二抗的稀释度
用点杂交
用1倍TBS稀释二抗
做不同的梯度1：1000，1：2000，1：4000，1：8000
稀释好后各取1ul点在NC膜上，RT干燥
加发光液（B液+30%H2O2+A液）
曝光
确定二抗的合适稀释度

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请教，我按如上方法摸二抗稀释度，但是什么都没曝光出来。胶片，显影液和定影液都没问题。我用乙肝三系检测试剂盒里的酶标抗体（也是HRP标记的抗体）和底物A，底物B分别检测发光试剂和二抗也都没问题（均为50ul体系）。是不是说明在NC膜上的抗体量太少才没能曝光出来？

作者: applebook=213 时间: 2013-1-31 15:29

选用55K的beta-tubulin是可取的
170K的完全可以在一张膜上做
8%的胶可以让170K的跑开，而且55K的仍在胶上
转膜的时候一170K的条件来进行
因为beta-tubulin量比较大
转过了一些没有关系
如果转过了大家转过的比例理论上是相同的

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再问老师一个比较幼稚的问题，可以不可以把目的蛋白的一抗和内参的一抗混合后一起孵育，然后在孵育二抗啊？反正两种一抗也不回相互作用。

作者: DDD 时间: 2013-1-31 15:30

请教，我按如上方法摸二抗稀释度，但是什么都没曝光出来。胶片，显影液和定影液都没问题。我用乙肝三系检测试剂盒里的酶标抗体（也是HRP标记的抗体）和底物A，底物B分别检测发光试剂和二抗也都没问题（均为50ul体系）。是不是说明在NC膜上的抗体量太少才没能曝光出来？

=====================

加AB液中加了双氧水？
把双氧水去了试试

作者: DDD 时间: 2013-1-31 15:30

再问老师一个比较幼稚的问题，可以不可以把目的蛋白的一抗和内参的一抗混合后一起孵育，然后在孵育二抗啊？反正两种一抗也不回相互作用。

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呵呵
这要通过预实验来确定
你不做预实验怎么能确定你的一抗就只有一条非常特异的条带呢？
我做过同时加两个一抗的WB
用的小鼠来源的单抗

作者: 66小飞侠 时间: 2013-1-31 15:31

相关疾病：
肿瘤
我开始做该实验，有个问题想问：我需要检测大约5个左右标本（培养的肿瘤细胞），不知需要多少抗体？如果抗体已按说明书稀释到相应浓度，每次实验加的抗体量一样嘛？有多少因素决定应用抗体量？让高手见笑了！实验室新手啊！

作者: NBA 时间: 2013-1-31 15:31

我开始做该实验，有个问题想问：我需要检测大约5个左右标本（培养的肿瘤细胞），不知需要多少抗体？如果抗体已按说明书稀释到相应浓度，每次实验加的抗体量一样嘛？有多少因素决定应用抗体量？让高手见笑了！实验室新手啊！

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取决于样本量及你的实验是否需要重复
最重要一点事抗体的稀释度
你这么问我没法回答你
每个抗体的稀释度是不同的

作者: glass 时间: 2013-1-31 15:32

前辈您好
我这几天跑的条带无一例外是白板处于深度郁闷中
现提供操作步骤请前辈指点
我做的是细胞蛋白的 HDAC4 VBGFR-1提取测定根据平皿中细胞数量的多少确定裂解液的量用的是申能博彩的未加干预的是70微升裂解液加了干预的考虑到不少细胞凋亡减少了裂解液的量
BCA法测蛋白收集蛋白时测的浓度是5点多 1点多微克每微升后放在-80的冰箱里后来测定浓度都竟然升高一师兄建议用裂解液稀释一下后测得的浓度在5左右最大的10点多
蛋白质量是90微克（是不是质量太大了）
下层胶我用的是8%的上层胶是5%的
跑电泳是120V 110MIN
转膜是NC膜转膜液的配置 10×trans biffer Tris 58g Gly 29g SDS3.7g 双蒸水定容至1000ml 用时用10×母液80ml+甲醇160ml+双蒸水560ml 定容至800ml
转膜是120V 120MIN（蛋白分子量分别是180KD 140kd）冰盒降温
5%牛奶封闭摇床1小时一抗（1：500 abcom）4度过夜
第二天 TBST 10MIN×3次洗
二抗（中杉 1：8000）孵育1小时后 TBST 10MIN×3次洗
发光液是HYGLO的曝光是在电脑控制曝光的
结果是白板
去哦那个前辈指点哪个需要改正
急盼

作者: 831226 时间: 2013-1-31 15:33

前辈您好
我这几天跑的条带无一例外是白板处于深度郁闷中
现提供操作步骤请前辈指点
我做的是细胞蛋白的 HDAC4 VBGFR-1提取测定根据平皿中细胞数量的多少确定裂解液的量用的是申能博彩的未加干预的是70微升裂解液加了干预的考虑到不少细胞凋亡减少了裂解液的量
BCA法测蛋白收集蛋白时测的浓度是5点多 1点多微克每微升后放在-80的冰箱里后来测定浓度都竟然升高一师兄建议用裂解液稀释一下后测得的浓度在5左右最大的10点多
蛋白质量是90微克（是不是质量太大了）
下层胶我用的是8%的上层胶是5%的
跑电泳是120V 110MIN
转膜是NC膜转膜液的配置 10×trans biffer Tris 58g Gly 29g SDS3.7g 双蒸水定容至1000ml 用时用10×母液80ml+甲醇160ml+双蒸水560ml 定容至800ml
转膜是120V 120MIN（蛋白分子量分别是180KD 140kd）冰盒降温
5%牛奶封闭摇床1小时一抗（1：500 abcom）4度过夜
第二天 TBST 10MIN×3次洗
二抗（中杉 1：8000）孵育1小时后 TBST 10MIN×3次洗
发光液是HYGLO的曝光是在电脑控制曝光的
结果是白板
去哦那个前辈指点哪个需要改正
急盼

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上样量多少ug？
我觉得可能是你的蛋白没有提取出来
另外二抗你检测过吗？是什么标记的？
二抗浓度有可能太稀了
目的蛋白定位在那？
做过内参吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:33

我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

作者: 101010 时间: 2013-1-31 15:34

请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-1-31 15:34

我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

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化学发光需要不同的二抗
另外需要暗室，胶片、压片盒等
如果没有暗室有仪器可以选择

作者: xueyouzhang 时间: 2013-1-31 15:35

请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

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建议加入buffer后就变性
变性后分装保存，可以分装成40多ul，上样时冻融一、两次对大部分蛋白没有影响
最好能分装成25ul左右，每次用一管
前期麻烦后期会省事
变性过的上样时我是不煮的
变性与降解不是一会是，变性后反复冻融会引起样品的降解

作者: 2541 时间: 2013-1-31 15:37

我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

作者: vvmmoy 时间: 2013-1-31 15:37

请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

作者: 831226 时间: 2013-1-31 15:38

,我想请教一下,与DBA显色相比,化学发光法还需要什么仪器.是不是买了试剂盒就可以了,请尽可能详细一点,我是新手,谢谢

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化学发光需要不同的二抗
另外需要暗室，胶片、压片盒等
如果没有暗室有仪器可以选择

作者: 831226 时间: 2013-1-31 15:38

请教楼主：
问一个比较白痴的问题：我把蛋白样品160微升和40微升5X LOADING BUFFER混在一起之后。能反复冻融几次我每次上样20微升？我每次解冻之后都拿到沸水里面煮5MIN，这样的可取吗？还有就是既然蛋白都已经变性过了，我们实验室的都是在上样之前又要重新煮一次？还有蛋白变性之后反复冻融为什么目的条带也有可能出不来？

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建议加入buffer后就变性
变性后分装保存，可以分装成40多ul，上样时冻融一、两次对大部分蛋白没有影响
最好能分装成25ul左右，每次用一管
前期麻烦后期会省事
变性过的上样时我是不煮的
变性与降解不是一会是，变性后反复冻融会引起样品的降解

作者: S6044 时间: 2013-1-31 15:39

建议加入buffer后就变性
变性后分装保存，可以分装成40多ul，上样时冻融一、两次对大部分蛋白没有影响
最好能分装成25ul左右，每次用一管
前期麻烦后期会省事
变性过的上样时我是不煮的
变性与降解不是一会是，变性后反复冻融会引起样品的降解

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谢谢版主！还有一个问题刚看了一些文章。说如果用tank的话用恒压比较好？我的目的蛋白是17KD。请问用tank湿转，转膜条件分别是什么？还有就是一抗如何回收利用？用脱脂奶粉稀释的一抗回收后放4°还是-20°？有公司的一抗稀释液说的可以放4°保存。

作者: S6044 时间: 2013-1-31 15:39

转膜条件我指的是恒流和恒压两种

作者: standbyme 时间: 2013-1-31 15:40

请教，我按如上方法摸二抗稀释度，但是什么都没曝光出来。胶片，显影液和定影液都没问题。我用乙肝三系检测试剂盒里的酶标抗体（也是HRP标记的抗体）和底物A，底物B分别检测发光试剂和二抗也都没问题（均为50ul体系）。是不是说明在NC膜上的抗体量太少才没能曝光出来？

加AB液中加了双氧水？
把双氧水去了试试

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我用的发光试剂说明书上说要加双氧水的。

[ 本帖最后由 standbyme 于 2013-1-31 15:42 编辑 ]

作者: standbyme 时间: 2013-1-31 15:42

还没说完一不小心就发出去了。

我后来加大了二抗上样量，用15ul二抗进行点样了（每次2.5ul，等干了之后在同样的位置再点），能够曝光出来，如图。1：4000，1：8000 的都没曝出来。那我以后实验是不是用1：2000就可以了？

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:43

谢谢版主！还有一个问题刚看了一些文章。说如果用tank的话用恒压比较好？我的目的蛋白是17KD。请问用tank湿转，转膜条件分别是什么？还有就是一抗如何回收利用？用脱脂奶粉稀释的一抗回收后放4°还是-20°？有公司的一抗稀释液说的可以放4°保存。

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t你有没有看人家说分子量多大啊？
恒压与恒流我觉得是个人习惯
我就一直用恒流
17K的你用tank transfer？不怕转过了？
一抗回收后短时间内重复用放4度就可以

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:44

转膜条件我指的是恒流和恒压两种

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我用恒流

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:44

我用的发光试剂说明书上说要加双氧水的。

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那你可以换其他厂家的发光液了

作者: wmp1234 时间: 2013-1-31 15:45

还没说完一不小心就发出去了。

我后来加大了二抗上样量，用15ul二抗进行点样了（每次2.5ul，等干了之后在同样的位置再点），能够曝光出来，如图。1：4000，1：8000 的都没曝出来。那我以后实验是不是用1：2000就可以了？

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你进行点样的话用了15ul？
1ul就可以了
可以选择1：2000
但是1：4000怎么会一点东西都没有呢？

作者: bamboo16 时间: 2013-1-31 15:49

我用恒流

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我们实验室只有BIO-RAD的TANK湿转系统。依您的经验，17KD转膜用恒流电流和时间如何设置？

作者: 831226 时间: 2013-1-31 15:51

你进行点样的话用了15ul？
1ul就可以了
可以选择1：2000
但是1：4000怎么会一点东西都没有呢？

==============================================================================================================

可是我用1ul试过，连1：1000的点都没曝光出来，在确定试剂都没问题的情况下，当时我是怀疑1ul的抗体上样量太少造成的，所以我采用15ul试了下。你只要用1ul就可以了？那是不是说明我的二抗活性不好啊？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:00

我们实验室只有BIO-RAD的TANK湿转系统。依您的经验，17KD转膜用恒流电流和时间如何设置？

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0.22um膜
恒流 300mA，20min

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:02

可是我用1ul试过，连1：1000的点都没曝光出来，在确定试剂都没问题的情况下，当时我是怀疑1ul的抗体上样量太少造成的，所以我采用15ul试了下。你只要用1ul就可以了？那是不是说明我的二抗活性不好啊？

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是的
一、可能二抗活性不好
二、ECL的敏感性低

作者: langlang 时间: 2013-1-31 16:03

,我想问一下,如果一抗用的是rabbit抗人的.但是内参beta-actine用的是mouse抗人的,这样对实验有什么影响.是不是内参和一抗的来源一定要相同.谢谢,,

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:03

你好,我想问一下,如果一抗用的是rabbit抗人的.但是内参beta-actine用的是mouse抗人的,这样对实验有什么影响.是不是内参和一抗的来源一定要相同.谢谢,,

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不用
选择不同的二抗就行
rabbit的选择抗rabbit的二抗
mouse的选择抗mouse的二抗
good luck

作者: remenb 时间: 2013-1-31 16:07

请问一下，我要检测10个样品，是应该一张膜上检测呢，还是分两次做呢？谢谢啊

作者: duoduo 时间: 2013-1-31 16:24

相关疾病：
肺癌
用BCA法测了样本的蛋白浓度，感觉好像不可信。帮我看看哪个条带的上样量比较合适。

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:25

请问一下，我要检测10个样品，是应该一张膜上检测呢，还是分两次做呢？谢谢啊

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这要看你的胶有多少个孔了
如果是12孔的话当然可以在一张膜上检测

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:25

用BCA法测了样本的蛋白浓度，感觉好像不可信。帮我看看哪个条带的上样量比较合适。

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各种蛋白浓度测定方法都有很多影响因素
电泳结果最能说明问题
不同物种之间，不同的细胞都不一样
我觉得你的这个电泳很漂亮，蛋白浓度稍微低了一些，但是已经很好了。
看你的目的分子量附近条带情况如何来确定你的上样量
如果WB想做漂亮（漂亮指内参一致的话至少要做2个月吧，按照我目前的水平）

作者: qumm1985 时间: 2013-1-31 16:25

我们这梳子都是10个孔的啊，还有12个孔的梳子吗，呵呵

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:26

我们这梳子都是10个孔的啊，还有12个孔的梳子吗，呵呵

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呵呵
有
还有25孔，30孔的
胶大小不一样
10孔的梳子你可以先摸好条件，然后10个样品一起做（但是有边缘效应，且没有Marker了）

作者: windy+++ 时间: 2013-1-31 16:26

10个样品一起做，没有marker不行啊，我们这是bio-rad的板，好像只有10个和15孔的，没有12孔的啊

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:32

10个样品一起做，没有marker不行啊，我们这是bio-rad的板，好像只有10个和15孔的，没有12孔的啊

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15孔的也行啊
不过15孔的上样量要小一些
如果蛋白丰度还可以的话就能用15孔的
good luck

作者: 98776langtao 时间: 2013-1-31 16:32

上样量多少ug？
我觉得可能是你的蛋白没有提取出来
另外二抗你检测过吗？是什么标记的？
二抗浓度有可能太稀了
目的蛋白定位在那？
做过内参吗？

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前辈好
我的抗体是兔多抗的
二抗是羊抗兔的
目的蛋白分别在胞膜胞浆及胞核
内参有还特浅淡
上样量是90微克

作者: orangecake 时间: 2013-1-31 16:33

相关疾病：
大动脉炎

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110的蛋白你可以选择用8%的胶
转膜用的是半干还是湿转？
半干 1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转移 1h30min
湿转：300mA 恒流，转移1h30min
good luck

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老师您好，还是没有把STAT2做出来，好像没有8%的胶，只有10%和5%，博士德的胶说明书上没有8%，条件基本按照您的来的，请老师帮帮忙,分离胶必须要用8%的么？抗体浓度需要调整么？一抗STAT2 1:100,二抗羊抗兔1：3000.另外我是养的HEPG2细胞用干扰素刺激后收集的，再用来做WESTERN

作者: 33号 时间: 2013-1-31 16:34

相关疾病：
阳萎

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目的蛋白：110KD 8%分离胶，5%浓缩胶
分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml10% SDS 0.08ml 10% APS 0.08ML TEMED 0.005ml 用的是碧云天的SDS-PAGE凝胶试剂盒，电泳60V，分离胶120V，转膜（湿转）300mA 2h，跑的胶如图，PVDF膜连actin都出不来，同一批样品分装的，我同学帮我带样跑的时候就能够出来（样品应该没问题）。很迷茫，多谢楼主能指导……

作者: am10 时间: 2013-1-31 16:34

相关疾病：
胃癌心肌梗死
NBA老师，您好，看了您的帖子真是受益匪浅。今天是我第一次做WB
条件是：六一的仪器，胶厚度1mm 上样蛋白50ug
4%分离胶 100V
10%浓缩胶 120V
0.22um孔径NC膜
一抗是博士德的1：400稀释 4度过夜
AP-NBT/BICP显色法
转膜条件是:冰水浴，湿转 β-actin 300mA 1h 结果还行，条带挺清晰
目的蛋白是胃癌SGC7901细胞中的VEGF 300mA 40min 五个样只能隐隐约约看见2个条带，很浅，几乎看不见
请老师给点修改意见，呵呵，先谢谢您了!

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:37

前辈好
我的抗体是兔多抗的
二抗是羊抗兔的
目的蛋白分别在胞膜胞浆及胞核
内参有还特浅淡
上样量是90微克

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你染过SDS-PAGE胶没？
正常情况下20ug 内参就应该很亮了
一抗与二抗的选择是对的

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:37

老师您好，还是没有把STAT2做出来，好像没有8%的胶，只有10%和5%，博士德的胶说明书上没有8%，条件基本按照您的来的，请老师帮帮忙,分离胶必须要用8%的么？抗体浓度需要调整么？一抗STAT2 1:100,二抗羊抗兔1：3000.另外我是养的HEPG2细胞用干扰素刺激后收集的，再用来做WESTERN

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8%的胶怎么配制你可以自己算啊
另外用10%的胶也没有大问题
电泳多跑一会
你用的是那家的抗体？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:38

请教楼主：
目的蛋白：110KD 8%分离胶，5%浓缩胶
分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml10% SDS 0.08ml 10% APS 0.08ML TEMED 0.005ml 用的是碧云天的SDS-PAGE凝胶试剂盒，电泳60V，分离胶120V，转膜（湿转）300mA 2h，跑的胶如图，PVDF膜连actin都出不来，同一批样品分装的，我同学帮我带样跑的时候就能够出来（样品应该没问题）。很迷茫，多谢楼主能指导……

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样品电泳这样还是有点问题的
具体问题你问问你同学啊
他不是能做出来吗
看看你的条件与他有什么不同的地方

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:38

您好，看了您的帖子真是受益匪浅。今天是我第一次做WB
条件是：六一的仪器，胶厚度1mm 上样蛋白50ug
4%分离胶 100V
10%浓缩胶 120V
0.22um孔径NC膜
一抗是博士德的1：400稀释 4度过夜
AP-NBT/BICP显色法
转膜条件是:冰水浴，湿转 β-actin 300mA 1h 结果还行，条带挺清晰
目的蛋白是胃癌SGC7901细胞中的VEGF 300mA 40min 五个样只能隐隐约约看见2个条带，很浅，几乎看不见
请老师给点修改意见，呵呵，先谢谢您了!

0.22um孔径

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目的蛋白分子量多少？
呵呵
VEGF不好做
它是一种分泌到细胞外的蛋白吧
你看见的隐约2个条带也不一定是阳性条带

作者: 3N4G 时间: 2013-1-31 16:47

培养细胞裂解后收集的蛋白做Westen-blot检测蛋白的表达量，具体操作步骤与组织蛋白提取后做westen-blot有没有大的区别

作者: memory 时间: 2013-1-31 16:47

你染过SDS-PAGE胶没？
正常情况下20ug 内参就应该很亮了
一抗与二抗的选择是对的

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前辈我今天又显影发现我用别人的内参及二抗与目的蛋白同时显影内参显得非常好但是我的目的蛋白依旧很浅我怀疑是我二抗的问题前辈可同意？

作者: wu11998866 时间: 2013-1-31 16:48

样品电泳这样还是有点问题的
具体问题你问问你同学啊
他不是能做出来吗
看看你的条件与他有什么不同的地方

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老师，谢谢你的回复，不过他做的时候根本没有染胶。
我怀疑3个原因：1：蛋白质降解 2：加样量太大 3：蛋白可能变性时间不够
请问老师，你遇到过这种情况没？电泳的时候拖着长长的尾巴，盼望老师指点！

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:49

培养细胞裂解后收集的蛋白做Westen-blot检测蛋白的表达量，具体操作步骤与组织蛋白提取后做westen-blot有没有大的区别

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呵呵
基本上没有区别

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:50

前辈我今天又显影发现我用别人的内参及二抗与目的蛋白同时显影内参显得非常好但是我的目的蛋白依旧很浅我怀疑是我二抗的问题前辈可同意？

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延长目的蛋白一抗的孵育时间
在4度
另外内参用的二抗与目的蛋白的二抗是一样的吗？
两种一抗来源相同？

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:51

老师，谢谢你的回复，不过他做的时候根本没有染胶。
我怀疑3个原因：1：蛋白质降解 2：加样量太大 3：蛋白可能变性时间不够
请问老师，你遇到过这种情况没？电泳的时候拖着长长的尾巴，盼望老师指点！

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没有
反复冻融及蛋白提取的时候没有严格在冰上进行、没有加蛋白酶抑制剂很容易使蛋白降解
从你的图片来看上样量应该不是很大
延长一下分离胶凝胶时间
离心不彻底，电泳时带入了沉淀

作者: 131415 时间: 2013-1-31 16:51

我用WB做GPCRs的MAPK信号，发现细胞裂解后呈粘稠状，可能是基因组DNA和胞内蛋白的混合物。

我用的HEK293细胞，药物刺激前，用无血清培养液饥饿细胞20h，然后再用药物刺激，用强裂解液裂解细胞。

发现细胞裂解液呈粘稠状，用枪依吸就是一坨，加热变形后还是如此，大大影响我加样时的精确度。

希望得到各位的帮助，谢谢。

作者: 8princess8 时间: 2013-1-31 16:52

有个问题我可能没表述清楚，在提取PBMC时会有红细胞，我的意思是用红细胞裂解液裂解红细胞，红细胞裂解液对我提取蛋白会不会有影响，或者红细胞裂解液处理PBMC后会不会对WB试验结果有影响？

而提蛋白的裂解液我是直接定购的，您的意思是说这个我订购裂解液还要看能不能提取我要的蛋白出来？我以前还没注意到这个问题。提蛋白都是用得一种裂解液。

祝老师工作顺利，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-1-31 16:53

相关疾病：
糖尿病肾病

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我用WB做GPCRs的MAPK信号，发现细胞裂解后呈粘稠状，可能是基因组DNA和胞内蛋白的混合物。

我用的HEK293细胞，药物刺激前，用无血清培养液饥饿细胞20h，然后再用药物刺激，用强裂解液裂解细胞。

发现细胞裂解液呈粘稠状，用枪依吸就是一坨，加热变形后还是如此，大大影响我加样时的精确度。

希望得到各位的帮助，谢谢。

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是DNA等物质
加入少量的 DNase会好些（or采用超声处理一下）
经过这个处理就会好了

作者: NBA 时间: 2013-1-31 17:51

有个问题我可能没表述清楚，在提取PBMC时会有红细胞，我的意思是用红细胞裂解液裂解红细胞，红细胞裂解液对我提取蛋白会不会有影响，或者红细胞裂解液处理PBMC后会不会对WB试验结果有影响？

而提蛋白的裂解液我是直接定购的，您的意思是说这个我订购裂解液还要看能不能提取我要的蛋白出来？我以前还没注意到这个问题。提蛋白都是用得一种裂解液。

祝老师工作顺利，谢谢

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我还是每太看懂
裂解液是要有所变化的
不同的目的蛋白不能采用同一种裂解液

作者: 33号 时间: 2013-2-1 13:14

相关疾病：
骨关节炎大动脉炎

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我还是每太看懂
裂解液是要有所变化的
不同的目的蛋白不能采用同一种裂解液

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我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞裂解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

我用的提蛋白的裂解液是自己订购的。一般都是用它。直接加48UL此种裂解液+12UL DTT+60UL的2X LOADING BUFFER，总体积120UL，再2UL样本+18UL水+1ML的考嘛斯亮蓝去测浓度。用这种裂解液提蛋白，STAT1做出来了，STAT2没做出来，我觉得您说的是对的，也许就是理解液的原因导致实验失败、

谢谢老师

作者: NBA 时间: 2013-2-1 13:15

我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞理解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

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哦
懂了
你裂解的时候肯定会有影响
这个过程应该控制在PBMC细胞的收集上
在裂解的时候是控制不了的

作者: 33号 时间: 2013-2-2 09:16

我的意思是说提PBMC时 PBMC和红细胞在一起，需要用红细胞裂解液裂红的。我担心红细胞裂解液在裂红的同时会对PBMC有影响，进而影响下一步我从PBMC提蛋白来做WESTERN

我用的提蛋白的裂解液是自己订购的。一般都是用它。直接加48UL此种裂解液+12UL DTT+60UL的2X LOADING BUFFER，总体积120UL，再2UL样本+18UL水+1ML的考嘛斯亮蓝去测浓度。用这种裂解液提蛋白，STAT1做出来了，STAT2没做出来，我觉得您说的是对的，也许就是理解液的原因导致实验失败、

谢谢老师

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这也是俺的问题所在，从病人的抗凝血提取PBMC，总是有红细胞，不得不采用裂红啊。很郁闷。听别人说一般分PBMC都会红细胞有，只是多少问题。我也不想用红细胞理解液，呵呵

作者: 33号 时间: 2013-2-2 09:18

这也是俺的问题所在，从病人的抗凝血提取PBMC，总是有红细胞，不得不采用裂红啊。很郁闷。听别人说一般分PBMC都会红细胞有，只是多少问题。我也不想用红细胞理解液，呵呵

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还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择方面的资料么？

作者: NBA 时间: 2013-2-2 09:19

还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择方面的资料么？

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不同类型：有细胞、组织、细菌、酵母等
蛋白不同定位：胞膜蛋白、胞浆、胞核、线粒体等

作者: NBA 时间: 2013-2-2 09:40

还有个问题针对不同蛋白选用不同裂解液，有裂解液选择方面的资料么？

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具体资料上网搜索
也可以问问我
大部分我还是比较了解
且实用过的

作者: dog002 时间: 2013-2-2 09:41

相关疾病：
阳萎
老师，我还想打扰一下，我的这个胶的配方没问题吧，ACR/BIS和tris-hcl的比例对吗？你能简单帮我看看吗？谢谢。8%的胶，分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml 10% SDS 0.08ml 10% APS 0.08ML TEMED 0.005ml

作者: NBA 时间: 2013-2-2 09:42

QUOTE:

原帖由 dog002 于 2013-2-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
阳萎
老师，我还想打扰一下，我的这个胶的配方没问题吧，ACR/BIS和tris-hcl的比例对吗？你能简单帮我看看吗？谢谢。8%的胶，分离胶配方(8ml)：H2O 2.635ml 30% ACR-BIS 2.16ml 1M Tris-hcl(PH 8.8) 3.04ml 10% SDS 0.08 ...

没问题

作者: ROSE李 时间: 2013-2-2 09:42

我做的是膜蛋白，现在我ECL做不出来，但是DAB可以，
1.二抗洗完膜后配制ECL发光液，在暗室没有荧光出现或有一些背景光，但是没有看到条带出现。
2.回到实验室重新洗膜，再加二抗，孵育1个小时（同前），用DAB 显色，不到5秒立刻出现明显的条带。
3.开始怀疑是ECL失效。取适量的AB液混匀，加一微升二抗，在暗室立刻可以看见的荧光，发光液变成棕黄色
4.开始也怀疑蛋白表达量很低，所以现在逐渐加到150微克，可是现在也没有看到荧光或者有微弱的背景光。
5.一抗是1:100或者1：200（推荐1：100-1：400），二抗1：2500（推荐1：2500-1：6000）稀释

作者: NBA 时间: 2013-2-2 09:43

QUOTE:

原帖由 ROSE李 于 2013-2-2 09:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是膜蛋白，现在我ECL做不出来，但是DAB可以，
1.二抗洗完膜后配制ECL发光液，在暗室没有荧光出现或有一些背景光，但是没有看到条带出现。
2.回到实验室重新洗膜，再加二抗，孵育1个小时（同前），用DAB 显色，不到5秒立刻出现明显的 ...

用ECL的时候把二抗调整至1：5000你再试试

作者: tuuu2 时间: 2013-2-2 09:49

相关疾病：
心肌梗死

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目的蛋白分子量多少？
呵呵
VEGF不好做
它是一种分泌到细胞外的蛋白吧
你看见的隐约2个条带也不一定是阳性条带

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您好 VEGF的分子量是29KD 在胞浆中表达我上次看见的那两个隐约的条带是在26KD和35KD之间所以我觉得可能是目的蛋白我也不确定我的条件是湿转300mA 40min 呵呵想问问前辈做29KD左右分子量的蛋白湿转用什么条件我想用您的经验条件再试试谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-2 11:05

相关疾病：
心肌梗死

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您好 VEGF的分子量是29KD 在胞浆中表达我上次看见的那两个隐约的条带是在26KD和35KD之间所以我觉得可能是目的蛋白我也不确定我的条件是湿转300mA 40min 呵呵想问问前辈做29KD左右分子量的蛋白湿转用什么条件我想用您的经验条件再试试谢谢

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300mA 30min
注意降温
祝你好运

作者: 33号 时间: 2013-2-2 11:17

相关疾病：
骨关节炎

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不同类型：有细胞、组织、细菌、酵母等
蛋白不同定位：胞膜蛋白、胞浆、胞核、线粒体等

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我是直接购买的蛋白裂解液，不是自己配的，请问下一般买的蛋白裂解液包含括蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂么？其实我处理细胞就是裂解液+DTT+LOADING BUFFER

明天准备继续做，采用您的常温下牛奶封闭半小时的策略！

作者: NBA 时间: 2013-2-2 11:18

我是直接购买的蛋白裂解液，不是自己配的，请问下一般买的蛋白裂解液包含括蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂么？其实我处理细胞就是裂解液+DTT+LOADING BUFFER

明天准备继续做，采用您的常温下牛奶封闭半小时的策略！

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做磷酸化的蛋白需要加：蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂
普通蛋白需要加：蛋白酶抑制剂
蛋白裂解液里是不包括这些抑制剂的
需要自己另行购买

作者: windy+++ 时间: 2013-2-2 11:20

求助120KD分子的转膜条件，我用的是BIO-RAD的半干转膜仪，做过的条件是15V、2h,结果不理想，请问一下高手这个条件可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-2 14:30

QUOTE:

原帖由 windy+++ 于 2013-2-2 11:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

求助120KD分子的转膜条件，我用的是BIO-RAD的半干转膜仪，做过的条件是15V、2h,结果不理想，请问一下高手这个条件可以吗？

300mA 2h
转膜过程中注意降温
good luck

作者: eric930 时间: 2013-2-2 14:33

请问抗体洗脱液的配方?我今天显影没显出,后用丽春红染色膜上有蛋白,有人说用抗体洗脱液洗脱然后从头加一抗,请问是这样的吗?洗脱液洗脱时间是多少?谢谢

作者: eric930 时间: 2013-2-2 14:34

请问38KD和185kd蛋白的转膜条件，我用的是湿转，恒流，400mA,需要多长时间？谢谢

作者: 33号 时间: 2013-2-2 14:35

做磷酸化的蛋白需要加：蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂
普通蛋白需要加：蛋白酶抑制剂
蛋白裂解液里是不包括这些抑制剂的
需要自己另行购买

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谢谢老师的回复。
今天又查了些资料，有个说道分离胶和浓缩胶高度问题，也可能会导致你需要的大分子蛋白跑不出来，也就是说分离胶矮了不行。老师一般做的时候浓缩胶分离胶高度是个什么比例呢？

作者: eric930 时间: 2013-2-2 14:35

感谢你的耐心回复

蛋白条带考染有清楚条带，不知道为什么爆光后的目的条带有三条，请问这是出现了什么问题？对你的回复不胜感激！

作者: sunnyB 时间: 2013-2-2 14:36

请教老师！我的目的蛋白18KD，二聚体30KD，跑了很多次都没有目的条带，10分钟时没有条带，30分钟以上则像考染一样都是杂带，内参压出来还可以。
条件：
分离胶12％，上样量40ug，1.5mm厚胶，100V电泳90分钟，250mA湿转2小时，考染见清楚条带，转膜后胶考染未见条带，未作丽春红染色。一抗，SANTA，1：200，二抗：1：5000。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗室温2小时，TBST洗2分钟，10分钟，10分钟，5分钟，5分钟，5分钟，二抗1小时，洗膜同上。ECL反应3分钟。

作者: sunnyB 时间: 2013-2-2 14:37

补充一下：0.22和0.45的PVDF膜都试过。

作者: ROSE李 时间: 2013-2-2 14:39

请问楼上这样洗膜的原理是什么呢？我没有做过那么小蛋白，不知这个和蛋白大小有关还是实验室习惯？

作者: ROSE李 时间: 2013-2-2 15:50

想向楼主请教如何简单快捷的得知蛋白是否降解？如果同时用丽染膜和考染胶没有目的蛋白所在位置的蛋白，是否可以结论降解了呢？有什么办法分辨是抗体不灵还是蛋白降解呢？非常感谢！

作者: guagua 时间: 2013-2-2 15:50

楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢

作者: kuohao17 时间: 2013-2-5 10:27

300mA 2h
转膜过程中注意降温
good luck

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请问老师，湿转是这个条件，那半干转呢？

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:28

相关疾病：
心肌梗死

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请问抗体洗脱液的配方?我今天显影没显出,后用丽春红染色膜上有蛋白,有人说用抗体洗脱液洗脱然后从头加一抗,请问是这样的吗?洗脱液洗脱时间是多少?谢谢

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非常不好意思
配方是公司的秘密
我也没办法告诉你
可以告诉你一点的就是这个产品很好用
如果你有兴趣我可以告诉是哪个公司的产品
用短消息吧

stripping的时间由产品来决定
一般是37度 30min或者室温 1h以内
good luck

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:28

请问38KD和185kd蛋白的转膜条件，我用的是湿转，恒流，400mA,需要多长时间？谢谢

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建议用300mA，电流太大温度会很高
300mA 38K 40min
300mA 185K 2h
转膜过程中一定要降温
good luck

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:29

谢谢老师的回复。
今天又查了些资料，有个说道分离胶和浓缩胶高度问题，也可能会导致你需要的大分子蛋白跑不出来，也就是说分离胶矮了不行。老师一般做的时候浓缩胶分离胶高度是个什么比例呢？

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呵呵，是的
我常用有两种电泳槽
分子量大于150K的话我用高的分离胶，10cm左右
小于150K的用mini胶就可以

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:29

蛋白条带考染有清楚条带，不知道为什么爆光后的目的条带有三条，请问这是出现了什么问题？对你的回复不胜感激！

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首先调整一抗的浓度，2倍稀释再试试

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:29

请教老师！我的目的蛋白18KD，二聚体30KD，跑了很多次都没有目的条带，10分钟时没有条带，30分钟以上则像考染一样都是杂带，内参压出来还可以。
条件：
分离胶12％，上样量40ug，1.5mm厚胶，100V电泳90分钟，250mA湿转2小时，考染见清楚条带，转膜后胶考染未见条带，未作丽春红染色。一抗，SANTA，1：200，二抗：1：5000。5％脱脂奶粉封闭1小时，一抗室温2小时，TBST洗2分钟，10分钟，10分钟，5分钟，5分钟，5分钟，二抗1小时，洗膜同上。ECL反应3分钟。

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用15%分离胶
转膜1h

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:30

补充一下：0.22和0.45的PVDF膜都试过。

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要用0.22um的膜
0.22um膜有个缺点就是背景会比0.45um的要高

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:30

想向楼主请教如何简单快捷的得知蛋白是否降解？如果同时用丽染膜和考染胶没有目的蛋白所在位置的蛋白，是否可以结论降解了呢？有什么办法分辨是抗体不灵还是蛋白降解呢？非常感谢！

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我做过AMPK的蛋白
第一次做条带单一，非常好
-20度冻存的样品冻融了两次做WB AMPK就成两条带了
这是一个最简单的实例了
没有具体的检测方法
如果是纯化的蛋白可以通过电泳来比较有没有降解
一般的样品用考染可以看出来有没有降解
但不是很精确的

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:31

相关疾病：
心肌梗死

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楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢

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1，甲醛？是甲醇吧？
2，63K用 300mA 恒流（半干） 1h20min
1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:31

楼主，你好。我是新手，刚做了几次WB。有几个问题希望解答：
1.湿转过程中电转液的甲醛有什么作用？可不可以用SDS替代？
2.我的目的蛋白是63KD，等电点为8.8，请问用什么电转条件（电流，时间）比较合适？
3.电转条件包括电转成分与蛋白的等电点有无关系？
期待您的解答，谢谢

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我没有看到过电转语蛋白等电点的资料
不好意思

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 10:31

请问老师，湿转是这个条件，那半干转呢？

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分子量大的半干转肯定不行
不建议采用
大于150K的蛋白我不会用半干转

作者: fei1226com 时间: 2013-2-5 10:32

相关疾病：
心肌梗死
1，不好意思，写错了，是甲醇，请问它的作用什么？解离与蛋白结合的SDS吗？可是我看有的资料显示有些电转液中还同时加有SDS和甲醇？
2，“1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min” 指的是湿转电泳条件吗？
3，我用的是PVDF膜，用之前没有用甲醇浸泡，而是直接用电转液浸泡15min，有影响吗？是不是甲醇浸泡效果更好些？
4，我的实验目的是想从植物总蛋白中杂出我的目的蛋白。想请教下，有无办法可以知道自己目的蛋白表达量究竟有多高？（该基因RNA表达水平是比较高的，可是每次都杂不到带，怀疑是不是蛋白表达水平较低）
谢谢解答。

作者: kuohao17 时间: 2013-2-5 10:32

1，不好意思，写错了，是甲醇，请问它的作用什么？解离与蛋白结合的SDS吗？可是我看有的资料显示有些电转液中还同时加有SDS和甲醇？
2，“1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min” 指的是湿转电泳条件吗？
3，我用的是PVDF膜，用之前没有用甲醇浸泡，而是直接用电转液浸泡15min，有影响吗？是不是甲醇浸泡效果更好些？
4，我的实验目的是想从植物总蛋白中杂出我的目的蛋白。想请教下，有无办法可以知道自己目的蛋白表达量究竟有多高？（该基因RNA表达水平是比较高的，可是每次都杂不到带，怀疑是不是蛋白表达水平较低）
谢谢解答。

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1，甲醇起固定作用
2，SDS促进大分子蛋白转移
3，“1.2mA每平方厘米膜面积 1h30min” 指的是半干转电泳条件
4，PVDF用之前必须用无水甲醇活化，不可以直接用电转液浸泡
5，那你就要查你专业的相关文献了，看蛋白表达量的情况

作者: lgm 时间: 2013-2-5 10:32

94kD大小的分子，根据版主的建议改用10%的胶。
用GAPDH做内参，结果很满意。
但是，目标分子却看不见，胶片荧光显色后---全是荧光，或者什么都看不见
santa 的二抗，说明1：2000———1：5000，我现在用的是1：4000
请教，这是什么原因？能否将二抗再稀释，如1：8000---1：10000？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:33

QUOTE:

原帖由 lgm 于 2013-2-5 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

94kD大小的分子，根据版主的建议改用10%的胶。
用GAPDH做内参，结果很满意。
但是，目标分子却看不见，胶片荧光显色后---全是荧光，或者什么都看不见
santa 的二抗，说明1：2000———1：5000，我现在用的是1：4000
请教，这是什么原因？能 ...

目的蛋白有条带吗？
对的
全是荧光的话要稀释至1：8000到1：10000
如果在全是荧光的情况下没有条带显示说明上样量不够大或者是一抗浓度不合适

作者: vcve 时间: 2013-2-5 10:33

呵呵，是的
我常用有两种电泳槽
分子量大于150K的话我用高的分离胶，10cm左右
小于150K的用mini胶就可以

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谢谢老师，麻烦老师短信告知抗体洗脱液的公司，我可能会需要，谢谢

作者: abc816 时间: 2013-2-5 10:34

00mA 30min
注意降温
祝你好运

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我今天又做了一次可是29kd的vegf和42kd的内参都没出结过上次内参有结果还不错这次湿转条件一样却没结果想问问老师您说膜的面积对结果影响大么

作者: abc816 时间: 2013-2-5 10:35

今天还做了一个72kd的cox-2 湿转300mA 1h20min 也没条带哎好郁闷啊该怎么办啊 555！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:36

您好我今天又做了一次可是29kd的vegf和42kd的内参都没出结过上次内参有结果还不错这次湿转条件一样却没结果想问问老师您说膜的面积对结果影响大么

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立春红染色有条带吗？
内参都没有结果不应该啊
那就是一抗上有问题了
不清楚你具体的条件是什么
整个系统你都应该好好斟酌

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:36

今天还做了一个72kd的cox-2 湿转300mA 1h20min 也没条带哎好郁闷啊该怎么办啊 555！

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同上

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 10:36

图A是当初摸蛋白浓度，图B是2个标本，上样量同图A第2和第3泳道。
伯乐半干转90mA，45min；封闭2h，一抗（beta-Tubulin，分子量50左右，1：10000）和二抗（1：2000）孵育100min，曝光什么都没曝出来。已确定二抗及曝光没问题。
请问：
1.电泳上样量够吗，分子量50左右的条带好像还不是很明显，可是上面拖尾都已经很厉害了，还需要增加上样量吗？
2.Mark上了7ul，可是胶上仍然很淡，转到膜上后就只能看到一个2kD的条带，根本没法根据Mark来剪切膜，Mark都这样吗，还是我用的这支有问题？
3.伯乐半干转90mA，45min，转完后考染凝胶，胶上非常干净，一点条带都没有。但是膜上的条带不是很明显，是不是蛋白转过头了？
注：这张膜是曝光后，用TBS清洗，再用丽春红染色的，而不是转膜后马上用丽春红染的。

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作者: kuaizige 时间: 2013-2-5 10:39

请问：
我的目的蛋白是beta-catenin 86kDa, 内参的是lamin b1 16kDa.我用0.45 的pvdf 膜可以吗？

作者: abc816 时间: 2013-2-5 10:39

谢谢老师，麻烦老师短信告知抗体洗脱液的公司，我可能会需要，谢谢

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请问26KD蛋白和45KD的β——actin可以在同一块胶上作么？选用什么样的？10%还是15%的胶？

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-5 10:40

请教，做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:40

图A是当初摸蛋白浓度，图B是2个标本，上样量同图A第2和第3泳道。
伯乐半干转90mA，45min；封闭2h，一抗（beta-Tubulin，分子量50左右，1：10000）和二抗（1：2000）孵育100min，曝光什么都没曝出来。已确定二抗及曝光没问题。
请问：
1.电泳上样量够吗，分子量50左右的条带好像还不是很明显，可是上面拖尾都已经很厉害了，还需要增加上样量吗？
2.Mark上了7ul，可是胶上仍然很淡，转到膜上后就只能看到一个2kD的条带，根本没法根据Mark来剪切膜，Mark都这样吗，还是我用的这支有问题？
3.伯乐半干转90mA，45min，转完后考染凝胶，胶上非常干净，一点条带都没有。但是膜上的条带不是很明显，是不是蛋白转过头了？
注：这张膜是曝光后，用TBS清洗，再用丽春红染色的，而不是转膜后马上用丽春红染的。

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1，上样量采用2就可以
2，加大marker的上样量
3，呵呵，不会转过头 55K的tubulin这个条件没问题

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:44

请问：
我的目的蛋白是beta-catenin 86kDa, 内参的是lamin b1 16kDa.我用0.45 的pvdf 膜可以吗？

===================

还是用0.22um的膜吧

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:44

请问26KD蛋白和45KD的β——actin可以在同一块胶上作么？选用什么样的？10%还是15%的胶？

=========

用12%
可以

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:45

做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

=================

呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

作者: wmp1234 时间: 2013-2-5 10:45

请教，做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

=================================================

呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

试过一抗浓度调小，不过阳性对照的目的条带也变得很弱。。。

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:48

请教，做了几次WB，一抗用过单抗，1：200孵育3h，1：500过夜，也用过多抗，1：500过夜，二抗1：5000孵育2h，阴性对照的也出现条带，跟目的条带似乎一样的位置，强度也差不多，不知道原因，谢

===================================================

呵呵
很正常啊
一抗浓度调小试试

试过一抗浓度调小，不过阳性对照的目的条带也变得很弱。。。

======================

换阴性对照试试啊
你现在用的阴性对照可靠不

作者: utt0989 时间: 2013-2-5 10:49

用12%
可以

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谢谢老师，今天下午110KD蛋白的转膜让人很郁闷，参照您的300MA 2小时，结果膜花了，象树枝样的花纹布满了膜，不知道怎么回事，以前还从没碰到这种情况，估计是今天用了上次用过的转膜缓冲液造成的，缓冲液只用过一次。以前基本是新配

今天做不成了，明天准备跑2块胶一块8%一块12% 。一块跑110和90，另一块跑43和26KD的。但是有个问题，这2块胶目的条带跑胶的时间可能会有所不同，转膜时间也会不同，如果想一起做，有什么好的办法不？

还2个小问题就是转膜和电泳缓冲液反复使用问题，想听听老师的意见，一般能用几次？用后怎么保存以便下次再用？我现在一般每次都是新配！

蛋白上样量少了会不会和大分子跑不出来有关系？我一般上量30-50

如老师在，谢谢老师回复哈，准备倒胶了，如果您认为我明天跑2块胶不合适，我今天就倒一块胶，明天早上来跑

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:49

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-2-5 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
用12%
可以

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谢谢老师，今天下午110KD蛋白的转膜让人很郁闷，参照您的300MA 2小时，结果膜花了，象树 ...

1，300mA转膜，要降温！
2，缓冲液肯定不能重复使用了！
3，把胶剪好，转不同的时间
4，电泳缓冲液内槽肯定不能重复，外槽可以
5，转环是坚决不能重复使用的：甲醇蒸发；蛋白转移后有一部分会在缓冲液里
6，大分子量蛋白占总蛋白的量是比较小的，先染胶看条带。但是110K的很好做
7，可以一起跑，因为不同的胶浓度在分离时的速度基本差不多
祝你好运

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 10:51

1，300mA转膜，要降温！
2，缓冲液肯定不能重复使用了！
3，把胶剪好，转不同的时间
4，电泳缓冲液内槽肯定不能重复，外槽可以
5，转环是坚决不能重复使用的：甲醇蒸发；蛋白转移后有一部分会在缓冲液里
6，大分子量蛋白占总蛋白的量是比较小的，先染胶看条带。但是110K的很好做
7，可以一起跑，因为不同的胶浓度在分离时的速度基本差不多
祝你好运

=============================================================================================================

谢谢老师，我估计还是缓冲液的问题，我每次都降温了，用的冰，今天第一次碰到这种情况

您的意思是我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？

另外转缓每次都要用甲醇200ML，呵呵，做的多用量还是很大啊。但我还是听您的，每次转缓和电泳都新配算了

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。

今天失败的膜照片已经发至您邮箱，麻烦您有时间看看，谢谢

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 10:52

谢谢老师，我估计还是缓冲液的问题，我每次都降温了，用的冰以前还用350MA跑过的，今天第一次碰到这种情况

=============================================================================================================

您的意思是我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？

另外转缓每次都要用甲醇200ML，呵呵，做的多用量还是很大啊。但我还是听您的，每次转缓和电泳都新配算了

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。

今天失败的膜照片已经发至您邮箱，麻烦您有时间看看，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:52

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-2-5 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢老师，我估计还是缓冲液的问题，我每次都降温了，用的冰以前还用350MA跑过的，今天第一次碰到这种情况

=========================================================================================================== ...

膜是不是过期了

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 10:52

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-2-5 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

膜是不是过期了

新订的啊！

我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？？？

给点建议行吗

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:53

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-2-5 10:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

新订的啊！

我跑两块胶，电泳时间还是一样，但是转膜时，一起转，到时候先把转时间短的膜拿出来，再继续转时间长的那块膜么？？？

给点建议行吗 ...

是的
时间长的继续转
拿的时候小心
最好把分子量小的放一块上，大的放一块，这样拿的时候就不会碰到剩下还要继续转的那块了

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 10:53

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-2-5 10:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是的
时间长的继续转
拿的时候小心
最好把分子量小的放一块上，大的放一块，这样拿的时候就不会碰到剩下还要继续转的那块了

今天又郁闷了，倒胶倒了一天，什么稀奇古怪的事都碰到了。漏胶，胶不平，凝了的胶像海浪状。
海绵洗了是湿的不好用，在上面垫的塑料袋，还是漏，玻璃虽说不是很好，但不至于这么大影响啊，以前很少碰到这种情况，哎。基本功啊基本功
倒胶也成问题了。

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:54

QUOTE:

原帖由 yjf1026 于 2013-2-5 10:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

今天又郁闷了，倒胶倒了一天，什么稀奇古怪的事都碰到了。漏胶，胶不平，凝了的胶像海浪状。
海绵洗了是湿的不好用，在上面垫的塑料袋，还是漏，玻璃虽说不是很好，但不至于这么大影响啊，以前很少碰到这种情况，哎。基本功啊基本功
倒 ...

呵呵
做实验别急
想当年我配胶配了好几个月
继续努力
会越来越好

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 10:54

QUOTE:

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呵呵
做实验别急
想当年我配胶配了好几个月
继续努力
会越来越好

谢谢老师，有倒胶的经验千万和我讲讲，今天真的郁闷了。我都开始怀疑是不是配胶液的问题了，是博士德的试剂盒。以后自己配算了

作者: NBA 时间: 2013-2-5 10:54

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谢谢老师，有倒胶的经验千万和我讲讲，今天真的郁闷了。我都开始怀疑是不是配胶液的问题了，是博士德的试剂盒。以后自己配算了

漏胶要看玻璃板及胶条是不是出现问题了

作者: yjf1026 时间: 2013-2-5 11:01

QUOTE:

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漏胶要看玻璃板及胶条是不是出现问题了

谢谢老师

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。到底有区别么？那种方法好些？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:01

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原帖由 yjf1026 于 2013-2-5 11:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢老师

进口抗体已经回来了，但是说明书都说要求一抗4C 过夜，但也有人说37C一小时也行，甚至不摇，直接放在37C 温箱中，呵呵。我一般都是用BSA稀释后过夜的。到底有区别么？那种方法好些？ ...

有条件5%BSA
4度过夜

作者: utt0989 时间: 2013-2-5 11:04

相关疾病：
心肌梗死

==============

有条件5%BSA
4度过夜

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谢谢老师，我的实验方案84，91，113的蛋白跑一块胶，350MA转一个半小时，不短吧？2小时会不会更好些？

另外还有26，43的蛋白跑一块胶，350转40MIN。但是我担心26的会转过了，有必要调整不

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:04

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相关疾病：
心肌梗死

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有条件5%BSA
4度过夜

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谢谢老师，我的实验方案84，91，113的蛋白跑一块胶，350MA转一个半小 ...

84，91，113这三个分不开

26，43可以分开，不会转过

作者: utt0989 时间: 2013-2-5 11:05

QUOTE:

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84，91，113这三个分不开

26，43可以分开，不会转过

相关疾病：
大动脉炎

谢谢老师，
84，91，113这三个分不开？能解释一下么？？跑胶的时候，还是转膜？
我一块胶转了膜剪一半，一个做84 93,因为他们实际对应的是STAT1一个抗体

另一半做110的不行么

或者给个解决办法？谢谢

作者: xyw5 时间: 2013-2-5 11:05

相关疾病：
心肌梗死大动脉炎
你好，请教：做了好几次WB，每次都是内参GAPDH（37kd）无条带，目的条带（45kd）很好！条件：小鼠骨组织总蛋白，上样量60-100ug，电泳75v，30min；100v，1.5h；转膜，300mA，1h；santa cruz GAPDH一抗，1：50，1：100，1：200，二抗1：2000，1：2500，1：5000均试过，没有条带，伤脑筋，不知道什么原因？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:06

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相关疾病：
大动脉炎

谢谢老师，
84，91，113这三个分不开？能解释一下么？？跑胶的时候，还是转膜？
我一块胶转了膜剪一半，一个做84 93,因为他们实际对应的是STAT1一个抗体

另一半做110的不行么

或者给个解决办法？谢谢 ...

同一块胶不行

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:06

QUOTE:

可以尝试用stripping buffer
但是现在市面上的产品不能保证能把前一次孵育的抗体全部strip掉

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:07

QUOTE:

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相关疾病：
心肌梗死大动脉炎
你好，请教：做了好几次WB，每次都是内参GAPDH（37kd）无条带，目的条带（45kd）很好！条件：小鼠骨组织总蛋白，上样量60-100ug，电泳75v，30min；100v，1.5h；转膜，300mA，1h；santa cruz GAPDH一抗，1：50，1：100，1：200，二抗1：2000，1：2500，1 ...

换GAPDH一抗

作者: Ao7 时间: 2013-2-5 11:07

换阴性对照试试啊
你现在用的阴性对照可靠不

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对照已经换过了，还是会出现条带，应该不是阴性对照样本的问题。。。。郁闷中

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:07

对照已经换过了，还是会出现条带，应该不是阴性对照样本的问题。。。。郁闷中

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那是抗体非特异？

作者: 33号 时间: 2013-2-5 11:09

相关疾病：
心肌梗死Barrett食管大动脉炎
我最近做WB，一直纠结在内参上。
我做的是一株转染miRNA后的大肠癌细胞株，用的是GAPDH做内参，目的蛋白每次都跑的非常漂亮，内参却要么没有，要么曝光十几分钟还是非常弱，没做任何处理的一组细胞也是这个情况。一开始以为是我的抗体有问题，换了师姐的（她前几天刚做过的）用，还是不行。后来实在不行，我就换了beta-actin，结果显色出来了。
难道是这个细胞株里GAPDH表达微弱？我于是做了四株没做任何处理的大肠癌细胞的WB，我上面做的那株细胞确实是GAPDH比其他三株弱非常非常多，几乎就没有。
不知道各位战友们有没有遇到过这种问题？这株细胞怎么会不怎么表达GAPDH呢？
还是我实验操作过程中存在某些失误？
恳请高手帮忙解释呀！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:09

QUOTE:

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相关疾病：
心肌梗死Barrett食管大动脉炎
我最近做WB，一直纠结在内参上。
我做的是一株转染miRNA后的大肠癌细胞株，用的是GAPDH做内参，目的蛋白每次都跑的非常漂亮，内参却要么没有，要么曝光十几分钟还是非常弱，没做任何处理 ...

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

有可能表达量很少
而且转染后对GAPDH的表达会不会有变化也不知道啊
因为很多情况下其实GAPDH等常用的内参表达量是会发生变化的
你还可以用beta-tubulin作为内参

作者: hold住 时间: 2013-2-5 11:10

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

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有可能表达量很少
而且转染后对GAPDH的表达会不会有变化也不知道啊
因为很多情况下其实GAPDH等常用的内参表达量是会发生变化的
你还可以用beta-tubulin作为内参

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多谢！
我现在用的是beta-actin做内参，还是挺好的。

作者: owanaka 时间: 2013-2-5 11:11

请问老师，1、用考马斯亮蓝染过的胶可不可以再转膜?
2、转膜时什么也转不上（膜上什么也没有）是怎么回事？

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:11

同一块胶不行

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多谢老师的提醒，您是不是认为我应该83,91跑10%的胶，113的跑8%的胶，而不能在同一浓度的胶跑？您上次好像教我的是这3个蛋白都可以用10%的胶跑哦？

还有一抗回收的问题，老师能给点建议么？回收了怎么保存，回收的抗体能用几次？还是每次最好配新的？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:13

请问老师，1、用考马斯亮蓝染过的胶可不可以再转膜?
2、转膜时什么也转不上（膜上什么也没有）是怎么回事？

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不可以
蛋白已经被固定了

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:13

多谢老师的提醒，您是不是认为我应该83,91跑10%的胶，113的跑8%的胶，而不能在同一浓度的胶跑？您上次好像教我的是这3个蛋白都可以用10%的胶跑哦？

还有一抗回收的问题，老师能给点建议么？回收了怎么保存，回收的抗体能用几次？还是每次最好配新的？

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当然可以用10%的胶了
只是这两个你要同时做的话分子量离得太近了
我不回收使用一抗
如果回收了在近期使用吧
放置4度

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:14

相关疾病：
大动脉炎

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当然可以用10%的胶了
只是这两个你要同时做的话分子量离得太近了
我不回收使用一抗
如果回收了在近期使用吧
放置4度

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老师，如果我把MARK点在中间，转膜后从中间剪开，一块膜做STAT1(83,91)stat1本来就是2条带，一个84,一个91，另一块做STAT2(113)行么?

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:15

老师，如果我把MARK点在中间，转膜后从中间剪开，一块膜做STAT1(83,91)stat1本来就是2条带，一个84,一个91，另一块做STAT2(113)行么?

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可以
但是Marker的上样体积与样品最好一致
你一共几个样品？

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:15

相关疾病：
骨关节炎
五个抗体，一个患者的PBMC提取蛋白同时做五个抗体。但是我担心从PBMC提的蛋白不够用。因为我一般的裂解液体系是120UL。一次上个20，就没了。而且您说的和MARK上样量一致，那MARK可用得多啊，呵呵，我一般加5UL MARK的，但是样本我一般加15-20

而且肯定会有很多空白的孔需要加LOADING BUFFER来平衡电压

我想5个抗体两块胶搞定。

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:15

QUOTE:

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相关疾病：
骨关节炎
五个抗体，一个患者的PBMC提取蛋白同时做五个抗体。但是我担心从PBMC提的蛋白不够用。因为我一般的裂解液体系是120UL。一次上个20，就没了。而且您说的和MARK上样量一致，那MARK可用得多啊，呵呵，我一般加5 ...

这样的话Marker放在中间不合适
会使两侧的泳道变形
你斟酌下吧
可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer
但是做之前我还是建议你用正常人或者量较多的样品来做预实验
别一次样品全废了

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:16

QUOTE:

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这样的话Marker放在中间不合适
会使两侧的泳道变形
你斟酌下吧
可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer
但是做之前我还是建议你用正常人或者量较多的样品来做预实验
别一 ...

谢谢老师。如果保险些，您认为这五个蛋白26,43,84,91,113应该怎么分胶来做，空白孔BUFFER的加法有什么技巧么！？就是您说得泳道变形是BUFFER加法不对造成的么？以前没注意过这类问题。o(∩_∩)o.

作者: ha111 时间: 2013-2-5 11:16

请教老师，转模时直接用电极液作为转膜缓冲液好不好？

作者: wmp1234 时间: 2013-2-5 11:17

我想请问以下，NF-kB活性检测到底是EMSO好，还是WesternBlot好？听说NF-kB活性检测试剂盒有不需要P32标记的，是吗？怎样才能买到？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:18

请教老师，转模时直接用电极液作为转膜缓冲液好不好？

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不行啊
转移缓冲液里有甲醇，起固定胶大小作用的

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:19

谢谢老师。如果保险些，您认为这五个蛋白26,43,84,91,113应该怎么分胶来做，空白孔BUFFER的加法有什么技巧么！？就是您说得泳道变形是BUFFER加法不对造成的么？以前没注意过这类问题。o(∩_∩)o.

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1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
3，空白孔加buffer技巧：buffer的上样体积我一般会选择同边上样品一致
泳道变形因为上样体积不一致

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:20

相关疾病：
多发性硬化感染性心内膜炎

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我想请问以下，NF-kB活性检测到底是EMSO好，还是WesternBlot好？听说NF-kB活性检测试剂盒有不需要P32标记的，是吗？怎样才能买到？非常感谢！

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EMSA与WB谁好我说不上来
各有优缺点吧
看你实验的设计了
有生物素标记的试剂盒
我用过的是Pierce的盒子

作者: jujuba 时间: 2013-2-5 11:20

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心肌梗死
请问老师，26KD，40KD，58Kd转膜，湿转200MA，1H，转缓：100ml甲醇，14.4甘氨酸，3.02g tris, 条件合适吗？谢谢老师！
电泳是5％浓缩，12%分离胶，80V30min, 120V75min.

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:20

QUOTE:

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相关疾病：
心肌梗死
请问老师，26KD，40KD，58Kd转膜，湿转200MA，1H，转缓：100ml甲醇，14.4甘氨酸，3.02g tris, 条件合适吗？谢谢老师！
电泳是5％浓缩，12%分离胶，80V30min, 120V75min. ...

甲醇用20%
再加0.01%的SDS
可以用300mA 1h
转膜时注意降温

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:21

1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
3，空白孔加buffer技巧：buffer的上样体积我一般会选择同边上样品一致
泳道变形因为上样体积不一致

==============================================================================================================

谢谢老师。
请问如果倒胶4度保存，我一般是用蒸馏水和滤纸包着，第二天再跑用胶有没有大的影响，有的人说没影响，有的人说过夜的胶跑的不好，还有人用电泳缓冲液打湿滤纸包住保存在4度冰箱。

今天转膜时将膜放到滤纸上，发现膜的边缘是卷曲的，就像波纹样，用小试管履平后好像还是有点卷，不知道怎么回事？

请老师给点建议行么？
胶最好当天倒么？

考马斯亮蓝染胶是不是那种测蛋白用的考马斯亮蓝？以前没染过胶，染了还需要用TBST洗么？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:21

QUOTE:

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1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
3，空白孔加buffer技巧：buffer的上样体积我一般会选择同边上样品一致
泳道变形因为上样体积不一致

================================================================================= ...

用蒸馏水和滤纸包着
过夜没事
分离效果很更好
染色与脱色配方很简单，建议自己上网搜一下

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:22

QUOTE:

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用蒸馏水和滤纸包着
过夜没事
分离效果很更好
染色与脱色配方很简单，建议自己上网搜一下

今天转膜时将膜放到滤纸上，发现膜的边缘是卷曲的，就像波纹样，用小试管履平后好像还是有点卷，不知道怎么回事？

过夜保存胶梳子需要拔么？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:22

QUOTE:

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今天转膜时将膜放到滤纸上，发现膜的边缘是卷曲的，就像波纹样，用小试管履平后好像还是有点卷，不知道怎么回事？

过夜保存胶梳子需要拔么？ ...

1，过夜保存分离胶，浓缩胶建议用前再配
2，如果是这样的膜，我是不会用的

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:23

相关疾病：
大动脉炎

==================================

1，过夜保存分离胶，浓缩胶建议用前再配
2，如果是这样的膜，我是不会用的

==============================================================================================================

老师，我打错了，是跑的胶边缘是卷的。转膜时放在滤纸上不平

今天STAT2还是没做出来，明天再做最后一次，加大上样量，一般我上样30-40左右，明天再多加点，还做不出来就找找其他原因吧，实验条件我基本应该没问题了。

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:23

相关疾病：
大动脉炎

=====================================

1，过夜保存分离胶，浓缩胶建议用前再配
2，如果是这样的膜，我是不会用的

==============================================================================================================

老师，我打错了，是跑的胶边缘是卷的。转膜时放在滤纸上不平

今天STAT2还是没做出来，明天再做最后一次，加大上样量，一般我上样30-40左右，明天再多加点，还做不出来就找找其他原因吧，实验条件我基本应该没问题了。

作者: kuaizige 时间: 2013-2-5 11:26

老师：您好！
最近试验遇到问题，我要疯了快，我以前作western很好，但是最近突然出现一种现象就是加上ECL发光液之后整张膜都发光，后来我选择使用封闭液来稀释抗体，好了一段时间，但是目的条带也弱了，可是不知道为什么后来又反复出现这种情况，我已经将所有试剂都重新配置了，您觉得可能是抗体的问题吗，可是为什么我降低抗体的浓度，一点好转的迹象都没有呢，非常感谢老师谢谢！

作者: qiangren789 时间: 2013-2-5 11:28

请教老师：转膜缓冲液用什么配方最好？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:28

老师：您好！
最近试验遇到问题，我要疯了快，我以前作western很好，但是最近突然出现一种现象就是加上ECL发光液之后整张膜都发光，后来我选择使用封闭液来稀释抗体，好了一段时间，但是目的条带也弱了，可是不知道为什么后来又反复出现这种情况，我已经将所有试剂都重新配置了，您觉得可能是抗体的问题吗，可是为什么我降低抗体的浓度，一点好转的迹象都没有呢，非常感谢老师谢谢！

==============

ECL换了吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:29

请教老师：转膜缓冲液用什么配方最好？

==============

湿转还是半干？

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 11:29

湿转还是半干？

===================

老师，我用的是半干式

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:30

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-2-5 11:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
湿转还是半干？

===================

老师，我用的是半干式

39mM glycine
48mM Tris
0.0375% SDS
20% methanol

1.2mA每平方厘米膜面积
恒流

作者: qumm1985 时间: 2013-2-5 11:30

再请教NBA老师一个问题：预染marker好用么？我以前没用过。我现在用的预染marker是14-170的，胶跑出来以后就很明显的分成10条蓝色条带，请问，转膜的时候这些蓝色条带转到膜就能证明蛋白转到膜上了么？

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:31

相关疾病：
骨关节炎

============================================================================================================

最近倒胶不顺，长期分离胶凝了不平，不知道怎么回事，桌面应该是平的，胶面总是往2边下降。
另外老师给的建议
1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
这2块胶上的样本，MARK，LOADING BUFFER的排列应该是怎么样的？估计会有很多孔空着，毕竟只5个样本

今天做了小分子的蛋白，一个26的一个43的，曝光很不顺利。我用的皮尔斯的ECL，一般加了后，就用膜包好放在卡盒中了，至于曝光时间一般是1-5分钟。加了ECL没亮带，曝光什么都没有，上次也这样，但是DAB显色却可以看到26的目的蛋白，不知道是怎么回事？曝光的操作有什么不对的地方么？
没亮带是不是应该加大二抗稀释度，一抗需要变化么？而且今天我用得进口抗体，直接用BSA稀释的，没有按照他的加TBST，呵呵。幸好是预试验

作者: jujuba 时间: 2013-2-5 11:31

请问如果是大于120KD的蛋白质，如何进行高效的转膜

作者: xingyi08 时间: 2013-2-5 11:31

相关疾病：
心肌梗死大动脉炎
西维亚 wrote:
你好，请教：做了好几次WB，每次都是内参GAPDH（37kd）无条带，目的条带（45kd）很好！条件：小鼠骨组织总蛋白，上样量60-100ug，电泳75v，30min；100v，1.5h；转膜，300mA，1h；santa cruz GAPDH一抗，1：50，1：100，1：200，二抗1：2000，1：2500，1：5000均试过，没有条带，伤脑筋，不知道什么原因？

换GAPDH一抗

刚换的GAPDH一抗，不再是白板了，都是非特异性条带，目的条带却没有，有可能是什么原因？谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:32

请问如果是大于120KD的蛋白质，如何进行高效的转膜

===================================================

我的是113KD
300MA 2H，应该够了，我一般350MA,1个半小时，注意降温

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:32

再请教NBA老师一个问题：预染marker好用么？我以前没用过。我现在用的预染marker是14-170的，胶跑出来以后就很明显的分成10条蓝色条带，请问，转膜的时候这些蓝色条带转到膜就能证明蛋白转到膜上了么？

=============================

预染Marker好用啊
只能证明一部分吧
蛋白能不能转到膜上要通过染膜哦

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:33

相关疾病：
心肌梗死感染性心内膜炎

==========================================================================================

最近倒胶不顺，长期分离胶凝了不平，不知道怎么回事，桌面应该是平的，胶面总是往2边下降。
另外老师给的建议
1，26，43用12%胶
2，84，91，113用10%胶
这2块胶上的样本，MARK，LOADING BUFFER的排列应该是怎么样的？估计会有很多孔空着，毕竟只5个样本

今天做了小分子的蛋白，一个26的一个43的，曝光很不顺利。我用的皮尔斯的ECL，一般加了后，就用膜包好放在卡盒中了，至于曝光时间一般是1-5分钟。加了ECL没亮带，曝光什么都没有，上次也这样，但是DAB显色却可以看到26的目的蛋白，不知道是怎么回事？曝光的操作有什么不对的地方么？
没亮带是不是应该加大二抗稀释度，一抗需要变化么？而且今天我用得进口抗体，直接用BSA稀释的，没有按照他的加TBST，呵呵。幸好是预试验

===============================================================

1，胶不平与你加水压胶有关，加水的时候应该慢慢的从左往右加
其实WB到后面就是精益求精的事了，都在细节上，希望你能早日达到这一步哦
2，样本的安排上次我不是和你说过吗
3，加上ECL之后应该孵育5min之后再曝光，看Pierce的说明书
4，曝光操作有问题
5，看看Pierce的说明书！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:35

请问如果是大于120KD的蛋白质，如何进行高效的转膜

=======================

呵呵
可以用10%或者8%的分离胶
good luck

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:36

相关疾病：
大动脉炎

=============================================================================================================

你好，请教：做了好几次WB，每次都是内参GAPDH（37kd）无条带，目的条带（45kd）很好！条件：小鼠骨组织总蛋白，上样量60-100ug，电泳75v，30min；100v，1.5h；转膜，300mA，1h；santa cruz GAPDH一抗，1：50，1：100，1：200，二抗1：2000，1：2500，1：5000均试过，没有条带，伤脑筋，不知道什么原因？

换GAPDH一抗

刚换的GAPDH一抗，不再是白板了，都是非特异性条带，目的条带却没有，有可能是什么原因？谢谢！

=================================

1，santa 的GAPDH我用过，效果一般
2，骨组织中有没有GAPDH表达？
3，如果确定有表达的话建议换GAPDH

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:36

我的是113KD
300MA 2H，应该够了，我一般350MA,1个半小时，注意降温

================

呵呵
350mA可以这么转

作者: wood533 时间: 2013-2-5 11:37

我有一蛋白抗体识别的分别是80KD和50KD的片段，那么做western时需要两个都做出来吗？发文章时之用一个片段能说明问题吗？不然两个片段在一张膜上相差挺远的呢，谢谢啊！

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 11:37

相关疾病：
骨关节炎

====================================================================================================

1，胶不平与你加水压胶有关，加水的时候应该慢慢的从左往右加
其实WB到后面就是精益求精的事了，都在细节上，希望你能早日达到这一步哦
2，样本的安排上次我不是和你说过吗
3，加上ECL之后应该孵育5min之后再曝光，看Pierce的说明书
4，曝光操作有问题
5，看看Pierce的说明书！

====================================================================================================

可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer,老师您说的这个是一块胶上的。
我的意思是一块胶上3个样本，另一块2个样本，该怎么加？
关于空白孔的上样缓冲液我一把是2X LOADING BUFFER加等体积的溴芬兰，不知道有没有问题？
麻烦老师了，新人问题比较多

作者: duoduo 时间: 2013-2-5 11:38

谢谢老师前面的回答。PVDF膜通常用甲醇活化，可不可以用乙醇或其他试剂代替。转膜缓冲液中的甲醇可不可以用其他试剂代替？

作者: yychen 时间: 2013-2-5 11:39

甲醇用20%
再加0.01%的SDS
可以用300mA 1h
转膜时注意降温

==============================================================================================================

谢谢老师的指导！昨天按老师说的做了，只是电流没敢加那么多，用了250ma 1H，一张膜用的标签抗，做出来了。另一张膜是用自己纯化的血清抗，可是没有条带，背景倒是比较干净，请问老师该如何改进呢？

还有一个问题：28KD的蛋白转300MA，1H不会转透吗？如何根据分子量大小选择湿转转膜时间和电流？原则是什么？

作者: PINK 时间: 2013-2-5 11:39

相关疾病：
心肌梗死
老师你好，我前面咨询过您eNOS WB的问题，上次不能看到二聚体的原因是一抗的问题。现在换了新的合适的一抗，还是有问题曝光后不能看到条带，在实验过程中，我发现，在转膜后彩虹MARKER的量很多，随意封闭，洗膜，一抗，二抗孵育，彩虹MARKER的颜色越来越淡，不知道是什么原因，我有个疑问在该过程中目的蛋白会不会也在减少？怎么避免这个问题？
我有的封闭液为TBS-T(0.1%Tween 20)+5%脱脂奶粉，RT 1 H，此后有TBS-T(0.1%Tween 20)洗脱10min 3次，再用TBS-T(0.1%Tween 20)＋一抗（1：800）孵育。再洗脱3次，用TBS-T(0.1%Tween 20)＋二抗（1：2000）孵育2H，曝光15分钟，结果是背景很干净，不能看到任何条带。

作者: qianqin1977 时间: 2013-2-5 11:40

我跑了两次WB，DAB显色后结果都是这样？你帮我简单分析一下吗？谢谢！我的目的蛋白应该就是红色marker对应的位置。

图片附件: 41139796.snap.jpg (2013-2-5 11:40, 7.36 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14819

作者: finger 时间: 2013-2-5 11:40

我有一蛋白抗体识别的分别是80KD和50KD的片段，那么做western时需要两个都做出来吗？发文章时之用一个片段能说明问题吗？不然两个片段在一张膜上相差挺远的呢，谢谢啊！

===========================================

1，看相关文献
2，减少跑电泳时间就可以让80K与50K距离离得近些

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:41

相关疾病：
骨关节炎

===================================================================================================

可以这样上buffer、PBMC、PBMC、PBMC、buffer、Marker、PBMC、PBMC、PBMC、buffer,老师您说的这个是一块胶上的。
我的意思是一块胶上3个样本，另一块2个样本，该怎么加？
关于空白孔的上样缓冲液我一把是2X LOADING BUFFER加等体积的溴芬兰，不知道有没有问题？
麻烦老师了，新人问题比较多

======================

呵呵
都是从新人过来的
buffer处上一倍的loading
good luck

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:41

相关疾病：
心肌梗死

=======================================================================================================

谢谢老师前面的回答。PVDF膜通常用甲醇活化，可不可以用乙醇或其他试剂代替。转膜缓冲液中的甲醇可不可以用其他试剂代替？

==================================

不可以
像Millipore的PVDF只能用无水甲醇活化
转缓中的甲醇也不能由其他试剂代替

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:42

相关疾病：
心肌梗死

==============================================================================================================

谢谢老师的指导！昨天按老师说的做了，只是电流没敢加那么多，用了250ma 1H，一张膜用的标签抗，做出来了。另一张膜是用自己纯化的血清抗，可是没有条带，背景倒是比较干净，请问老师该如何改进呢？

还有一个问题：28KD的蛋白转300MA，1H不会转透吗？如何根据分子量大小选择湿转转膜时间和电流？原则是什么？

===========================================================================

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

作者: NBA 时间: 2013-2-5 11:42

老师你好，我前面咨询过您eNOS WB的问题，上次不能看到二聚体的原因是一抗的问题。现在换了新的合适的一抗，还是有问题曝光后不能看到条带，在实验过程中，我发现，在转膜后彩虹MARKER的量很多，随意封闭，洗膜，一抗，二抗孵育，彩虹MARKER的颜色越来越淡，不知道是什么原因，我有个疑问在该过程中目的蛋白会不会也在减少？怎么避免这个问题？
我有的封闭液为TBS-T(0.1%Tween 20)+5%脱脂奶粉，RT 1 H，此后有TBS-T(0.1%Tween 20)洗脱10min 3次，再用TBS-T(0.1%Tween 20)＋一抗（1：800）孵育。再洗脱3次，用TBS-T(0.1%Tween 20)＋二抗（1：2000）孵育2H，曝光15分钟，结果是背景很干净，不能看到任何条带。

==========================================================================================================

1，Marker变浅是因为蛋白中结合的染料被洗掉了，长时间浸泡在液体中、不同的pH都会有影响。避免不太可能，除非Marker质量很好
2，加大上样量，同时抗体浓度加大
抗体是哪个厂家的？把抗体的链接挂上来

作者: NBA 时间: 2013-2-5 12:25

我跑了两次WB，DAB显色后结果都是这样？你帮我简单分析一下吗？谢谢！我的目的蛋白应该就是红色marker对应的位置。

====================================

说的太简单了
做的什么蛋白等等信息一点都没有啊
1，二抗浓度有点高，加大稀释度至少两倍
2，一抗的稀释度要多试几个

作者: kuaizige 时间: 2013-2-5 12:36

我今天做wb，转膜没问题，最后显影的时候，可能没加2号液，也可能加了，溜号了，30分钟曝光后片子上就可以见到浅浅的带，不仔细看就什么都没有（一点东西都没有，背景都没有），请问1）如果只加1号液，能显影么，2）如果不是忘记加2号液了，还会是什么原因，最近换奶粉了，不过也是脱脂的，新打开的3）如果是忘了加2号液，怎么重复使用膜呢，是stripping还是wash就可以了
不好意思问题有点多，谢谢
补充一下，2个月前做的同样的wb都有很好的结果，是什么问题呢

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 12:36

buffer处上一倍的loading??老师？不太懂

作者: NBA 时间: 2013-2-5 12:37

我今天做wb，转膜没问题，最后显影的时候，可能没加2号液，也可能加了，溜号了，30分钟曝光后片子上就可以见到浅浅的带，不仔细看就什么都没有（一点东西都没有，背景都没有），请问1）如果只加1号液，能显影么，2）如果不是忘记加2号液了，还会是什么原因，最近换奶粉了，不过也是脱脂的，新打开的3）如果是忘了加2号液，怎么重复使用膜呢，是stripping还是wash就可以了
不好意思问题有点多，谢谢
补充一下，2个月前做的同样的wb都有很好的结果，是什么问题呢

=====================================================================

1，你说的1、2号液是不是ECL的A、B液啊？抑或是稳定剂与发光剂，名称不同
2，有条件使用BSA
3，直接Wash后重新加ECL孵育，没问题的
4，两个月前与现在的不能做确切的比较，只能做参考，抗体活性会下降，样品会讲解
你用的条件也会有一些不一样（如试剂等或者ECL换了灯）祝你实验顺利

作者: NBA 时间: 2013-2-5 12:38

相关疾病：
骨关节炎

=================================

buffer处上一倍的loading??老师？不太懂

==============================================================================================================

呵呵
别叫老师，
听着怪怪的
一倍的loading的意思就是：你在你的样品是不是要用2倍或者5倍的样品缓冲液啊，把它用你稀释样品的缓冲液稀释样品缓冲液至一倍，在空泳道上等体积的buffer
好像挺拗口
慢慢看

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 12:39

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-2-5 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
骨关节炎

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buffer处上一倍的loading??老师？不太懂

============================================================================================================ ...

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骨关节炎

看昏了！哈哈
我处理样本是2X的LOADING BUFFER，直接把它稀释成1X的上样至空泳道？然后体积和旁边的泳道上的体积一致
我一般是2X LODING BUFFER加等体积的溴芬兰，不就成了1XLOADDING BUFFER么，然后直接上样，不知道对不对。

作者: NBA 时间: 2013-2-5 12:40

QUOTE:

原帖由 zwsyrt 于 2013-2-5 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

相关疾病：
骨关节炎

看昏了！哈哈
我处理样本是2X的LOADING BUFFER，直接把它稀释成1X的上样至空泳道？然后体积和旁边的泳道上的体积一致
我一般是2X LODING BUFFER加等体积的溴芬兰，不就成了1XLOADDING BUFFER么，然后直接 ...

相关疾病：
骨关节炎

你的2倍loading里不含溴酚蓝？
稀释成1倍上样
因为你的样品中loading的含量就是一倍的

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 13:23

你的2倍loading里不含溴酚蓝？
稀释成1倍上样
因为你的样品中loading的含量就是一倍的

=======================================================================================

我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

作者: u234 时间: 2013-2-5 13:25

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

============================================================================================

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 13:26

你的2倍loading里不含溴酚蓝？
稀释成1倍上样
因为你的样品中loading的含量就是一倍的

===============================================================================================================

继续问，刚刚孕育一抗过夜回来了。
今天按您的步骤同时做2块膜，转膜一小时后先拿出一块膜，本想等另一块转好拿出来一起洗和封闭，但是不知道该怎么保存，所以先洗了一块膜封闭，等另一块膜好了再拿出来洗封闭，这就引出个问题，应该怎么保存第一块膜，让他和第二块一起开始做呢？

同时曝光的膜以后想再继续曝光？是不是应该先洗几次，4度保存啊？用塑料袋？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 13:28

我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

==========

呵呵
是有问题

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-5 13:29

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-2-5 13:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我处理样本是48裂解液 12DTT 60 2XLODING BUFFER,总体积120.加另外13UL的溴芬兰。BUFFER里没溴芬兰。
您认为怎么加啊？我加错了？

==========

呵呵
是有问题

老师推荐个样本处理体系和具体加法好么？谢谢了

作者: wu11998866 时间: 2013-2-5 13:32

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

==============================================================================================================

一直都没有做出目的条带，请老师帮忙看看是哪里出了问题。先谢谢！！
从贴壁的细胞中提取蛋白，上样40ug-80ug都试过。跑胶后考马斯亮蓝染过，总蛋白条带均匀。转膜200mA，1h或100mA 2h或20mA过夜都试过，之后膜丽春红染色也能看见总蛋白的条带。封闭1h，一抗1：1000和1：500都试过，二抗1：1000，1：2500，1：5000都试过。DAB显色和ECL显色都试过，只有actin能显出来，目的蛋白125KD的一直没有显出来。请大家帮忙分析一下原因。谢谢大家了！！

作者: glass 时间: 2013-2-5 14:20

我的下胶凝好后出现皱褶，请问怎么解决这个问题？谢谢

作者: wsll 时间: 2013-2-5 14:21

那是抗体非特异？

=======================================================

用的是单克隆抗体，这样的情况属于正常和可以接受的范围吗？谢谢

作者: memory 时间: 2013-2-5 14:22

请问楼主，我的目的蛋白的条带比较弥散，但位置是对的，调整电压可以改变吗？在同一胶上我帮别人做的条带很漂亮的，可能是什么问题呢？会不会蛋白不能用啦？感谢答复！

作者: TAT 时间: 2013-2-5 14:22

请问楼主有没做过DNMT家族的WB?如果有麻烦告知电泳和转膜的条件

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:27

老师推荐个样本处理体系和具体加法好么？谢谢了

=================

用5倍的还原样缓
具体配方上网查
呵呵

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:30

相关疾病：
心肌梗死

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一直都没有做出目的条带，请老师帮忙看看是哪里出了问题。先谢谢！！
从贴壁的细胞中提取蛋白，上样40ug-80ug都试过。跑胶后考马斯亮蓝染过，总蛋白条带均匀。转膜200mA，1h或100mA 2h或20mA过夜都试过，之后膜丽春红染色也能看见总蛋白的条带。封闭1h，一抗1：1000和1：500都试过，二抗1：1000，1：2500，1：5000都试过。DAB显色和ECL显色都试过，只有actin能显出来，目的蛋白125KD的一直没有显出来。请大家帮忙分析一下原因。谢谢大家了！！

=================================

125K的目的蛋白？
建议300mA湿转 1h50min
注意降温
另外你的蛋白的细胞定位是那？
不同定位的蛋白有时候提取会有些问题

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:30

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阳萎

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我的下胶凝好后出现皱褶，请问怎么解决这个问题？谢谢

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减少APS及TEMED的量试试
可能室温较高
凝胶时间缩短造成

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:33

用的是单克隆抗体，这样的情况属于正常和可以接受的范围吗？谢谢

=============================

单克隆抗体也会出现非特异性条带
如果能准确确定你的目的蛋白位置
我认为是可以接受的
图挂上来看看

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:33

请问楼主，我的目的蛋白的条带比较弥散，但位置是对的，调整电压可以改变吗？在同一胶上我帮别人做的条带很漂亮的，可能是什么问题呢？会不会蛋白不能用啦？感谢答复！

======================================

如果是这种情况的话有可能是的目的蛋白降解
你的目的蛋白是糖蛋白？
别人的蛋白和你是一样吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:34

请问楼主有没做过DNMT家族的WB?如果有麻烦告知电泳和转膜的条件

===============

呵呵
不好意思
没做过
不知道这个蛋白

作者: dog002 时间: 2013-2-5 14:34

相关疾病：
心肌梗死

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

作者: S6044 时间: 2013-2-5 14:37

相关疾病：
心肌梗死

1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:39

125K的目的蛋白？
建议300mA湿转 1h50min
注意降温
另外你的蛋白的细胞定位是那？
不同定位的蛋白有时候提取会有些问题

============================================================================================================

每次转膜都是放在冰盒中转的。蛋白位于细胞质中，用的裂解液是碧云天的“Western 及 IP细胞裂解液”，不知道行不行。由于每次都是actin出来，所以感觉细胞提取不会出问题吧。呵呵，不知道对不对。谢谢！！

作者: okhaha 时间: 2013-2-5 14:40

老师，谢谢您的解答。我已经找到原因了，可能是我做的组织是小鼠的，而又用了小鼠的单抗，造成这种情况，我换了兔多抗，好多了，只是不知道原因，因为一抗的说明书上，是可以检测小鼠的，希望得到您的解答，谢谢！

作者: remenb 时间: 2013-2-5 14:41

相关疾病：
心肌梗死
想请教，我的目标蛋白分别是33KD，27，19KD，用半干转，15V，45min，只有33的能出来，27和19的都不在膜上，考虑转过了，改14V,43min,转完后丽春红染色，27的能看到泳道，但没有蛋白带，19的连泳道都没有。考虑丽春红无特异性，继续一抗二抗孵育，结果没有一点发光的。考马染胶，没有残留。（另外一个问题，有时染的胶可以隐约看到泳道，没有蛋白条带，算是没转上吗？）
有没什么好方法可以提高小分子蛋白的转膜效率的？
一抗回收再利用，是放4度冰箱保存就可以吗？再利用时会不会因为抗体效价降低而要另外再加一些抗体呢？谢谢

作者: remenb 时间: 2013-2-5 14:42

不可以
像Millipore的PVDF只能用无水甲醇活化
转缓中的甲醇也不能由其他试剂代替

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甲醇活化时间一般是多久呢？我们一般用是十几秒钟，可以吗？

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-5 14:43

如果是这种情况的话有可能是的目的蛋白降解
你的目的蛋白是糖蛋白？
别人的蛋白和你是一样吗？

============================================================================================================

我们检测的目的蛋白一样，一起电泳转膜的，蛋白标本是不用模型的。之后又一次电压变低跑（因为时间的原因，当时有别的事情），我们的都弥散了。我是不是应该调高电压？谢谢！

作者: kuohao17 时间: 2013-2-5 14:45

老师，你好，请问为了防止目的蛋白降解，能否在先将动物多聚甲醛固定后再取材呢？

作者: 49888 时间: 2013-2-5 14:45

请问：我转膜结果用丽春红染色，往往是膜的中间三分之一区域（约100kD至50kD）有比较清晰的条带，而上下两块区域则不多，尤其是下面的三分之一（低分子量）条带很淡。这是怎么回事？我做脑组织，考马斯亮蓝染胶，条带很丰富；转膜后，胶也很干净。转移液是 192 m mol 甘氨酸、25 m mol Tris、10% 甲醇、0.04% SDS，130mA，7小时。目的蛋白约150KD，还可以杂出来，就是β-actin近来没杂出来或是条带很浅，为什么？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:46

相关疾病：
心肌梗死

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1，加大抗体浓度
2，会转过，300mA 用30min足够了
3，根据分子量、胶的厚度来确定转膜时间和电流
我一般会确定电流，恒流 300mA（湿转）、半干转我一般确定恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
确定电流后再确定时间
总之是一个比较复杂的过程
需要慢慢体会

可是老师，我的样品中同时含有三个蛋白呢，28KD，40KD，58KD，这样的话我该如何选择湿转条件呢？谢谢！呵呵～

=================

300mA 40min

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:47

每次转膜都是放在冰盒中转的。蛋白位于细胞质中，用的裂解液是碧云天的“Western 及 IP细胞裂解液”，不知道行不行。由于每次都是actin出来，所以感觉细胞提取不会出问题吧。呵呵，不知道对不对。谢谢！！

====================================

细胞质中的蛋白提取应该没什么问题
actin能出来说明你的过程应该还是没有问题
提取蛋白的时候加入蛋白酶抑制剂了吗？
另外目的蛋白的一抗是什么厂家的？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:48

想请教，我的目标蛋白分别是33KD，27，19KD，用半干转，15V，45min，只有33的能出来，27和19的都不在膜上，考虑转过了，改14V,43min,转完后丽春红染色，27的能看到泳道，但没有蛋白带，19的连泳道都没有。考虑丽春红无特异性，继续一抗二抗孵育，结果没有一点发光的。考马染胶，没有残留。（另外一个问题，有时染的胶可以隐约看到泳道，没有蛋白条带，算是没转上吗？）
有没什么好方法可以提高小分子蛋白的转膜效率的？
一抗回收再利用，是放4度冰箱保存就可以吗？再利用时会不会因为抗体效价降低而要另外再加一些抗体呢？谢谢

==========================================

1，换用0.22um孔径的膜
2，小分子不需要提高转膜效率哦
3，我不建议重复回收利用抗体，稀释比例不好控制

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:49

甲醇活化时间一般是多久呢？我们一般用是十几秒钟，可以吗？

===================

活化10至15s就可以了
之后用转环平衡

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:49

我们检测的目的蛋白一样，一起电泳转膜的，蛋白标本是不用模型的。之后又一次电压变低跑（因为时间的原因，当时有别的事情），我们的都弥散了。我是不是应该调高电压？谢谢！

======================

电泳用的是什么条件呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:51

老师，你好，请问为了防止目的蛋白降解，能否在先将动物多聚甲醛固定后再取材呢？

============================

后续你要做什么？
用甲醇固定之后做WB会有问题的

作者: NBA 时间: 2013-2-5 14:58

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

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请问：我转膜结果用丽春红染色，往往是膜的中间三分之一区域（约100kD至50kD）有比较清晰的条带，而上下两块区域则不多，尤其是下面的三分之一（低分子量）条带很淡。这是怎么回事？我做脑组织，考马斯亮蓝染胶，条带很丰富；转膜后，胶也很干净。转移液是 192 m mol 甘氨酸、25 m mol Tris、10% 甲醇、0.04% SDS，130mA，7小时。目的蛋白约150KD，还可以杂出来，就是β-actin近来没杂出来或是条带很浅，为什么？

==========================================

同样的样品与抗体beta-actin你一直做的很好吗？
对于beta-actin来说转膜时间有点长了

作者: 987789 时间: 2013-2-5 14:59

相关疾病：
多发性硬化大动脉炎

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细胞质中的蛋白提取应该没什么问题
actin能出来说明你的过程应该还是没有问题
提取蛋白的时候加入蛋白酶抑制剂了吗？
另外目的蛋白的一抗是什么厂家的？

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提取蛋白的时候加了PMSF，一般PMSF的浓度需要多少呢？一抗用过santa cruz的，但买的是分装的，没做出来。现在用的是凯基的，同样没做出来~郁闷ing~

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:02

相关疾病：
心肌梗死

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提取蛋白的时候加了PMSF，一般PMSF的浓度需要多少呢？一抗用过santa cruz的，但买的是分装的，没做出来。现在用的是凯基的，同样没做出来~郁闷ing~

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1~3mM
在水溶液中（裂解液）降解时间是30min
超过30min要重新加入
你做的是什么蛋白？

作者: bring 时间: 2013-2-5 15:04

电泳用的是什么条件呢？

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60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:05

60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V

=====================================

电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-5 15:06

cell signaling 的抗体一抗的起始稀释比例是1：1000（不同的抗体均不同：厂家，批次等）
我建议你做两个稀释度1：1000与1：2000的预实验
稀释比例的大小还要取决于二抗及ECL的敏感性
抗体稀释液最好用5%的奶粉或者BSA
与封闭液相同
你做的是磷酸化的蛋白，用BSA
good luck

=======================================================

做磷酸化的蛋白，抗体必须用BSA稀释吗？用封闭液稀释可以吗？谢谢！！

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-5 15:07

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心肌梗死多发性硬化

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1~3mM
在水溶液中（裂解液）降解时间是30min
超过30min要重新加入
你做的是什么蛋白？

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做的FAK，裂解时得在冰上裂解30min以上吧，之后还要重新加PMSF再离心吗？谢谢！！！

作者: wood533 时间: 2013-2-5 15:08

电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温

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是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？

作者: wood533 时间: 2013-2-5 15:09

我在转膜1.5h后把电流调至250ma，但是发现没有转干净。谢谢您帮我分析一下吧。

作者: wood533 时间: 2013-2-5 15:09

电泳你用300mA？
电流很大了
条带弥散应该是电流太大了，温度过高导致
电泳的时候要降温

======================================================================

是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:11

做磷酸化的蛋白，抗体必须用BSA稀释吗？用封闭液稀释可以吗？谢谢！！

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最好用BSA
你可以选择3%浓度的
CST说明书就是建议用封闭液稀释抗体的
4度过夜

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:11

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心肌梗死多发性硬化

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做的FAK，裂解时得在冰上裂解30min以上吧，之后还要重新加PMSF再离心吗？谢谢！！！

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FAK我做过
30min足够了
不用重新加
在裂解液细胞或者组织的时候加
PMSF与蛋白酶结合是不可逆反应
后续不用再加

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:13

是110KD的蛋白，应该300ma可以吧，降温都是常规的。我有必要调低电流试试看吗？

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你前面是说电泳用300mA？
如果是的话电流太大了

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:14

我在转膜1.5h后把电流调至250ma，但是发现没有转干净。谢谢您帮我分析一下吧。

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是电泳还是转膜啊
说清楚哦

作者: qqq111 时间: 2013-2-5 15:15

请楼主指点一下130和180蛋白的电泳和转膜条件？

作者: www.1 时间: 2013-2-5 15:16

60V---90V然后300ma 2.5h。因为当时有事情，就调低了。平时用80V---120V

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不好意思，我没有讲清楚，电泳60V---90V然后300ma 2.5h转膜

作者: one 时间: 2013-2-5 15:17

我使用的是Tubulin作为我的上样量标准。每次测完蛋白含量，我都是很小心的将所有蛋白稀释至相同浓度，然后上相同体积的样品跑sds-page电泳。但是每次做出来以后总是会发现条带并不均一。请问这是怎么回事吗？谢谢。
如图：

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:18

相关疾病：
心肌梗死

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请楼主指点一下130和180蛋白的电泳和转膜条件？

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湿转
300mA 130K 为 1h30min
300mA 180K 为 1h50min或者2h
电泳用8%分离胶
4%浓缩胶

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:20

不好意思，我没有讲清楚，电泳60V---90V然后300ma 2.5h转膜

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浓缩胶 90V
分离胶120或者150V溴酚蓝至底部

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:20

我使用的是Tubulin作为我的上样量标准。每次测完蛋白含量，我都是很小心的将所有蛋白稀释至相同浓度，然后上相同体积的样品跑sds-page电泳。但是每次做出来以后总是会发现条带并不均一。请问这是怎么回事吗？谢谢。
如图：

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变性后要用高速离心机做短暂的离心（也叫“甩一下”）
你的上样量有些大
降低上样量
其次，蛋白定量误差是很大的，你可以看文献，其实很多内参都是不一致的，内参只是一个校正的过程
如果要把内参做成肉眼看着一致的话要通过预实验后的内参条带的IOD值来调整上样量
呵呵
这需要好几次的实验才行
一般一个月差不多吧
good luck

作者: 987789 时间: 2013-2-5 15:20

我的样品浓度不够，做WB条带总是很弱，只比背景深一点点，想浓缩样品，请楼主和大家帮忙推荐个简便易行的浓缩办法，谢谢！
另外，请问楼主老师，扫描WB胶片的时候，有三个值可以调，貌似是明调值，暗调值和中间调值，请问文章中对这三个值的调整有什么要求吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:21

我的样品浓度不够，做WB条带总是很弱，只比背景深一点点，想浓缩样品，请楼主和大家帮忙推荐个简便易行的浓缩办法，谢谢！
另外，请问楼主老师，扫描WB胶片的时候，有三个值可以调，貌似是明调值，暗调值和中间调值，请问文章中对这三个值的调整有什么要求吗？

========================

看你的扫描仪设置了
同一批图片设置相同就可以了
浓缩这一块我不懂

作者: zranqi_1 时间: 2013-2-5 15:22

请问怎么才能验证WEST的抗体和二抗是否已经失效
我的方法是直接把抗体和二抗混合加底物看是否显色，这种方法可行吗？
如果不可行还有更好的方法来验证WEST的抗体和二抗是否失效？

作者: 66+77 时间: 2013-2-5 15:24

相关疾病：
心肌梗死多发性硬化

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FAK我做过
30min足够了
不用重新加
在裂解液细胞或者组织的时候加
PMSF与蛋白酶结合是不可逆反应
后续不用再加

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我就是裂解的细胞。那是不是30min后还需再补加PMSF？还有个问题，您做FAK的时候详细的操作过程是怎样的呢？比如蛋白的上样量，转膜时间、强度，以及一抗的公司、浓度，二抗的公司、浓度，ECL的公司，曝光时间等等。一直显不出FAK，为它快愁死了。万分感谢，谢谢！！！！

作者: 66+77 时间: 2013-2-5 15:25

相关疾病：
心肌梗死

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湿转
300mA 130K 为 1h30min
300mA 180K 为 1h50min或者2h
电泳用8%分离胶
4%浓缩胶

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我的蛋白是125KD，fangweibin119建议300mA，1h50min啊！130KD的倒时间短了？是不是影响不大啊。

作者: 66+77 时间: 2013-2-5 15:26

请指点：
最近做Western blot，检测目的蛋白大小分别为110kd和120kd。分离胶为8%，浓缩胶5%。电泳100V 20 min，200V 20min。电转（湿转,Bio-rad)200mA 90-105min，电转液配方：Trs 5.8g，甘氨酸 2.9g,SDS 0.37g，甲醛 200ml，加水至1000ml.每次新鲜配。抗体均为单克隆抗体，为一家公司产品。
每次110kd条带很好，但120kd没有条带。请问可能的原因是什么？怎样调整液体配方，转膜条件？谢谢！

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转膜液中应该是甲醇吧~

作者: yapuyapu 时间: 2013-2-5 15:32

变性后要用高速离心机做短暂的离心（也叫“甩一下”）
你的上样量有些大
降低上样量
其次，蛋白定量误差是很大的，你可以看文献，其实很多内参都是不一致的，内参只是一个校正的过程
如果要把内参做成肉眼看着一致的话要通过预实验后的内参条带的IOD值来调整上样量
呵呵
这需要好几次的实验才行
一般一个月差不多吧
good luck

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请问老师，这样甩一下起什么作用？要多大的转速？我们用2000g甩10秒左右，够了吗？

作者: kswl870 时间: 2013-2-5 15:35

相关疾病：
多发性硬化
我是新手，想问问fangweibin119老师关于组织标本提蛋白的问题！
我每次取回来的标本一部分用75%的乙醇固定保存，一部分直接提蛋白！前者先做流式，然后剩下的也是提蛋白，不知道用固定后的细胞提蛋白会不会有什么不一样的！因为考虑到是组织细胞，所以我都是选用的1XSDS裂解液，觉得应该会裂解得强一点~！
我的方法是将固定的细胞悬液先也用PBS洗一遍，然后加1XSDS，也用超声超了的，冰上处理1小时左右，100度水浴10分钟，然后12000转离心10分钟，取上清，放入-80°冰箱保存~！
但不知道为什么我做了几次WB，过程什么的都是跟着师姐一起做的，所以应该没有问题~！因为她的都跑出来了~！但是我的每次常常连β-actin都不是很浓，甚至没有！想问问fangweibin119老师是不是我提蛋白有问题？是不是一定要加DTT和PMSF？谢谢！

作者: ending 时间: 2013-2-5 15:36

看你的扫描仪设置了
同一批图片设置相同就可以了
浓缩这一块我不懂

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实验室有师兄说"中间值"必须调为零，其他两个值可以随便调，文章有这样的要求吗？

作者: wsll 时间: 2013-2-5 15:37

看你的扫描仪设置了
同一批图片设置相同就可以了
浓缩这一块我不懂

================================================================

实验室有师兄说"中间值"必须调为零，其他两个值可以随便调，文章有这样的要求吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:38

相关疾病：
心肌梗死多发性硬化大动脉炎

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我就是裂解的细胞。那是不是30min后还需再补加PMSF？还有个问题，您做FAK的时候详细的操作过程是怎样的呢？比如蛋白的上样量，转膜时间、强度，以及一抗的公司、浓度，二抗的公司、浓度，ECL的公司，曝光时间等等。一直显不出FAK，为它快愁死了。万分感谢，谢谢！！！！

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1，那是不是30min后还需再补加PMSF？
在裂解液细胞时加入到裂解液中，加入PMSF后马上加到细胞中，不需要再补加。但是如果裂解液（没加入细胞）放置超过30min时要重新加入PMSF才能继续提取细胞
2，上样量40ug，转膜：湿转 300mA 恒流时间 1h50min或者2h
一抗是santa的，稀释比例忘了。二抗也是santa的，ECL 国产

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:39

相关疾病：
心肌梗死

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我的蛋白是125KD，fangweibin119建议300mA，1h50min啊！130KD的倒时间短了？是不是影响不大啊。

======================================

呵呵
这个分子量范围相差10到20min是没有问题的

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:41

转膜液中应该是甲醇吧~

=============

20% methanol

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:42

谢谢老师的解答。还有一个问题：转膜液里面甲醇和SDS应该怎么加？

==============================

转环需要新鲜配制
SDS你可以用10%的储液稀释
甲醇一般是20%，直接加啊

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:42

请问老师，这样甩一下起什么作用？要多大的转速？我们用2000g甩10秒左右，够了吗？

==============================

把变性时蒸发到EP管盖的水分甩下来
够了

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:44

相关疾病：
多发性硬化

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我是新手，想问问fangweibin119老师关于组织标本提蛋白的问题！
我每次取回来的标本一部分用75%的乙醇固定保存，一部分直接提蛋白！前者先做流式，然后剩下的也是提蛋白，不知道用固定后的细胞提蛋白会不会有什么不一样的！因为考虑到是组织细胞，所以我都是选用的1XSDS裂解液，觉得应该会裂解得强一点~！
我的方法是将固定的细胞悬液先也用PBS洗一遍，然后加1XSDS，也用超声超了的，冰上处理1小时左右，100度水浴10分钟，然后12000转离心10分钟，取上清，放入-80°冰箱保存~！
但不知道为什么我做了几次WB，过程什么的都是跟着师姐一起做的，所以应该没有问题~！因为她的都跑出来了~！但是我的每次常常连β-actin都不是很浓，甚至没有！想问问fangweibin119老师是不是我提蛋白有问题？是不是一定要加DTT和PMSF？谢谢！

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固定组织我没有提取过蛋白做WB
看过一些资料好像大家说可以做
PMSF肯定要加的
另外整个提取蛋白时间太长，容易降解

作者: NBA 时间: 2013-2-5 15:46

实验室有师兄说"中间值"必须调为零，其他两个值可以随便调，文章有这样的要求吗？

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每种仪器设备不同
你可以用普通的扫描仪扫描胶片就行
后面用软件读数

作者: 小野花 时间: 2013-2-5 15:49

相关疾病：
心肌梗死多发性硬化
我也请教一个问题：
图中下面的是内参，有总蛋白、浆蛋白和膜蛋白，上面的是同一块胶跑出来的目的蛋白，但每次都是一条细细的直线，并且这条直线正好在我目的蛋白的地方（70KD左右），但我怀疑这不是我需要的目的蛋白，因为根据下面的内参来看，蛋白并没有融合在一起，那这直线究竟是什么东西呢？怎样才能消除掉呢？我用的4%的浓缩胶和8%的分离胶，Marker跑得还可以。剪开膜后才分开敷的一抗二抗。所有试剂是跟别人一起用的，他们做都没问题。
另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？
谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14820

作者: fsdd817 时间: 2013-2-5 15:49

1，那是不是30min后还需再补加PMSF？
在裂解液细胞时加入到裂解液中，加入PMSF后马上加到细胞中，不需要再补加。但是如果裂解液（没加入细胞）放置超过30min时要重新加入PMSF才能继续提取细胞
2，上样量40ug，转膜：湿转 300mA 恒流时间 1h50min或者2h
一抗是santa的，稀释比例忘了。二抗也是santa的，ECL 国产

=======================================================

谢谢！您在做FAK的时候纯化了吗？还是就直接提的细胞中的FAK来做？

作者: fsdd817 时间: 2013-2-5 15:53

Pierce的ECL我了解
三种我都在用
我的意思是加大总蛋白的上样量
另外一抗不要用回收的（回收的一抗不知道它的确切浓度会成多少）
你还可以试试Pierce的膜蛋白提取试剂盒

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一抗不回收岂不是很浪费啊，每次就用15ul~

作者: lixi559 时间: 2013-2-5 15:53

谢谢！您在做FAK的时候纯化了吗？还是就直接提的细胞中的FAK来做？

===================

没做纯化
做的是骨骼肌来源的

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:14

一抗不回收岂不是很浪费啊，每次就用15ul~

=====================

呵呵
那你可以试试回收利用

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:15

我也请教一个问题：
图中下面的是内参，有总蛋白、浆蛋白和膜蛋白，上面的是同一块胶跑出来的目的蛋白，但每次都是一条细细的直线，并且这条直线正好在我目的蛋白的地方（70KD左右），但我怀疑这不是我需要的目的蛋白，因为根据下面的内参来看，蛋白并没有融合在一起，那这直线究竟是什么东西呢？怎样才能消除掉呢？我用的4%的浓缩胶和8%的分离胶，Marker跑得还可以。剪开膜后才分开敷的一抗二抗。所有试剂是跟别人一起用的，他们做都没问题。
另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？
谢谢！

========================

那就是你自己操作有问题了
问问你的同学

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-5 16:15

最近一直在做western blot
想我用的内参是HRP-GAPDH，如果我只想显色内参，是不是封闭后，加入GAPDH，就可以了？
如果接下来要显色目的蛋白，需不需要用一抗二抗洗脱液洗脱？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:16

最近一直在做western blot
想我用的内参是HRP-GAPDH，如果我只想显色内参，是不是封闭后，加入GAPDH，就可以了？
如果接下来要显色目的蛋白，需不需要用一抗二抗洗脱液洗脱？

=====================================

是封闭后直接加入GAPDH-HRP，孵育后显色

为什么先做GAPDH？
应该先做目的蛋白
洗脱的话会损失蛋白
做半定量的话不建议洗脱做

作者: TAT 时间: 2013-2-5 16:16

相关疾病：
心肌梗死
f我已经重复快2周了，目的还是没出来，直接上图：
目的蛋白：72KD的膜蛋白，8%分离胶，用的是碧云天的SDS-PAGE试剂盒配制，电泳80V，然后120V，共75min；湿转350mA，90min，5%脱脂奶粉（PBST配制）封闭4h，一抗（1：1000) ,4°c过夜；PBST 洗3次*10min；二抗（1：3000）2h，3次*5min；DAB显色。结果如图，很纳闷。先谢谢老师的指点。

图片附件: 45084264.jpg (2013-2-5 16:16, 10.97 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14821

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:17

QUOTE:

原帖由 TAT 于 2013-2-5 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
相关疾病：
心肌梗死
f我已经重复快2周了，目的还是没出来，直接上图：
目的蛋白：72KD的膜蛋白，8%分离胶，用的是碧云天的SDS-PAGE试剂盒配制，电泳80V，然后120V，共75min；湿转350mA，90min，5%脱脂奶粉（PBST配制）封闭4h，一抗（1：1000) ,4°c过夜；P ...

呵呵
别郁闷
实验不顺利很正常
这几天我也不太顺利
共同努力
你的条件基本没有问题
我认为：1，膜蛋白没有提取出来
2，你的DAB染色方法敏感度较低，建议改用ECL
保持联系

作者: yes4 时间: 2013-2-5 16:18

向楼主请教一下，我这几天转膜后发现在Make的左边总出现其copy一样的条带，不知什么原因，希望您帮分析一下，多谢！我的Marker上样5ul，之前没有出现过。

作者: qhyu 时间: 2013-2-5 16:20

前一段时间做Western已经比较熟练了，条带也跑的很漂亮，但是这几天两次实验到最后发光的时候片子上竟然什么也没有，特别的干净。所有缓冲液都是新配的，转膜后MARKER也很清晰，凝胶考马斯亮蓝染色后也有条带，今天试了一下二抗和发光剂也没有问题，但是暗室曝光时膜上加发光剂后没有荧光，连着做了三种蛋白都没有结果，和我之前做的步骤我也没想出来有什么不同。
今天还做了ACTIN，几乎什么液体都是新配的，还是不行，您说到底怎么了啊？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:32

向楼主请教一下，我这几天转膜后发现在Make的左边总出现其copy一样的条带，不知什么原因，希望您帮分析一下，多谢！我的Marker上样5ul，之前没有出现过。

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换Marker了？
另外曝光的时候是不是把胶片动了？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 16:38

前一段时间做Western已经比较熟练了，条带也跑的很漂亮，但是这几天两次实验到最后发光的时候片子上竟然什么也没有，特别的干净。所有缓冲液都是新配的，转膜后MARKER也很清晰，凝胶考马斯亮蓝染色后也有条带，今天试了一下二抗和发光剂也没有问题，但是暗室曝光时膜上加发光剂后没有荧光，连着做了三种蛋白都没有结果，和我之前做的步骤我也没想出来有什么不同。
今天还做了ACTIN，几乎什么液体都是新配的，还是不行，您说到底怎么了啊？

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测一下缓冲液的pH
另外一抗是不是过期了

作者: DNA 时间: 2013-2-5 16:39

你好，这几天做32KD的蛋白杂交，第一天做出了很好的带挺亮的，可是到第二天的时候做出来的，带是有的，不过很不清楚几乎看不出啦，转膜的时候mark都转上去了，我想问题应该是出在杂交上，但是我有不知道具体处在那里啊？我的PVDF膜，用的ECL显色液，请高手指点一下啊

作者: wmp1234 时间: 2013-2-5 16:40

请教前辈，我准备做淋巴细胞磷酸化蛋白的WB，我可不可以想冻存组织那样先把细胞冻起来，准备做的时候再拿出来提蛋白，还是应该把蛋白提取出来以后再冻呢，还有你说做磷酸化的蛋白，应该将抗体用BSA稀释，这是为什么呢？谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2013-2-5 16:41

相关疾病：
大动脉炎心肌梗死
你好：
请老师帮我解答一下问题：
从细胞提取的蛋白，分子量是12.9kd，28mA，120v电泳，80mA两个半小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭过夜，santa一抗 1：1000TBST稀释（推荐1：100-1：1000）。室温孵4h，二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温1小时。都是TBST洗膜3*15min。发光剂是碧云天ECL PLUS。
电泳的时候溴酚蓝有拖尾和弥散。曝光时一片发光也没有特异性的条带。不知是怎么回事。是不是我的蛋白有问题？做的内参也是一样。
谢谢！

作者: avi317 时间: 2013-2-5 16:43

换Marker了？
另外曝光的时候是不是把胶片动了？

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您好！没有换maker，是转膜后肉眼可见的旁边像个副本似的，不影响显影，因为我用的maker本身是不显影的，只是想知道原因。多谢！

作者: ha111 时间: 2013-2-5 16:44

老师：您好！
蛋白样品变性后-20℃保存好还是不变性直接-20℃保存好？如果蛋白样品变性后-20℃保存后做WB时还要再次变性及离心吗？为什么？
谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-5 16:52

楼主！！！转运的时候结果老是转散了，怎么回事啊？

作者: finger 时间: 2013-2-5 16:57

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎
请问：
我的目的蛋白是胞浆蛋白：44kd.
那么我选择什么作为内参呢？
我仅仅知道beta-actin和gap dh,这两个内参的分子量与我的目的蛋白很接近，我怕不好剪膜，又没有合适的marker.

作者: ero11 时间: 2013-2-5 17:01

本来还没有做过几次WB，像我问一下，内参b-actin有什么作用，是在哪一步使用的？

作者: bring 时间: 2013-2-5 17:01

没做纯化
做的是骨骼肌来源的

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我提的成骨细胞中的，要上样到150ug才出条带。好恐怖哦~您分析是哪儿的原因呢？总的FAK做出来了，接着要做磷酸化的了，有什么特别需要注意的地方吗？万分感谢！

作者: bring 时间: 2013-2-5 17:07

呵呵
那你可以试试回收利用

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回收试过，还OK，呵呵~

作者: 2541 时间: 2013-2-5 17:07

半干转可以用恒压吗？
半干转的恒压和恒流的区别是？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:14

你好，这几天做32KD的蛋白杂交，第一天做出了很好的带挺亮的，可是到第二天的时候做出来的，带是有的，不过很不清楚几乎看不出啦，转膜的时候mark都转上去了，我想问题应该是出在杂交上，但是我有不知道具体处在那里啊？我的PVDF膜，用的ECL显色液，请高手指点一下啊

=====================================================

问题是你第一天与第二天做的时候有什么区别只有你自己知道啊
严格来说相差两天应该没有这么大的差别
我的想法是：你的蛋白冻融了一次可能降解了

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:15

请问怎么才能验证WEST的抗体和二抗是否已经失效
我的方法是直接把抗体和二抗混合加底物看是否显色，这种方法可行吗？
如果不可行还有更好的方法来验证WEST的抗体和二抗是否失效？

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二抗可以用PBS稀释不同的浓度点在NC膜上，每个点1ul
然后用ECL孵育，后续同曝光过程
这样可以看出二抗的效价

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:18

请教前辈，我准备做淋巴细胞磷酸化蛋白的WB，我可不可以想冻存组织那样先把细胞冻起来，准备做的时候再拿出来提蛋白，还是应该把蛋白提取出来以后再冻呢，还有你说做磷酸化的蛋白，应该将抗体用BSA稀释，这是为什么呢？谢谢

======================

-70度保存细胞
测试前再提取蛋白
奶粉里有一些干扰因素
都建议采用BSA与TBST

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:18

你好：
请老师帮我解答一下问题：
从细胞提取的蛋白，分子量是12.9kd，28mA，120v电泳，80mA两个半小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭过夜，santa一抗 1：1000TBST稀释（推荐1：100-1：1000）。室温孵4h，二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温1小时。都是TBST洗膜3*15min。发光剂是碧云天ECL PLUS。
电泳的时候溴酚蓝有拖尾和弥散。曝光时一片发光也没有特异性的条带。不知是怎么回事。是不是我的蛋白有问题？做的内参也是一样。
谢谢！

=====================

先做好内参再做目的蛋白
一抗浓度先不变
二抗浓度要稀释
你再试试

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:19

你好：
请老师帮我解答一下问题：
从细胞提取的蛋白，分子量是12.9kd，28mA，120v电泳，80mA两个半小时湿转，5%脱脂奶粉室温封闭过夜，santa一抗 1：1000TBST稀释（推荐1：100-1：1000）。室温孵4h，二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温1小时。都是TBST洗膜3*15min。发光剂是碧云天ECL PLUS。
电泳的时候溴酚蓝有拖尾和弥散。曝光时一片发光也没有特异性的条带。不知是怎么回事。是不是我的蛋白有问题？做的内参也是一样。
谢谢！

========================

二抗建议你采用1：5000试试
ECL Plus这个产品我没用过
有可能是ECl的背景
注意观察哦

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:19

您好！没有换maker，是转膜后肉眼可见的旁边像个副本似的，不影响显影，因为我用的maker本身是不显影的，只是想知道原因。多谢！

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我做的时候预染Marker上样量大点转膜后就会有这样的情况

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:19

蛋白样品变性后-20℃保存好还是不变性直接-20℃保存好？如果蛋白样品变性后-20℃保存后做WB时还要再次变性及离心吗？为什么？
谢谢！

==========================================

近期做的话变性后-20度保存
不是近期做的话-70度保存蛋白
变性好的蛋白做WB的时候不用再次变性，也不用离心
只需要用离心机甩几秒就可以

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:20

楼主！转运的时候结果老是转散了，怎么回事啊？

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1，转膜是温度太高
2，电泳就没有跑好

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:20

相关疾病：
Barrett食管大动脉炎

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请问：
我的目的蛋白是胞浆蛋白：44kd.
那么我选择什么作为内参呢？
我仅仅知道beta-actin和gap dh,这两个内参的分子量与我的目的蛋白很接近，我怕不好剪膜，又没有合适的marker.

======================

呵呵
还有一个beta-tubulin
55K

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:21

本来还没有做过几次WB，像我问一下，内参b-actin有什么作用，是在哪一步使用的？

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校正蛋白定量误差、调整蛋白浓度时的误差、上样时误差
内参的操作与你的目的蛋白是一样的
只不过内参用内参的抗体杂交

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:22

我提的成骨细胞中的，要上样到150ug才出条带。好恐怖哦~您分析是哪儿的原因呢？总的FAK做出来了，接着要做磷酸化的了，有什么特别需要注意的地方吗？万分感谢！！！

==============================================

1，FAK丰度很小
2，蛋白定量不准
3，磷酸化注意事项在蛋白提取，加入磷酸化酶抑制剂

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:22

半干转可以用恒压吗？
半干转的恒压和恒流的区别是？

=======================

可以用
个人习惯与长期以来的经验

作者: tie8 时间: 2013-2-5 17:22

相关疾病：
心肌梗死
您好，我是用mice组织匀浆来作western的。以前用细胞来作western，同样的3-8%的Neupage胶，同样的湿转条件，同样的目的蛋白，同样的抗体，在细胞结果很好。换作组织匀浆后，电泳时，上样蛋白为40ug每well，120v，跑成波浪状，而且应该组成性表达此蛋白的wild type 只有一个器官的匀浆里有表达。内参照蛋白有的为正常的条带，有的为一圆点。不知为何电泳跑成波浪状？困惑中，多谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:23

您好，我是用mice组织匀浆来作western的。以前用细胞来作western，同样的3-8%的Neupage胶，同样的湿转条件，同样的目的蛋白，同样的抗体，在细胞结果很好。换作组织匀浆后，电泳时，上样蛋白为40ug每well，120v，跑成波浪状，而且应该组成性表达此蛋白的wild type 只有一个器官的匀浆里有表达。内参照蛋白有的为正常的条带，有的为一圆点。不知为何电泳跑成波浪状？困惑中，多谢！

===================

Neupage胶我没有跑过

作者: is2011 时间: 2013-2-5 17:23

又一个问题：转膜后看不到marker?(200、130、97、62、43KDa)
以前用130mA，7小时，只能看到200、130两条带，其余的看不到，但是样品的低分子条带可见，胶很干净。猜测是时间太长了，后来缩短到4小时、3小时，丽春红染膜仍不见marker，胶挺干净，看不到marker。可能是marker的量太少，以前上10μl，但是增加到30μl（以前的3倍量）仍不见。这是怎么回事？

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:24

又一个问题：转膜后看不到marker?(200、130、97、62、43KDa)
以前用130mA，7小时，只能看到200、130两条带，其余的看不到，但是样品的低分子条带可见，胶很干净。猜测是时间太长了，后来缩短到4小时、3小时，丽春红染膜仍不见marker，胶挺干净，看不到marker。可能是marker的量太少，以前上10μl，但是增加到30μl（以前的3倍量）仍不见。这是怎么回事？

====================================

电泳时肉眼能在胶上看到Marker条带吗？
Marker反复冻融了吗？

作者: dog002 时间: 2013-2-5 17:24

相关疾病：
结肠癌
我想请教一个关于wb之前细胞裂解的问题。我用的是结肠癌lovo细胞，裂解液是碧云天的Western及IP细胞裂解液，每个ep管加30微升。冰上裂解一个半小时，每五分钟涡旋10秒。可是之后高速离心12000，10min上清分不出来，或是分出很少，只能吸出20微左右，别人做同样的步骤可以得到40左右的上清蛋白样品。是我用的裂解液不适用于这个细胞嘛？还是我得裂解过程有问题？希望得到解答。还有就是涡旋的时候就总是觉得细胞和裂解液总是没有混匀，总像是有沉淀一样。不知道是为什么。延长时间到两个小时还是这样。

作者: NBA 时间: 2013-2-5 17:25

相关疾病：
结肠癌

我想请教一个关于wb之前细胞裂解的问题。我用的是结肠癌lovo细胞，裂解液是碧云天的Western及IP细胞裂解液，每个ep管加30微升。冰上裂解一个半小时，每五分钟涡旋10秒。可是之后高速离心12000，10min上清分不出来，或是分出很少，只能吸出20微左右，别人做同样的步骤可以得到40左右的上清蛋白样品。是我用的裂解液不适用于这个细胞嘛？还是我得裂解过程有问题？希望得到解答。还有就是涡旋的时候就总是觉得细胞和裂解液总是没有混匀，总像是有沉淀一样。不知道是为什么。延长时间到两个小时还是这样。

========================================

个人认为裂解时间太长了
我一般孵育20 to 30min
另外你加裂解液没？
加入30ul的裂解液怎么能得到40左右的上清？
不理解
像沉淀的东西是cell debris

作者: moonlight45 时间: 2013-2-5 17:26

感谢解答。我以为裂解时间越长裂解的效果会越好，看来是误会了。那如果沉淀是细胞碎片的话，那我收细胞的时候是不是已经飘在培养基里不再贴壁的细胞就应该弃去不要了啊？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-5 17:26

做的是B-Tubulin ，第一泳道上样8ul，第二12ul，第三10ul

一抗1：10000 ，二抗1：2000

条带下面很脏，很难看，请问我的上样量是不是还要降低？还是降低抗体浓度？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14822

作者: youyou99 时间: 2013-2-7 15:06

我配的下胶面倾斜，请问在用酒精压液面时酒精该怎样加可以避免液面倾斜，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:06

感谢解答。我以为裂解时间越长裂解的效果会越好，看来是误会了。那如果沉淀是细胞碎片的话，那我收细胞的时候是不是已经飘在培养基里不再贴壁的细胞就应该弃去不要了啊？

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死细胞肯定不能要啊
用预冷的PBS洗三次
洗的时候要缓慢使PBS流动

作者: zsxan1990 时间: 2013-2-7 15:08

我配的下胶面倾斜，请问在用酒精压液面时酒精该怎样加可以避免液面倾斜，谢谢！

==========================================

你说的下胶面是浓缩胶和分离胶的交界处吗？
你的实验台有测过水平吗？把台面调水平后再试试

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:09

做的是B-Tubulin ，第一泳道上样8ul，第二12ul，第三10ul

一抗1：10000 ，二抗1：2000

条带下面很脏，很难看，请问我的上样量是不是还要降低？还是降低抗体浓度？

=====================

1，上样量试试2ul，4ul
2，一抗 1：10000不要变
3，二抗 1：4000
试试这些条件

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:09

做了WB检测四种细胞中某蛋白的表达，actin可以，目的蛋白的条带呈串珠样，下面是图，请楼主帮忙看看

=======================

转膜时有小气泡
抗体孵育的时候没有孵育完全

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:10

这是actin

===================================

从你的目的蛋白来看可以降低一倍上样量
你试试

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:10

我配的下胶面倾斜，请问在用酒精压液面时酒精该怎样加可以避免液面倾斜，谢谢！

=====================

用蒸馏水压就可以
加的时候从左到右慢慢加

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:14

你说的下胶面是浓缩胶和分离胶的交界处吗？
你的实验台有测过水平吗？把台面调水平后再试试

===================

这个应该没有太大关系
不会超过30度吧

作者: sunnyB 时间: 2013-2-7 15:16

从你的目的蛋白来看可以降低一倍上样量
你试试

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降低一倍只有两种细胞出来，且很弱

作者: yonger 时间: 2013-2-7 15:37

相关疾病：
类风湿关节炎肺癌
今天被碧云天的裂解液雷到了，说它裂解的蛋白不能用 bradford法测浓度，以前根本没注意。要用它的BCA试剂盒，以前都是用BRADFORD测蛋白浓度的，那看来是不准啊。昏了，那是我试验怎么做出来的啊？BCA从没用过，还要酶标仪？

作者: 2541 时间: 2013-2-7 15:37

你好,最近作western不顺，今天跑内参，转膜之后膜用丽春红染色，每个泳道条带有的，后来封闭，加一抗，二抗，发光剂，显影。奇怪的是只有一个条带，而且很清晰。期间我还以为是片子没放好，或鸦片不均匀，压了几次，都是这样。后来将莫洗脱，再次用丽春红染色，每个泳道还是有条带的，这是什么原因，郁闷中，特请教

作者: kuohao17 时间: 2013-2-7 15:37

相关疾病：
头痛
老师你好我一直在做这个分子量为180左右的蛋白（p糖蛋白），做了很多次条带都不干净，条带边上有纵向的黑影，一直不知道怎么解决。头痛哦。
我用的是8％的分离胶，感觉还是没有跑开，是抗体的问题嚒？请问老师要如何解决呢谢谢哦

图片附件: 63532066.jpg (2013-2-7 15:38, 6.8 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14832

作者: moonlight45 时间: 2013-2-7 15:38

我配的下胶面倾斜，请问在用酒精压液面时酒精该怎样加可以避免液面倾斜，谢谢！

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如果排除试验台很倾斜的话，你会不会灌胶后没有立即用酒精来压呢？如果是这样的情况，那就是你人为的造成的外力的原因啦。及时压胶就好啦。只是推测，仅供参考，希望有用。

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:39

降低一倍只有两种细胞出来，且很弱

=====================

抗体孵育是否完全？
转膜时气泡赶得干净吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:39

今天被碧云天的裂解液雷到了，说它裂解的蛋白不能用 bradford法测浓度，以前根本没注意。要用它的BCA试剂盒，以前都是用BRADFORD测蛋白浓度的，那看来是不准啊。昏了，那是我试验怎么做出来的啊？BCA从没用过，还要酶标仪？

===========================================

没有定量蛋白不是说做不出来
只不过是上样时没有一个统一的量
其实WB预实验后还是要根据内参的量来调整上样量的
可以用酶标仪，也可以用分光光度计
后者需要的样品要多一些

作者: langlang 时间: 2013-2-7 15:40

相关疾病：
心肌梗死
我做了好大半个月的WB，都只能做出33KD和内参43KD的蛋白，27的和19的一直都不出来，转膜后丽春红也染不出，换了小孔径的膜，转膜条件也调了好多次，结果都一样。
疑小分子量蛋白降解，今天又重新提取了蛋白，裂解液为自配三去污，（我们实验室一直用的配方，先前有人多次做出12KD的条带来），超声打碎（超声的次数多些会不会导致低分子量蛋白降解呢？），加热8分钟，高速离心，去上清，BAC测得浓度分别是10ug/ul,13ug/ul，上样20ul,蛋白总量100ug以上了，12%的胶，80V 30min，100V 到底，切下两个泳道的考马斯亮蓝染色30min，脱色后图片如下。上面的蛋白条带都集中在55到30KD，但在30KD以后蛋白就好像一下消失了样的，一个泳道的蛋白干脆就完全没有，另一个隐隐约约的有一点点。另外的几个泳道都到转到膜上，丽春红染色效果和胶的情况一样，30以上的有条带，以下的一片白板。
为什么我的蛋白在30KD以后就没有了呢？多次提取的蛋白都是这样。
思考：1.我的细胞（A549和A549/DDP）小分子量蛋白表达本来就少？但也不至于跑胶都跑不出来啊。
2.细胞裂解液有问题？但同样配方，师兄们却可以做出小分子量的。而且我自己的33KD的也能做出来。
3.跑胶没跑好，小分子量蛋白可能还在Mark指示的30KD左右？但我用10%的胶跑的效果也差不多。
4.我的细胞是从另一个实验室带去的，中间间隔大概30分钟，我就用一般的盒子装了那过去的，会不会是这里出问题呢？
急啊，总是那两个不出来，折腾我好久了，请各位帮我分析下，谢谢啦！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14833

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:40

我做了好大半个月的WB，都只能做出33KD和内参43KD的蛋白，27的和19的一直都不出来，转膜后丽春红也染不出，换了小孔径的膜，转膜条件也调了好多次，结果都一样。
疑小分子量蛋白降解，今天又重新提取了蛋白，裂解液为自配三去污，（我们实验室一直用的配方，先前有人多次做出12KD的条带来），超声打碎（超声的次数多些会不会导致低分子量蛋白降解呢？），加热8分钟，高速离心，去上清，BAC测得浓度分别是10ug/ul,13ug/ul，上样20ul,蛋白总量100ug以上了，12%的胶，80V 30min，100V 到底，切下两个泳道的考马斯亮蓝染色30min，脱色后图片如下。上面的蛋白条带都集中在55到30KD，但在30KD以后蛋白就好像一下消失了样的，一个泳道的蛋白干脆就完全没有，另一个隐隐约约的有一点点。另外的几个泳道都到转到膜上，丽春红染色效果和胶的情况一样，30以上的有条带，以下的一片白板。
为什么我的蛋白在30KD以后就没有了呢？多次提取的蛋白都是这样。
思考：1.我的细胞（A549和A549/DDP）小分子量蛋白表达本来就少？但也不至于跑胶都跑不出来啊。
2.细胞裂解液有问题？但同样配方，师兄们却可以做出小分子量的。而且我自己的33KD的也能做出来。
3.跑胶没跑好，小分子量蛋白可能还在Mark指示的30KD左右？但我用10%的胶跑的效果也差不多。
4.我的细胞是从另一个实验室带去的，中间间隔大概30分钟，我就用一般的盒子装了那过去的，会不会是这里出问题呢？
急啊，总是那两个不出来，折腾我好久了，请各位帮我分析下，谢谢啦！

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从你的图来看电泳就有问题
先解决SDS-PAGE吧
后面的问题再慢慢解决

作者: wood533 时间: 2013-2-7 15:41

从你的图来看电泳就有问题
先解决SDS-PAGE吧
后面的问题再慢慢解决

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大概是什么的问题呢，SDS？Tris8.8？丙烯？
但是我的蛋白Mark可以跑得很好啊……所以我一直都没想到是胶的问题。
丙烯，Tris8.8和6.8，还有SDS分别要怎样保存呢，保质期大概是多久呢？
谢谢老师！

作者: NBA 时间: 2013-2-7 15:41

大概是什么的问题呢，SDS？Tris8.8？丙烯？
但是我的蛋白Mark可以跑得很好啊……所以我一直都没想到是胶的问题。
丙烯，Tris8.8和6.8，还有SDS分别要怎样保存呢，保质期大概是多久呢？
谢谢老师！

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4度一年没问题
你调整一下后先染胶
把结果图放山来

作者: am10 时间: 2013-2-8 09:25

电泳时肉眼能在胶上看到Marker条带吗？
Marker反复冻融了吗？

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相同的marker，电泳后染胶可以看到条带。marker是买回来就分装了，不存在反复冻融的问题。现在在试别的marker，看看有没有改进。

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:25

QUOTE:

原帖由 am10 于 2013-2-8 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
电泳时肉眼能在胶上看到Marker条带吗？
Marker反复冻融了吗？

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相同的marker，电泳后染胶可以看到条带。mar ...

你的整个胶系统建议重配

作者: bs4665 时间: 2013-2-8 09:26

我是新手
最近跟着师兄在做
上周一直都很顺利
这周同样的样本和试剂,只是二抗的量有微调.
不知道为什么就是没有结果,只有内参的条带能出来,另外的目的蛋白完全不显
请教大概会是什么原因呢？

作者: ero11 时间: 2013-2-8 09:34

您好，我想问您几个问题：
我做的是单核细胞株上的TLR4蛋白表达，分子量90KD，转膜用的是70V湿转2小时，10%牛奶封闭过夜，一抗1：500孵育3小时，二抗1：5000孵育1小时，然后洗膜发光，但是TLR4基本上没有显影，但是内参很浓很明显，之前也是这个条件做出来过，但是今天不知道为什么做不出来了，请求指导！谢谢您。

作者: wmp1234 时间: 2013-2-8 09:35

请教我的目的蛋白是59kd和38kd。我转膜势400mA,转膜60分钟，但是转过了头（我分别进行考马斯亮蓝和丽春红染色）。以前我们也是这样的条件，但是转膜恰好，这是什么原因呢？你看以上的目标蛋白改用多大的电流和时间呢？我的膜是NC膜，谢谢！

作者: loli 时间: 2013-2-8 09:36

楼主，您好！
我最近做western遇到一些问题向您请教下。抗体是cell signal的，第一次做的时候一抗按照1：2000稀释，二抗1：2000稀释，蛋白上样量15ug，没有杂出任何条带，考虑可能一抗浓度不够，第二次把一抗的浓度调整为1：1000，蛋白上样量30ug，因为是连续做的，所以接着用了前面的抗体，把浓度调整了一下，还是什么都没有杂出来，第三次考虑二抗的浓度过高消耗了ECL底物，把二抗浓度调整为1：4000，上样量40ug，还是什么都没出现，此外第二次actin出现了一次，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，请问楼主是什么原因呢？

作者: www.1 时间: 2013-2-8 09:37

楼主好：我做130kd的蛋白，8%的胶。转膜液体10%甲醇，千分之一SDS。300ma 1个半小时。转膜完成后发现marker在膜上不明显无法切膜。奇怪的是比较小的marker都能看到，反而是70多的红色marker非常模糊.请您分析一下是什么原因。

作者: fei1226com 时间: 2013-2-8 09:40

4度一年没问题
你调整一下后先染胶
把结果图放山来

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恩，谢谢老师，找到原因了，是电泳缓冲液的问题，重新配了一批，现在已经正常了。

作者: ritou1985 时间: 2013-2-8 09:40

楼主好，看了你众多的问题解答，觉得收益匪浅！感谢！
最近开始做WB，一个月前学习这门技术时只做内参蛋白GAPDH，条带每次都很好，正式开始做目的蛋白了，结果却没有很迷惘！我开始给自己找原因：
1，因为粗心，电转液新配制时忘记加甲醇了，可是考马斯亮蓝染色证实蛋白都转到膜上了，是否没有加甲醇会对结果有很重要的影响？？
2. 换了一瓶新的ECL显色液，想证实一下显色液是否有问题，我看论坛上提到在NC膜上点杂交的办法，实验室没有NC膜，请问PVDF膜可以用来检测二抗，及ECL显色液是否有问题？？怎么检测，能否告知具体方法？？非常感谢！！
3，同一瓶电转缓冲液储存液前后两次配制的电转液，一次电流达到350MA，一次电压达到100V，分别是按恒流及恒压电转的，所以很奇怪？？电转仪器用的是BIO-RAD的装置！
楼主可否给予一定的建议和意见！
蛋白我认为是没有问题，冰上孵育我都很注意！考马斯亮蓝染色证实蛋白是存在的！可是结果不知怎么解释？？希望楼主帮帮我！

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:40

是新手
最近跟着师兄在做
上周一直都很顺利
这周同样的样本和试剂,只是二抗的量有微调.
不知道为什么就是没有结果,只有内参的条带能出来,另外的目的蛋白完全不显
请教大概会是什么原因呢？

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样品冻融了几次？
感觉是样品冻融

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:41

您好，我想问您几个问题：
我做的是单核细胞株上的TLR4蛋白表达，分子量90KD，转膜用的是70V湿转2小时，10%牛奶封闭过夜，一抗1：500孵育3小时，二抗1：5000孵育1小时，然后洗膜发光，但是TLR4基本上没有显影，但是内参很浓很明显，之前也是这个条件做出来过，但是今天不知道为什么做不出来了，请求指导！谢谢您。

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是同样的样品吗？
考虑一下样品降解

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:42

请教我的目的蛋白是59kd和38kd。我转膜势400mA,转膜60分钟，但是转过了头（我分别进行考马斯亮蓝和丽春红染色）。以前我们也是这样的条件，但是转膜恰好，这是什么原因呢？你看以上的目标蛋白改用多大的电流和时间呢？我的膜是NC膜，谢谢！

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300mA 60min就够了

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:42

楼主，您好！
我最近做western遇到一些问题向您请教下。抗体是cell signal的，第一次做的时候一抗按照1：2000稀释，二抗1：2000稀释，蛋白上样量15ug，没有杂出任何条带，考虑可能一抗浓度不够，第二次把一抗的浓度调整为1：1000，蛋白上样量30ug，因为是连续做的，所以接着用了前面的抗体，把浓度调整了一下，还是什么都没有杂出来，第三次考虑二抗的浓度过高消耗了ECL底物，把二抗浓度调整为1：4000，上样量40ug，还是什么都没出现，此外第二次actin出现了一次，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，请问楼主是什么原因呢？

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1，第三次actin用的半个月以前配的杂出来了，新近配的没杂出来，你说的新近配的是什么意思
2，目的蛋白是什么？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:43

楼主好：我做130kd的蛋白，8%的胶。转膜液体10%甲醇，千分之一SDS。300ma 1个半小时。转膜完成后发现marker在膜上不明显无法切膜。奇怪的是比较小的marker都能看到，反而是70多的红色marker非常模糊.请您分析一下是什么原因。

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这样的情况要看看你的marker如何了
丽春红染过转移后的膜吗？
用丽春红染膜来验证一下转移效果

作者: 831226 时间: 2013-2-8 09:45

你好我最近在做WESTERN 出现个问题，就是当切割完胶后放入转印槽中打开电泳仪没有电流不知道出现什么问题检测后发现不是电线的问题也是不电泳仪的问题，但是弄不懂为什么没有电流那？就是没接通的状态。
敬等回答，谢谢了！~

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:46

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-2-8 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好我最近在做WESTERN 出现个问题，就是当切割完胶后放入转印槽中打开电泳仪没有电流不知道出现什么问题检测后发现不是电线的问题也是不电泳仪的问题，但是弄不懂为什么没有电流那？就是没接通的状态。
敬等回答，谢谢 ...

半干还是湿转？
如果是半干的话有可能是滤纸、膜、胶、滤纸短路了
要是湿转的话不存在短路问题

作者: standbyme 时间: 2013-2-8 09:47

请教！WB的结果条带用软件进行统计后出现两个数值：总密度与平均密度。
请问目的条带要与内参条带进行比对时应该用哪个数值比较准确？貌似有不少人用的是平均密度的比值去比较，但我觉得总密度才能很好衡量反映总量，而且肉眼看总密度似乎得出的结果更准些？我的结果是用总密度比较有差别而平均密度没有差别。

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:48

QUOTE:

原帖由 standbyme 于 2013-2-8 09:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请教！WB的结果条带用软件进行统计后出现两个数值：总密度与平均密度。
请问目的条带要与内参条带进行比对时应该用哪个数值比较准确？貌似有不少人用的是平均密度的比值去比较，但我觉得总密度才能很好衡量反映总量，而且肉眼 ...

个人感觉现在用的多的是积分光密度值（IOD）
用目的条带的IOD比上相应内参的IOD
IOD是总的密度

作者: shenkunjie 时间: 2013-2-8 09:48

样品冻融了几次？
感觉是样品冻融

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样本用了2个月，做的次数也不超过10次
是冻融次数多会使样本蛋白降解吗？可为什么内参可以出来呢

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:49

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2013-2-8 09:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
样品冻融了几次？
感觉是样品冻融

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样本用了2个月，做的次数也不超过10次
是冻融次数多会使样本蛋白降解吗？可为什么内参可以出来呢 ...

内参当然能出来了
我做过37度水浴实验
样品用37度水浴融化、-20度冻起来、37度水浴融化.....
这样做10次内参条带有些减弱，但是还能做出来
内参是比较稳定的蛋白、含量较多，冻融后条带会一次比一次弱的
目的蛋白就不一样了

作者: zhezhe 时间: 2013-2-8 09:49

我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！

作者: qianqin1977 时间: 2013-2-8 09:50

请教版主：

我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊

作者: xingyi08 时间: 2013-2-8 09:51

B-ACTIN不齐一定是测蛋白浓度引起的吗？我今天做了一个5组的组织蛋白，1，2组ACTIN很粗，3，4，5较细但这三组比较齐，不知是什么原因，请帮我回答一下吧？谢谢！

作者: am10 时间: 2013-2-8 09:52

我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！

=======================================================

如果你的分离效果好，最好是在40-55之间的位置把膜剪开，各做各的；
如果不好剪，那你就先做目标蛋白，目标蛋白出来后在做内参。

作者: S6044 时间: 2013-2-8 09:53

我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊

谢谢谢谢谢谢谢~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:53

我目的蛋白大概40kD，内参为B-Tubulin 55kD，想在一张膜上把这两个蛋白抗体都结合上去，请问：我是应该先孵育一种抗体，洗涤，再孵育另一种抗体，洗涤，上二抗；还是把两种蛋白抗体混合在一起孵育，洗涤，再上二抗？两种抗体之间会不会互相影响？谢谢！

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可以啊
第一：先杂交目的蛋白，加二抗、曝光、用缓冲液洗去ECL，加入内参一抗、二抗、曝光
第二：先杂交目的蛋白，加二抗、曝光，然后用stripping buffer洗去目的蛋白的一抗与二抗，然后封闭，杂交内参
good luck

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:56

请教版主：

我现在正在做一个非磷酸化蛋白的Wb，蛋白分子量是80KD，这个蛋白有磷酸化和非磷酸化两种状态，非磷酸化状态时在胞核，磷酸化时在胞浆，之前提的冰冻组织的总蛋白，裂解液用的是碧云天的，上样量加到了150微克，一抗稀释浓度为1比100都没怎么做出来，请问我这种情况需要提取核蛋白做吗？

有没有一些好的建议，提示一二，感激不尽啊

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1，什么蛋白？抗体用的是什么厂家的？货号多少？不方便说可以pm我
2，提取的方法是什么？详细点说

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:57

B-ACTIN不齐一定是测蛋白浓度引起的吗？我今天做了一个5组的组织蛋白，1，2组ACTIN很粗，3，4，5较细但这三组比较齐，不知是什么原因，请帮我回答一下吧？谢谢！

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测定蛋白浓度、调整蛋白浓度、上样、转膜、抗体孵育都会引起
你自己可以想一想

作者: NBA 时间: 2013-2-8 09:57

如果你的分离效果好，最好是在40-55之间的位置把膜剪开，各做各的；
如果不好剪，那你就先做目标蛋白，目标蛋白出来后在做内参。

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我的做法是用大的电泳槽
分离胶在10cm左右
充分分离
剪开做
呵呵

作者: DONT 时间: 2013-2-8 09:58

相关疾病：
阳萎心肌梗死
试验中又发现一些小问题，想请教一下。
1.现在天气热，27度空调房里，分离胶几分钟就凝了，减少APS和EDMET的量，20分钟左右凝好，积层胶30多分钟凝好。想问一般时间控制在多少好。我现在12%的胶上样后，积层胶还好，基本可成一条线，压线后进入分离胶就变得很散，跑到最后时，最下面溴酚蓝的带很宽，大约0.8cm,我以前跑胶时基本都很漂亮的一条线。请问这是什么造成的，会不会影响结果（个人感觉蛋白带被拉长拉细了），是不是胶凝得不好的缘故？
2.转膜，半干转，15V 45min，小点分子量的预览Mark已经转过到滤纸上了，但72KD的在胶上还可以看到残留，染胶有蛋白带残留，条带稍模糊，也很细。请教，我要不要改善转膜条件呢？是降低电压延长时间还是怎样呢？
谢谢

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 09:59

相关疾病：
大动脉炎
另外，用santa cruz的一抗，1：150稀释，4°过夜，相应二抗室温1h，最后DAB染色，没看到目标蛋白带，也没有背景，完全白板，是什么原因呢？同样条件的内参有条带，但也不强。蛋白应该在膜上，转后用丽春红染过。上样的蛋白量也有100ug了。

作者: is2011 时间: 2013-2-8 10:00

想求问，蜡块能否进行western blot？效果会不会受很大影响？
蜡块是上一届师兄留下来的，大约是2-4月份做的，保存在-80度下

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-8 10:02

目的蛋白是IKK-β,actin是当时做的时候取了2ul溶在了5%的BSA4ml中，按1：2000稀释的，我们是丽春红染色后把膜剪开了，actin和目的蛋白分开杂的

作者: 2541 时间: 2013-2-8 10:03

半干还是湿转？
如果是半干的话有可能是滤纸、膜、胶、滤纸短路了
要是湿转的话不存在短路问题

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谢谢老师指导
我们是半转干，那可能是短路了如果是短路的话在重新做没问题吧转印槽没事吧只要重新跑下电泳切胶就可以了吧

作者: plaa 时间: 2013-2-8 10:03

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大动脉炎阳萎
恩，谢谢NBA师兄！我现在每天都在做WB，但是始终是找不到最佳的一抗二抗稀释比例，我用的是DAB显色法，一抗的话试过1：500，1：1000的，二抗试过1：2000，1：4000的！一抗是santa的，二抗是ZYMED实验室的，我的上样量是25微升，大概40微克的样子，电泳液转移液都是新鲜配置的，转膜之后用立春红染色条带很清晰，但是DAB显色就是看不清，我师姐用了1：500一抗，二抗和我用的不一样，也做出来了。我的封闭时间是2个小时，TBST洗涤时间是接近45分钟，洗涤和封闭时间延长应该只有好处没有坏处吧？一抗二抗为什么不是越浓越好阿，虽然可能会有非特异的条带，但是好歹算看得见吧？谢谢，希望师兄看到的话早点回哦，谢谢！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-8 10:04

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心肌梗死
目的蛋白100-130KD 5%浓缩胶 8%分离胶。转膜液20%甲醇，千分之一SDS。恒流300ma 1h20min.
发现内参出现2到3条带。蛋白样品是新制的。原来做17的从来没出现过这种情况。请楼主分析一下原因。已经重复两次了，内参都是这样的。膜是新买的0.45的PVDF。

作者: DNA 时间: 2013-2-8 10:05

请教一下，干转，电压调到25v，结果只上到16v就不增加了，为什么
转膜分子量62KD，干转，一小时十分钟可以吗

作者: 66+77 时间: 2013-2-8 10:07

我用的六一的电泳仪DYY-7C湿转，六一的DYCZ-24DNmini型电转移，我的目的蛋白是35-38kd，请问我电转需要多久

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:10

相关疾病：
心肌梗死

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NBA老师，试验中又发现一些小问题，想请教一下。
1.现在天气热，27度空调房里，分离胶几分钟就凝了，减少APS和EDMET的量，20分钟左右凝好，积层胶30多分钟凝好。想问一般时间控制在多少好。我现在12%的胶上样后，积层胶还好，基本可成一条线，压线后进入分离胶就变得很散，跑到最后时，最下面溴酚蓝的带很宽，大约0.8cm,我以前跑胶时基本都很漂亮的一条线。请问这是什么造成的，会不会影响结果（个人感觉蛋白带被拉长拉细了），是不是胶凝得不好的缘故？
2.转膜，半干转，15V 45min，小点分子量的预览Mark已经转过到滤纸上了，但72KD的在胶上还可以看到残留，染胶有蛋白带残留，条带稍模糊，也很细。请教，我要不要改善转膜条件呢？是降低电压延长时间还是怎样呢？
谢谢

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1，分离胶20min左右可以啊，40min到1h凝好为佳
2，浓缩胶我一般是12min
3，溴酚蓝会跑的很宽，胶浓度为15%溴酚蓝不会散
4，转膜电压的没有经验，我用恒流，70K的蛋白我选择1.2mA每平方厘米膜面积，时间 1h10min左右

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:10

另外，用santa cruz的一抗，1：150稀释，4°过夜，相应二抗室温1h，最后DAB染色，没看到目标蛋白带，也没有背景，完全白板，是什么原因呢？同样条件的内参有条带，但也不强。蛋白应该在膜上，转后用丽春红染过。上样的蛋白量也有100ug了。

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转膜不充分

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:11

想求问，蜡块能否进行western blot？效果会不会受很大影响？
蜡块是上一届师兄留下来的，大约是2-4月份做的，保存在-80度下

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原则上来说应该可以吧
我没做过
做蜡块要把蜡先脱掉

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:12

目的蛋白是IKK-β,actin是当时做的时候取了2ul溶在了5%的BSA4ml中，按1：2000稀释的，我们是丽春红染色后把膜剪开了，actin和目的蛋白分开杂的

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可以啊

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:12

谢谢老师指导
我们是半转干，那可能是短路了如果是短路的话在重新做没问题吧转印槽没事吧只要重新跑下电泳切胶就可以了吧

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是的
这次滤纸和胶、膜大小要一致
看看还有没有短路现象

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:14

相关疾病：
阳萎

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恩，谢谢fangweibin119师兄！我现在每天都在做WB，但是始终是找不到最佳的一抗二抗稀释比例，我用的是DAB显色法，一抗的话试过1：500，1：1000的，二抗试过1：2000，1：4000的！一抗是santa的，二抗是ZYMED实验室的，我的上样量是25微升，大概40微克的样子，电泳液转移液都是新鲜配置的，转膜之后用立春红染色条带很清晰，但是DAB显色就是看不清，我师姐用了1：500一抗，二抗和我用的不一样，也做出来了。我的封闭时间是2个小时，TBST洗涤时间是接近45分钟，洗涤和封闭时间延长应该只有好处没有坏处吧？一抗二抗为什么不是越浓越好阿，虽然可能会有非特异的条带，但是好歹算看得见吧？谢谢，希望师兄看到的话早点回哦，谢谢！

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1，Zymed的二抗我用过，很好用，用ECL发光的时候它的稀释度是1：10000
2，一抗、二抗的浓度要合适才好，建议你看《抗体技术指南》一书

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:14

恩，谢谢NBA师兄！我现在每天都在做WB，但是始终是找不到最佳的一抗二抗稀释比例，我用的是DAB显色法，一抗的话试过1：500，1：1000的，二抗试过1：2000，1：4000的！一抗是santa的，二抗是ZYMED实验室的，我的上样量是25微升，大概40微克的样子，电泳液转移液都是新鲜配置的，转膜之后用立春红染色条带很清晰，但是DAB显色就是看不清，我师姐用了1：500一抗，二抗和我用的不一样，也做出来了。我的封闭时间是2个小时，TBST洗涤时间是接近45分钟，洗涤和封闭时间延长应该只有好处没有坏处吧？一抗二抗为什么不是越浓越好阿，虽然可能会有非特异的条带，但是好歹算看得见吧？谢谢，希望师兄看到的话早点回哦，谢谢！

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你师姐也用DAB方法吗？
DAB与ECL的抗体稀释度是不一样的
ECL要更加敏感

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:15

目的蛋白100-130KD 5%浓缩胶 8%分离胶。转膜液20%甲醇，千分之一SDS。恒流300ma 1h20min.
发现内参出现2到3条带。蛋白样品是新制的。原来做17的从来没出现过这种情况。请楼主分析一下原因。已经重复两次了，内参都是这样的。膜是新买的0.45的PVDF。

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内参变成两条首先考虑样品反复冻融，降解

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:15

请教一下，干转，电压调到25v，结果只上到16v就不增加了，为什么
转膜分子量62KD，干转，一小时十分钟可以吗

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我喜欢用恒流
1.2mA每平方厘米膜面积，转膜1h即可

作者: tuuu2 时间: 2013-2-8 10:16

相关疾病：
糖尿病肾病心肌梗死

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我用的六一的电泳仪DYY-7C湿转，六一的DYCZ-24DNmini型电转移，我的目的蛋白是35-38kd，请问我电转需要多久

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DYCZ-24DN mini型是电泳槽吧
湿转的话我用300mA，40min

作者: greenbee 时间: 2013-2-8 10:16

我是新手，想问一个问题：转膜完毕后，5%脱脂牛奶封闭，4℃下可否放置3天时间？（因抗体的使用还没摸索，而实验负责人又不在）封闭时间过长对以后的一抗和2抗孵育会产生什么影响？

作者: greenbee 时间: 2013-2-8 10:17

不好意思，再补充一个问题，电泳加样一般都是用什么加呢？
我以前用微量进样器，后来老师批评说微量进样器不准，而且每次用完要现冲洗，易污染使用麻烦，让我订一种取样枪加样用的枪头，这种枪头底部很扁且长，能插进电泳槽的加样孔里边，我去网上查了几个大公司的都没有，如果版主老师知道的话，请不吝告知，多谢了！

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:17

我是新手，想问一个问题：转膜完毕后，5%脱脂牛奶封闭，4℃下可否放置3天时间？（因抗体的使用还没摸索，而实验负责人又不在）封闭时间过长对以后的一抗和2抗孵育会产生什么影响？

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我以前做过
在4度不会有太多的影响

作者: lgm 时间: 2013-2-8 10:18

不好意思，再补充一个问题，电泳加样一般都是用什么加呢？
我以前用微量进样器，后来老师批评说微量进样器不准，而且每次用完要现冲洗，易污染使用麻烦，让我订一种取样枪加样用的枪头，这种枪头底部很扁且长，能插进电泳槽的加样孔里边，我去网上查了几个大公司的都没有，如果版主老师知道的话，请不吝告知，多谢了！

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10ul的枪头就可以加样的
祝你好运

作者: mimili_901 时间: 2013-2-8 10:19

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糖尿病肾病
六一的电泳仪DYY-7C，电泳用的是北京六一DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪(槽)（小号），湿转仪型号为北京六一的DYCZ-40D迷你型转移槽，我的目的蛋白为35-38kd，我的目的蛋白表达量很低，现在上样达到100ug，目的蛋白有的时候出现条带，有的时候曝光没有出现条带，我现在用PVDF膜（0.22），我的转膜时间是多少，是不是300ma转膜40分钟吗？可以延长时间让更多的蛋白转到膜上吗
期待您的答复
提前谢谢您

作者: hustwb 时间: 2013-2-8 10:20

相关疾病：
心肌梗死

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10ul的枪头就可以加样的
祝你好运

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其实我也想用枪头加，一般我是把2块玻璃板卡好后往两板中间加电泳液加满，再用微量加样器加样。用枪头加的话是不是不能把电泳液加满啊？也就是说加样口不能和缓冲液页面持平？

实验室4度离心机坏了，离心能用别的办法把温度控制在4度么？

裂解后12000RPM 15MIN左右是不是时间长了啊？还是和细胞数有关？我今天只离了五分钟。
这几天试试了5X106细胞提下蛋白，一般是2-3UG/UL，不知道行不？

作者: XYZQ 时间: 2013-2-8 10:21

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我是新手，假期准备做WB，想请教几个问题。我准备测的蛋白有细胞色素C、Caspase3和PARP，是做诱导肿瘤细胞凋亡的，湿转，BIO RAD Mini-PROTEAN 3 电泳系统。我想知道这些蛋白的转膜条件和注意事项，我还需要告诉大家什么信息？谢谢各位！

作者: 33号 时间: 2013-2-8 10:22

相关疾病：
多发性硬化
谢谢版主悉心指导，最近关于western 也是在边做边摸索，我看到网上说如果做的是磷酸化蛋白，在提取组织蛋白的时候需要使用含磷酸酶抑制剂的裂解液配方才可以，我在网上自行搜索了一下，说含有PMSF的裂解液就可以达到要求，我现在使用的是从试剂公司订购的RIPA裂解液（含PMSF浓度为1mM）我查了下RIPA的配方，里面没有抑制磷酸酶常用的钒酸钠，能达到阻止去磷酸化的效果么？
问题2：我看到很多人在讲做western时提到一个名词叫做杂交，是什么含义呢？我在园里搜索看到得回答说western杂交就是western blot，这种说法对么？
问题3：我下一步要做一抗孵育，要检的蛋白有两个，那这两个蛋白的一抗可否配成1份溶液（5%蛋白血清的TBST）同时进行孵育呢？因这两个1抗都是兔抗体IGg，我是不是只要用抗兔IGg的2抗就可以将2个蛋白的2抗同时完成了？

作者: loli 时间: 2013-2-8 10:23

我又来请教啦！
近来做WB，蛋白为7次跨膜蛋白，分子量220KD，一直采用胰酶消化法将细胞消化完了放-70度，三五天后集齐几个细胞一起做，但老是做不出很明显的条带（内参比较明显，而目的则经常是隐隐约约看不清楚），看了文献该蛋白的WB条带都还可以，不至于含量很低。起初用全蛋白提取试剂盒，后来改用进口的膜蛋白提取试剂盒还是没有改善。现在做不出来明显条带考虑会不会是消化时胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？或者方兄对我这个问题有何改进良方？多谢！！！

作者: gogo 时间: 2013-2-8 10:23

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糖尿病肾病
NBA老师您好：
我做WB用的是六一的电泳仪DYY-7C，电泳用的是北京六一DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪(槽)（小号），湿转仪型号为北京六一的DYCZ-40D迷你型转移槽，我的目的蛋白为35-38kd，我的目的蛋白表达量很低，现在上样达到100ug，目的蛋白有的时候出现条带，有的时候曝光没有出现条带，我现在用PVDF膜（0.22），我的转膜时间是多少，是不是300ma转膜40分钟吗？可以延长时间让更多的蛋白转到膜上吗
期待您的答复
提前谢谢您

作者: mamamiya 时间: 2013-2-8 10:24

请问NBA老师：配制好的APS在4度和-20度能放多久？有的说4度放2周就开始降解，是吗？降解了对结果有什么样的影响？

作者: ququer787 时间: 2013-2-8 10:25

我也有个问题想问你：
最近看了WB注意事项。
其中，很多教程里都写了这么一句话，
转膜时，滤纸的大小要小于膜的大小。
其目的是为了防止边缘滤纸接触，导致短路！
请问，滤纸接触就能导致短路吗？为什么？
如果上面命题成立的话，那么正负极之间的海绵接触不早就短路了吗
还是滤纸导电性大过缓冲液？
滤纸接触真的会导致转膜不成功吗？如果这样海绵之间是不是也需要铺满转移膜？

作者: 8princess8 时间: 2013-2-8 10:26

我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。
采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？

作者: 131415 时间: 2013-2-8 10:34

我最近（12年6月份）刚买的抗体上面的Ref. date是11年11月份，而且该抗体的Rev是11年4月。这是不是表明我买的抗体已经过期8个月了，基本失效了？Rev对于抗体是什么时间，生产日期嘛？这种情况下，我能否要求对方换货？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:38

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心肌梗死

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六一的电泳仪DYY-7C，电泳用的是北京六一DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪(槽)（小号），湿转仪型号为北京六一的DYCZ-40D迷你型转移槽，我的目的蛋白为35-38kd，我的目的蛋白表达量很低，现在上样达到100ug，目的蛋白有的时候出现条带，有的时候曝光没有出现条带，我现在用PVDF膜（0.22），我的转膜时间是多少，是不是300ma转膜40分钟吗？可以延长时间让更多的蛋白转到膜上吗
期待您的答复
提前谢谢您

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300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:38

相关疾病：
心肌梗死

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其实我也想用枪头加，一般我是把2块玻璃板卡好后往两板中间加电泳液加满，再用微量加样器加样。用枪头加的话是不是不能把电泳液加满啊？也就是说加样口不能和缓冲液页面持平？

实验室4度离心机坏了，离心能用别的办法把温度控制在4度么？

裂解后12000RPM 15MIN左右是不是时间长了啊？还是和细胞数有关？我今天只离了五分钟。
这几天试试了5X106细胞提下蛋白，一般是2-3UG/UL，不知道行不？

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1，我是加满了之后上样的，在你的sample buffer中有甘油，样品会很快沉底的
2，控制在4度我没有好办法
3，4度离心我一般是15到20min
4，细胞蛋白浓度一般就是你说的这个样子，当然行了

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:39

相关疾病：
肿瘤

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我是新手，假期准备做WB，想请教几个问题。我准备测的蛋白有细胞色素C、Caspase3和PARP，是做诱导肿瘤细胞凋亡的，湿转，BIO RAD Mini-PROTEAN 3 电泳系统。我想知道这些蛋白的转膜条件和注意事项，我还需要告诉大家什么信息？谢谢各位！

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你说的这几个我都做过
要注意蛋白提取
PARP-1，定位在细胞核，所以你要提取核蛋白来做（这个蛋白在胞浆中很少，可能检不出来，要注意）
caspase3定位在胞浆，要用胞浆蛋白来做
cytochrome C定位在mitochondrial matrix
祝你好运

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:40

相关疾病：
多发性硬化心肌梗死大动脉炎

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谢谢fang版主悉心指导，最近关于western 也是在边做边摸索，我看到网上说如果做的是磷酸化蛋白，在提取组织蛋白的时候需要使用含磷酸酶抑制剂的裂解液配方才可以，我在网上自行搜索了一下，说含有PMSF的裂解液就可以达到要求，我现在使用的是从试剂公司订购的RIPA裂解液（含PMSF浓度为1mM）我查了下RIPA的配方，里面没有抑制磷酸酶常用的钒酸钠，能达到阻止去磷酸化的效果么？
问题2：我看到很多人在讲做western时提到一个名词叫做杂交，是什么含义呢？我在园里搜索看到得回答说western杂交就是western blot，这种说法对么？
问题3：我下一步要做一抗孵育，要检的蛋白有两个，那这两个蛋白的一抗可否配成1份溶液（5%蛋白血清的TBST）同时进行孵育呢？因这两个1抗都是兔抗体IGg，我是不是只要用抗兔IGg的2抗就可以将2个蛋白的2抗同时完成了？

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1，我认为不妥，PMSF在水溶液中全部降解是30min，你买的RIPA中有PMSF，应该全部降解了
建议你买磷酸酶的cocktail，我一直在用Roche的，很好
2，这个你不用太在意，有叫做Western blot，western blotting，immunoblot
3，不可以

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:40

谢谢版主悉心指导，最近关于western 也是在边做边摸索，我看到网上说如果做的是磷酸化蛋白，在提取组织蛋白的时候需要使用含磷酸酶抑制剂的裂解液配方才可以，我在网上自行搜索了一下，说含有PMSF的裂解液就可以达到要求，我现在使用的是从试剂公司订购的RIPA裂解液（含PMSF浓度为1mM）我查了下RIPA的配方，里面没有抑制磷酸酶常用的钒酸钠，能达到阻止去磷酸化的效果么？
问题2：我看到很多人在讲做western时提到一个名词叫做杂交，是什么含义呢？我在园里搜索看到得回答说western杂交就是western blot，这种说法对么？
问题3：我下一步要做一抗孵育，要检的蛋白有两个，那这两个蛋白的一抗可否配成1份溶液（5%蛋白血清的TBST）同时进行孵育呢？因这两个1抗都是兔抗体IGg，我是不是只要用抗兔IGg的2抗就可以将2个蛋白的2抗同时完成了？

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3，会有交叉反应
不建议你采用

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:48

近来做WB，蛋白为7次跨膜蛋白，分子量220KD，一直采用胰酶消化法将细胞消化完了放-70度，三五天后集齐几个细胞一起做，但老是做不出很明显的条带（内参比较明显，而目的则经常是隐隐约约看不清楚），看了文献该蛋白的WB条带都还可以，不至于含量很低。起初用全蛋白提取试剂盒，后来改用进口的膜蛋白提取试剂盒还是没有改善。现在做不出来明显条带考虑会不会是消化时胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？或者方兄对我这个问题有何改进良方？多谢！！！

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如果目的蛋白现在已经有隐约的条带的话
其他的不用改
建议你用更加灵敏的ECL

作者: NBA 时间: 2013-2-8 10:55

近来做WB，蛋白为7次跨膜蛋白，分子量220KD，一直采用胰酶消化法将细胞消化完了放-70度，三五天后集齐几个细胞一起做，但老是做不出很明显的条带（内参比较明显，而目的则经常是隐隐约约看不清楚），看了文献该蛋白的WB条带都还可以，不至于含量很低。起初用全蛋白提取试剂盒，后来改用进口的膜蛋白提取试剂盒还是没有改善。现在做不出来明显条带考虑会不会是消化时胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？或者方兄对我这个问题有何改进良方？多谢！！！

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胰蛋白酶使细胞膜上的跨膜蛋白降解导致目的条带弱？
你说的这个问题很好
我以前没考虑过
我认为胰酶消化会损失一部分
贴壁细胞你可以直接加裂解液提取蛋白的

作者: wsll 时间: 2013-2-8 10:57

呵呵，谢谢指点！我下次直接加裂解液试试

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 11:07

请问：配制好的APS在4度和-20度能放多久？有的说4度放2周就开始降解，是吗？降解了对结果有什么样的影响？

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4度2周重配
-20度可以保存半年
降解了对结果有很大影响
胶不会聚合

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 11:07

我也有个问题想问你：
最近看了WB注意事项。
其中，很多教程里都写了这么一句话，
转膜时，滤纸的大小要小于膜的大小。
其目的是为了防止边缘滤纸接触，导致短路！
请问，滤纸接触就能导致短路吗？为什么？
如果上面命题成立的话，那么正负极之间的海绵接触不早就短路了吗
还是滤纸导电性大过缓冲液？
滤纸接触真的会导致转膜不成功吗？如果这样海绵之间是不是也需要铺满转移膜？

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在半干转中滤纸上的缓冲液，起电极作用（及支持作用）
在湿转中滤纸只起支持作用，不会短路

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 11:08

我得实验室首先构建原核表达，将我要的蛋白序列装到表达载体pGEX-4T1中，我大概算了一下，载体表达蛋白GST ,26kd .我的目的蛋白是11kd .将装有目的蛋白的重组质粒转入BL21 表达菌。挑斑诱导30度，6小时，跑蛋白胶，同时以BL21，pGEX-4T1未诱导与诱导作为对照，在37KD左右可以明显看到蛋白表达。故采用此条件大量诱导，超声提取融合蛋白。上GST珠子，用gsh 洗脱液洗脱。将洗下的蛋白进行透析纯化，进行定量以及电泳检测。采用1mg/ml与佐剂混匀注射兔子。定期采血清。ELISA检测抗体效价，当效价为1/10000时采血。取血清。
采用细菌蛋白跑western ，用抗血清1：1000可以看到明显的目的条带。由于我的基因是x物种，故想用抗血清来检测x 物种中组织中该基因是否有表达。但是组织蛋白我上了30ug 60ug 均未发现目的条带，为什么？原因出在哪？

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组织中目的蛋白11KD，不太好做
可能在你的WB系统上有问题
另外你用细菌蛋白做WB的时候抗体应该会识别两个蛋白：GST与你的目的蛋白
但是你做组织的时候情况就会不一样了

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 11:09

我最近（09年6月份）刚买的抗体上面的Ref. date是08年11月份，而且该抗体的Rev是08年4月。这是不是表明我买的抗体已经过期8个月了，基本失效了？Rev对于抗体是什么时间，生产日期嘛？这种情况下，我能否要求对方换货？
谢谢

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呵呵
你说的这个时间问题我不懂
每个厂家它标时间用的单词会不一样
说实话
如果是进口抗体的话按照它的保存条件保存一般一年是不会有什么问题的
我用过的抗体有保存两年的，超出保质期都一年了，效果依旧很好
当然你可以要求退换

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-8 11:09

呵呵，谢谢方兄指点！我下次直接加裂解液试试

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直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

作者: loli 时间: 2013-2-8 11:23

直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

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用的进口的，加了裂解液后必须直接做吗？因为细胞多，不能长到同时裂解，能不能加完裂解液后放到-70先冻两天，这样会不会有影响？

作者: ending 时间: 2013-2-8 11:34

相关疾病：
感染性心内膜炎

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用的进口的，加了裂解液后必须直接做吗？因为细胞多，不能长到同时裂解，能不能加完裂解液后放到-70先冻两天，这样会不会有影响？

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进口的是不是用的Pierce的？
把提完的蛋白放在-70度保存就可以啊
等最后一起测试呗

作者: duoduo 时间: 2013-2-8 11:35

你说的这几个我都做过
要注意蛋白提取
PARP-1，定位在细胞核，所以你要提取核蛋白来做（这个蛋白在胞浆中很少，可能检不出来，要注意）
caspase3定位在胞浆，要用胞浆蛋白来做
cytochrome C定位在mitochondrial matrix
祝你好运

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老师您好，首先感谢您的回复，我还有两个问题，请您看看。
一、我在裂细胞收蛋白的时候，用的是碧云天的western及IP细胞裂解液（产品编号P0013），不知道能否满足我要跑的蛋白的要求。
二、今天我刚把实验室的电泳和电转的型号抄下来，针对我要跑的这三个蛋白，能否请老师给出相应的电转条件，十分感谢！
一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型

作者: greenbee 时间: 2013-2-8 11:37

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心肌梗死
300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

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染过胶我曾经用300ma 1.5个小时染胶仍然有残留，不知道是怎么回事
电转液没有加SDS

作者: summerxx 时间: 2013-2-8 11:47

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多发性硬化
我的组织蛋白提取后浓度较大，而western电泳的上样量有限制，所以我的样品上样体积要很小，我想把样品稀释下，那样量取样品样好操作些，请问有什么方法呢。看到有的说可以用裂解液稀释，那这个裂解液可不可以是不加PMSF的啊。或者有没有其他的方法可以解决这个问题啊。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:48

老师您好，首先感谢您的回复，我还有两个问题，请您看看。
一、我在裂细胞收蛋白的时候，用的是碧云天的western及IP细胞裂解液（产品编号P0013），不知道能否满足我要跑的蛋白的要求。
二、今天我刚把实验室的电泳和电转的型号抄下来，针对我要跑的这三个蛋白，能否请老师给出相应的电转条件，十分感谢！
一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型

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1，做PARP这个蛋白可能会效果比较差，另两个应该问题不大
2，你用湿转还是半干转？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:48

300mA 40min够了
在mini胶中上样量100ug已经很大了
你上样100ug的时候染过胶吗？（在没有转膜前）

染过胶我曾经用300ma 1.5个小时染胶仍然有残留，不知道是怎么回事
电转液没有加SDS

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有残留是很正常的
你的蛋白分子量多大？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:49

相关疾病：
多发性硬化

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我的组织蛋白提取后浓度较大，而western电泳的上样量有限制，所以我的样品上样体积要很小，我想把样品稀释下，那样量取样品样好操作些，请问有什么方法呢。看到有的说可以用裂解液稀释，那这个裂解液可不可以是不加PMSF的啊。或者有没有其他的方法可以解决这个问题啊。谢谢

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[size=2]稀释样品的时候一般用裂解液或者PBS，加入样品缓冲液后变性，变性后蛋白降解就会慢很多
PMSF是一种光谱的抑制剂，在蛋白提取中要加，很重要
祝你实验顺利

作者: u234 时间: 2013-2-8 11:50

1，做PARP这个蛋白可能会效果比较差，另两个应该问题不大
2，你用湿转还是半干转？

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恩，我用的是湿转。PARP的问题怎么解决呢？是换一种裂解液吗？谢谢

作者: hold住 时间: 2013-2-8 11:50

我的目的蛋白有35-38kd，我的目的蛋白表达很少，目的蛋白是膜蛋白，怎么才能解决呢

作者: mimili_901 时间: 2013-2-8 11:51

1，Zymed的二抗我用过，很好用，用ECL发光的时候它的稀释度是1：10000
2，一抗、二抗的浓度要合适才好，建议你看《抗体技术指南》一书

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恩，好的，谢谢fangweibin119师兄，我重新稀释一下抗体再试试！

作者: wood533 时间: 2013-2-8 11:51

关于转膜
以前我们对50Kd左右的蛋白用恒流400ma1小时转膜，很好。现在用同样的条件发现转过头了，因为预染的MARKER的颜色都没有了，用丽春红染色发现膜上没有蛋白。请问是何原因？县天气炎热，转膜与温度有关系吗？
另外我看到您说恒流用1.2MA/CM2，这平方厘米是膜的面积吗？如是的话，每次转膜时裁的膜不一样，那电流也不一样是吗？
以您的经验，我分子量为38KD和59KD的两种蛋白加上内参43KD，转膜用恒流的话用400MA该多长时间？如用300MA，那需要多长时间？谢谢
丽春红染色液有使用期限吗？我怀疑是否是转膜成功但丽春红失效了。该入和判断丽春红失效呢？

作者: shenkunjie 时间: 2013-2-8 11:52

请问：
ki-67的分子量为300多，这样可以做western blot吗？

作者: okhaha 时间: 2013-2-8 11:54

1，我是加满了之后上样的，在你的sample buffer中有甘油，样品会很快沉底的
2，控制在4度我没有好办法
3，4度离心我一般是15到20min
4，细胞蛋白浓度一般就是你说的这个样子，当然行了

================================================================================================

谢谢老师了，几天没看到还以为您出外云游了，呵呵
今天看了个操作指南，胶聚合后加了电泳缓冲液再拔梳子。而我一般是把梳子拔了再卡在玻璃板中加缓冲液，那种方法更好。

作者: okhaha 时间: 2013-2-8 11:54

直接用预冷的PBS洗3遍细胞
洗完后把PBS弃去就可以加裂解液了，按照说明书操作
不知道你用的是哪家的膜蛋白提取试剂

============================================================

老师我以前试过用冷的PBS洗细胞有脱落的现象，查资料好像有这种可能性。
所以现在我一般是把PBS拿出来放一下再洗六孔板的细胞。
如果用冷的PBS洗细胞脱落了，是不是说明细胞本身状态就不好啊？

作者: jkobn 时间: 2013-2-8 11:54

我用ECL显影后，整张膜都是黑的，啥原因造成的啊？谢谢了！！

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:55

QUOTE:

原帖由 jkobn 于 2013-2-8 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用ECL显影后，整张膜都是黑的，啥原因造成的啊？谢谢了！！

是的
要用提取核蛋白的试剂

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:55

我的目的蛋白有35-38kd，我的目的蛋白表达很少，目的蛋白是膜蛋白，怎么才能解决呢

====================================

用提取膜蛋白的试剂
表达量少的话要提高最后检测试剂的敏感性
比如高敏感性的ECL

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:55

关于转膜
以前我们对50Kd左右的蛋白用恒流400ma1小时转膜，很好。现在用同样的条件发现转过头了，因为预染的MARKER的颜色都没有了，用丽春红染色发现膜上没有蛋白。请问是何原因？县天气炎热，转膜与温度有关系吗？
另外我看到您说恒流用1.2MA/CM2，这平方厘米是膜的面积吗？如是的话，每次转膜时裁的膜不一样，那电流也不一样是吗？
以您的经验，我分子量为38KD和59KD的两种蛋白加上内参43KD，转膜用恒流的话用400MA该多长时间？如用300MA，那需要多长时间？谢谢
丽春红染色液有使用期限吗？我怀疑是否是转膜成功但丽春红失效了。该入和判断丽春红失效呢？

============================================================

1，我认为与你的缓冲液有关，另外400mA产生的温度相当高了，一定要降温
2，是膜面积，每次都要根据膜的面积来计算电流
3，300mA 1h足够了
4，如何判断不清楚，不确定的话就重新配置一下，很简单啊

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:56

请问：
ki-67的分子量为300多，这样可以做western blot吗？

============================

可以啊
ki-67定位在细胞核
用细胞核提取试剂盒
300K多要用梯度胶或者大的分离胶

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:56

谢谢老师了，几天没看到还以为您出外云游了，呵呵
今天看了个操作指南，胶聚合后加了电泳缓冲液再拔梳子。而我一般是把梳子拔了再卡在玻璃板中加缓冲液，那种方法更好。

==================================

我用拔了梳子之后再加缓冲液的操作方法
加入缓冲液之后梳孔就看的不是很清楚了
有些孔是需要修改下的

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:56

老师我以前试过用冷的PBS洗细胞有脱落的现象，查资料好像有这种可能性。
所以现在我一般是把PBS拿出来放一下再洗六孔板的细胞。
如果用冷的PBS洗细胞脱落了，是不是说明细胞本身状态就不好啊？

=======================================

如果是正常的贴壁细胞一般是不会出现这种情况的
如果是状态不好的细胞肯定会洗掉的

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:57

我用ECL显影后，整张膜都是黑的，啥原因造成的啊？谢谢了！！！

===============

1，二抗浓度过高
2，一抗没有纯化
3，洗膜次数不够

作者: zhezhe 时间: 2013-2-8 11:58

1，二抗浓度过高
2，一抗没有纯化
3，洗膜次数不够

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二抗现在是1：2500，一抗没有纯化的问题我们自己貌似解决不了啊，还有洗膜我是洗3次，每次10分钟，第一次显影，整张膜都是黑的，然后又压了一张片子，结果不怎么黑了，但是条带只剩actin的了，我想是不是ECL残留过多的缘故？谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-2-8 11:58

二抗现在是1：2500，一抗没有纯化的问题我们自己貌似解决不了啊，还有洗膜我是洗3次，每次10分钟，第一次显影，整张膜都是黑的，然后又压了一张片子，结果不怎么黑了，但是条带只剩actin的了，我想是不是ECL残留过多的缘故？谢谢！！！

===================

ECL孵育完成后要弃去
但是不能全部吸干

作者: zhezhe 时间: 2013-2-8 11:59

ECL孵育完成后要弃去
但是不能全部吸干

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是啊，我是将膜夹出来放在另一干净的保鲜膜上的，这样不可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:00

是啊，我是将膜夹出来放在另一干净的保鲜膜上的，这样不可以吗？

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可以啊
用保鲜膜盖上
然后压片

作者: loli 时间: 2013-2-8 12:00

我用拔了梳子之后再加缓冲液的操作方法
加入缓冲液之后梳孔就看的不是很清楚了
有些孔是需要修改下的

=============================

谢谢老师，请问修改是什么意思呢？

作者: standbyme 时间: 2013-2-8 12:01

组织中目的蛋白11KD，不太好做
可能在你的WB系统上有问题
另外你用细菌蛋白做WB的时候抗体应该会识别两个蛋白：GST与你的目的蛋白
但是你做组织的时候情况就会不一样了

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谢谢了，我得细菌蛋白是可以识别两个蛋白。我想请教一下，怎样才能验证我得抗血清是可以使用的？你说的WB系统有问题，可否说清楚点。谢谢了

作者: zhezhe 时间: 2013-2-8 12:02

可以啊
用保鲜膜盖上
然后压片

==============================================================================================================

恩，我就是这样做的，结果第一次压片漆黑一片，第二次虽然不黑，但目的条带没有了，您看是二抗浓度高的缘故？稀释到多少合适？谢谢！！！

作者: any333 时间: 2013-2-8 12:03

[size=2]相关疾病：
类风湿关节炎心肌梗死

=====================

是的
要用提取核蛋白的试剂

========================================================================

谢谢老师，还要请教细胞色素C、caspase-3和PARP 的转膜条件，湿转。
仪器一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型
谢谢老师！

作者: DDD 时间: 2013-2-8 12:04

内参变成两条首先考虑样品反复冻融，降解

=========================

请问定量灰度用什么软件好？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:05

内参变成两条首先考虑样品反复冻融，降解

========================

请问定量灰度用什么软件好？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:06

谢谢了，我得细菌蛋白是可以识别两个蛋白。我想请教一下，怎样才能验证我得抗血清是可以使用的？你说的WB系统有问题，可否说清楚点。谢谢了

=============================================================

因为你做抗体的时候的抗原与天然抗原就不一样啊
你要是检测天然抗原的话只能是能检测出阳性样品天然抗原才算可以使用吧
个人这么觉得

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:06

恩，我就是这样做的，结果第一次压片漆黑一片，第二次虽然不黑，但目的条带没有了，您看是二抗浓度高的缘故？稀释到多少合适？谢谢！！！

=====================

你现在用多大稀释比例？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:07

相关疾病：
心肌梗死

======================================================================

谢谢老师，还要请教细胞色素C、caspase-3和PARP 的转膜条件，湿转。
仪器一台是Bio-Rad的Mini-PROTEAN 3 电泳系统
另一台是北京六一仪器厂的，电泳仪电源型号 DYY-6D型，电泳仪（电转）型号 DYY-7C型
谢谢老师！

=====================================

如果有半干的话最好用半干转

湿转的话300mA 用30min左右吧
而且你这三个目的蛋白每个应该都是不一样的

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:09

请问定量灰度用什么软件好？

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我喜欢用ImageQuant TL这个软件读取IOD值
不用灰度
这个软件有个缺点就是只能使用两周

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:10

请问定量灰度用什么软件好？

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现在有人用Gel-Pro，QuantyOne等软件，我没具体用过
如果你找到好的软件告诉我一声

作者: zhezhe 时间: 2013-2-8 12:10

你现在用多大稀释比例？

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二抗是1：2500

作者: lxh031 时间: 2013-2-8 12:11

用提取膜蛋白的试剂
表达量少的话要提高最后检测试剂的敏感性
比如高敏感性的ECL

能推荐一个提膜蛋白的试剂公司吗（老板不肯出钱），或者组织膜蛋白提取配方，我现在提的是总蛋白，用的是碧云天强裂解液（RIPA），显色试剂用的普利来公司超强ECL发光液的，那个家的ECL发光液比较好啊
谢谢期待您的答复

作者: www.1 时间: 2013-2-8 12:13

二抗是1：2500

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用1：5000及1：10000试试

作者: www.1 时间: 2013-2-8 12:14

用提取膜蛋白的试剂
表达量少的话要提高最后检测试剂的敏感性
比如高敏感性的ECL
to fangweibin119
能推荐一个提膜蛋白的试剂公司吗（老板不肯出钱），或者组织膜蛋白提取配方，我现在提的是总蛋白，用的是碧云天强裂解液（RIPA），显色试剂用的普利来公司超强ECL发光液的，那个家的ECL发光液比较好啊
谢谢期待您的答复

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膜提取试剂建议用Pierce的，RIPA强裂解液也可以提取部分膜蛋白

作者: loli 时间: 2013-2-8 12:14

请问同时跑两块胶，转2张膜，如何把胶和膜做标记区分，怕搞混了

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:15

请问同时跑两块胶，转2张膜，如何把胶和膜做标记区分，怕搞混了

===============================

用铅笔在左上角写上数字或者字母
要用铅笔！

作者: zsxan1990 时间: 2013-2-8 12:16

可以啊
ki-67定位在细胞核
用细胞核提取试剂盒
300K多要用梯度胶或者大的分离胶

====================================================================================

梯度胶，我这里没有梯度仪，所以配制不了。
只能用浓度小的分离胶，内参是66kd的，那么分子量分别为359kd和66kd,要用多大浓度的胶，您给个建议！

作者: 831226 时间: 2013-2-8 12:17

用铅笔在左上角写上数字或者字母
要用铅笔！

====================================

谢谢，是在转膜之前泡甲醇之间就用铅笔么？

作者: langlang 时间: 2013-2-8 12:17

因为你做抗体的时候的抗原与天然抗原就不一样啊
你要是检测天然抗原的话只能是能检测出阳性样品天然抗原才算可以使用吧
个人这么觉得

============================================================================================================

老师您好，首先谢谢你的解答。按你的意思来说，我做组织的western可信不高，想请教一下，组织蛋白上样量的问题，上多少量的蛋白可以？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:19

梯度胶，我这里没有梯度仪，所以配制不了。
只能用浓度小的分离胶，内参是66kd的，那么分子量分别为359kd和66kd,要用多大浓度的胶，您给个建议！

===================================================

想保留内参很难
你的分离胶高度是多少？
如果分离胶高度能达到10cm就可以用8%的胶来做
400K的我做过
用的电泳槽型号是DXCZ-24E，你可以上网搜一下它的具体信息

作者: windy+++ 时间: 2013-2-8 12:43

谢谢，是在转膜之前泡甲醇之间就用铅笔么？

============================

直接用铅笔标好了再浸泡甲醇活化

作者: windy+++ 时间: 2013-2-8 12:44

老师您好，首先谢谢你的解答。按你的意思来说，我做组织的western可信不高，想请教一下，组织蛋白上样量的问题，上多少量的蛋白可以？

====================================

摸条件的时候第一次我一般上40ug
按照预实验结果来决定正式实验时的上样量

作者: mysmdbl 时间: 2013-2-8 12:44

版主您好，我需要检测处理后syk磷酸化程度的改变(即目的为p-syk），请问我的内参应该是选择syk,还是选择erk1/2，或是actin?

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:45

QUOTE:

原帖由 mysmdbl 于 2013-2-8 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

版主您好，我需要检测处理后syk磷酸化程度的改变(即目的为p-syk），请问我的内参应该是选择syk,还是选择erk1/2，或是actin?

我个人认为要选择syk作为磷酸化程度的对照
同时选择actin作为syk与p-syk上样量的参照

作者: tianmei001 时间: 2013-2-8 12:45

大哥好，请你一定要帮我分析我的问题：
溴芬蓝条带在浓缩胶不压成一条很窄的带，大约有“二”这个字宽，以前84V要30分钟，现在只要20分钟，
其他条件不变，
ECL结果：出现多条带，而且条带明显比以前细，
请问这大概是什么原因啊？感谢！

作者: 49888 时间: 2013-2-8 12:46

想保留内参很难
你的分离胶高度是多少？
如果分离胶高度能达到10cm就可以用8%的胶来做
400K的我做过
用的电泳槽型号是DXCZ-24E，你可以上网搜一下它的具体信息

=============================================================================================

您说的DXCZ-24E我没有查到，科里也不能买仪器。3%浓缩胶，6%的分离胶可以吗？内参我从跑一张胶，这样可以吗？

作者: wood533 时间: 2013-2-8 12:46

在做问题western blot 时遇到难以想通的问题，希望高手解答：
目的蛋白的分子量在44KD 可是每次做下来条带到靠近于55KD的地方没有杂带是什么原因？

另外一个目的蛋白在100KD 可是每次做下来在130KD 和70KD的地方都有很明显的很好看的条带，只有抗体浓度非常高时，在100KD处才会有淡淡的一条带，而抗体浓度下降时消失，而130，70KD的条带很好看，那么100KD的是我的目的条带吗还是其他两个有可能是我的目的条带吗？

另外，有一个目的条带，转膜时蛋白染色很好看，可是曝光时条带总是不成形，而相同区域另一个蛋白条带很好看，是抗体的原因吗，这是一个核受体，是提取蛋白时需要特定的措施吗？

作者: yonger 时间: 2013-2-8 12:48

我个人认为要选择syk作为磷酸化程度的对照
同时选择actin作为syk与p-syk上样量的参照

==============================

那我分析的时候应该怎么分析？
是(1)syk/actin;(2)p-syk/syk;然后再？

作者: Ao7 时间: 2013-2-8 12:48

你好，我刚开始做WB ，我转膜后有用立春红染色，显示上面有蛋白条带，我想问下这是不是说明转膜已经成功，另外一个问题，我曝光后发现上面什么都没有，我尝试过3min 5min 30min,都没有，我想问下什么原因（我当时膜正反面不太确定，这样会不会有影响呢），请帮我解释下，非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:49

大哥好，请你一定要帮我分析我的问题：
溴芬蓝条带在浓缩胶不压成一条很窄的带，大约有“二”这个字宽，以前84V要30分钟，现在只要20分钟，
其他条件不变，
ECL结果：出现多条带，而且条带明显比以前细，
请问这大概是什么原因啊？感谢！

==============================

和以前你认为好的结果的时候相比
你现在换了新试剂没有？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:49

您说的DXCZ-24E我没有查到，科里也不能买仪器。3%浓缩胶，6%的分离胶可以吗？内参我从跑一张胶，这样可以吗？

==============================

你可以试试
内参是用来校正你的误差的
这样两次上样会影响最后结果
不过没办法的情况下自己可以考虑

作者: loli 时间: 2013-2-8 12:50

直接用铅笔标好了再浸泡甲醇活化

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谢谢老师，最近的胶软软的，易破，而且不好移动操作，请问是成份的问题么？该怎么调整

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:51

在做问题western blot 时遇到难以想通的问题，希望高手解答：
目的蛋白的分子量在44KD 可是每次做下来条带到靠近于55KD的地方没有杂带是什么原因？

另外一个目的蛋白在100KD 可是每次做下来在130KD 和70KD的地方都有很明显的很好看的条带，只有抗体浓度非常高时，在100KD处才会有淡淡的一条带，而抗体浓度下降时消失，而130，70KD的条带很好看，那么100KD的是我的目的条带吗还是其他两个有可能是我的目的条带吗？

另外，有一个目的条带，转膜时蛋白染色很好看，可是曝光时条带总是不成形，而相同区域另一个蛋白条带很好看，是抗体的原因吗，这是一个核受体，是提取蛋白时需要特定的措施吗？

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Why is the actual band size different from the predicted?

Western blotting is a technique that separates proteins based on size - in general, the smaller the protein the faster it migrates through the gel. However, migration is also affected by other factors and so the actual band size observed may differ from that predicted. Common factors include...

post-translational modification - e.g. phosphorylation, glycosylation etc which increases the size of the protein
post-translation cleavage - e.g. many proteins are synthesized as pro-proteins, and then cleaved to give the active form, e.g. pro-caspases
splice variants - alternative splicing may create different sized proteins from the same gene
relative charge - the composition of amino acids (charged vs non-charged)
multimers - e.g. dimerisation of a protein. This is usually prevented in reducing conditions, although strong interactions can result in the appearance of higher bands

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:51

那我分析的时候应该怎么分析？
是(1)syk/actin;(2)p-syk/syk;然后再？？？

=====================================

我认为应该（1）syk/actin（2）p-syk/actin
最后（1）/（2）

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:52

你好，我刚开始做WB ，我转膜后有用立春红染色，显示上面有蛋白条带，我想问下这是不是说明转膜已经成功，另外一个问题，我曝光后发现上面什么都没有，我尝试过3min 5min 30min,都没有，我想问下什么原因（我当时膜正反面不太确定，这样会不会有影响呢），请帮我解释下，非常感谢

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转膜是成功的
抗体有问题吗
出现问题的可能点是：1，目的蛋白没有提取出来（比较难提取吧）2，抗体没有孵育好或者质量差3，ECl敏感性不高

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:52

谢谢老师，最近的胶软软的，易破，而且不好移动操作，请问是成份的问题么？该怎么调整

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多凝一会

作者: fei1226com 时间: 2013-2-8 12:53

楼主：
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？（且两边的2条带经常出不来）
注：同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样。
转膜也是常规操作啊，60V，2h;洗膜后奶粉封闭1--2h，以抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。

个人觉得加样应该没问题，但转膜及孵育抗体似乎也挑不出毛病，郁闷至极。还请高人指点一番！
诚谢！

作者: plaa 时间: 2013-2-8 12:53

转膜是成功的
抗体有问题吗
出现问题的可能点是：1，目的蛋白没有提取出来（比较难提取吧）2，抗体没有孵育好或者质量差3，ECl敏感性不高

======================================================

膜正反面有影响吗，如果是反面做，有荧光吗，能曝的出来吗，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:54

楼主：
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？（且两边的2条带经常出不来）
注：同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样。
转膜也是常规操作啊，60V，2h;洗膜后奶粉封闭1--2h，以抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。

个人觉得加样应该没问题，但转膜及孵育抗体似乎也挑不出毛病，郁闷至极。还请高人指点一番！
诚谢！

===================================================

1，条带粗细不一是由蛋白定量时的误差及上样时的误差引起的
2，两边没有条带的话说明你的转膜或者抗体孵育时膜没有弄好
注意细节

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:54

膜正反面有影响吗，如果是反面做，有荧光吗，能曝的出来吗，谢谢

============

不分正反面

作者: loli 时间: 2013-2-8 12:55

多凝一会

================================================

老师，请问有时候目的条带出不来，加大一抗浓度有用么？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:56

老师，请问有时候目的条带出不来，加大一抗浓度有用么？

=========================

加大上样量，一抗浓度先不变

作者: memory 时间: 2013-2-8 12:57

我在做WB时，曝光尝试了3min 5min 30min ,3min时在目的蛋白处有一条连着的条带，5min时曝光了，30min时又没有东西，不知道这是什么原因，我刚开始做，请指教，如何解决
另外我想问下，我当时那张膜立春红染色时也有marker，那曝光时marker会出来吗，他如果有曝出来跟一抗二抗有关系吗，还是只有跟发光剂有关系？
谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-8 12:57

您好，想老师咨询下，一、我我做的western显影用的是ECL试剂，找出来的结果是背景是黑的条带是白色的，而我看文献上的western图片都是白底黑条的，这是什么原因啊。二、显影照相那个用的仪器是bio-rad的，上面的Image model有三个选项，分别是UV，white，chemi。我用的是UV，可听说要用chemi，请问下该是怎样的啊。谢谢，期待老师的解答。

作者: qianqin1977 时间: 2013-2-8 12:57

楼主：
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？（且两边的2条带经常出不来）
注：同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样。
转膜也是常规操作啊，60V，2h;洗膜后奶粉封闭1--2h，以抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。

个人觉得加样应该没问题，但转膜及孵育抗体似乎也挑不出毛病，郁闷至极。还请高人指点一番！
诚谢！

1，条带粗细不一是由蛋白定量时的误差及上样时的误差引起的
2，两边没有条带的话说明你的转膜或者抗体孵育时膜没有弄好
注意细节

转膜时有什么特别需要注意的细节吗？
我基本上按照胶大于膜大于滤纸做三明治的。

作者: NBA 时间: 2013-2-8 12:58

我在做WB时，曝光尝试了3min 5min 30min ,3min时在目的蛋白处有一条连着的条带，5min时曝光了，30min时又没有东西，不知道这是什么原因，我刚开始做，请指教，如何解决
另外我想问下，我当时那张膜立春红染色时也有marker，那曝光时marker会出来吗，他如果有曝出来跟一抗二抗有关系吗，还是只有跟发光剂有关系？
谢谢

=============================================================================

1，marker有时候也会出条带的，具体原因不详（与厂家采用的蛋白有关）
2，曝光时间长了荧光淬灭，如果目的蛋白连成一片的话，下次上样的时候至少减少一半的上样量试试

作者: PINK 时间: 2013-2-8 12:59

您好，想老师咨询下，一、我我做的western显影用的是ECL试剂，找出来的结果是背景是黑的条带是白色的，而我看文献上的western图片都是白底黑条的，这是什么原因啊。二、显影照相那个用的仪器是bio-rad的，上面的Image model有三个选项，分别是UV，white，chemi。我用的是UV，可听说要用chemi，请问下该是怎样的啊。谢谢，期待老师的解答。

====================================================

呵呵
这个仪器怎么使用的我不清楚，建议你自己看看说明书
另外把你现在照的图片反色一下应该条带是黑色，背景是灰色了

作者: PINK 时间: 2013-2-8 13:00

楼主：
我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？（且两边的2条带经常出不来）
注：同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样。
转膜也是常规操作啊，60V，2h;洗膜后奶粉封闭1--2h，以抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。

个人觉得加样应该没问题，但转膜及孵育抗体似乎也挑不出毛病，郁闷至极。还请高人指点一番！
诚谢！

1，条带粗细不一是由蛋白定量时的误差及上样时的误差引起的
2，两边没有条带的话说明你的转膜或者抗体孵育时膜没有弄好
注意细节

转膜时有什么特别需要注意的细节吗？
我基本上按照胶大于膜大于滤纸做三明治的。

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胶大于膜有没有可能两边的目的条带没有转到膜上啊
因为膜不够大啊
另外我建议你三者最好一样大小

作者: jkobn 时间: 2013-2-8 13:00

首先是几个现象问题，因为从来没做过wb，也没人教，所有现象都是自己从网上查，
1.显影，二抗孵育完，洗完了之后ecl发光，然后x光夹里曝光底片。放在显影液中观察，底片慢慢变暗，显影完了之后底片非常暗，没有白色条带，然后定影之后底片变成纯黑，基本上只有杂乱无章的细小划痕似的条带，这是否说明我膜上无二抗结合？无检测量级别的蛋白？（二抗稀释液和发光液混合有强烈荧光）。
2.转膜之后的染色：转膜之后，我用普利莱的memgel快速染色液染色，发现膜上染得紫红色非常浅（转上的蛋白非常少？），并且在marker标记的16~60KD（目标条带也在该范围内）无条带（冲洗完之后只有泳道之间非常窄的扩散蛋白其他地方是可恶的白色的膜原始色），我又去染胶，染完之后发现胶上也无蛋白条带只有很浅的粉红色（可能是洗脱不完全），我转膜一直是超多冰浴的，条件是：60mA2h（膜面积45cm2）和60mA2h+80mA1h（膜面积45cm2）是转过了还是没转上？（本人新手，也很有可能是海绵和滤纸之间气泡未除尽）
版内的问答都很简略，我很愚钝不能理解，所以就只能继续求助了，

作者: 987789 时间: 2013-2-8 13:01

加大上样量，一抗浓度先不变

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用10UL的枪头加样，如果上样体积超过10UL，加的时候是不是还是加样器好点？

作者: NBA 时间: 2013-2-8 13:02

用10UL的枪头加样，如果上样体积超过10UL，加的时候是不是还是加样器好点？

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用20ul的金花枪加呗
上10ul的小枪头可以加的
或者加两枪

作者: NBA 时间: 2013-2-8 13:03

首先是几个现象问题，因为从来没做过wb，也没人教，所有现象都是自己从网上查，
1.显影，二抗孵育完，洗完了之后ecl发光，然后x光夹里曝光底片。放在显影液中观察，底片慢慢变暗，显影完了之后底片非常暗，没有白色条带，然后定影之后底片变成纯黑，基本上只有杂乱无章的细小划痕似的条带，这是否说明我膜上无二抗结合？无检测量级别的蛋白？（二抗稀释液和发光液混合有强烈荧光）。
2.转膜之后的染色：转膜之后，我用普利莱的memgel快速染色液染色，发现膜上染得紫红色非常浅（转上的蛋白非常少？），并且在marker标记的16~60KD（目标条带也在该范围内）无条带（冲洗完之后只有泳道之间非常窄的扩散蛋白其他地方是可恶的白色的膜原始色），我又去染胶，染完之后发现胶上也无蛋白条带只有很浅的粉红色（可能是洗脱不完全），我转膜一直是超多冰浴的，条件是：60mA2h（膜面积45cm2）和60mA2h+80mA1h（膜面积45cm2）是转过了还是没转上？（本人新手，也很有可能是海绵和滤纸之间气泡未除尽）
版内的问答都很简略，我很愚钝不能理解，所以就只能继续求助了，

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1，胶片走光了
2，应该转上了，换膜染色液试试

作者: langlang 时间: 2013-2-8 13:03

楼主您好！
我刚开始做western，电泳每次都要很长时间，大概6到8个小时，我的目的蛋白43KD，电泳仪是Bio-RAD的，先用恒压60v然后80v，但是时间久了以后电压就会自动降低，缓冲液是新的，不过Tris买了两年多了，有没有什么影响？？
谢谢楼主！

作者: DONT 时间: 2013-2-8 13:04

把配胶的buffer，电泳buffer测一下pH

作者: remenb 时间: 2013-2-8 13:04

我做的蛋白分子量很小，只有6kDa，请楼主指点指点，帮帮忙，谢啦

作者: okhaha 时间: 2013-2-8 13:05

老师您好！想请教您，曝光后，条带很细，都连在一起是什么原因啊？我的上样量是50ug。

作者: lxh031 时间: 2013-2-8 13:05

老师，请教下，我是新手，要做的目的蛋白是273KD的，据说很难做，就内参、胶的浓度和转膜条件等给嗲建议？谢谢

作者: xueyouzhang 时间: 2013-2-8 13:06

我在转膜的时候偶尔也会遇到一种情况，就是电泳跑出的marker道都很平齐，电转之后同一张膜上部分区域的marker和蛋白条带就变得扭曲不平了，情形见附图，但膜上其他部分的蛋白条带仍然是正常的，甚至同时转的另一张膜上就全部正常。不知道这种现象是什么原因造成的，该如何避免？

图片附件: 62832343.jpg (2013-2-8 13:06, 14.72 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14834

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-2-15 09:25

楼主你好，
我的目的蛋白表达量偏低，做了好一段Westen blot了，结果总不理想。

用5%的脱脂奶粉来孵育一抗和二抗时，基本上没有背景，可也杂不到目的条带；我有个表达丰富较高的正对照，显影可以显出条带，说明整个系统还是没有问题的。

我试过用TBST来封闭一抗和二抗，可以看到有目的条带，但背景又特别高。
那么，
1：我该用什么样的封闭液呢？
2：对于低丰度的目的蛋白，有没有较好的Westen的试验方案呢？

谢谢了

作者: pou 时间: 2013-2-15 09:26

怎么才能提高整个系统的敏感性？我买的是非磷酸化的抗体，应该用什么裂解液较好呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:26

我做的蛋白分子量很小，只有6kDa，请楼主指点指点，帮帮忙，谢啦

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经验不足
不好意思
前段时间做过Tricine胶
效果很不好

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:27

老师您好！想请教您，曝光后，条带很细，都连在一起是什么原因啊？我的上样量是50ug。

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可能分离胶没有凝好
延长分离胶凝聚时间

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:27

老师，请教下，我是新手，要做的目的蛋白是273KD的，据说很难做，就内参、胶的浓度和转膜条件等给嗲建议？谢谢

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用8%的胶
如果你的电泳槽是mini的
那内参就不好做
如果是大胶（分离胶在10cm左右就没有问题）
或者用梯度胶

转膜的话用300mA，2h30min就可以

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:28

我在转膜的时候偶尔也会遇到一种情况，就是电泳跑出的marker道都很平齐，电转之后同一张膜上部分区域的marker和蛋白条带就变得扭曲不平了，情形见附图，但膜上其他部分的蛋白条带仍然是正常的，甚至同时转的另一张膜上就全部正常。不知道这种现象是什么原因造成的，该如何避免？

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marker与每个样品之间上样体积都一样吗？
如果不同建议用1倍样缓补齐

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:34

楼主你好，
我的目的蛋白表达量偏低，做了好一段Westen blot了，结果总不理想。

用5%的脱脂奶粉来孵育一抗和二抗时，基本上没有背景，可也杂不到目的条带；我有个表达丰富较高的正对照，显影可以显出条带，说明整个系统还是没有问题的。

我试过用TBST来封闭一抗和二抗，可以看到有目的条带，但背景又特别高。
那么，
1：我该用什么样的封闭液呢？
2：对于低丰度的目的蛋白，有没有较好的Westen的试验方案呢？

谢谢了

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1，你的目的蛋白提取的怎样？
2，你做的是什么蛋白？磷酸化还是非磷酸化？需要用不同的封闭体系
3，低丰度的蛋白建议采用更加敏感的检测系统（超敏ECL），具体的你可以再问

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-15 09:34

您好！
请问：我每次转膜后，发现凝胶都缩小了，会影响估算蛋白的位置，凝胶变小是怎么回事呢？

作者: 66+77 时间: 2013-2-15 09:35

可能分离胶没有凝好
延长分离胶凝聚时间

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我觉得可能不是这个原因，因为膜上还有非特异条带，都是分开的，很整齐，效果都很好。只有目的条带是连在一起的。
另外，同一抗体洗出两个条带，变化趋势一样的，分子量相差很远，这是怎么回事啊？我测的是p21蛋白，会是二聚体的条带吗？

作者: yonger 时间: 2013-2-15 09:36

用20ul的金花枪加呗
上10ul的小枪头可以加的
或者加两枪

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上样前加5XBUFFER，然后95-100五分钟变性，完后能立即上样么？上完样能马上放到-80度么？

作者: youyou99 时间: 2013-2-15 09:36

1，你的目的蛋白提取的怎样？
2，你做的是什么蛋白？磷酸化还是非磷酸化？需要用不同的封闭体系
3，低丰度的蛋白建议采用更加敏感的检测系统（超敏ECL），具体的你可以再问

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1.我的目的蛋白是抽提的酵母蛋白，因为现在要验证双杂筛到的两个蛋白的互作，所以想利用双杂载体上的HA和c-myc两个tag来做酵母体内的Co-IP,现在先是拿了一个抗体来做酵母提取物中的目的蛋白的检测效果都不太理想。
抽提方法是酵母菌体，液氮研磨后直接加抽提Buffer（主要成分包括PIPES，EDTA，TRITON X-100,PMSF,和蛋白酶抑制剂），4度离心20min取上清。
蛋白丰度低是低了一些，但这种方法应该也是可行的啊，其他实验室有用的。

2.实际上我有一个蛋白是激酶，最后我要证明能它能磷酸化另一个蛋白的，但是现在主要是想做Co-IP,也没考虑过具体是磷酸化还是非磷酸化的。磷酸化与否影响它们相互作用的表位吗？

3.我目前用的是HRP显影，碧云天的底物，超敏ECL是怎样的？可否推荐一下。
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:37

您好！
请问：我每次转膜后，发现凝胶都缩小了，会影响估算蛋白的位置，凝胶变小是怎么回事呢？

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在转缓中加入20%甲醇

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:37

我觉得可能不是这个原因，因为膜上还有非特异条带，都是分开的，很整齐，效果都很好。只有目的条带是连在一起的。
另外，同一抗体洗出两个条带，变化趋势一样的，分子量相差很远，这是怎么回事啊？我测的是p21蛋白，会是二聚体的条带吗？

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看厂家抗体说明书
还有就是文献上怎么说的
有时候不在目的分子量处是很正常的
你可以稀释抗体试试能不能把你说的所谓的非特异性条带减弱了
另外如果还是不行只能换抗体了（你可以参考《抗体技术实验指南》）

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:38

上样前加5XBUFFER，然后95-100五分钟变性，完后能立即上样么？上完样能马上放到-80度么？

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变性后用离心机短暂离心，把挂壁的水蒸气甩到管中
之后上样
能放到-80度保存，但是我觉得-20度保存一、两个月没有问题
good luck

作者: popo520 时间: 2013-2-15 09:39

在转缓中加入20%甲醇

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我是加了20%的甲醇的转移缓冲液！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:39

我是加了20%的甲醇的转移缓冲液！

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整个缓冲液体系你是怎么配置的？

作者: popo520 时间: 2013-2-15 09:40

整个缓冲液体系你是怎么配置的？

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1L:
苷酸酸：2.9g
tris :5.8g
sds :0.37g
200ml 甲醇。定容到1升

pvdf膜甲醇浸泡5分钟。然后放入转移缓冲液中平衡。

作者: NBA 时间: 2013-2-15 09:42

1L:
苷酸酸：2.9g
tris :5.8g
sds :0.37g
200ml 甲醇。定容到1升

pvdf膜甲醇浸泡5分钟。然后放入转移缓冲液中平衡。

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这个配方是半干转的
胶变小了与甲醇有关
注意转膜时的降温没？

作者: youyou99 时间: 2013-2-15 09:43

老师您好，请问1.5mm的板子蛋白的上样量是多少微克呀？是蛋白的总量，不是样品的容量哦，谢谢老师！

作者: 33号 时间: 2013-2-15 10:31

这个配方是半干转的
胶变小了与甲醇有关
注意转膜时的降温没？

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我是放在4度转膜的，原来是半干转的，能告诉我湿转的配方吗？谢谢！！！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 10:33

老师您好，请问1.5mm的板子蛋白的上样量是多少微克呀？是蛋白的总量，不是样品的容量哦，谢谢老师！

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我喜欢用1.0的胶
上样量最大在100ug左右
1.5的胶的上样量可以大一些，150ug应该差不多

作者: NBA 时间: 2013-2-15 10:34

我是放在4度转膜的，原来是半干转的，能告诉我湿转的配方吗？谢谢！！！

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看看《抗体技术实验指南》
好好看看

作者: qhyu 时间: 2013-2-15 10:34

相关疾病：
头痛
专家呀，关于western，我有一很头痛的问题，做完后发现膜上有条带，不过不是那种曝光很强留下的棕黄条带，是那种淡淡的对着光能看见的条带，用丽春红染色后显出的条带与前面看的一致，但是就是做不出结果，一抗二抗ECL显影液等各环节都没有问题，请问有可能是蛋白降解导致的呢？连actin都做不出来。我百思不得其解啊。请赐教

作者: vcve 时间: 2013-2-15 10:35

marker与每个样品之间上样体积都一样吗？
如果不同建议用1倍样缓补齐

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上样体积在25～27微升之间，差别不大。

作者: 831226 时间: 2013-2-15 10:36

有站友有《抗体技术实验指南》这本书的电子版吗？能共享一下吗？谢谢！！！

作者: windy+++ 时间: 2013-2-15 10:37

老师您上次说上样40UG内参就应该比较好看了，请问下如果是样本一般上多少比较好，有的资料是50-80，有的是30-50？

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-15 10:37

我转膜的缓冲液和sermester
的一样，但也是要湿转，请问谁有抗体技术实验指南这书啊，好好学习一下~

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-15 10:41

再问NBA老师一个问题，strip buffer 的配方是什么啊，我只用NaOH洗膜，感觉洗不干净。谢谢！！！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 10:41

有站友有《抗体技术实验指南》这本书的电子版吗？能共享一下吗？谢谢！！！

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上网搜一下
有很多免费下载的链接

作者: NBA 时间: 2013-2-15 10:42

老师您上次说上样40UG内参就应该比较好看了，请问下如果是样本一般上多少比较好，有的资料是50-80，有的是30-50？

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我做细胞的时候上样量10ug内参就很好
组织上10ug也没有问题
但是组织蛋白浓度比细胞的高
具体上样量要通过SDS-PAGE染胶及目的蛋白的WB来确定

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:11

再问方老师一个问题，strip buffer 的配方是什么啊，我只用NaOH洗膜，感觉洗不干净。谢谢！！！

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NaOH我用过，效果很差哦
具体配方恕我不能告诉你
因为这是公司研发的产品，有保密协议

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:12

老师您上次说上样40UG内参就应该比较好看了，请问下如果是样本一般上多少比较好，有的资料是50-80，有的是30-50？

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蛋白定量时会有很大误差
建议SDS-PAGE来验证

作者: summerxx 时间: 2013-2-15 12:13

我转膜的缓冲液和sermester
的一样，但也是要湿转，请问谁有抗体技术实验指南这书啊，好好学习一下~

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请问：
你的胶也变小吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:14

请问：
你的胶也变小吗？

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没有变小
胶很正常
我湿转与半干转都做

作者: wsll 时间: 2013-2-15 12:15

我做出的条带总是皱眉状，我用的4%的积层胶，12%的分离胶，这个做的是B-ACTIN,条带总是很粗，皱眉状。我上样量已经减少到4微克蛋白了。不知道是碧云天的BCA蛋白定量试剂盒不行还是怎么回事？发两张图给老师看看。都是ACTIN的，望老师指点。

图片附件: 10715542.jpg (2013-2-15 12:15, 8.14 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14841

作者: wsll 时间: 2013-2-15 12:15

不好意思，我刚才说错了是5%的积层胶

作者: avi317 时间: 2013-2-15 12:16

今天第一次做western，结果电转转出了一张实验室里大家都没见过的很糟糕的膜，发出来让大

家开心开心，顺便请教前辈，这可能是什么原因？所用的电转液配方是Tris 2.375g,甘氨

酸11.25g，甲醇200ml，SDS 0.375g，加三蒸水到1000ml。目的蛋白是95kD，转膜条件是2

200mA,120min。丽春红染色没有任何条带，而且整个膜开起来很奇怪。

图片附件: 53783479.snap.jpg (2013-2-15 12:16, 18.11 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14842

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:17

我做出的条带总是皱眉状，我用的4%的积层胶，12%的分离胶，这个做的是B-ACTIN,条带总是很粗，皱眉状。我上样量已经减少到4微克蛋白了。不知道是碧云天的BCA蛋白定量试剂盒不行还是怎么回事？发两张图给老师看看。都是ACTIN的，望老师指点。

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1，蛋白定量肯定会存在误差，WB结果条带会有差异，通过WB的结果扫描读数才能进行下一步上样量的调整
2，我认为你电泳的时候热量产生太多，没有采取降温措施吧
3，转膜也是需要降温的

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:23

今天第一次做western，结果电转转出了一张实验室里大家都没见过的很糟糕的膜，发出来让大

家开心开心，顺便请教前辈，这可能是什么原因？所用的电转液配方是Tris 2.375g,甘氨

酸11.25g，甲醇200ml，SDS 0.375g，加三蒸水到1000ml。目的蛋白是95kD，转膜条件是2

200mA,120min。丽春红染色没有任何条带，而且整个膜开起来很奇怪。

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用的是什么膜？
NC不需要活化，在转缓中浸泡平衡就可以用了
PVDF需要无水甲醇活化，然后在转缓中平衡
封闭后染的膜吗？

作者: avi317 时间: 2013-2-15 12:23

请问：
你的胶也变小吗？

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胶倒是不会变小的。

作者: avi317 时间: 2013-2-15 12:24

请问PVDF膜在甲醇中浸泡多久？

作者: avi317 时间: 2013-2-15 12:25

请教高手——96kD的蛋白，用的是北京六一的DYY电泳仪，用什么样的转膜条件？谢谢！

作者: 子衿青青 时间: 2013-2-15 12:27

请问，想提取血小板的总蛋白，该如何操作？使用改良的RIPA试剂可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:28

请问PVDF膜在甲醇中浸泡多久？

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不同厂家的不一样
Millipore的是10到15S

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:29

请教高手——96kD的蛋白，用的是北京六一的DYY电泳仪，用什么样的转膜条件？谢谢！

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湿转 300mA 1h30min

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:29

请问，想提取血小板的总蛋白，该如何操作？使用改良的RIPA试剂可以吗？

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不好意思
没有提取过
建议你看相关的文献
也可以把目的蛋白名称告诉我
我也帮你看看

作者: JK.jon 时间: 2013-2-15 12:30

你好请教一下
我最近在做一个小分子蛋白大概18KD 表达很微量检测mRNA是有的
15%的胶 0.2的硝酸纤维素膜湿转80mA30min和一小时都转过从marker看很清晰的在膜上脱脂牛奶RT封闭3小时
一抗1：50 建议是1：200到1：1000 4度过夜二抗1：2000 1小时 TBST洗膜都是3分钟5次
ECL显色压片15min
但总是白板啊怎么回事？

作者: star#room 时间: 2013-2-15 12:30

请教：四个样品 SDS-PAGE考染出现漂亮条带隔天做WB立春红染色2个样品无条带另二个样品有条带重复几次结果一样想问原因？望回答！谢谢！

作者: ending 时间: 2013-2-15 12:31

用的是什么膜？
NC不需要活化，在转缓中浸泡平衡就可以用了
PVDF需要无水甲醇活化，然后在转缓中平衡
封闭后染的膜吗？

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用的是PVDF膜，在无水甲醇中浸泡10min活化后于转膜液中平衡
膜是从转膜夹中取出，在1XTBS中漂洗5min后染的，没有封闭
刚打开转膜夹时的膜就是图中的样子

作者: ending 时间: 2013-2-15 12:32

用的是什么膜？
NC不需要活化，在转缓中浸泡平衡就可以用了
PVDF需要无水甲醇活化，然后在转缓中平衡
封闭后染的膜吗？

===================================================

用的是PVDF膜，在无水甲醇中浸泡10min活化后于转膜液中平衡
膜是从转膜夹中取出，在1XTBS中漂洗5min后染的，没有封闭
刚打开转膜夹时的膜就是图中的样子

作者: mimili_901 时间: 2013-2-15 12:41

你好，请教一个问题。我做的是小鼠肌肉组织的蛋白，结果一直不是很理想。actin的条带很浅，曝光很长时间才能看到，但是之前有过出的好的（不同批次样品）。
组织蛋白提取后上清约200微升，加4*上样buffer煮15分钟，离心后发现样品分层，下层是颗粒状的沉淀，同学分析是样品浓度太大，蛋白质变性不完全，请问应该如何补救?
1.只吸取上清，加大上样量，or
2.加1*上样buffer再煮蛋白，使其溶解？
如果用第二种方法，到最后蛋白浓度是否还是像现在一样低？

作者: 8princess8 时间: 2013-2-15 12:42

请教一下：
组织蛋白用的是液氮提取，严格冰上操作。目标蛋白60KD和100KD，1.0的胶，上样50ug，电泳100V 100min，湿转100V 90min，丽春红，考马斯亮蓝染色蛋白条带均佳，一抗（CST）1：1000（推荐） 4度过夜，二抗：odyssey荧光二抗1;5000 2h，PBST各洗3*20min，扫膜结果没有条带，actin之前做是有的，最近两次都没有。个人认为操作没什么问题。
问题：
1. 上样前沸水煮5min，反复间隔煮了3次才上样（中间时间耽误，冷却了再重新煮）不知道有没有影响？加loading变性后发现上样的时候有沉淀，有影响吗？
2.转移缓冲液忘记加SDS，不知道有没有影响？
3.一抗浓度CST口碑还不错，就是短时间内反复用了两三次吧，二抗也是实验室试过的浓度应该没问题。用细胞做出来过60KD那个，但组织就是没有，如果是上样量少的话，可是之前actin又很浓.
我做的蛋白都是表达量丰富的蛋白，一般组织都会有表达，但是就是没有条带，有的时候有杂带很清楚，但是目的蛋白就是没有。做了好多次了，想不出来原因在哪里，郁闷ing. 烦您指点，不胜感激

作者: 00无名指00 时间: 2013-2-15 12:46

楼主我想请教下，我WB的膜上次曝光过了，想重复用，如何解析呢，是否需要解析液80度5分钟？常温水平摇床5分钟可以嘛
我上次这张膜第二次用，第一次用时做出了很漂亮的β actin条带，第二次用时膜解析时是用解析液水平摇床洗5MIN，（这个方法可以吗）最后我暗室里膜上没有看到荧光，3 10min都没有爆出来帮我分析下原因吧
谢谢

作者: 2541 时间: 2013-2-15 12:47

北京DYY电泳仪没有那么高的电流。我用120MA,湿转3小时可以吗？

作者: 66+77 时间: 2013-2-15 12:47

楼主你好，最近我在摸目的蛋白，你上面的评论常常提到“确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度”。我想请教如何确定二抗稀释度，以及如何确定二抗稀释度已经确定好了，能具体一些的操作嘛，非常感谢！

作者: mamamiya 时间: 2013-2-15 12:47

我的样品是鲨肝，取100mg用1mlRIPA裂解液裂解，BCA法测得总蛋白浓度是0.5ug/ul,如果上样量是20-40ug的话，我这个浓度是不是太小了？得重新制备样品？用的是0.75mm厚度的胶。谢谢！
我看有的同志说上样5-10ug就可以了，是否可行呢？

作者: vcve 时间: 2013-2-15 12:48

请教版主：
我要检测3种细胞蛋白质，上样量50ug，目的蛋白大小为85KD、60KD、41KD，内参GAPDH。一抗(CST)稀释浓度1：1000和1：500，二抗(博士德）1:5000，每次洗膜都为TBST 10min3次，结果内参和60KD均可见条带，而85KD和41KD没有条带，原因可能是什么？41KD的抗体已经用于做免疫组化，显色很好，所以应该不是抗体的问题。下次程序因该做些什么改进？
期待中，谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-15 12:50

弱弱的问一句：
1 β-actin跑出来了，是不是可以认为整个电泳、转膜、封闭的过程没问题？
2 每次我跑WB时β-actin的条带都很不错，就是目的是空白，啥都没有？有没有理由怀疑一抗的问题？
3 因为我们的ECL成像的系统坏掉了，现在我们用DAB显色，DAB显色之后是不是不能再重新封闭，再杂一抗？
4 我跑的是一个跨膜蛋白，用的蛋白提取试剂有效成分是1% Triton X-100, 1%deoxycholate, 0.1% SDS，BCA测蛋白浓度也很不错，平均16微克/微升，但是就是跑不出来。有没有好的建议？
先谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:51

你好请教一下
我最近在做一个小分子蛋白大概18KD 表达很微量检测mRNA是有的
15%的胶 0.2的硝酸纤维素膜湿转80mA30min和一小时都转过从marker看很清晰的在膜上脱脂牛奶RT封闭3小时
一抗1：50 建议是1：200到1：1000 4度过夜二抗1：2000 1小时 TBST洗膜都是3分钟5次
ECL显色压片15min
但总是白板啊怎么回事？

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你现在用什么ECL？
建议改用敏感性更高的ECL

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:52

你好请教一下
我最近在做一个小分子蛋白大概18KD 表达很微量检测mRNA是有的
15%的胶 0.2的硝酸纤维素膜湿转80mA30min和一小时都转过从marker看很清晰的在膜上脱脂牛奶RT封闭3小时
一抗1：50 建议是1：200到1：1000 4度过夜二抗1：2000 1小时 TBST洗膜都是3分钟5次
ECL显色压片15min
但总是白板啊怎么回事？

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加大点上样量

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:53

请教：四个样品 SDS-PAGE考染出现漂亮条带隔天做WB立春红染色2个样品无条带另二个样品有条带重复几次结果一样想问原因？望回答！谢谢！

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那就是转膜有问题了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:54

用的是PVDF膜，在无水甲醇中浸泡10min活化后于转膜液中平衡
膜是从转膜夹中取出，在1XTBS中漂洗5min后染的，没有封闭
刚打开转膜夹时的膜就是图中的样子

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不需要活化那么长时间的
另外缓冲液有没有问题

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:54

你好，请教一个问题。我做的是小鼠肌肉组织的蛋白，结果一直不是很理想。actin的条带很浅，曝光很长时间才能看到，但是之前有过出的好的（不同批次样品）。
组织蛋白提取后上清约200微升，加4*上样buffer煮15分钟，离心后发现样品分层，下层是颗粒状的沉淀，同学分析是样品浓度太大，蛋白质变性不完全，请问应该如何补救?
1.只吸取上清，加大上样量，or
2.加1*上样buffer再煮蛋白，使其溶解？
如果用第二种方法，到最后蛋白浓度是否还是像现在一样低？

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1，样品浓度多大？
2，你变性的时候样品浓度调整至多少？
3，肌肉组织蛋白浓度一般在10到15mg/ml，上样量20ug actin就已经很亮了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 12:55

请教一下：
组织蛋白用的是液氮提取，严格冰上操作。目标蛋白60KD和100KD，1.0的胶，上样50ug，电泳100V 100min，湿转100V 90min，丽春红，考马斯亮蓝染色蛋白条带均佳，一抗（CST）1：1000（推荐） 4度过夜，二抗：odyssey荧光二抗1;5000 2h，PBST各洗3*20min，扫膜结果没有条带，actin之前做是有的，最近两次都没有。个人认为操作没什么问题。
问题：
1. 上样前沸水煮5min，反复间隔煮了3次才上样（中间时间耽误，冷却了再重新煮）不知道有没有影响？加loading变性后发现上样的时候有沉淀，有影响吗？
2.转移缓冲液忘记加SDS，不知道有没有影响？
3.一抗浓度CST口碑还不错，就是短时间内反复用了两三次吧，二抗也是实验室试过的浓度应该没问题。用细胞做出来过60KD那个，但组织就是没有，如果是上样量少的话，可是之前actin又很浓.
我做的蛋白都是表达量丰富的蛋白，一般组织都会有表达，但是就是没有条带，有的时候有杂带很清楚，但是目的蛋白就是没有。做了好多次了，想不出来原因在哪里，郁闷ing. 烦您指点，不胜感激

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1，加入样缓后我都是变性5min，没有重复
2，100K的蛋白建议你加0.01%SDS
3，CST的抗体我用的多了，整体还行
4，细胞的actin与组织的actin的量不能比，组织中actin的量非常大，像肌肉组织20ug上样量actin就会很亮。不知道你是什么组织
5，检查marker有没有问题，也许你所谓的杂带就是你要的目的带
6，反复用了两三次是什么意思？一抗重复利用？正式实验我不建议你这么用

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:14

楼主我想请教下，我WB的膜上次曝光过了，想重复用，如何解析呢，是否需要解析液80度5分钟？常温水平摇床5分钟可以嘛
我上次这张膜第二次用，第一次用时做出了很漂亮的β actin条带，第二次用时膜解析时是用解析液水平摇床洗5MIN，（这个方法可以吗）最后我暗室里膜上没有看到荧光，3 10min都没有爆出来帮我分析下原因吧
谢谢

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不明白你说的解析是什么意思
stripping？ or 抗体洗脱？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:14

北京DYY电泳仪没有那么高的电流。我用120MA,湿转3小时可以吗？

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DYY系列电流都有400mA啊
你的怎么达不到啊？
120mA 3h你可以摸条件试试

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:15

楼主你好，最近我在摸目的蛋白，你上面的评论常常提到“确定二抗的稀释度之后再去摸一抗的稀释度”。我想请教如何确定二抗稀释度，以及如何确定二抗稀释度已经确定好了，能具体一些的操作嘛，非常感谢！

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二抗稀释度如何确定你搜一下我发过的帖子
祝你顺利

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:15

我的样品是鲨肝，取100mg用1mlRIPA裂解液裂解，BCA法测得总蛋白浓度是0.5ug/ul,如果上样量是20-40ug的话，我这个浓度是不是太小了？得重新制备样品？用的是0.75mm厚度的胶。谢谢！
我看有的同志说上样5-10ug就可以了，是否可行呢？

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不知道你目的蛋白在总蛋白中的丰度如何
0.5ug的浓度有点低了
不知道你是怎么提取的

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:15

我的样品是鲨肝，取100mg用1mlRIPA裂解液裂解，BCA法测得总蛋白浓度是0.5ug/ul,如果上样量是20-40ug的话，我这个浓度是不是太小了？得重新制备样品？用的是0.75mm厚度的胶。谢谢！
我看有的同志说上样5-10ug就可以了，是否可行呢？

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既然蛋白已经提取了
就先做个预实验试试
上最大量

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:16

请教版主：
我要检测3种细胞蛋白质，上样量50ug，目的蛋白大小为85KD、60KD、41KD，内参GAPDH。一抗(CST)稀释浓度1：1000和1：500，二抗(博士德）1:5000，每次洗膜都为TBST 10min3次，结果内参和60KD均可见条带，而85KD和41KD没有条带，原因可能是什么？41KD的抗体已经用于做免疫组化，显色很好，所以应该不是抗体的问题。下次程序因该做些什么改进？
期待中，谢谢！

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加大上样量，调整抗体浓度

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:17

弱弱的问一句：
1 β-actin跑出来了，是不是可以认为整个电泳、转膜、封闭的过程没问题？
2 每次我跑WB时β-actin的条带都很不错，就是目的是空白，啥都没有？有没有理由怀疑一抗的问题？
3 因为我们的ECL成像的系统坏掉了，现在我们用DAB显色，DAB显色之后是不是不能再重新封闭，再杂一抗？
4 我跑的是一个跨膜蛋白，用的蛋白提取试剂有效成分是1% Triton X-100, 1%deoxycholate, 0.1% SDS，BCA测蛋白浓度也很不错，平均16微克/微升，但是就是跑不出来。有没有好的建议？
先谢谢了！

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1，可以这么认为
2，目的是空白的话你做了几个稀释度？你怎么不怀疑你的目的蛋白没有提取出来？或者上样量小了？
3，你可以重新杂一抗试试
4，跨膜蛋白本身就不好提取，怎么就怀疑抗体不好？用膜蛋白提取试剂试试吧

作者: shenkunjie 时间: 2013-2-15 13:17

1，样品浓度多大？
2，你变性的时候样品浓度调整至多少？
3，肌肉组织蛋白浓度一般在10到15mg/ml，上样量20ug actin就已经很亮了

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没有测蛋白浓度，是这样，我们实验室用考马斯亮蓝法测浓度，不知道是手法还是标准蛋白的问题，测完调了之后actin也不齐，所以我们都不测了。应该是浓度过大，我想知道现在怎么补救，样品离心后下层有不少沉淀。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-15 13:18

1，可以这么认为
2，目的是空白的话你做了几个稀释度？你怎么不怀疑你的目的蛋白没有提取出来？或者上样量小了？
3，你可以重新杂一抗试试
4，跨膜蛋白本身就不好提取，怎么就怀疑抗体不好？用膜蛋白提取试剂试试吧

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2 目的蛋白根据说明书要求，我们做过1：100；1：200；1：500；1:800；1：1000几个稀释度，都没有目的条带。上样量我们尝试过50微克，100微克，200微克。也没有目的条带。
就是没有办法排除1 蛋白没有提取出来 2 一抗是不是可以认为只剩下这两个原因？
4 fangweibin119老师有没有做跨膜蛋白的经验，能否介绍给我你觉得还不错的膜蛋白提取试剂或者相关公司。非常谢谢！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-15 13:21

不明白你说的解析是什么意思
stripping？ or 抗体洗脱？

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就是重复使用原来已经曝过光的膜，把抗体及发光液洗脱下来的意思

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:21

没有测蛋白浓度，是这样，我们实验室用考马斯亮蓝法测浓度，不知道是手法还是标准蛋白的问题，测完调了之后actin也不齐，所以我们都不测了。应该是浓度过大，我想知道现在怎么补救，样品离心后下层有不少沉淀。

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是加了loading变性之后又不少沉淀吗？
如果是这样建议你重新提取了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:22

2 目的蛋白根据说明书要求，我们做过1：100；1：200；1：500；1:800；1：1000几个稀释度，都没有目的条带。上样量我们尝试过50微克，100微克，200微克。也没有目的条带。
就是没有办法排除1 蛋白没有提取出来 2 一抗是不是可以认为只剩下这两个原因？
4 NBA老师有没有做跨膜蛋白的经验，能否介绍给我你觉得还不错的膜蛋白提取试剂或者相关公司。非常谢谢！

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可以选择Pierce的胞膜提取试剂试试
另外国内的几家所谓的可以提取膜蛋白的基本上不怎么地
一抗的稀释度与上样量预实验够了
你用什么ECL？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:22

就是重复使用原来已经曝过光的膜，把抗体及发光液洗脱下来的意思

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用抗体洗脱液洗脱抗体之后从封闭开始，后续同WB
洗脱后会影响后续蛋白检测的敏感性，因为蛋白也会同时被洗下来一部分

作者: kuohao17 时间: 2013-2-15 13:23

预实验孵完抗体后用invitrogen试剂盒中的显色剂曝光，是白板一张，拿回来用丽春红染色，发现貌似有目的条带，而且有非特异性条带。
丽春红染色是非特异的吧？封闭加孵完抗体后丽春红染色能不能染出目的条带啊？
如图，左边是marker.往下数第三条是95kd,第四条是72kd,目的条带是83kd
请高手指点！多谢！

图片附件: 18514192.jpg (2013-2-15 13:23, 34.83 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14843

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:23

预实验孵完抗体后用invitrogen试剂盒中的显色剂曝光，是白板一张，拿回来用丽春红染色，发现貌似有目的条带，而且有非特异性条带。
丽春红染色是非特异的吧？封闭加孵完抗体后丽春红染色能不能染出目的条带啊？
如图，左边是marker.往下数第三条是95kd,第四条是72kd,目的条带是83kd
请高手指点！多谢！

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立春红染得是总蛋白
封闭后染出的条带就不清楚了
因为膜上都附有蛋白了

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-15 13:24

老师，你好，
关于二抗稀释度确定我有点不明白，按照你这样操作，曝光以后最佳的稀释度是不是应该是临界点的稀释度。如果1：2000有报光信号，1：4000没有曝光信号，就选1：2000？还是要稍微大一点，选1：1000呢？不好意思，帖子太长，写到后边怕你看不见，发个消息，呵呵。

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-15 13:26

刚才做了一个梯度，稀释1：1000-1：100000，做了7个梯度，二抗是国产的羊抗兔，ECL显色，暗室曝光，
结果1：100000有很微弱信号，1：50000信号比较明显。如果选1：50000是否稀释的太过了？
如图依次是：1：1000，1：2000，1：5000，1：10000
1：20000，1：50000，1：100000

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14844

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:27

刚才做了一个梯度，稀释1：1000-1：100000，做了7个梯度，二抗是国产的羊抗兔，ECL显色，暗室曝光，
结果1：100000有很微弱信号，1：50000信号比较明显。如果选1：50000是否稀释的太过了？
如图依次是：1：1000，1：2000，1：5000，1：10000
1：20000，1：50000，1：100000

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我会选择1：10000或者20000

作者: sunnyB 时间: 2013-2-15 13:28

大虾，你好。
我做western已经一个半月了，可是一直没有结果。染膜，染胶都能看见一条条的蛋白带。原打算不做内参的，但是目的条带一直都没有。于是，别人建议做做内参看看。结果连内参都不出。胶片上只有可曝光的marker显现出来。现在毕业还等着western的结果呢，谁知这比想象中的还要困难。请高手指点一下迷津。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-15 13:28

楼主，我想请教72kd的cox-2蛋白湿转的条件，我用的是bio-rad的仪器，0.22和0.45的pvdf膜湿转条件一样吗？谢谢啊

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:28

大虾，你好。
我做western已经一个半月了，可是一直没有结果。染膜，染胶都能看见一条条的蛋白带。原打算不做内参的，但是目的条带一直都没有。于是，别人建议做做内参看看。结果连内参都不出。胶片上只有可曝光的marker显现出来。现在毕业还等着western的结果呢，谁知这比想象中的还要困难。请高手指点一下迷津。

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应该用内参来做实验
比较容易出结果
可以用此来调试系统
把蛋白样品用SDS-PAGE之后染色看蛋白条带
把图挂上来

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:29

楼主，我想请教72kd的cox-2蛋白湿转的条件，我用的是bio-rad的仪器，0.22和0.45的pvdf膜湿转条件一样吗？谢谢啊

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300mA恒流，1h20min至1h30min
注意降温
0.45um的PVDF膜就行

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-15 13:29

我二抗用了1：20000，一抗做梯度1：1000，1：2000，1：5000，1：10000。
预杂用2% BSA 4度过夜
一抗室温一个小时
TBST洗5个5min
二抗室温一个小时
TBST洗5个5min
显色5min，曝光，结果如图：照片拍得不清楚，目标带有，但是有两条非特异带，而且目标带上下不太干净。好像一抗稀释度小的时候目标带更清楚一点，下边抗体浓度该怎么调？老师给指点一下！

一抗是GST融合表达自制的多抗，然后用histag融合表达的蛋白把特异的抗体吸附下来，作为纯化的一抗使用。

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作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:30

我二抗用了1：20000，一抗做梯度1：1000，1：2000，1：5000，1：10000。
预杂用2% BSA 4度过夜
一抗室温一个小时
TBST洗5个5min
二抗室温一个小时
TBST洗5个5min
显色5min，曝光，结果如图：照片拍得不清楚，目标带有，但是有两条非特异带，而且目标带上下不太干净。好像一抗稀释度小的时候目标带更清楚一点，下边抗体浓度该怎么调？老师给指点一下！

一抗是GST融合表达自制的多抗，然后用histag融合表达的蛋白把特异的抗体吸附下来，作为纯化的一抗使用。

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上样量减少至1/10，抗体浓度用1：10000试试

作者: yonger 时间: 2013-2-15 13:30

应该用内参来做实验
比较容易出结果
可以用此来调试系统
把蛋白样品用SDS-PAGE之后染色看蛋白条带
把图挂上来

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这是上次丽春红染的膜，照的不是太清楚。
另外，转膜，350ma，1h。封闭液是5%的奶粉，4℃过夜。一抗actin（santa的）1：500，室温，2h。PBST洗，3*10min。二抗（中杉金桥）1：4000，室温，1h。PBST洗，3*10min。ecl发光。
一抗是今年3月份买的。在我做之前一直放在-20℃里。大概有3个月。说明书上说放在4℃里，这会不会有问题呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 13:30

这是上次丽春红染的膜，照的不是太清楚。
另外，转膜，350ma，1h。封闭液是5%的奶粉，4℃过夜。一抗actin（santa的）1：500，室温，2h。PBST洗，3*10min。二抗（中杉金桥）1：4000，室温，1h。PBST洗，3*10min。ecl发光。
一抗是今年3月份买的。在我做之前一直放在-20℃里。大概有3个月。说明书上说放在4℃里，这会不会有问题呢？

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从你的图片来看转膜基本可以
我用santa的actin一抗一般用1：4000，santa的抗体都是4度保存的，放在-20应该会有影响，但不至于不会出结果
如果做不出来建议你换抗体
祝你好运

作者: yonger 时间: 2013-2-15 13:31

从你的图片来看转膜基本可以
我用santa的actin一抗一般用1：4000，santa的抗体都是4度保存的，放在-20应该会有影响，但不至于不会出结果
如果做不出来建议你换抗体
祝你好运

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谢谢大虾指点，现在准备换个实验室，试试别人的东东
希望能早日见到我朝思暮想的条带！

作者: 子衿青青 时间: 2013-2-15 13:31

1，加入样缓后我都是变性5min，没有重复
2，100K的蛋白建议你加0.01%SDS
3，CST的抗体我用的多了，整体还行
4，细胞的actin与组织的actin的量不能比，组织中actin的量非常大，像肌肉组织20ug上样量actin就会很亮。不知道你是什么组织
5，检查marker有没有问题，也许你所谓的杂带就是你要的目的带
6，反复用了两三次是什么意思？一抗重复利用？正式实验我不建议你这么用

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1. 0.01%SDS是转移液加0.01%SDS吗？昨天又做了一次，DAB显色，0.5%SDS转移液，60KD那个有条带，100那个还是没有，跟这个有关吗？
2. 我的是心肌组织，我明白了。
3. 是的，一抗反复用了三次，因为是预实验，所以为了省抗体就用了好几次。

还有个问题：我蛋白定量（BCA)的时候没有冰上操作，蛋白样本室温放置大概有半小时，对我的蛋白会有影响吗？急！ thank you so much！

作者: 子衿青青 时间: 2013-2-15 13:41

这是丽春红染的膜，是不是什么都没有？1 蛋白降解了？2 蛋白没有提取出来 3 蛋白变性时间不够？4 蛋白上样量太多？这次上样量>200微克。这批样本我上次还跑出来了，这次就成这样了。

图片附件: 94583910.jpg (2013-2-15 13:41, 9.48 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14846

作者: 子衿青青 时间: 2013-2-15 13:41

谢谢楼主，按照您给的转膜条件，我终于显出了目的条带，可是却出现很多垂直于目的条带的杂带，而且黑而直，我的电泳液和电转液都是新配的，用的是millipore0.45的膜；一抗是santa的1：500（TBST配），冰上摇过夜，TBST洗3次*10min/次；二抗santa1：7000（TBST配）室温一小时，TBST洗3次*10min/次。5%脱脂奶粉（TBST配）封闭一小时。一抗和二抗每次都是新配的。做了几次都是这样。
麻烦楼主帮分析分析。谢谢！

作者: moonlight45 时间: 2013-2-15 13:43

这是丽春红染的膜，是不是什么都没有？1 蛋白降解了？2 蛋白没有提取出来 3 蛋白变性时间不够？4 蛋白上样量太多？这次上样量>200微克。这批样本我上次还跑出来了，这次就成这样了。

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我的考染后和比他的还遭，是一片模糊，您说会不会是蛋白没有提取好呢？不可能是变性的问题和上样量的问题吧！

作者: moonlight45 时间: 2013-2-15 13:43

您好我有几个难题难以解决，向您请教：
一，
如图中，a处条带较为清晰，但是分子量在170KD，c处条带也较为清晰，但是分子量在100KD，
但是，我们的目的条带应该在130KD处，图中b处条带似乎是我们的目的条带，但是隐隐约约，而且每次做都是这样，而且一旦抗体浓度降下来，b处条带就没有了，只有a，c两处条带。
是否a，c处就是我的目的条带，如果不是，b处是我们的目的条带，抗体的质量是不是太差了。

作者: bring 时间: 2013-2-15 13:43

我的内参始终不好，原来用B-Tubulin，现在改成B-actin，反而是我的目的条带做得比较理想，不知道是什么原因，实验条件都一样，蛋白上样量也一样，但内参始终不均衡，有些甚至暴不出来内参。请帮忙分析一下是什么原因，谢谢！

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作者: bring 时间: 2013-2-15 13:44

二，
如图，
有一个蛋白，是核受体，可是每次做下来条带都很弥散，是不是提蛋白有什么特殊要求，我就是用RIPA裂解提取的蛋白，可是实在太难做了，这还是比较好的情况，有时候就像云一样根本看不出来条带，请问这是什么原因，应该怎么解决啊

[ 本帖最后由 bring 于 2013-2-15 16:49 编辑 ]

图片附件: 69170539.jpg (2013-2-15 16:49, 56.21 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14851

作者: bring 时间: 2013-2-15 13:44

三，
还有一个蛋白，以前做是能够出好看的条带的，可是最近怎么做就是没有目的条带，只有背景，抗体又新订了，做下来还是这样，这是一个硝基化的蛋白质，分子量在215KD，以前做有很好的发光，可是现在不知道什么原因，这是什么原因啊，转膜是好的。

[ 本帖最后由 bring 于 2013-2-15 16:49 编辑 ]

图片附件: 63488921.jpg (2013-2-15 16:49, 33.91 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14850

作者: ROSE李 时间: 2013-2-15 16:50

做45KD左右的蛋白无结果请教版主
用5%浓缩和10%分离 gel 电泳时间约1小时
100V 转膜约40分钟
封闭 TBST+MILK(脱脂) 2.5h
一抗封闭用TBST+BSA 4度过夜 (第一次用2h室温)
洗膜4次TBST 一次5分钟 ,一次TBS 10分钟
二抗封闭4h TBST+MILK(脱脂)
洗膜同上
曝光时间从一分钟到半小时都试过
结果没有条带
ps:总蛋白上样30ug 抗体 1:5000一抗 1:5000二抗 sant 购买
eci 为 pierce
抗体洗脱后做内参也没有条带
望不吝赐教谢谢

作者: star#room 时间: 2013-2-15 16:50

你好我请问下如果要做分泌蛋白的WESTERN，蛋白样本我该怎么制备
谢谢！

作者: lgm 时间: 2013-2-15 16:51

你好，我想请教个问题，就是我在加了ECL后每个孔都有荧光，可是过了几分钟后有几个孔的荧光条带明显变淡，最后完全消失了，请问这是怎么回事啊。知道的话能不能指点一下，谢谢。

作者: orangecake 时间: 2013-2-15 16:51

我的考染后和比他的还遭，是一片模糊，您说会不会是蛋白没有提取好呢？不可能是变性的问题和上样量的问题吧！

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我一个朋友还说可能是胶的问题，他建议我找别的实验室借点东西配胶。我也不是很清楚了，想听听NBA老师的意见。

作者: bamboo16 时间: 2013-2-15 16:52

版主你好，我要做p-creb蛋白的wb，蛋白约43KD，用cellsignal的抗体，电泳转膜后丽春红染色可见清晰条带，然后我用5%脱脂奶粉封闭，室温一个小时，一抗按推荐浓度1：1000室温2个小时，二抗按1：2000室温两个小时，用ECL发光剂，显影后胶片上没有东西，显影液是以前配的，有没有影响呢？二抗的稀释倍数大概要多少？
ps：我们的电泳仪估计有问题了，调到100v的时候跑一会儿电流就会升到400ma，电压就会慢慢下降，我试了调ph，将超纯水再用0.22um的膜过滤，效果都不是很明显，我看有人曾经用恒流跑，30ma浓缩胶，然后20ma分离胶，请问版主有没有用过恒流呢？效果怎样？

作者: bamboo16 时间: 2013-2-15 16:52

你好,我做的蛋白是GLAST,文献中条带是说在55KD,而我做了几次都是在35-25之间,因为用的是多克隆的抗体,条带还有几条,但在55KD的地方没有很明显的条带,但是在35-25之间的那一条颜色非常的深,我又用ACTIN染了一下,发现ACTIN也没有显出,而那条在35-25之间的条带依然能够显出来,颜色还是很深,我跑胶用的是120V,75分钟,8%的分离胶,5%的浓缩胶,转膜是100V,70分钟,一抗用的是ABCAM的,二抗用的是国产的HRP,MARKER石用的碧云天的蓝色宽范围预染MARKER,实验室的人都用的是这种,我也就买的这种了,一抗封闭液用的5%的脱脂奶粉,一抗和二抗的稀释液都是用的0.5%的脱脂奶粉,就是把封闭液稀释了一下就用来稀释抗体了,显影时用的ECL化学发光,是用的伯乐的那种暗箱显影,请指点,问题可能出在哪里!不胜感激!

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14852

作者: xingyi08 时间: 2013-2-15 16:52

前辈，你好，我现在做WB，目前在做内参（actin)，ECL显色时发现整张膜都在发荧光，曝出来背景很深，而且非特异性条带较多。
我的实验条件如下：浓缩胶80v 20min，分离胶120v 60min，湿转100v 60min,封闭（5%BSA）1h，一抗（Millipore的抗体，用封闭液1：1000稀释）4℃过夜，二抗（用5%脱脂奶粉 1：5000稀释）室温1h,ECL显色.
请前辈指教问题出在哪里

作者: summerxx 时间: 2013-2-15 16:53

你好我做的目的条带是白色的不知道怎么回事以前没有这种情况这次做步骤唯一的改变是我一抗孵育的时间延长了

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-15 16:53

二抗作用完成后,洗膜三次,但是由于种种原因没办法及时曝光,放4度过夜,第二天再加ECL曝光可以吗?

作者: ukonptp 时间: 2013-2-15 16:54

我一个朋友还说可能是胶的问题，他建议我找别的实验室借点东西配胶。我也不是很清楚了，想听听NBA老师的意见。

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不可能是胶的问题，我是两种标本跑胶的，一种是好的，另一种就不好，这样肯定是说明是标本的缘故。你也试试用其他肯定是好的标本做对照试试

作者: ukonptp 时间: 2013-2-15 16:54

前辈，你好，我现在做WB，目前在做内参（actin)，ECL显色时发现整张膜都在发荧光，曝出来背景很深，而且非特异性条带较多。
我的实验条件如下：浓缩胶80v 20min，分离胶120v 60min，湿转100v 60min,封闭（5%BSA）1h，一抗（Millipore的抗体，用封闭液1：1000稀释）4℃过夜，二抗（用5%脱脂奶粉 1：5000稀释）室温1h,ECL显色.
请前辈指教问题出在哪里

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会不会是一抗时间太久了

作者: ukonptp 时间: 2013-2-15 16:55

二抗作用完成后,洗膜三次,但是由于种种原因没办法及时曝光,放4度过夜,第二天再加ECL曝光可以吗?

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我试过，可以的！

作者: 831226 时间: 2013-2-15 17:08

前辈，你好，我现在做WB，目前在做内参（actin)，ECL显色时发现整张膜都在发荧光，曝出来背景很深，而且非特异性条带较多。
我的实验条件如下：浓缩胶80v 20min，分离胶120v 60min，湿转100v 60min,封闭（5%BSA）1h，一抗（Millipore的抗体，用封闭液1：1000稀释）4℃过夜，二抗（用5%脱脂奶粉 1：5000稀释）室温1h,ECL显色.
请前辈指教问题出在哪里

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你试试室温封闭2h，一抗室温1h，二抗室温1h。个人感觉你封闭时间不够，一抗过夜时间又长，容易有非特异性条带。或者你也可以4℃封闭过夜，第二天再上一抗二抗。
不行的话就只能等fang老师来啦，fang老师都还久没出现了。急啊！

作者: eric930 时间: 2013-2-15 17:08

呃...这里有没有用过博士德一抗的同学？我用他们的兔多克隆抗体（1：400）做了几次目的条带都没有，几条杂带却很清晰，唉...

作者: 131415 时间: 2013-2-15 17:09

版主，我刚做western，我问一下为什么用脱脂奶粉封闭，原理是什么啊

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:09

1. 0.01%SDS是转移液加0.01%SDS吗？昨天又做了一次，DAB显色，0.5%SDS转移液，60KD那个有条带，100那个还是没有，跟这个有关吗？
2. 我的是心肌组织，我明白了。
3. 是的，一抗反复用了三次，因为是预实验，所以为了省抗体就用了好几次。

还有个问题：我蛋白定量（BCA)的时候没有冰上操作，蛋白样本室温放置大概有半小时，对我的蛋白会有影响吗？急！ thank you so much！

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1，小分子量蛋白转膜的时候不建议加SDS
2，预实验你反复用你知道具体的稀释度吗
3，RT 半小时影响很大

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:10

这是丽春红染的膜，是不是什么都没有？1 蛋白降解了？2 蛋白没有提取出来 3 蛋白变性时间不够？4 蛋白上样量太多？这次上样量>200微克。这批样本我上次还跑出来了，这次就成这样了。

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感觉像是蛋白量太大了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:10

谢谢楼主，按照您给的转膜条件，我终于显出了目的条带，可是却出现很多垂直于目的条带的杂带，而且黑而直，我的电泳液和电转液都是新配的，用的是millipore0.45的膜；一抗是santa的1：500（TBST配），冰上摇过夜，TBST洗3次*10min/次；二抗santa1：7000（TBST配）室温一小时，TBST洗3次*10min/次。5%脱脂奶粉（TBST配）封闭一小时。一抗和二抗每次都是新配的。做了几次都是这样。
麻烦楼主帮分析分析。谢谢！

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配置的奶粉过滤后使用

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:10

你好啊，看了您的解说，真的很精彩！
我这刚刚遇到了western blot的问题，麻烦您帮忙看看

查看了很多文献，说原发性肝癌90%以上是表达HBX抗原
我提取了原发性肝癌的组织蛋白，用蛋白及其血浆分别做western blot，转膜到PVDF膜上，（这里我就简单讲了，因为个人认为上面操作没有问题），转膜后剪成两段，上面的用做内参，两个抗体一起做的，内参的做的很漂亮。HBX一抗是1：1000BSA稀释（建议1：500-1：2000）室温先放置2小时，然后4°冰箱放置了4个小时，其他操作和内参的操作都是一样的，但是目的片段没有看到，杂带到是有好几条，HBX抗体是在这个网站上买的cuturl('www.abcam.com')，抗体应该是很好的。

另外还有一个问题：
我把这个原发性肝癌蛋白组织提取液和血浆还有胃癌蛋白提取液分别跑了SDS-PAGE，然后考玛斯亮蓝染色，发现一个很奇怪的问题，胃癌的蛋白是正常的，条带是一条一条的，但是肝癌的组织提取液和血浆却是一片模糊，条带都看不到，这些都是一起操作的，我想应该是样本的问题吧，我重复了两次实验，都是这样的结果，为什么会这样呢？
麻烦你帮我解答一下，谢谢！

小妹还是新手，可能请教的时候讲不清楚，请大家见谅哈

================================

可能是蛋白上样量大了
每次做WB之前应该先跑电泳，染胶

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:11

我的考染后和比他的还遭，是一片模糊，您说会不会是蛋白没有提取好呢？不可能是变性的问题和上样量的问题吧！

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你用的什么裂解液？
肯能蛋白上样量太大
或者盐浓度过高

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:11

我的考染后和比他的还遭，是一片模糊，您说会不会是蛋白没有提取好呢？不可能是变性的问题和上样量的问题吧！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:11

您好我有几个难题难以解决，向您请教：
一，
如图中，a处条带较为清晰，但是分子量在170KD，c处条带也较为清晰，但是分子量在100KD，
但是，我们的目的条带应该在130KD处，图中b处条带似乎是我们的目的条带，但是隐隐约约，而且每次做都是这样，而且一旦抗体浓度降下来，b处条带就没有了，只有a，c两处条带。
是否a，c处就是我的目的条带，如果不是，b处是我们的目的条带，抗体的质量是不是太差了。

============================

1，减小上样量，稀释一抗试试
2，确定Marker的位置是否正确

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:15

我的内参始终不好，原来用B-Tubulin，现在改成B-actin，反而是我的目的条带做得比较理想，不知道是什么原因，实验条件都一样，蛋白上样量也一样，但内参始终不均衡，有些甚至暴不出来内参。请帮忙分析一下是什么原因，谢谢！

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1，内参不均衡是很正常的，但像你这样结果不是很好
2，通过预实验结果来调整蛋白的上样量
3，注意抗体的孵育
4，ECL孵育时可能没有覆盖好膜

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:15

二，
如图，
有一个蛋白，是核受体，可是每次做下来条带都很弥散，是不是提蛋白有什么特殊要求，我就是用RIPA裂解提取的蛋白，可是实在太难做了，这还是比较好的情况，有时候就像云一样根本看不出来条带，请问这是什么原因，应该怎么解决啊

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感觉是胶凝的不好
可以用胞浆、胞核蛋白分别抽提的试剂盒来抽提胞核蛋白

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:16

三，
还有一个蛋白，以前做是能够出好看的条带的，可是最近怎么做就是没有目的条带，只有背景，抗体又新订了，做下来还是这样，这是一个硝基化的蛋白质，分子量在215KD，以前做有很好的发光，可是现在不知道什么原因，这是什么原因啊，转膜是好的。

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考虑抗体是不是活性降低了
好的条带与现在的实验之间换过二抗没？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:16

做45KD左右的蛋白无结果请教版主
用5%浓缩和10%分离 gel 电泳时间约1小时
100V 转膜约40分钟
封闭 TBST+MILK(脱脂) 2.5h
一抗封闭用TBST+BSA 4度过夜 (第一次用2h室温)
洗膜4次TBST 一次5分钟 ,一次TBS 10分钟
二抗封闭4h TBST+MILK(脱脂)
洗膜同上
曝光时间从一分钟到半小时都试过
结果没有条带
ps:总蛋白上样30ug 抗体 1:5000一抗 1:5000二抗 sant 购买
eci 为 pierce
抗体洗脱后做内参也没有条带
望不吝赐教谢谢

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1，蛋白细胞定位在那？
2，可能目的蛋白没有提取出来
3，一抗太稀了，用1:200先试试

作者: kswl870 时间: 2013-2-15 17:16

请教，我的条带在NC膜上有显示，但是曝光后在胶片上就是一片空白，不知道怎么回事，不知道可能是那些地方出现了问题，

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:17

请教，我的条带在NC膜上有显示，但是曝光后在胶片上就是一片空白，不知道怎么回事，不知道可能是那些地方出现了问题，

==========================

在NC膜上有显示是什么意思

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:17

你好，我想请教个问题，就是我在加了ECL后每个孔都有荧光，可是过了几分钟后有几个孔的荧光条带明显变淡，最后完全消失了，请问这是怎么回事啊。知道的话能不能指点一下，谢谢。

===============================

二抗浓度太高
或者接触到了ECL中催化酶的抑制剂

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:19

我一个朋友还说可能是胶的问题，他建议我找别的实验室借点东西配胶。我也不是很清楚了，想听听fangweibing119老师的意见。

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1，延长胶的凝聚时间
2，校正tris buffer的pH

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:19

版主你好，我要做p-creb蛋白的wb，蛋白约43KD，用cellsignal的抗体，电泳转膜后丽春红染色可见清晰条带，然后我用5%脱脂奶粉封闭，室温一个小时，一抗按推荐浓度1：1000室温2个小时，二抗按1：2000室温两个小时，用ECL发光剂，显影后胶片上没有东西，显影液是以前配的，有没有影响呢？二抗的稀释倍数大概要多少？
ps：我们的电泳仪估计有问题了，调到100v的时候跑一会儿电流就会升到400ma，电压就会慢慢下降，我试了调ph，将超纯水再用0.22um的膜过滤，效果都不是很明显，我看有人曾经用恒流跑，30ma浓缩胶，然后20ma分离胶，请问版主有没有用过恒流呢？效果怎样？

=============================================================

1，加了ECL后在暗处应该能看到荧光（目的蛋白表达量大的话，比如内参）
2，显影液我一般用一周，每次用完用密封的瓶保存

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:20

你好,我做的蛋白是GLAST,文献中条带是说在55KD,而我做了几次都是在35-25之间,因为用的是多克隆的抗体,条带还有几条,但在55KD的地方没有很明显的条带,但是在35-25之间的那一条颜色非常的深,我又用ACTIN染了一下,发现ACTIN也没有显出,而那条在35-25之间的条带依然能够显出来,颜色还是很深,我跑胶用的是120V,75分钟,8%的分离胶,5%的浓缩胶,转膜是100V,70分钟,一抗用的是ABCAM的,二抗用的是国产的HRP,MARKER石用的碧云天的蓝色宽范围预染MARKER,实验室的人都用的是这种,我也就买的这种了,一抗封闭液用的5%的脱脂奶粉,一抗和二抗的稀释液都是用的0.5%的脱脂奶粉,就是把封闭液稀释了一下就用来稀释抗体了,显影时用的ECL化学发光,是用的伯乐的那种暗箱显影,请指点,问题可能出在哪里!不胜感激!

==============================

1，35K处是一条污染带
2，一抗，二抗稀释用5%脱脂奶粉

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:21

前辈，你好，我现在做WB，目前在做内参（actin)，ECL显色时发现整张膜都在发荧光，曝出来背景很深，而且非特异性条带较多。
我的实验条件如下：浓缩胶80v 20min，分离胶120v 60min，湿转100v 60min,封闭（5%BSA）1h，一抗（Millipore的抗体，用封闭液1：1000稀释）4℃过夜，二抗（用5%脱脂奶粉 1：5000稀释）室温1h,ECL显色.
请前辈指教问题出在哪里

=====================

1，一抗与二抗浓度太高

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:22

你好我做的目的条带是白色的不知道怎么回事以前没有这种情况这次做步骤唯一的改变是我一抗孵育的时间延长了

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我也出现过这种情况
可能是蛋白上样量大了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:22

二抗作用完成后,洗膜三次,但是由于种种原因没办法及时曝光,放4度过夜,第二天再加ECL曝光可以吗?

========

可以

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:23

你试试室温封闭2h，一抗室温1h，二抗室温1h。个人感觉你封闭时间不够，一抗过夜时间又长，容易有非特异性条带。或者你也可以4℃封闭过夜，第二天再上一抗二抗。
不行的话就只能等fang老师来啦，fang老师都还久没出现了。急啊！

================

封闭室温30min
一抗4度过夜
二抗室温40min

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:23

呃...这里有没有用过博士德一抗的同学？我用他们的兔多克隆抗体（1：400）做了几次目的条带都没有，几条杂带却很清晰，唉...

=============

我用过
不行就换抗体
具体的不便多说

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:25

版主，我刚做western，我问一下为什么用脱脂奶粉封闭，原理是什么啊

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有一个封闭原理的帖子
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15201822&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: wood533 时间: 2013-2-15 17:26

我想请教下，细胞提取蛋白时加RAPA（细胞裂解液）的量是多少，一瓶培养瓶的量
是150ul,200ul 300ul 还是400ul，是否有差别，加多的话蛋白浓度会不会够呢？

另外大家是否在冰板上超作30MIN呢？然后在去离心

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:26

我想请教下，细胞提取蛋白时加RAPA（细胞裂解液）的量是多少，一瓶培养瓶的量
是150ul,200ul 300ul 还是400ul，是否有差别，加多的话蛋白浓度会不会够呢？

另外大家是否在冰板上超作30MIN呢？然后在去离心

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1乘以10的7次方细胞加1ml
冰上孵育20至30min

作者: fsdd817 时间: 2013-2-15 17:28

生物无忧，好像有WB的视频，可以学习一下

作者: nn255 时间: 2013-2-15 17:28

你好
我做的是240KD左右的蛋白
提取的是小鼠肝组织总蛋白，蛋白浓度都在10mg/ml以上
分离胶8%
电泳时间2小时*100V
转膜时间4小时*400mA恒流（PVDF 膜）
封闭5%牛奶 TBST *1小时
一抗 SANTA 1：400 （1：100--1：1000）TBST稀释过夜
二抗 SANTA 1：4000 TBST稀释 1小时
ECL显色曝光
整条膜发光
曝光后背景很浓，但是没有目的条带，
另外有个关于提取蛋白的问题
我用的是sigma德RIPA buffer 提取的组织蛋白，组织裂解，4°C离心*10min后最上层出现粘稠物质，如何处理？对后续试验什么影响？
谢谢！！！

作者: yes4 时间: 2013-2-15 17:32

前辈，你好，我做的是300KD的蛋白质，但是还没有作出明显的条带来，我估计是电泳和转膜条件不好、能否给些参考意见？谢谢前辈，前辈辛苦啦！

我的条件如下：
电泳 6%分离胶，20mA浓缩胶，40mA分离胶，溴酚蓝跑至胶底缘即停止，时间在75min左右。
转膜 NC膜，90v，4h，4度。转膜液甲醇含量20%。

我一直在查，自己也在总结原因。
电泳时间太短？
转膜时间太短？
甲醇含量需降低？

作者: yes4 时间: 2013-2-15 17:35

哦，还有，我用的北京六一的DYY电泳仪，电流最大输出200mA.电压最大输出写的是600v，但前天转膜的时候，我把电流调至200mA,电压调至100v，但最后电压只稳定在90v。还在找原因。

作者: xyw5 时间: 2013-2-15 17:35

谢谢楼主的指导
但是试过一抗1：200 后仍然无法曝出来
考染显示蛋白浓度不高我上的是30ug
丽春红染色未见明显条带（曝光后染色）
目的蛋白定位在细胞质中
做过一次内参也没有显示
郁闷中希望老师指导谢谢

作者: JK.jon 时间: 2013-2-15 17:36

你用的什么裂解液？
肯能蛋白上样量太大
或者盐浓度过高

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血浆是直接拿来和loading buffer一起煮沸跑的，也是呈现模糊的状态的吗？我用细胞裂解后蛋白一起跑，条带是好的，这说明胶是没有问题的吧！

作者: JK.jon 时间: 2013-2-15 17:36

相关疾病：
原发性肝癌
不好意思，您没有特别回答我的问题，所以又问一遍哈。

查看了很多文献，说原发性肝癌90%以上是表达HBX抗原。
我提取了原发性肝癌的组织蛋白，做western blot，转膜到PVDF膜上，（这里我就简单讲了，因为个人认为上面操作没有问题），我做了2块，一块用内参抗体，另一块用HBX，两个抗体一起做的，内参的做的很漂亮。
HBX抗体是在这个网站上买的cuturl('www.abcam.com')，抗体应该是很好的。
HBX一抗是1：1000BSA稀释（建议1：500-1：2000）4°冰箱放置了2个小时，其他操作和内参的操作都是一样的，结果HBX抗体特异性很好，就是条带是39KD的，而我们的目的条带是17KD的。
后来增加了一抗放置的时间，出现多条条带，但是都没有看到17kd的，请问这是这么回事呢？？?
文献报到说HBX只有17KD，在融合状态有28KD，其他的就没有了，我改怎么调整我的实验呢？

作者: zranqi_1 时间: 2013-2-15 17:36

版主：又来麻烦了。目的蛋白97kd.santa一抗。
8%分离胶，300ma1个半小时转膜。
问题是：内参没问题，但是目的蛋白条带不是水平而是竖直的！已经重复了两次。第二次的蛋白样品是新制的。
请问是怎么回事？电泳液和电转液都是新配的。

作者: dog002 时间: 2013-2-15 17:38

请问版主
磷酸化位点的WB样本蛋白需要特殊处理吗？
我听有人说之前蛋白不应煮沸的啊？
求助
急啊
谢谢斑竹

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-15 17:38

继续请教：我pvdf膜抗体孵育并ecl发光做完了之后，因有其他事情，仅用蒸馏水湿润了一下封在保鲜膜里面就没再管，后来分析底片感觉条带有问题，打算重新显色，发现膜已经干了，我重新取出膜来加AB显色剂曝光显影定影后发现条带消失了，请问这是怎么回事啊？我如果要重新处理我的膜的话应该怎么办啊？现在我很担心我这张膜没法重新再显色曝光了..

作者: mickeylin 时间: 2013-2-15 17:38

做SDS-PAGE电泳时，凝胶的厚度对电泳结果有什么影响？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:45

你好
我做的是240KD左右的蛋白
提取的是小鼠肝组织总蛋白，蛋白浓度都在10mg/ml以上
分离胶8%
电泳时间2小时*100V
转膜时间4小时*400mA恒流（PVDF 膜）
封闭5%牛奶 TBST *1小时
一抗 SANTA 1：400 （1：100--1：1000）TBST稀释过夜
二抗 SANTA 1：4000 TBST稀释 1小时
ECL显色曝光
整条膜发光
曝光后背景很浓，但是没有目的条带，
另外有个关于提取蛋白的问题
我用的是sigma德RIPA buffer 提取的组织蛋白，组织裂解，4°C离心*10min后最上层出现粘稠物质，如何处理？对后续试验什么影响？
谢谢！！！

=================================================================================

1，用什么裂解液取决于你的目的蛋白定位在那，你可以上Abcam搜搜你的目的蛋白的cellular location
2，整膜发光的话延长二抗洗膜时间
3，加大二抗稀释度至少一倍

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:47

前辈，你好，我做的是300KD的蛋白质，但是还没有作出明显的条带来，我估计是电泳和转膜条件不好、能否给些参考意见？谢谢前辈，前辈辛苦啦！

我的条件如下：
电泳 6%分离胶，20mA浓缩胶，40mA分离胶，溴酚蓝跑至胶底缘即停止，时间在75min左右。
转膜 NC膜，90v，4h，4度。转膜液甲醇含量20%。

我一直在查，自己也在总结原因。
电泳时间太短？
转膜时间太短？
甲醇含量需降低？

===================

用什么裂解液？
目的蛋白定位在那？
你的系统有问题吗？
做过内参吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:47

哦，还有，我用的北京六一的DYY电泳仪，电流最大输出200mA.电压最大输出写的是600v，但前天转膜的时候，我把电流调至200mA,电压调至100v，但最后电压只稳定在90v。还在找原因。

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问问六一厂

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:48

谢谢楼主的指导
但是试过一抗1：200 后仍然无法曝出来
考染显示蛋白浓度不高我上的是30ug
丽春红染色未见明显条带（曝光后染色）
目的蛋白定位在细胞质中
做过一次内参也没有显示
郁闷中希望老师指导谢谢

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那就先摸条件做内参

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:48

血浆是直接拿来和loading buffer一起煮沸跑的，也是呈现模糊的状态的吗？我用细胞裂解后蛋白一起跑，条带是好的，这说明胶是没有问题的吧！

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血浆需要稀释50倍以上才行

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-15 17:49

不好意思，您没有特别回答我的问题，所以又问一遍哈。

查看了很多文献，说原发性肝癌90%以上是表达HBX抗原。
我提取了原发性肝癌的组织蛋白，做western blot，转膜到PVDF膜上，（这里我就简单讲了，因为个人认为上面操作没有问题），我做了2块，一块用内参抗体，另一块用HBX，两个抗体一起做的，内参的做的很漂亮。
HBX抗体是在这个网站上买的cuturl('www.abcam.com')，抗体应该是很好的。
HBX一抗是1：1000BSA稀释（建议1：500-1：2000）4°冰箱放置了2个小时，其他操作和内参的操作都是一样的，结果HBX抗体特异性很好，就是条带是39KD的，而我们的目的条带是17KD的。
后来增加了一抗放置的时间，出现多条条带，但是都没有看到17kd的，请问这是这么回事呢？？?
文献报到说HBX只有17KD，在融合状态有28KD，其他的就没有了，我改怎么调整我的实验呢？

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您好，我是用半干法转膜的，电压15V，30分钟，是不是电压太高，把17KD的分子量转出去了啊？我的内参是25KD分子量的抗原是可以做出来的，好像这也说明不了问题哦！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:49

不好意思，您没有特别回答我的问题，所以又问一遍哈。

查看了很多文献，说原发性肝癌90%以上是表达HBX抗原。
我提取了原发性肝癌的组织蛋白，做western blot，转膜到PVDF膜上，（这里我就简单讲了，因为个人认为上面操作没有问题），我做了2块，一块用内参抗体，另一块用HBX，两个抗体一起做的，内参的做的很漂亮。
HBX抗体是在这个网站上买的cuturl('www.abcam.com')，抗体应该是很好的。
HBX一抗是1：1000BSA稀释（建议1：500-1：2000）4°冰箱放置了2个小时，其他操作和内参的操作都是一样的，结果HBX抗体特异性很好，就是条带是39KD的，而我们的目的条带是17KD的。
后来增加了一抗放置的时间，出现多条条带，但是都没有看到17kd的，请问这是这么回事呢？？?
文献报到说HBX只有17KD，在融合状态有28KD，其他的就没有了，我改怎么调整我的实验呢？

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实际检测到得目的条带位置与你想要的条带的位置有差别，你可以上Abcam网站上看看是怎么解释的

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:49

您好，我是用半干法转膜的，电压15V，30分钟，是不是电压太高，把17KD的分子量转出去了啊？我的内参是25KD分子量的抗原是可以做出来的，好像这也说明不了问题哦！

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不会转出去
用0.22um的膜
另外你可以换一抗试试

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:50

您好，我是用半干法转膜的，电压15V，30分钟，是不是电压太高，把17KD的分子量转出去了啊？我的内参是25KD分子量的抗原是可以做出来的，好像这也说明不了问题哦！

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不会转出去
用0.22um的膜
另外你可以换一抗试试

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:51

版主：又来麻烦了。目的蛋白97kd.santa一抗。
8%分离胶，300ma1个半小时转膜。
问题是：内参没问题，但是目的蛋白条带不是水平而是竖直的！已经重复了两次。第二次的蛋白样品是新制的。
请问是怎么回事？电泳液和电转液都是新配的。

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奇怪
我也没碰到过这种情况
胶泥可以选择用10%的
条带散吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:51

请问版主
磷酸化位点的WB样本蛋白需要特殊处理吗？
我听有人说之前蛋白不应煮沸的啊？？？？
求助
急啊
谢谢斑竹

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蛋白提取时需要加蛋白酶抑制剂
封闭及孵育抗体最好用BSA
要煮沸变性
其他同正常WB

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:51

看了您的精彩回答，向您致敬
小弟也想问个问题，就是关于1抗怎么买的问题。
我是想检测HCVC蛋白的表达，1b型，pubmed上序号是AB092962
翻译过来是这个
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTVPASA
想检测此蛋白的表达，1抗该如何购买？很多家说亚型太多，无法判断～望您不吝赐教～不胜感激～！

作者: 49888 时间: 2013-2-15 17:52

你好，我想问一个关于免疫沉淀的问题
为什么不能同时用抓蛋白的抗体去做western blot呢？
为什么这样做的结果是不能说明这个蛋白是存在的呢？

作者: 49888 时间: 2013-2-15 17:53

您好！抗体在煮沸后是不是他的重链和轻链就会断开，也就是说抗体煮开后没有效价了吧？
那煮沸后的一抗还能和原来的相应的二抗结合呢？

作者: ROSE李 时间: 2013-2-15 17:53

谢谢版主的指导
现在内参出来了
靶蛋白还是曝不出来
文献提示靶蛋白应该有中度表达
我用5%的BSA TBST封闭孵育一抗
说明上讲用0.2%BSA 以及PBS 孵育不知道影响是否会很大

作者: greenbee 时间: 2013-2-15 17:54

小弟也想问个问题，就是关于1抗怎么买的问题。
我是想检测HCVC蛋白的表达，1b型，pubmed上序号是AB092962
翻译过来是这个
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERSQPRGRRQPIPKARRPEGRTWAQPGYPWPLYGNEGCGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTVPASA
想检测此蛋白的表达，1抗该如何购买？很多家说亚型太多，无法判断～望您不吝赐教～不胜感激～！

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你上Abcam网站查查

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:54

你好，我想问一个关于免疫沉淀的问题
为什么不能同时用抓蛋白的抗体去做western blot呢？
为什么这样做的结果是不能说明这个蛋白是存在的呢？

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看你检测的目的是什么了
一般做免疫沉淀是研究与某个蛋白有相互作用的其他感兴趣的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:55

您好！抗体在煮沸后是不是他的重链和轻链就会断开，也就是说抗体煮开后没有效价了吧？
那煮沸后的一抗还能和原来的相应的二抗结合呢？

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可以结合
煮沸变性抗体从protein A或者G上断开
重链和轻链还在你的体系中

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:55

谢谢版主的指导
现在内参出来了
靶蛋白还是曝不出来
文献提示靶蛋白应该有中度表达
我用5%的BSA TBST封闭孵育一抗
说明上讲用0.2%BSA 以及PBS 孵育不知道影响是否会很大

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查查目的蛋白的提取方法

作者: tuuu2 时间: 2013-2-15 17:55

方老师，您看我做WB后用ECL显色出现这种结果是因为什么原因啊？谢谢！！！

作者: kulee 时间: 2013-2-15 17:56

你好，我想请教下，如何确保蛋白上样量是一样的啊，我是用BCA蛋白浓度测定法，如何根据标准曲线计算出蛋白浓度，希望具体些，非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:56

方老师，您看我做WB后用ECL显色出现这种结果是因为什么原因啊？谢谢！！！

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抗体浓度太高了

作者: NBA 时间: 2013-2-15 17:57

你好，我想请教下，如何确保蛋白上样量是一样的啊，我是用BCA蛋白浓度测定法，如何根据标准曲线计算出蛋白浓度，希望具体些，非常感谢

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看试剂说明书吧

作者: wu11998866 时间: 2013-2-15 17:57

1，小分子量蛋白转膜的时候不建议加SDS，
2，100KD建议用0.01%SDS转膜。

请问：SDS对转膜影响真的很大吗？
1.我用0.01%SDS转膜液 100kd（8%胶）那个有条带（不太清楚），但20kd（12%胶）的蛋白没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug。湿转：100V 90min。
2.0.5%sds 100kd、20kd 蛋白都没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug 之前用0.5%sds 20kd 蛋白做出来过一次。
3.又试了一次转移液不加sds 结果20kd 和100kd 都没有，内参好的。1.0胶上样量：150ug。
请问一下：还有可能是其他什么原因吗？应该是都可以做出来的蛋白。 thanks a lot！

作者: wu11998866 时间: 2013-2-15 17:58

请问：SDS对转膜影响真的很大吗？
1.我用0.01%SDS转膜液 100kd（8%胶）那个有条带（不太清楚），但20kd（12%胶）的蛋白没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug。湿转：100V 90min。
2.0.5%sds 100kd、20kd 蛋白都没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug 之前用0.5%sds 20kd 蛋白做出来过一次。
3.又试了一次转移液不加sds 结果20kd 和100kd 都没有，内参好的。1.0胶上样量：150ug。
请问一下：还有可能是其他什么原因吗？应该是都可以做出来的蛋白。 thanks a lot！

作者: langlang 时间: 2013-2-15 17:58

抗体浓度太高了

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是一抗的浓度太高吗？

作者: glass 时间: 2013-2-15 18:00

请教，我和我同学一起跑娇，电转曝光所有的都一样，除了蛋白抗体，最后我出来的条带很漂亮可是她什么都没有，
我想问下，当时我们做过BCA测定，她的蛋白还比我浓，是不是说明蛋白已经提取成功了呢？
另外她是用10％牛奶封闭的，我是用5%,这样有区别吗
可是帮我们分析是什么原因吗

作者: wmp1234 时间: 2013-2-15 18:01

请问做Western提取膜蛋白的试剂盒推荐哪个公司的性价比比较高呢？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-15 18:01

请问：SDS对转膜影响真的很大吗？
1.我用0.01%SDS转膜液 100kd（8%胶）那个有条带（不太清楚），但20kd（12%胶）的蛋白没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug。湿转：100V 90min。
2.0.5%sds 100kd、20kd 蛋白都没有条带。60kd 和actin都很好。 1.0胶上样量：100ug 之前用0.5%sds 20kd 蛋白做出来过一次。
3.又试了一次转移液不加sds 结果20kd 和100kd 都没有，内参好的。1.0胶上样量：150ug。
请问一下：还有可能是其他什么原因吗？应该是都可以做出来的蛋白。 thanks a lot！

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高浓度SDS会有影响
转膜条件是什么？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 18:01

是一抗的浓度太高吗？

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一抗、二抗都高

作者: NBA 时间: 2013-2-15 18:02

请教，我和我同学一起跑娇，电转曝光所有的都一样，除了蛋白抗体，最后我出来的条带很漂亮可是她什么都没有，
我想问下，当时我们做过BCA测定，她的蛋白还比我浓，是不是说明蛋白已经提取成功了呢？
另外她是用10％牛奶封闭的，我是用5%,这样有区别吗
可是帮我们分析是什么原因吗

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1，蛋白浓你排除了测试时的干扰因素了吗？各种离子成分等
2，10%太高了
3，你做的好，她为什么不参考你的方法？

作者: NBA 时间: 2013-2-15 18:02

请问做Western提取膜蛋白的试剂盒推荐哪个公司的性价比比较高呢？
谢谢！

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我用过Pierce的
其他就是我自己配制的
国内的我不是很清楚
如果你的膜蛋白丰度比较高，可以用提取总蛋白的裂解液试试

作者: wsll 时间: 2013-2-15 18:04

请教一下,26kd蛋白的转膜条件.谢谢

作者: www.1 时间: 2013-2-15 18:04

请教一下,26kd蛋白的转膜条件.谢谢

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半干还是湿转？

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-15 18:05

半干还是湿转？

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我用的是湿转,

作者: mysmdbl 时间: 2013-2-15 18:06

高浓度SDS会有影响
转膜条件是什么？

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转膜条件：湿转：100V 90min.

作者: qqq111 时间: 2013-2-15 18:07

谢谢！
膜蛋白丰度是不是就是膜蛋白的含量的意思？怎么知道它的丰度呢？

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-15 18:07

二抗浓度过高使得ECL信号瞬间损失，那么一抗浓度过高会不会出现类似情况呢

作者: wmp1234 时间: 2013-2-15 18:10

我用的是湿转,

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300mA 30min

作者: wmp1234 时间: 2013-2-15 18:11

转膜条件：湿转：100V 90min.

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可能目的蛋白没有提取出来

作者: wmp1234 时间: 2013-2-15 18:11

谢谢！
膜蛋白丰度是不是就是膜蛋白的含量的意思？怎么知道它的丰度呢？

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看文献人家的上样量多大，条带结果如何
或者看有关的抗体说明书上的条带

作者: wmp1234 时间: 2013-2-15 18:11

二抗浓度过高使得ECL信号瞬间损失，那么一抗浓度过高会不会出现类似情况呢

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一抗浓度过高也会同样非特异性吸附在膜上
加入二抗时会结合在一抗上

作者: duoduo 时间: 2013-2-15 18:12

你好，我最近发现我跑出来的条带有时曝光后颜色不均匀，就是该看到的条带条带你都看得到，就单个来看但会发现它的颜色不均匀，有的地方颜色深有的地方颜色浅。我想请问一下这是什么原因造成的，如果发表论文要用的话可以拿来用吗？

图片附件: 93925382.jpg (2013-2-15 18:12, 12.45 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14853

作者: NBA 时间: 2013-2-15 18:12

你好，我最近发现我跑出来的条带有时曝光后颜色不均匀，就是该看到的条带条带你都看得到，就单个来看但会发现它的颜色不均匀，有的地方颜色深有的地方颜色浅。我想请问一下这是什么原因造成的，如果发表论文要用的话可以拿来用吗？

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我认为可以发表论文
真实
另外我感觉上样量大了
减少上样量试试
曝光后显影充分些

作者: fei1226com 时间: 2013-2-15 18:13

请问在做westen 时条带呈现哑铃型和胡萝卜型是什么原因？

作者: DDD 时间: 2013-2-15 18:14

请教185 Kd和38Kd蛋白质的转膜条件?我用的是湿转,谢谢

作者: cwcwcww 时间: 2013-2-15 18:14

请问在做westen 时条带呈现哑铃型和胡萝卜型是什么原因？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14854

作者: cwcwcww 时间: 2013-2-16 08:50

请问在做westen 时条带呈现哑铃型和胡萝卜型是什么原因？

图片附件: 38970194.snap.jpg (2013-2-16 08:50, 12.89 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14862

作者: NBA 时间: 2013-2-16 08:54

请教185 Kd和38Kd蛋白质的转膜条件?我用的是湿转,谢谢

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185K：300mA恒流，2h30min
38K：300mA恒流，1h

作者: NBA 时间: 2013-2-16 09:04

请问在做westen 时条带呈现哑铃型和胡萝卜型是什么原因？

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边缘抗体孵育不好
增加一抗孵育体系，充分孵育

作者: NBA 时间: 2013-2-16 09:04

请问在做westen 时条带呈现哑铃型和胡萝卜型是什么原因？

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另外转膜时注意赶气泡

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-2-16 09:13

WB做了一个月了，但是什么条带都没有，我是指内参。。。。（天啊，我连内参都做不出来，不过事实就是这样）刚开始是师兄的抗体过期，后来什么都换新的了还是做不出来。
我用的条件是：12%的分离胶，6%的浓缩胶。100V。转移的时候是200MA 1个半小时。5%牛奶封闭2H，1：500 一抗 4度过夜。洗3次，每次10分钟。然后2抗是1:1500.洗3次，每次10分钟.碧云天的化学发光试剂显色。什么都没有白白的。应该不是蛋白的问题，我自己的蛋白做了PAGE，有的。然后用别人已经刚做出来很漂亮内参的蛋白一起做，什么都没有。就是什么都没有。555555555555555555555555555555555555555555555急死人了。用的别人做出内参条带的条件还是白白的。干净的很。救救我啊~~~~

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-2-16 15:38

半干还是湿转？

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呀~~20多KD就90分钟，那我的43KD岂不3个小时？
可以这样类推？

作者: NBA 时间: 2013-2-16 15:39

呀~~20多KD就90分钟，那我的43KD岂不3个小时？
可以这样类推？

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43K半干转40min~1h都可以
恒流
每平方厘米膜面积1.2mA

作者: NBA 时间: 2013-2-16 15:39

WB做了一个月了，但是什么条带都没有，我是指内参。。。。（天啊，我连内参都做不出来，不过事实就是这样）刚开始是师兄的抗体过期，后来什么都换新的了还是做不出来。
我用的条件是：12%的分离胶，6%的浓缩胶。100V。转移的时候是200MA 1个半小时。5%牛奶封闭2H，1：500 一抗 4度过夜。洗3次，每次10分钟。然后2抗是1:1500.洗3次，每次10分钟.碧云天的化学发光试剂显色。什么都没有白白的。应该不是蛋白的问题，我自己的蛋白做了PAGE，有的。然后用别人已经刚做出来很漂亮内参的蛋白一起做，什么都没有。就是什么都没有。555555555555555555555555555555555555555555555急死人了。用的别人做出内参条带的条件还是白白的。干净的很。救救我啊~~~~

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如果确定不是样品有问题的话把二抗换一下
同时把ECL也换了（可以用你同学的能做出条带来的东西试试）

作者: one 时间: 2013-2-16 15:40

请问下新配的电泳缓冲液，稀释0.5X的，马上就变浑浊，是怎么回事啊，最可能是哪个成分的问题？浑浊像牛奶样！新配的，还是

作者: NBA 时间: 2013-2-16 15:41

请问下新配的电泳缓冲液，稀释0.5X的，马上就变浑浊，是怎么回事啊，最可能是哪个成分的问题？浑浊像牛奶样！新配的，还是

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不清楚你说的这种情况

作者: lgm 时间: 2013-2-16 15:42

楼主你好：
我想请你帮我分析一下我WB结果失败的原因这是我做的内参GAPDH的结果，为什么会有2条带，而且那么不清楚?

图片附件: 15980828.jpg (2013-2-16 15:42, 19.54 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14863

作者: lgm 时间: 2013-2-16 15:42

我要测人血清中的一种蛋白，要买该蛋白的一抗。找到2个一抗。一个是reacts with：人，小鼠，大鼠，狗。另一个是reacts with：人。我选哪个好呢？
另外选一抗时，是多克隆的好呢，还是多克隆的好呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-16 15:43

楼主你好：
我想请你帮我分析一下我WB结果失败的原因这是我做的内参GAPDH的结果，为什么会有2条带，而且那么不清楚?

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下面那一坨不知道什么东西

作者: NBA 时间: 2013-2-16 15:43

我要测人血清中的一种蛋白，要买该蛋白的一抗。找到2个一抗。一个是reacts with：人，小鼠，大鼠，狗。另一个是reacts with：人。我选哪个好呢？
另外选一抗时，是多克隆的好呢，还是多克隆的好呢？

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取决于抗体的质量
两者我都喜欢用

作者: H2O 时间: 2013-2-17 14:22

不清楚你说的这种情况

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我直接配的5X，然后用的时候稀释10倍，没稀释前是清亮的，加蒸馏水后就变浑浊了，会不会是SDS的问题啊？没有充分溶解？

作者: NBA 时间: 2013-2-17 14:25

我直接配的5X，然后用的时候稀释10倍，没稀释前是清亮的，加蒸馏水后就变浑浊了，会不会是SDS的问题啊？没有充分溶解？

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是不是你稀释用的蒸馏水有问题

作者: moonlight45 时间: 2013-2-17 14:26

我想请教一下,我购买的DAB显色试剂盒的说明书上没有写可以用于western.只写了免疫组织化学.这种试剂盒能用于western吗?

作者: windy+++ 时间: 2013-2-17 14:26

非常感谢楼主的热情答复。我在做WB时经常会出现胡萝卜和哑铃型条带。楼主说的第一个方面：转膜时注意赶走气泡：***作时很注意，眼睛不错眼珠的看，膜和胶之间肯定没有气泡的。而且做好三明治结构后还用玻璃棒像擀面条一样杆一杆。第二个方面：边缘一抗孵育不好，增加一抗孵育体系：请问怎样增加呢？是不是增加一抗的总体孵育体积？还是加大抗体的浓度？其实在边缘的条带（泳道）外侧均有marker 或者Loading占据着膜，即使是最边上的条带也不是在膜的最边上的。还请不吝赐教！

这几天我比较关注咱们的版块，挺有收获的！谢谢楼主对于我们的指导！有几个问题我想在请教一下：
1.什么是湿转？什么是干转？我们一般是在1*转膜缓冲液（甘氨酸14.4g，TRIS 3.0g,甲醇200ml，最后定容1000ml）中稳流转膜，属于哪一种？
2.您提到做预实验时应该摸一下二抗和ECL发光液的匹配度，我想请问下具体的操作步骤？如果没有NC膜，用PVDF膜可以吗？做预实验，除了摸这个，还有一抗和蛋白结合的最佳浓度之外，还需要不需要摸一抗和二抗的匹配度？
3.一般转膜的条件比如稳流具体的数值和时间？比如40KD左右的，还有100ka左右的，170KD 左右的，是不是不一样啊？
4.如果要做磷酸化蛋白的测定，您提到要加磷酸化酶抑制剂，我们提蛋白时PBS里面加NaF，用RIPA加有pmsf,请问还应该加别的什么蛋白酶抑制剂吗？请推荐一下
5.我想请问一下贵实验室一抗和二抗孵育的体系是什么？在什么容器里面？我们用的是2.5%TBST-脱脂牛奶稀释抗体，然后封闭在杂交带（塑料袋）里面，摇床摇2小时-1个小时，或者一抗4度冰箱过夜。是不是改进一下就不会产生胡萝卜条带呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-17 14:30

我想请教一下,我购买的DAB显色试剂盒的说明书上没有写可以用于western.只写了免疫组织化学.这种试剂盒能用于western吗?

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DAB可以用于检测HRP标记的抗体

作者: NBA 时间: 2013-2-17 14:32

非常感谢楼主的热情答复。我在做WB时经常会出现胡萝卜和哑铃型条带。楼主说的第一个方面：转膜时注意赶走气泡：***作时很注意，眼睛不错眼珠的看，膜和胶之间肯定没有气泡的。而且做好三明治结构后还用玻璃棒像擀面条一样杆一杆。第二个方面：边缘一抗孵育不好，增加一抗孵育体系：请问怎样增加呢？是不是增加一抗的总体孵育体积？还是加大抗体的浓度？其实在边缘的条带（泳道）外侧均有marker 或者Loading占据着膜，即使是最边上的条带也不是在膜的最边上的。还请不吝赐教！

这几天我比较关注咱们的版块，挺有收获的！谢谢楼主对于我们的指导！有几个问题我想在请教一下：
1.什么是湿转？什么是干转？我们一般是在1*转膜缓冲液（甘氨酸14.4g，TRIS 3.0g,甲醇200ml，最后定容1000ml）中稳流转膜，属于哪一种？
2.您提到做预实验时应该摸一下二抗和ECL发光液的匹配度，我想请问下具体的操作步骤？如果没有NC膜，用PVDF膜可以吗？做预实验，除了摸这个，还有一抗和蛋白结合的最佳浓度之外，还需要不需要摸一抗和二抗的匹配度？
3.一般转膜的条件比如稳流具体的数值和时间？比如40KD左右的，还有100ka左右的，170KD 左右的，是不是不一样啊？
4.如果要做磷酸化蛋白的测定，您提到要加磷酸化酶抑制剂，我们提蛋白时PBS里面加NaF，用RIPA加有pmsf,请问还应该加别的什么蛋白酶抑制剂吗？请推荐一下
5.我想请问一下贵实验室一抗和二抗孵育的体系是什么？在什么容器里面？我们用的是2.5%TBST-脱脂牛奶稀释抗体，然后封闭在杂交带（塑料袋）里面，摇床摇2小时-1个小时，或者一抗4度冰箱过夜。是不是改进一下就不会产生胡萝卜条带呢？

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1，增加一抗孵育的体积，比如原本你是4ml，现在可以加大到6ml或者8ml，一抗稀释度不变
2，湿转与干转差别你自己查查
3，你的属于湿转
4，一抗的稀释度要单独摸索，二抗也是一样
5，稳流只是电流一样，转膜时间与分子量大小，胶的浓度有关
6，建议采用4度过夜

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-18 15:55

我在做notch受体的WB，分子量很大，大约300KD,一直出不来。请问用多大浓度的分离胶好？跑多长时间？半干转要多长时间？

作者: star#room 时间: 2013-2-18 15:55

各位前辈，我在做蛋白时荧光很快消失了，其原因除了二抗浓度过高还会是什么？请指点！

作者: H2O 时间: 2013-2-18 16:01

相关疾病：
头痛
楼主，请教你一个问题，我最近再做一个蛋白，用两种不同的方法纯化，洗脱两条带大小不等。一种方法洗脱后发生沉淀之后用ELISA试剂盒检测，上清几乎为阴性（带偏大的那个），沉淀阳性；另一种方法洗脱的ELISA反应强阳性，以上两个均有稀释。但是出现了一个奇怪的想象，我用该种蛋白的单抗、多抗做的Western Blot，两个结果显示第一种的上清均出现显色，第二种没有，请问楼主，为何第一种免疫印记会显色，情况与ELISA很不符合，头疼啊？

作者: ha111 时间: 2013-2-18 16:02

楼主你好，我做IGF2，分子量才7.5，跑的图片一片白

图片附件: 87852361.snap.jpg (2013-2-18 16:02, 24.96 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14873

作者: ha111 时间: 2013-2-18 16:03

又做了内参

图片附件: 20668951.jpg (2013-2-18 16:03, 28.56 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14874

作者: 49888 时间: 2013-2-18 16:03

请教一个问题：作内参的，共有6个样本，一抗1：1000 4度过夜，TBST3*15min
二抗1：1000，室温1h,TBST 3*10min
ECL发光，只有一个条带？是不是蛋白样品有问题？

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:03

我在做notch受体的WB，分子量很大，大约300KD,一直出不来。请问用多大浓度的分离胶好？跑多长时间？半干转要多长时间？

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可以用5%~15%梯度胶，这种胶可保留内参
或者用中型电泳槽，分离胶高度在10cm左右，用8%的分离胶也可有效分离，同时也可保留内参
跑多长时间要参考marker的条带
不建议用半干转，湿转300mA，3h到3.5h，注意转膜时的降温

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:04

各位前辈，我在做蛋白时荧光很快消失了，其原因除了二抗浓度过高还会是什么？请指点！

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膜被金属等污染了

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:17

相关疾病：
头痛

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楼主，请教你一个问题，我最近再做一个蛋白，用两种不同的方法纯化，洗脱两条带大小不等。一种方法洗脱后发生沉淀之后用ELISA试剂盒检测，上清几乎为阴性（带偏大的那个），沉淀阳性；另一种方法洗脱的ELISA反应强阳性，以上两个均有稀释。但是出现了一个奇怪的想象，我用该种蛋白的单抗、多抗做的Western Blot，两个结果显示第一种的上清均出现显色，第二种没有，请问楼主，为何第一种免疫印记会显色，情况与ELISA很不符合，头疼啊？

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再不是很确定的情况下要重复你的实验（如果是做科研的话）

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:18

楼主你好，我做IGF2，分子量才7.5，跑的图片一片白

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分子量太小
用Tricine胶
不过这种胶不太好做

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:29

请教一个问题：作内参的，共有6个样本，一抗1：1000 4度过夜，TBST3*15min
二抗1：1000，室温1h,TBST 3*10min
ECL发光，只有一个条带？是不是蛋白样品有问题？

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转膜后用立春红染膜了吗？
如果有一个条带存在的话应该是孵育或者转膜的问题

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:29

请教一个问题：作内参的，共有6个样本，一抗1：1000 4度过夜，TBST3*15min
二抗1：1000，室温1h,TBST 3*10min
ECL发光，只有一个条带？是不是蛋白样品有问题？

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转膜后用立春红染膜了吗？
如果有一个条带存在的话应该是孵育或者转膜的问题

作者: fei1226com 时间: 2013-2-18 16:30

丽春红染色后，条带清晰，目的蛋白也有，洗掉丽春红后牛奶封闭液室温封闭1小时，TBST洗3次，每次5分钟；再各加内参（GAPDH）和一抗，4°过夜，TBST洗3次，每次5分钟；加二抗室温1-2小时，TBST洗3次，每次5分钟；最后ECL化学发光，显影，定影。
结果底片上什么都没有。
请问这是怎么回事？

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:30

丽春红染色后，条带清晰，目的蛋白也有，洗掉丽春红后牛奶封闭液室温封闭1小时，TBST洗3次，每次5分钟；再各加内参（GAPDH）和一抗，4°过夜，TBST洗3次，每次5分钟；加二抗室温1-2小时，TBST洗3次，每次5分钟；最后ECL化学发光，显影，定影。
结果底片上什么都没有。
请问这是怎么回事？

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换抗体
并确定你的样品中GAPDH有没有表达

作者: ero11 时间: 2013-2-18 16:31

分子量太小
用Tricine胶
不过这种胶不太好做

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楼主你好，那你有tricine胶配方吗？能告诉我一下吗？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-18 16:50

请教一下，有没有商品化的针对SA的单克隆抗体，那家公司有，有人用过吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-18 16:53

分子量太小
用Tricine胶
不过这种胶不太好做

楼主你好，那你有tricine胶配方吗？能告诉我一下吗？园里说法太多，不知该信谁的，非常感谢！

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tricine胶我做的很不好
你想要参考资料的话我可以发给你
把你的邮箱用短消息形式发给我

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:43

请教一下，有没有商品化的针对SA的单克隆抗体，那家公司有，有人用过吗？

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没用过
最好告知蛋白全称

作者: vivian4123 时间: 2013-2-20 09:44

转膜后用立春红染膜了吗？
如果有一个条带存在的话应该是孵育或者转膜的问题

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谢谢，用丽春红染过了，目的条带都有的，为什么抗体结合不上呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:45

谢谢，用丽春红染过了，目的条带都有的，为什么抗体结合不上呢？

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看看抗体孵育的时候液体有没有完全覆盖膜

作者: lgm 时间: 2013-2-20 09:45

我的marker是大分子量的300KD 80V跑胶2.5小时溴酚蓝已经快到分离胶底部而且有点弥散，但是marker挤在一起刚出浓缩胶，请教下，怎么回事？

作者: c86v 时间: 2013-2-20 09:46

请问大侠，0.2孔径的millipore Immobilon-PSQ膜封闭条件是什么?

Immobilon-PSQ膜用5%脱脂牛奶封闭两小时背景还很高，请问用什么封闭条件？还请不吝赐教。封闭前用不用甲醇处理？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:50

我的marker是大分子量的300KD 80V跑胶2.5小时溴酚蓝已经快到分离胶底部而且有点弥散，但是marker挤在一起刚出浓缩胶，请教下，怎么回事？

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我认为分离胶的pH可能有问题

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:50

请问大侠，0.2孔径的millipore Immobilon-PSQ膜封闭条件是什么?

Immobilon-PSQ膜用5%脱脂牛奶封闭两小时背景还很高，请问用什么封闭条件？还请不吝赐教。封闭前用不用甲醇处理？

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我查了下
你说的这个是PVDF膜，需要用无水甲醇活化
另外我以前用PVDF膜的时候，0.22um的膜背景比0.45um的就是要高
good luck

作者: xue258 时间: 2013-2-20 09:51

要检测链亲和素的表达，所以想用针对它的抗体检测，不知道有没有。谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-2-20 09:52

你好！我做COX-2，一抗和二抗都是博奥森的，一抗按1：500（要求1：100-500），二抗1：4000（1：1000-5000），发光液用bioword,曝光后在70kda、46kda、30kda均出现条带，并且30kda特别浓。action做出来比较清楚，且没有上述的现象，我想问一下这种情况下是不是考虑抗体的问题呀？

作者: duoduo 时间: 2013-2-20 09:52

请问，我前些天用碧云天的发光液，后来换成bioword的，原来用的抗体浓度较高，后来换发光液后原来的膜整张膜均发光，有没有什么办法可以重复利用原来的旧膜呀，我试过用25mM甘氨酸-HCL,PH2，1%SDS配的解吸液振摇30分钟，可是再重复封闭孵育后膜依然发光。有没有什么更好的方法呀？是不是配的时候ph没有调好的原因呀？

作者: eric930 时间: 2013-2-20 09:53

我最近刚做WB，目的条带17KD，内参是β-actin，请问
1.我用5%浓缩胶和10%分离胶电泳时（100v30min，120v2h），marker的35kd到10kd总是跑不开跟溴酚蓝在一块，请问该用多少浓度的浓缩胶和分离胶？电泳和转膜条件怎样？
2.用什么样的膜？
3.请问Actin和β-actin是否都可做为WB的内参？有何区别？
问题有点多，盼望指教！谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:54

要检测链亲和素的表达，所以想用针对它的抗体检测，不知道有没有。谢谢

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不好意思
你说的这个我没做过
我只做过用SA与biotin结合的
你再找找

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:54

你好！我做COX-2，一抗和二抗都是博奥森的，一抗按1：500（要求1：100-500），二抗1：4000（1：1000-5000），发光液用bioword,曝光后在70kda、46kda、30kda均出现条带，并且30kda特别浓。action做出来比较清楚，且没有上述的现象，我想问一下这种情况下是不是考虑抗体的问题呀？

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减少上样量
稀释一下抗体试试（摸一摸不同的稀释度）
如果还是这样的话就要考虑抗体的问题了

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:54

请问，我前些天用碧云天的发光液，后来换成bioword的，原来用的抗体浓度较高，后来换发光液后原来的膜整张膜均发光，有没有什么办法可以重复利用原来的旧膜呀，我试过用25mM甘氨酸-HCL,PH2，1%SDS配的解吸液振摇30分钟，可是再重复封闭孵育后膜依然发光。有没有什么更好的方法呀？是不是配的时候ph没有调好的原因呀？

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你用的这个抗体洗脱的配方我用过
但是效果非常不好
后来我改变了配方
因为涉及到公司的产品配方，不便告诉你
现在产品的效果同Pierce的stripping buffer相同

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:55

你好！我最近刚做WB，目的条带17KD，内参是β-actin，请问
1.我用5%浓缩胶和10%分离胶电泳时（100v30min，120v2h），marker的35kd到10kd总是跑不开跟溴酚蓝在一块，请问该用多少浓度的浓缩胶和分离胶？电泳和转膜条件怎样？
2.用什么样的膜？
3.请问Actin和β-actin是否都可做为WB的内参？有何区别？
问题有点多，盼望指教！谢谢

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1，用15%的分离胶
2，022um膜
3，常用beta-actin作为内参

作者: gogo 时间: 2013-2-20 09:57

可以用5%~15%梯度胶，这种胶可保留内参
或者用中型电泳槽，分离胶高度在10cm左右，用8%的分离胶也可有效分离，同时也可保留内参
跑多长时间要参考marker的条带
不建议用半干转，湿转300mA，3h到3.5h，注意转膜时的降温

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谢谢楼主！5%指的是轻溶液，15%是重溶液吗？半干转有什么缺点吗？我是根据别人的意见把湿转改成半干转的。

作者: 8princess8 时间: 2013-2-20 09:57

相关疾病：
胃癌肿瘤
您好，我前天做的小鼠皮下种植胃癌SGC-7901形成的肿瘤的组织western，做了三个指标，分别是36KD,56KD，66KD，结果36和56的片子出来什么都没有，而66有很淡的目的条带，但19KD以下黑乎乎的一片，感觉很困惑。丽春红染膜条带很好，膜应该没什么问题。因为以前做的都是细胞的，这次组织的也是照以前的条件做的，是不是不行呢？一抗1：8000，二抗1：4000.我是不是应该提高抗体浓度？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:58

谢谢楼主！5%指的是轻溶液，15%是重溶液吗？半干转有什么缺点吗？我是根据别人的意见把湿转改成半干转的。

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5%指的是轻溶液，15%是重溶液
梯度的形成及操作你可以参考汪家政《蛋白质技术手册》
半干和湿转各有所好吧
我两种都用

作者: NBA 时间: 2013-2-20 09:58

相关疾病：
胃癌肿瘤

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我前天做的小鼠皮下种植胃癌SGC-7901形成的肿瘤的组织western，做了三个指标，分别是36KD,56KD，66KD，结果36和56的片子出来什么都没有，而66有很淡的目的条带，但19KD以下黑乎乎的一片，感觉很困惑。丽春红染膜条带很好，膜应该没什么问题。因为以前做的都是细胞的，这次组织的也是照以前的条件做的，是不是不行呢？一抗1：8000，二抗1：4000.我是不是应该提高抗体浓度？
谢谢！

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改变抗体浓度试试

作者: any333 时间: 2013-2-20 09:59

我想请教一下,pvdf膜的孔径对实验有什么影响,还有我电泳仪设定的300mA怎么跑到230mA就跑不上去了,谢谢

作者: hulu呼噜 时间: 2013-2-20 10:00

由于kdr是膜蛋白，分子量很大，200kd, 我已经作了快两个月了，没有结果，请楼主给我一些指点好么。蛋白提取我用的是碧云天的RIPA(强，该说明书上说是能裂解膜蛋白），然后超声，蛋白浓度有5mg/ml，6％分离胶，转膜后丽春红染色有条带，一抗是santa cruz的多抗，室温孵育2h，就是没有结果，不知什么原因，请指点。谢谢！我怀疑是蛋白提取的问题，不知如何解决。

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-20 10:01

请问，如果内参的一抗和目的蛋白的一抗都是兔抗大鼠的，那么在孵育一抗时是否可以不剪开膜而将两种一抗加在一起同时孵育呢？如果可以的话，这样同时孵育跟两种一抗分开孵育相比效果有何差别？

作者: eric930 时间: 2013-2-20 10:01

你好！我最近刚做WB，目的条带17KD，内参是β-actin，请问
1.我用5%浓缩胶和10%分离胶电泳时（100v30min，120v2h），marker的35kd到10kd总是跑不开跟溴酚蓝在一块，请问该用多少浓度的浓缩胶和分离胶？电泳和转膜条件怎样？
2.用什么样的膜？
3.请问Actin和β-actin是否都可做为WB的内参？有何区别？
问题有点多，盼望指教！谢谢

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1，用15%的分离胶
2，022um膜
3，常用beta-actin作为内参
谢谢你的解答!!

作者: eric930 时间: 2013-2-20 10:02

请问丽春红染液可否重复利用？

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-20 10:03

您好，请教个问题，我做原核表达，每次WB背景都乱混混的，杂蛋白甚至比目的蛋白清楚。刚开始以为是二抗浓度太大了，在改变浓度以后，还是没有改进。结果甚至不如SDS-PAGE清楚！用的是millipore的一抗，1：500稀释；进口分装的二抗，1：3300稀释。折腾了好几回了，实在没招了，指导一下吧，谢谢！

作者: glass 时间: 2013-2-20 10:04

请教一下：一抗二抗的浓度大对后续结果有影响吗？有什么影响？我前段时间做GAPDH可以做出来，现在一直做不出来了，一抗浓度较高。

作者: ha111 时间: 2013-2-20 10:04

尊敬的版主好，我是新手，最近做了两次WB，杂带太多，我是做动物细胞的，检测bcl-2，配的胶是12%，转膜2.5h，一抗稀释浓度是1：1000，二抗稀释1：500，1：3000都用过，封闭用5%脱脂奶粉封闭的，但都有杂带，1：3000的时候目标带不明显，杂带却很明显，我想请版主帮我分析下原因，谢谢！接下来该怎么做。不胜感激！

作者: bring 时间: 2013-2-20 10:05

我买的暗盒不是自发光的,可不可以用日光灯来曝光,

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:06

我想请教一下,pvdf膜的孔径对实验有什么影响,还有我电泳仪设定的300mA怎么跑到230mA就跑不上去了,谢谢

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把电压调高后电流就上去了
这种仪器的问题要看说明书哦

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:06

由于kdr是膜蛋白，分子量很大，200kd, 我已经作了快两个月了，没有结果，请楼主给我一些指点好么。蛋白提取我用的是碧云天的RIPA(强，该说明书上说是能裂解膜蛋白），然后超声，蛋白浓度有5mg/ml，6％分离胶，转膜后丽春红染色有条带，一抗是santa cruz的多抗，室温孵育2h，就是没有结果，不知什么原因，请指点。谢谢！我怀疑是蛋白提取的问题，不知如何解决。

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用膜蛋白提取的试剂盒提取目的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:33

请问，如果内参的一抗和目的蛋白的一抗都是兔抗大鼠的，那么在孵育一抗时是否可以不剪开膜而将两种一抗加在一起同时孵育呢？如果可以的话，这样同时孵育跟两种一抗分开孵育相比效果有何差别？

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我用小鼠单抗做过三种抗体一起加的实验
兔多抗及羊多抗等抗体没有见过文献支持这样做
在混合小鼠单抗时要把每个抗体非开单独做好预实验后才能混

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:33

请问丽春红染液可否重复利用？

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可以重复利用几次没问题

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:36

您好，请教个问题，我做原核表达，每次WB背景都乱混混的，杂蛋白甚至比目的蛋白清楚。刚开始以为是二抗浓度太大了，在改变浓度以后，还是没有改进。结果甚至不如SDS-PAGE清楚！用的是millipore的一抗，1：500稀释；进口分装的二抗，1：3300稀释。折腾了好几回了，实在没招了，指导一下吧，谢谢！

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加大一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:49

请教一下：一抗二抗的浓度大对后续结果有影响吗？有什么影响？我前段时间做GAPDH可以做出来，现在一直做不出来了，一抗浓度较高。

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抗体浓度要合适才行，过高与过低都不行的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:49

请教一下：一抗二抗的浓度大对后续结果有影响吗？有什么影响？我前段时间做GAPDH可以做出来，现在一直做不出来了，一抗浓度较高。

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用不同的抗体稀释度再试试
检查二抗是否过期

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:50

尊敬的版主好，我是新手，最近做了两次WB，杂带太多，我是做动物细胞的，检测bcl-2，配的胶是12%，转膜2.5h，一抗稀释浓度是1：1000，二抗稀释1：500，1：3000都用过，封闭用5%脱脂奶粉封闭的，但都有杂带，1：3000的时候目标带不明显，杂带却很明显，我想请版主帮我分析下原因，谢谢！接下来该怎么做。不胜感激！

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1，用15%分离胶
2，一抗做了不同的稀释度如果非特异性条带仍旧较深需要考虑抗体的原因

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:50

我买的暗盒不是自发光的,可不可以用日光灯来曝光,

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当然不能

作者: flower-201 时间: 2013-2-20 10:51

请问下电泳时用1X的电泳缓冲液和0.5X的缓冲液不知道有没什么区别和影响

作者: 3648755 时间: 2013-2-20 10:51

首先十分感谢楼主在前期试验过程中遇到的问题给与的精彩解答！
现在我把遇到的问题提出，希望楼主继续给与帮助！

我做的细胞蛋白WB，目的条带110KD，内参是β-actin，请问
1.我用5%浓缩胶和8%分离胶电泳时（60v30min，100v1h），彩虹marker的72kd可以跑开，但55kd的以下的条带总是跑不开，，请问该楼主可能是什么问题！
2.问题补充：同等条件下，跑开过一次，但是以后都没有分开过。不知道是什么原因！也尝试改下电压，延长时间，但是36kd及以下始终分不开！

再次感谢楼主的热心帮助！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-20 10:52

请问楼主，WB做完后还想用这张NC膜检测下一个目的蛋白，NC膜应该怎样处理才能再次使用？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:52

请问下电泳时用1X的电泳缓冲液和0.5X的缓冲液不知道有没什么区别和影响

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离子强度及PH均会有所不同
一般都用1倍的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:53

首先十分感谢楼主在前期试验过程中遇到的问题给与的精彩解答！
现在我把遇到的问题提出，希望楼主继续给与帮助！

我做的细胞蛋白WB，目的条带110KD，内参是β-actin，请问
1.我用5%浓缩胶和8%分离胶电泳时（60v30min，100v1h），彩虹marker的72kd可以跑开，但55kd的以下的条带总是跑不开，，请问该楼主可能是什么问题！
2.问题补充：同等条件下，跑开过一次，但是以后都没有分开过。不知道是什么原因！也尝试改下电压，延长时间，但是36kd及以下始终分不开！

再次感谢楼主的热心帮助！

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分离胶浓度太低了
你看看说明书有关marker适用的胶浓度
我建议你采用10%的胶
可以多跑一会，把内参留住就行

作者: NBA 时间: 2013-2-20 10:53

请问楼主，WB做完后还想用这张NC膜检测下一个目的蛋白，NC膜应该怎样处理才能再次使用？谢谢！

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如果要把已经检测的目的蛋白洗掉的话
用stripping buffer，stripping后从封闭开始，后同WB过程
如果不用去掉已检测的目的蛋白
洗去ECL后
直接加入另一目的蛋白的一抗，后同WB过程

作者: DONT 时间: 2013-2-20 11:01

分离胶浓度太低了
你看看说明书有关marker适用的胶浓度
我建议你采用10%的胶
可以多跑一会，把内参留住就行

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但是楼主，一般mark不是在浓缩胶里面就应该跑开了吗？

作者: DONT 时间: 2013-2-20 11:01

但是楼主，一般mark不是在浓缩胶里面就应该跑开了吗？

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问题补充：mark上说8%--16%的胶都可以！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:01

但是楼主，一般mark不是在浓缩胶里面就应该跑开了吗？

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浓缩胶里跑不开的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:02

问题补充：mark上说8%--16%的胶都可以！

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如果说在浓缩胶里都能跑的开的话
说明你的浓缩胶高度太大了
除了Marker之外，样品在30K以下能分开吗？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-20 11:02

如果说在浓缩胶里都能跑的开的话
说明你的浓缩胶高度太大了
除了Marker之外，样品在30K以下能分开吗？

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都是分不开的。以前一直在浓缩胶都可以跑开，只是mark条带之间的间隙很小，但是也可以看的见各个条带，高度也是1cm左右，所以我就一直以为在浓缩胶里都能跑开！现在就是70kd下面所有的条带都在蓝色一起，到最后也是这样！
很是郁闷！
谢谢楼主耐心帮助！

作者: lgm 时间: 2013-2-20 11:03

你好，请教个问题。作小分子蛋白的检测，使用的marker范围1-40KD,应该选用什么内参呢？

作者: windy+++ 时间: 2013-2-20 11:04

我用的BIO-RAD的wb仪器，0.75mm的玻璃板，做分离胶没问题，做浓缩胶时总是有几个孔做不好，十个孔的梳子每次只能有七个孔是好的，梳子插上后再想补胶就补不上了，请问有没有办法解决？谢谢

作者: ROSE李 时间: 2013-2-20 11:06

请教185kd的蛋白用多少浓缩胶和分离胶合适？如是膜蛋白用全蛋白提取试剂盒提取后的蛋白能跑westernblot吗，谢谢。

作者: mamamiya 时间: 2013-2-20 11:06

版主做过eNOS吗？希望楼主给予指点
分子量140kd，做了一个月郁闷哈
DAB显色内皮细胞可以出条带，但是血管组织却总是出不来条带哈，蛋白量都上到120ug还是一点影都没有

作者: lixi559 时间: 2013-2-20 11:07

你好！

我的目的蛋白的分子量是210KD.10%的分离胶，电泳至溴酚蓝泳出后15分钟。150mA湿转3H，用的是0.45um的NC膜。未见目的条带。是怎么回事呢？盼回答！谢谢

作者: moonlight45 时间: 2013-2-20 11:07

问版主一个问题
有没有用三抗的
将二抗的信号强度再次放大

作者: 3648755 时间: 2013-2-20 11:07

做了一个多月WB，啥也没出来过，我做的小分子蛋白，7.5kDa，今天电泳结束后就用考马斯亮蓝染了下，发现17kDa一下就看不到蛋白了，请楼主指点一下，考马斯亮蓝敏感度怎样？我的蛋白上样量做了个梯度：30-60微克

作者: kuohao17 时间: 2013-2-20 11:08

都是分不开的。以前一直在浓缩胶都可以跑开，只是mark条带之间的间隙很小，但是也可以看的见各个条带，高度也是1cm左右，所以我就一直以为在浓缩胶里都能跑开！现在就是70kd下面所有的条带都在蓝色一起，到最后也是这样！
很是郁闷！
谢谢楼主耐心帮助！

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你的问题我最近才在坛子上回过，最大可能是你使用的水质有问题。
在你这个问题中，可能是水质导致pH值有问题。
此外，你的30% gel 母液降解也有可能。基于降解这个原因，决不能偷懒一次配很多8%分离胶（不含APS、TEMED），降解更严重。PS：stacking gel可以这么做，能节约每次制胶的时间。
重新配制聚丙烯酰胺的母液很重要。聚丙烯酰胺母液要避光保存。4度最好。
你用8%的分离胶正确（对目的蛋白110KDa和内参而言），希望lz不要忽悠人。（本着付责任的精神）
但是，如果你要用8%分开36KDa以下，不可能；8%最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa

作者: moonlight45 时间: 2013-2-20 11:08

jacqueslm2001,8%最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa ,请问15%最底部约？我的母的蛋白7.5KDa，15%胶可以吗

作者: am10 时间: 2013-2-20 11:09

楼主您好:
请问:MARK是预染的,转膜后可以看到很漂亮的条带.但做到发光染色洗照片后,标本目标条带可以看到,不过MARK却看不到,是怎么回事?
谢谢!

作者: tuuu2 时间: 2013-2-20 11:09

lz您好！想请教您一个问题，我买了同一蛋白的不同物种（兔和鼠）的两个抗体，说明书上说预测蛋白的条带大小分别是80kda和43kda，这种差异是因为不同的抗原表位所导致的吗？而我的蛋白是人的，这两种抗体都和human有反应。奇怪的是：兔抗体的说明书上说预测大小是80kda，实际出来是100kda，为什么会这样呢？是因为跑胶的缘故吗？Western blot最后出来的条带大小到底由什么决定的呢？谢谢您！

作者: standbyme 时间: 2013-2-20 11:10

lz您好！想请教您一个问题，我买了同一蛋白的不同物种（兔和鼠）的两个抗体，说明书上说预测蛋白的条带大小分别是80kda和43kda，这种差异是因为不同的抗原表位所导致的吗？而我的蛋白是人的，这两种抗体都和human有反应。奇怪的是：兔抗体的说明书上说预测大小是80kda，实际出来是100kda，为什么会这样呢？是因为跑胶的缘故吗？Western blot最后出来的条带大小到底由什么决定的呢？谢谢您！

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呵呵，越俎代庖下！
请仔细阅读说明书！！！——因为同一蛋白不同种属抗体不会差异这么巨大，差不多一倍了，除非有不同异构体或多聚体；所以出现这个问题的原因是，你没有仔细阅读说明书。
为什么？
很多抗体的质量不好，对于表达相对较弱的内源性条带识别能力很差，因此抗体公司为了吸引你的眼球，让你相信它的抗体足够好，他们会使用纯化的蛋白。那么问题就出在纯化蛋白这步上，为了使条带足够清晰，蛋白浓度足够大（背景又几乎没有），通常会使用GST、GFP、His等等tagged的蛋白纯化，尤其前两者，分子量会大26或36KDa，所以我猜测，43KDa应该标注的是whole cell lysis；而80KDa估计是GST－tag，因为70和80，稍微偏差一点点就差不多。
希望下次读说明书的时候仔细些，你会学到很多东西。
至于你标记的100KDa，90%可能是杂带。应该在43KDa附近（其实即使厂家没有告诉你具体多大，从你学生化的开始，你的老师一定告诉过你怎么计算蛋白的分子量，至于表观分子量有可能差一些，差别应该也不大；所以你只需要确定你的蛋白多长，你就可以准确的判断到底分子量是多大——而不需要到处问。反倒是，你发现兔抗80KDa的时候，你应该问个为什么，然后仔细看过说明书，就会学到一些书本上不会告诉你的知识）。

作者: fei1226com 时间: 2013-2-20 11:10

楼上：
如果没有特殊说明，mark是不会发光的，而会发光的mark保存时间短，价格也贵。
我是再买个发光笔在mark上自己画一下，放到机器里就可以看到了。

作者: fei1226com 时间: 2013-2-20 11:10

想请教一下楼主：
原来做的很好的实验，如果突然染色特别浅，或者膜上光光的，最大的可能是什么呢？
在不同的实验室，不同的时间段，都出现过这样的时候，会一段时间一直都不好。
简直要抓狂了！
我敢肯定转膜为止是没有问题的。
谢谢！

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 11:11

你好！我做COX-2，一抗和二抗都是博奥森的，一抗按1：500（要求1：100-500），二抗1：4000（1：1000-5000），发光液用bioword,曝光后在70kda、46kda、30kda均出现条带，并且30kda特别浓。action做出来比较清楚，且没有上述的现象，我想问一下这种情况下是不是考虑抗体的问题呀？

作者: yjf1026 时间: 2013-2-20 11:11

老师您好：我是新手，还着急做实验，想在您这里走个捷径：
我要做
大鼠脑组织的NR1受体蛋白，
分子量是115KD,能给我参考信息吗？包括
胶的浓度，电泳条件（电压，时间），转膜条件（电压，时间），谢谢。我用的是ABCOM的一抗，稀释度多少为宜？

作者: wmp1234 时间: 2013-2-20 11:12

楼主好！又来麻烦你了！最近做一个65到75的蛋白。做了一次啥都没有
我的预染marker是10 17 26 34 43 55 72 95 130 170 内参有actin和tublin
请你指点一下胶的浓度和转膜条件。

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-20 11:12

楼主，您好。我想请教一下，为什么PVDF膜可以用甲醇激活，而NC膜一放入纯甲醇中就融了呢？

作者: avi317 时间: 2013-2-20 11:12

版主老师您好，我已做western好久了，不怕您笑话，快一年了还是出不了结果。所以很着急！我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少，我提的是细胞总蛋白。浓缩胶5%，分离胶12%内参betatubulin，早已稳定，就是条带有时连成一条线，无法分辩每个条带，考虑裂解液离子浓度太高，或上样量太大，上样前冲洗过每个孔，我已将上样量加到最高20微升，蛋白浓度偶测上样在50微克左右，可是就是不见目的条带。每次转膜后丽春红染膜2分钟都有条带清晰可见。一抗是羊抗鼠（santacruze）2抗兔抗羊（博士德）。一抗的浓度梯度都做过，2抗也做过。年初一抗曾以1：200出来过目的条带，当时上样很多，细胞量大，样本粘稠，未用DNAse所以无法去除沉淀，连着沉淀一起上样了，条带不规则。后来换了牛奶，2抗，ECL，样本，就一直出不了结果，什么都没有。ECL有人用过，是没问题的。目前2抗浓度大则膜背景一片糊状，看不到条带，浓度小则什么也看不见。偶尔做出目的条带，肉眼只能看到有淡淡的影子。延长曝光时间无改变。我每次曝光都要分不同的时间爆好几张。封闭液用牛奶，兔血清都试过。我该怎么办，请版主帮忙

作者: xingyi08 时间: 2013-2-20 11:13

关于显影的问题
作western显影曝光时，压片的时间该如何控制啊？在显影液和定影液里各浸泡多长时间。有诀窍吗？我觉得很悬的，请楼主帮助解决，谢谢

作者: caihong 时间: 2013-2-20 11:13

版主您好：我用western blot 检测3个目标条带，在大鼠组织蛋白中3条都可以测到，可是相同的人细胞蛋白中只能测到1条，上样量已经加到100ug，可还是没有条带，可能原因是什么？望指点迷津，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:14

但是楼主，一般mark不是在浓缩胶里面就应该跑开了吗？

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marker在浓缩胶怎么能跑开呢?
我没有碰到过这种情况

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:14

你好，请教个问题。作小分子蛋白的检测，使用的marker范围1-40KD,应该选用什么内参呢？

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选择不同分子量的内参就可以

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:14

我用的BIO-RAD的wb仪器，0.75mm的玻璃板，做分离胶没问题，做浓缩胶时总是有几个孔做不好，十个孔的梳子每次只能有七个孔是好的，梳子插上后再想补胶就补不上了，请问有没有办法解决？谢谢

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把胶加满再插梳子

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:15

请教185kd的蛋白用多少浓缩胶和分离胶合适？如是膜蛋白用全蛋白提取试剂盒提取后的蛋白能跑westernblot吗，谢谢。

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mini胶用8%分离胶
中型胶可以用8%，并且把内参留住
可以跑的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:15

版主做过eNOS吗？希望楼主给予指点
分子量140kd，做了一个月郁闷哈
DAB显色内皮细胞可以出条带，但是血管组织却总是出不来条带哈，蛋白量都上到120ug还是一点影都没有

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1，WB与IHC不是一回事
2，WB首先要保证eNOS能提取出来
3，我做过iNOS
4，你做不出条带先重蛋白提取下手

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:16

你好！

我的目的蛋白的分子量是210KD.10%的分离胶，电泳至溴酚蓝泳出后15分钟。150mA湿转3H，用的是0.45um的NC膜。未见目的条带。是怎么回事呢？盼回答！谢谢

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用8%的胶
300mA 3h

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:16

问版主一个问题
有没有用三抗的
将二抗的信号强度再次放大

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在组化上用三抗
但是在WB中我没有见过用三抗的
你的想法很好
我觉得值得一试

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:16

做了一个多月WB，啥也没出来过，我做的小分子蛋白，7.5kDa，今天电泳结束后就用考马斯亮蓝染了下，发现17kDa一下就看不到蛋白了，请楼主指点一下，考马斯亮蓝敏感度怎样？我的蛋白上样量做了个梯度：30-60微克

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7.5K的蛋白我做过
很不好做
说实话没有很好的结果
用Tricine 胶试试

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:16

做了一个多月WB，啥也没出来过，我做的小分子蛋白，7.5kDa，今天电泳结束后就用考马斯亮蓝染了下，发现17kDa一下就看不到蛋白了，请楼主指点一下，考马斯亮蓝敏感度怎样？我的蛋白上样量做了个梯度：30-60微克

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小分子量的蛋白会聚在一块
用Tris胶没法分离
这与考染的灵敏度没关系
常规考染的灵敏度是很高的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:17

jacqueslm2001,8%最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa ,请问15%最底部约？我的母的蛋白7.5KDa，15%胶可以吗

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15%的胶不行

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:17

楼主您好:
请问:MARK是预染的,转膜后可以看到很漂亮的条带.但做到发光染色洗照片后,标本目标条带可以看到,不过MARK却看不到,是怎么回事?
谢谢!

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预染Marker曝光肯定看不到条带啊
你用Western blotmarker试试

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:17

lz您好！想请教您一个问题，我买了同一蛋白的不同物种（兔和鼠）的两个抗体，说明书上说预测蛋白的条带大小分别是80kda和43kda，这种差异是因为不同的抗原表位所导致的吗？而我的蛋白是人的，这两种抗体都和human有反应。奇怪的是：兔抗体的说明书上说预测大小是80kda，实际出来是100kda，为什么会这样呢？是因为跑胶的缘故吗？Western blot最后出来的条带大小到底由什么决定的呢？谢谢您！

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你可以上Abcam网站上搜一下看分子量位置条带如何确定及分子量与预期不同的造成原因

作者: summerxx 时间: 2013-2-20 11:18

不明白你说的解析是什么意思
stripping？ or 抗体洗脱？

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师兄，有什么办法可以将抗体洗脱呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:19

想请教一下楼主：
原来做的很好的实验，如果突然染色特别浅，或者膜上光光的，最大的可能是什么呢？
在不同的实验室，不同的时间段，都出现过这样的时候，会一段时间一直都不好。
简直要抓狂了！
我敢肯定转膜为止是没有问题的。
谢谢！

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蛋白降解
特别是磷酸化的一些
一定要尽快做

作者: glass 时间: 2013-2-20 11:20

请问抗体用牛奶液配效果好，还是用加bsa效果好
谢谢老师

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:20

你好！我做COX-2，一抗和二抗都是博奥森的，一抗按1：500（要求1：100-500），二抗1：4000（1：1000-5000），发光液用bioword,曝光后在70kda、46kda、30kda均出现条带，并且30kda特别浓。action做出来比较清楚，且没有上述的现象，我想问一下这种情况下是不是考虑抗体的问题呀？

================================

做不同稀释度再试试
还是不行的话就只能考虑抗体的问题了

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:20

老师您好：我是新手，还着急做实验，想在您这里走个捷径：
我要做
大鼠脑组织的NR1受体蛋白，
分子量是115KD,能给我参考信息吗？包括
胶的浓度，电泳条件（电压，时间），转膜条件（电压，时间），谢谢。我用的是ABCOM的一抗，稀释度多少为宜？

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分离胶浓度8%
一抗稀释度看抗体说明书

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:21

楼主好！又来麻烦你了！最近做一个65到75的蛋白。做了一次啥都没有
我的预染marker是10 17 26 34 43 55 72 95 130 170 内参有actin和tublin
请你指点一下胶的浓度和转膜条件。

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10或者12的分离胶
转膜
湿转 300mA，1h30min

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:21

楼主，您好。我想请教一下，为什么PVDF膜可以用甲醇激活，而NC膜一放入纯甲醇中就融了呢？

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看说明书

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:22

版主老师您好，我已做western好久了，不怕您笑话，快一年了还是出不了结果。所以很着急！我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少，我提的是细胞总蛋白。浓缩胶5%，分离胶12%内参betatubulin，早已稳定，就是条带有时连成一条线，无法分辩每个条带，考虑裂解液离子浓度太高，或上样量太大，上样前冲洗过每个孔，我已将上样量加到最高20微升，蛋白浓度偶测上样在50微克左右，可是就是不见目的条带。每次转膜后丽春红染膜2分钟都有条带清晰可见。一抗是羊抗鼠（santacruze）2抗兔抗羊（博士德）。一抗的浓度梯度都做过，2抗也做过。年初一抗曾以1：200出来过目的条带，当时上样很多，细胞量大，样本粘稠，未用DNAse所以无法去除沉淀，连着沉淀一起上样了，条带不规则。后来换了牛奶，2抗，ECL，样本，就一直出不了结果，什么都没有。ECL有人用过，是没问题的。目前2抗浓度大则膜背景一片糊状，看不到条带，浓度小则什么也看不见。偶尔做出目的条带，肉眼只能看到有淡淡的影子。延长曝光时间无改变。我每次曝光都要分不同的时间爆好几张。封闭液用牛奶，兔血清都试过。我该怎么办，请版主帮忙

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抗体活性降低

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:22

关于显影的问题
作western显影曝光时，压片的时间该如何控制啊？在显影液和定影液里各浸泡多长时间。有诀窍吗？我觉得很悬的，请楼主帮助解决，谢谢

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用红灯看啊

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:23

版主您好：我用western blot 检测3个目标条带，在大鼠组织蛋白中3条都可以测到，可是相同的人细胞蛋白中只能测到1条，上样量已经加到100ug，可还是没有条带，可能原因是什么？望指点迷津，谢谢

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重新提取细胞蛋白

作者: ritou1985 时间: 2013-2-20 11:23

请问一下，我跑的蛋白条带呈水印，是什么原因？你有遇到过类似情况吗？

作者: vera+ 时间: 2013-2-20 11:24

请教185kd的蛋白用多少浓缩胶和分离胶合适？如是膜蛋白用全蛋白提取试剂盒提取后的蛋白能跑westernblot吗，谢谢。

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mini胶用8%分离胶
中型胶可以用8%，并且把内参留住
可以跑的

那浓缩胶该是多少?谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:24

请问抗体用牛奶液配效果好，还是用加bsa效果好
谢谢老师

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各有利弊
看你目的蛋白需要
有些抗体：如CST的，要求用BSA来进行封闭及稀释抗体
一般蛋白用奶粉就可以

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:24

请问一下，我跑的蛋白条带呈水印，是什么原因？你有遇到过类似情况吗？

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水印？
有图吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:25

请教185kd的蛋白用多少浓缩胶和分离胶合适？如是膜蛋白用全蛋白提取试剂盒提取后的蛋白能跑westernblot吗，谢谢。

mini胶用8%分离胶
中型胶可以用8%，并且把内参留住
可以跑的

那浓缩胶该是多少?谢谢

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4或者5都可以

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-20 11:25

最近一直在做WB，但是很不顺利，步骤如下请指点一下，谢谢：
目的蛋白：60KD 细胞中中等量表达
电泳：12%浓缩胶80v,30min 4%分离胶40min，跑胶后染色可见清楚蛋白条带。
转膜：0.22 PVDF膜，半干式转膜，50min，转后染胶，发现大部分转上，膜上Marker 很明显，滤纸上也没有蛋白。
封闭：5%milk 室温 1h
结合一抗：santa的FUT8一抗（1：100，封闭液和PBST稀释），4度，过夜，抗体袋中结合。PBST 3*10min洗膜。
结合二抗：中杉兔抗羊二抗（1：3000，封闭液和PBST稀释），室温，1h，PBST 3*10min洗膜。
ECL显色：碧云天ECL，显色3min后，未见荧光。曝光，显影，定影后未见条带，空片。

如此反复做了10几遍，都是空片子。让我费解的是，用同样的电泳试剂,ECL，WB设备，同实验室同学，做的其它目的蛋白（20KD）,就能顺利曝光出结果。而同样的抗体以及一抗以及二抗在上述浓度下，上一届同学曾作出过。

我想请问什么原因呢？
1、我高度怀疑是在一抗和二抗结合过程中出现了问题，因为我确定ECL，二抗都没有问题，那么只能是二抗与一抗没有结合导致的没有结果，但是蛋白也转到膜上了，各种试剂以及平皿都没有问题，是什么原因会导致一抗二抗在膜上无法结合呢？

2、是不是二抗浓度过低，可否提高二抗浓度到1：1000甚至1：500，孵育时间是否可以进一步延长。

真是做得很郁闷。谢谢了先。

作者: greenbee 时间: 2013-2-20 11:26

关于显影的问题
作western显影曝光时，压片的时间该如何控制啊？在显影液和定影液里各浸泡多长时间。有诀窍吗？我觉得很悬的，请楼主帮助解决，谢谢

用红灯看啊

看到何时终止显影呢?在显影结束之后放在定影液里之前要在清水里漂洗晃动几下吗?最近我做出的条带显色不均,断断续续,象省略号一样,是什么原因啊?谢谢!

作者: ero11 时间: 2013-2-20 11:26

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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各有利弊
看你目的蛋白需要
有些抗体：如CST的，要求用BSA来进行封闭及稀释抗体
一般蛋白用奶粉就可以

作者: greenbee 时间: 2013-2-20 11:27

我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少
不好意思呵，请版主指教

作者: orangecake 时间: 2013-2-20 11:28

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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朋友们，真的，提问前先搜搜。
你的问题回过，封闭液和稀释抗体的液体完全可以不同，没有任何问题。我之前已经给过非常详尽的回答，包括抗体稀释液配方的选择。
stripping buff太贵，也不知道你从何谈起。我知道有很多stripping的配方，如果你嫌那些成本高，我告诉你一个最廉价的配方，0.1M Glycine（pH2.5），这个还贵嘛？实际上，对stripping的问题，我也回过，最简单的stripping方法是用TBST洗很久时间>8 hr，当然对弱的条带比较高效；不放心，就用glycine，又便宜。你搜搜先，我应该还解释过为什么glycine可以用来stripping。

作者: qianqin1977 时间: 2013-2-20 11:28

求助：
做WB时，显影压片后，背景很强，整张膜都显影的，不知道是什么原因？自己觉得可能是封闭的原因或者二抗浓度过高的原因，但是同时用牛奶和BSA都封闭试过了，而且封闭时间接近2小时，一抗是abcam的，做iNOS(推荐浓度是1：200，我用1：200、300都试过了），二抗1：8000、10000都试过，结果都一样，请老师能不能帮我解答下。附加说一下，我的内参是用同样的条件，做的非常漂亮。

作者: kuaizige 时间: 2013-2-20 11:29

楼主你好~
我做WB快一个月了，但都没有得到结果~想请教你几个问题，具体情况如下：

目的蛋白：43KDa 样品：贴壁细胞裂解上清液内参：Tubulin（55KDa）
预染marker、标准品、样品分别上样后电泳：
5%浓缩胶60v/30min；10%分离胶100V/50min；考马斯染色后条带清晰
湿转90V/50min（PVDF膜），转膜后膜上预染marker条带清晰且转膜后的胶染色后无条带
5%MILK室温封闭2h
一抗（目的蛋白一抗1：1000+内参一抗1:1000）室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
二抗1：5000室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
ECL显色

第一次的结果是：有标准蛋白的条带以及样品中内参的条带，只是没有样品中的目的蛋白的条带。
再重复以上实验时所得到得结果均是：只有样品中内参的条带，连标准品的条带都没有了。

我之前怀疑是目的蛋白的一抗出现问题，于是另外用一小张膜，预处理后在上面直接滴加了一小滴目的蛋白的标准品溶液，然后同电转过后的膜一起封闭、孵育一抗二抗并显色，结果显示电转的膜仍然只有内参的条带而小膜上却出现了光点，这应该可以说明我的一抗二抗都没有问题。

请老师帮我分析一下，导致这种结果出现的原因是什么？应该怎么改进呢？

万分感谢！！！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:29

最近一直在做WB，但是很不顺利，步骤如下请指点一下，谢谢：
目的蛋白：60KD 细胞中中等量表达
电泳：12%浓缩胶80v,30min 4%分离胶40min，跑胶后染色可见清楚蛋白条带。
转膜：0.22 PVDF膜，半干式转膜，50min，转后染胶，发现大部分转上，膜上Marker 很明显，滤纸上也没有蛋白。
封闭：5%milk 室温 1h
结合一抗：santa的FUT8一抗（1：100，封闭液和PBST稀释），4度，过夜，抗体袋中结合。PBST 3*10min洗膜。
结合二抗：中杉兔抗羊二抗（1：3000，封闭液和PBST稀释），室温，1h，PBST 3*10min洗膜。
ECL显色：碧云天ECL，显色3min后，未见荧光。曝光，显影，定影后未见条带，空片。

如此反复做了10几遍，都是空片子。让我费解的是，用同样的电泳试剂,ECL，WB设备，同实验室同学，做的其它目的蛋白（20KD）,就能顺利曝光出结果。而同样的抗体以及一抗以及二抗在上述浓度下，上一届同学曾作出过。

我想请问什么原因呢？
1、我高度怀疑是在一抗和二抗结合过程中出现了问题，因为我确定ECL，二抗都没有问题，那么只能是二抗与一抗没有结合导致的没有结果，但是蛋白也转到膜上了，各种试剂以及平皿都没有问题，是什么原因会导致一抗二抗在膜上无法结合呢？

2、是不是二抗浓度过低，可否提高二抗浓度到1：1000甚至1：500，孵育时间是否可以进一步延长。

真是做得很郁闷。谢谢了先。

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我认为问题出现在抗体上
你可以先用内参抗体（你其他同学做出结果的抗体）来验证你的系统

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:29

关于显影的问题
作western显影曝光时，压片的时间该如何控制啊？在显影液和定影液里各浸泡多长时间。有诀窍吗？我觉得很悬的，请楼主帮助解决，谢谢

用红灯看啊

看到何时终止显影呢?在显影结束之后放在定影液里之前要在清水里漂洗晃动几下吗?最近我做出的条带显色不均,断断续续,象省略号一样,是什么原因啊?谢谢!

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像省略号应该是抗体孵育及转膜造成的
显影你的话你可以看到条带的出现，这时放入定影液中
至于条带显影到什么程度需要你自己多摸索

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:30

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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最好用同一封闭体系
2到3次应该是没有问题的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:31

谢谢老师
但是我封闭用牛奶，稀释抗体用bsa可以吗？（处于节省成本的原因）两相是否矛盾？
另外一个问题是，老师以您的经验来看，洗一二抗的strip buffer（为了染内参），一般可以反复用几次效果就不行了？说明书上没有此类说明，它的意思应该是用完就倒掉。但是成本实在太高了。
谢谢老师的回答

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次数增加会影响你的抗体洗脱效果

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:33

我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少
不好意思呵，请版主指教

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你做组织还是细胞？
如果细胞的话分泌性糖蛋白是分泌到细胞外还是？
组织的话用组织裂解液提取

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:33

求助：
做WB时，显影压片后，背景很强，整张膜都显影的，不知道是什么原因？自己觉得可能是封闭的原因或者二抗浓度过高的原因，但是同时用牛奶和BSA都封闭试过了，而且封闭时间接近2小时，一抗是abcam的，做iNOS(推荐浓度是1：200，我用1：200、300都试过了），二抗1：8000、10000都试过，结果都一样，请老师能不能帮我解答下。附加说一下，我的内参是用同样的条件，做的非常漂亮。

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iNOS一抗用1：400，1：1000
二抗用1：20000及1：40000

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:34

楼主你好~
我做WB快一个月了，但都没有得到结果~想请教你几个问题，具体情况如下：

目的蛋白：43KDa 样品：贴壁细胞裂解上清液内参：Tubulin（55KDa）
预染marker、标准品、样品分别上样后电泳：
5%浓缩胶60v/30min；10%分离胶100V/50min；考马斯染色后条带清晰
湿转90V/50min（PVDF膜），转膜后膜上预染marker条带清晰且转膜后的胶染色后无条带
5%MILK室温封闭2h
一抗（目的蛋白一抗1：1000+内参一抗1:1000）室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
二抗1：5000室温孵育1小时，TBST洗涤3次*10min
ECL显色

第一次的结果是：有标准蛋白的条带以及样品中内参的条带，只是没有样品中的目的蛋白的条带。
再重复以上实验时所得到得结果均是：只有样品中内参的条带，连标准品的条带都没有了。

我之前怀疑是目的蛋白的一抗出现问题，于是另外用一小张膜，预处理后在上面直接滴加了一小滴目的蛋白的标准品溶液，然后同电转过后的膜一起封闭、孵育一抗二抗并显色，结果显示电转的膜仍然只有内参的条带而小膜上却出现了光点，这应该可以说明我的一抗二抗都没有问题。

请老师帮我分析一下，导致这种结果出现的原因是什么？应该怎么改进呢？

万分感谢！！！

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1，目的蛋白与内参先分开孵育（当然两者预实验条件摸好的情况下可以混合一起孵育）
2，目的蛋白可能没有提取出来

作者: TAT 时间: 2013-2-20 11:34

1，目的蛋白与内参先分开孵育（当然两者预实验条件摸好的情况下可以混合一起孵育）
2，目的蛋白可能没有提取出来

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即使样品里面的目的蛋白可能没有提取出来，但是我有目的蛋白的标准品作为对照啊!第一次做的时候标准品的条带都出来过，后面几次就没有了,只有内参的条带~这是怎么回事呢？请老师帮我分析一下~谢谢~

作者: 2541 时间: 2013-2-20 11:34

刚接触western blot,请问组织取材多大才够？限于取肠镜下肠粘膜组织，不能取很多，希望各位大侠指点一二，最少量多少才够？需要测三个指标。

作者: ukonptp 时间: 2013-2-20 11:35

楼主,你好,我转的膜下面有很多白色的东西(图),不知是什么,怎么避免.还有用0.45膜做分子量26kb的蛋白做不做的出来.是不是一定要用0.22的膜.谢谢

图片附件: 79586818.snap.jpg (2013-2-20 11:35, 13.75 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14885

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:36

即使样品里面的目的蛋白可能没有提取出来，但是我有目的蛋白的标准品作为对照啊!第一次做的时候标准品的条带都出来过，后面几次就没有了,只有内参的条带~这是怎么回事呢？请老师帮我分析一下~谢谢~

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从这些来分析的话只能说一抗可能降解了
你每次用新的一抗吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:36

刚接触western blot,请问组织取材多大才够？限于取肠镜下肠粘膜组织，不能取很多，希望各位大侠指点一二，最少量多少才够？需要测三个指标。

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3个指标30至50mg足以

作者: NBA 时间: 2013-2-20 11:36

楼主,你好,我转的膜下面有很多白色的东西(图),不知是什么,怎么避免.还有用0.45膜做分子量26kb的蛋白做不做的出来.是不是一定要用0.22的膜.谢谢

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20K以上的蛋白不建议用0.22um的膜
感觉像是膜过期了
老化

作者: www.1 时间: 2013-2-20 11:36

相关疾病：
头痛
版主你好，遇到了头疼的事情，做WB的条件是这样的：转膜2.5h，丽春红预染有条带，5
%封闭液封闭过夜，一抗是santa 公司的，用的1：500；二抗用的天根的羊抗鼠用的1：500；1：1000；1：2000都用来摸浓度，推荐的一抗浓度是1：500到1：1000；推荐的二抗浓度是1：300到500，ECL用的是Thermo的supersignal压片时间大概5分钟的样子，但最后没有条带，连杂带都没有，连续两次都是这样的，很奇怪，头疼，请教版主，不甚感谢。

作者: avi317 时间: 2013-2-20 11:37

我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少
不好意思呵，请版主指教

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你做组织还是细胞？
如果细胞的话分泌性糖蛋白是分泌到细胞外还是？
组织的话用组织裂解液提取

我做的是细胞的。肯定是有分泌到细胞外的。不过上面有人做过类似的蛋白，我们都提的总蛋白。不知道版主有没有好的建议。我只是想把总蛋白提取的效率提高，检测目的蛋白表达的情况。

作者: avi317 时间: 2013-2-20 11:37

补充：分泌到胞外的目的蛋白可以与细胞膜上受体结合

作者: 49888 时间: 2013-2-20 13:38

相关疾病：
肿瘤
有没有人用细胞做过血管生成相关因子VEGF,HIF-1的？请问一下操作条件？我曾经用HepG2,K562,KB,EAhy926总蛋白曝，但是都没做出来过（据说可以考虑曝培养液中的蛋白，因为VEGF在肿瘤细胞中是向外分泌的，有没有人这么做过？），后来尝试低氧诱导，用过氯化钴，环保菌素A诱导都没做出来。充氮缺氧培养也没做出来。请教做过的高手指点一二！
我的上样量40-80都试过，
12%分离胶，5%浓缩胶
电泳100V,2.5h，转膜190mA,1h
5%牛奶封闭1h
一抗1：500，二抗1：5000
据说这个用组织很好做，可是细胞做为什么这么困难呢？请大家赐教！

作者: DONT 时间: 2013-2-20 13:40

如果用PVDF膜作斑点印迹，是否可直接点样，还需要用甲醇浸泡吗?

作者: glass 时间: 2013-2-20 13:40

我在做转膜的时侯用的Marker有六条带（14.4-97KD）,转移条件是湿转、恒压80v、2.5h。我用的电转仪是六一的40B型，电极间距离有8cm。转膜结束后Marker有间隔的三条带转到了膜上（不知道什么原因），丽春红染色液显示有目的条带。结果在做完免疫检测（HRP法，参考汪家政的《蛋白质技术手册》）后却没有条带，而且Marker的三条带也被洗掉了。

看到许多战友在帖子中提到转膜时要压紧，不知道应该进到什么程度？

另外我们如何确定转膜过程是否短路呢?看到有的战友提到在半干转时,可以让膜>= 滤纸> 胶在湿转时是否可行呢?

目的蛋白(纯度80-90%以上，可以继续浓缩)的上样量下限为多大呢？

请大侠帮忙分析一下，不吝赐教。

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:40

版主你好，遇到了头疼的事情，做WB的条件是这样的：转膜2.5h，丽春红预染有条带，5
%封闭液封闭过夜，一抗是santa 公司的，用的1：500；二抗用的天根的羊抗鼠用的1：500；1：1000；1：2000都用来摸浓度，推荐的一抗浓度是1：500到1：1000；推荐的二抗浓度是1：300到500，ECL用的是Thermo的supersignal压片时间大概5分钟的样子，但最后没有条带，连杂带都没有，连续两次都是这样的，很奇怪，头疼，请教版主，不甚感谢。

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目的蛋白是什么？
我以前用santa的抗体很多
但是近期看大家的言论觉得santa的抗体好像有一定问题

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:41

我的目的蛋白是分泌性糖蛋白分子量39.6KD。想请问您怎样才能提高蛋白提取效率，因为我的目的蛋白表达量很少
不好意思呵，请版主指教

你做组织还是细胞？
如果细胞的话分泌性糖蛋白是分泌到细胞外还是？
组织的话用组织裂解液提取

我做的是细胞的。肯定是有分泌到细胞外的。不过上面有人做过类似的蛋白，我们都提的总蛋白。不知道版主有没有好的建议。我只是想把总蛋白提取的效率提高，检测目的蛋白表达的情况。

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分泌性蛋白我做过一个细胞的
也是分泌到细胞外
没有得到阳性条带
前人做过的东西我建议你多找几篇文献来验证

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:56

相关疾病：
肿瘤

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有没有人用细胞做过血管生成相关因子VEGF,HIF-1的？请问一下操作条件？我曾经用HepG2,K562,KB,EAhy926总蛋白曝，但是都没做出来过（据说可以考虑曝培养液中的蛋白，因为VEGF在肿瘤细胞中是向外分泌的，有没有人这么做过？），后来尝试低氧诱导，用过氯化钴，环保菌素A诱导都没做出来。充氮缺氧培养也没做出来。请教做过的高手指点一二！
我的上样量40-80都试过，
12%分离胶，5%浓缩胶
电泳100V,2.5h，转膜190mA,1h
5%牛奶封闭1h
一抗1：500，二抗1：5000
据说这个用组织很好做，可是细胞做为什么这么困难呢？请大家赐教！

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VEGF我做过细胞总蛋白的
没有阳性条带
HIF-1没有问题
有结果
用胞浆、胞核蛋白抽提试剂来分别提取胞浆、胞核蛋白
因为HIF-1会在胞浆与胞核中移动
做WB时胞浆、胞核蛋白都要检测

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:57

如果用PVDF膜作斑点印迹，是否可直接点样，还需要用甲醇浸泡吗?

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没有活化的PVDF膜是媳妇不上蛋白的

作者: ending 时间: 2013-2-20 13:57

目的蛋白是什么？
我以前用santa的抗体很多
但是近期看大家的言论觉得santa的抗体好像有一定问题

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天啊，我的二抗也是天根的，也没有做出来。
还有哪位战友友用天根的二抗？
本来我很信任天根（质粒小提确实很好）

作者: jkobn 时间: 2013-2-20 13:58

从这些来分析的话只能说一抗可能降解了
你每次用新的一抗吗？

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对啊~我就怕是一抗降解，所以每次都用新的一抗来稀释，没有重复使用过。一抗是GenScript的，今年4月份买的，买来之后就分装成小支-20°C储存的，应该没有这么快就降解吧？
昨天我又将标准蛋白直接滴加在PVDF膜上，想做个杂交试验摸一摸一抗条件，结果曝光过后仍然什么都没有。难道真的是一抗的问题？会不会是封闭过头？我用的是5%脱脂奶粉RT封闭一小时。
另外还有一个问题，我转膜过后膜上的预染Marker上下两头的条带很清晰但是中间的条带有点模糊，这是怎么回事呢？有什么解决方法么？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:58

天啊，我的二抗也是天根的，也没有做出来。
还有哪位战友友用天根的二抗？
本来我很信任天根（质粒小提确实很好）

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二抗一般都没有问题的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:58

对啊~我就怕是一抗降解，所以每次都用新的一抗来稀释，没有重复使用过。一抗是GenScript的，今年4月份买的，买来之后就分装成小支-20°C储存的，应该没有这么快就降解吧？
昨天我又将标准蛋白直接滴加在PVDF膜上，想做个杂交试验摸一摸一抗条件，结果曝光过后仍然什么都没有。难道真的是一抗的问题？会不会是封闭过头？我用的是5%脱脂奶粉RT封闭一小时。
另外还有一个问题，我转膜过后膜上的预染Marker上下两头的条带很清晰但是中间的条带有点模糊，这是怎么回事呢？有什么解决方法么？
谢谢！

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就这么一说我不清楚具体情况是什么

作者: kuohao17 时间: 2013-2-20 13:59

请问测NF-kB最好用什么哪种抗体比较好啊 IKB，p-IKB还是p65什么的？
另外我们的仪器是北京六一的电泳槽和湿法转膜仪求湿转法的protocal
还有我们没有凝胶成像系统请问通过什么方法可以在一抗二抗反应之后直接显示条带？听说的DAB和TMB沉淀型可以显色，如果使用这两种一二抗有什么要求啊？操作有什么注意事项吗？
p-Akt的磷酸化位点选择473好还是308好呢？
谢谢你啦！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 13:59

QUOTE:

原帖由 kuohao17 于 2013-2-20 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问测NF-kB最好用什么哪种抗体比较好啊 IKB，p-IKB还是p65什么的？
另外我们的仪器是北京六一的电泳槽和湿法转膜仪求湿转法的protocal
还有我们没有凝胶成像系统请问通过什么方法可以在一抗二抗反应之后直接显示 ...

请告知分子量
抗体的选择请参考你要投杂志中的参考文献
AKT，IKB及其磷酸化蛋白都很好做
用化学发光法（ECL），曝光，显影、定影

作者: glass 时间: 2013-2-20 14:00

作了几次wastern,用的都是pvdf，可是，当用甲醇浸泡10秒后，再用双蒸水浸泡，pvdf总是卷成一团，或者飘在水面上，不知什么原因？
另外，我转膜的时候，膜的大小超过了胶以及上下滤膜的大小，转膜后，pvdf末端是干燥的，对后续试验有影响吗？谢谢

作者: lgm 时间: 2013-2-20 14:00

你好，最近遇见一个问题，一个条带会有中间一两个孔的条带不太清楚，然后继续孵育一样的一抗，二抗，重新发光，发现这两个孔条带变深变亮了，请问是怎么回事啊？
而开始边上的两孔很深的，孵育后，发光变淡了，可以理解，可是前面一种情况不知道怎么避免，谢谢啊

作者: ritou1985 时间: 2013-2-20 14:01

请问版主，我的蛋白是105k，如果想转膜过夜用40am可以吗？希望您能给出比较详细的建议，非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:01

作了几次wastern,用的都是pvdf，可是，当用甲醇浸泡10秒后，再用双蒸水浸泡，pvdf总是卷成一团，或者飘在水面上，不知什么原因？
另外，我转膜的时候，膜的大小超过了胶以及上下滤膜的大小，转膜后，pvdf末端是干燥的，对后续试验有影响吗？谢谢

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剪成基本一致大小
膜卷曲的事我不知道怎么回事

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:01

你好，最近遇见一个问题，一个条带会有中间一两个孔的条带不太清楚，然后继续孵育一样的一抗，二抗，重新发光，发现这两个孔条带变深变亮了，请问是怎么回事啊？
而开始边上的两孔很深的，孵育后，发光变淡了，可以理解，可是前面一种情况不知道怎么避免，谢谢啊

==========================

抗体在孵育的时候没有孵育好
中间液体容易少

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:02

请问版主，我的蛋白是105k，如果想转膜过夜用40am可以吗？希望您能给出比较详细的建议，非常感谢！

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300mA，2h

作者: IAM007 时间: 2013-2-20 14:02

老师：我做大鼠脑组织中的GABA A 受体的亚单位：α1的WB，分子量：52kD,上样量：40ug，
分离胶：10％ ,电泳条件：70u，20min；110u，60min；转模条件：PVDF膜，50u，70min；一抗：建议稀释度：1:500--2000，我用的是：1：1000，1:2000；ABCOM公司的；二抗：碱性磷酸酶的，santa分装的，1:2000稀释；
作出的结果：背景很深，基本看不到条带；
请老师指点一下。

作者: qhyu 时间: 2013-2-20 14:03

请问蛋白分子量为250KD电泳时电压与电泳时间多少为好，我用
6%的分离胶

作者: vivian4123 时间: 2013-2-20 14:04

我才开始做WB。我用BCA法测蛋白浓度。
我加2ul样品到96孔板的样品孔中，再加18ul的标准品稀释液至样品孔中。。
我用标准曲线计算出样品浓度后，我的样品实际浓度，是否需要在测出值上乘以10倍。还是，其它。我一直没搞明白，问了周围的人，他们一个人给我一个答案。郁闷之中。。。。。。

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:04

老师：我做大鼠脑组织中的GABA A 受体的亚单位：α1的WB，分子量：52kD,上样量：40ug，
分离胶：10％ ,电泳条件：70u，20min；110u，60min；转模条件：PVDF膜，50u，70min；一抗：建议稀释度：1:500--2000，我用的是：1：1000，1:2000；ABCOM公司的；二抗：碱性磷酸酶的，santa分装的，1:2000稀释；
作出的结果：背景很深，基本看不到条带；
请老师指点一下。

=============================

加大上样量至60或者80ug
一抗稀释度 1：4000
二抗用1：4000，1：2000试试

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:04

请问蛋白分子量为250KD电泳时电压与电泳时间多少为好，我用
6%的分离胶

=================

需要看Marker的位置

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:05

请问蛋白分子量为250KD电泳时电压与电泳时间多少为好，我用
6%的分离胶

===================

电压：浓缩胶 90V
分离胶180
注意降温

作者: NBA 时间: 2013-2-20 14:05

我才开始做WB。我用BCA法测蛋白浓度。
我加2ul样品到96孔板的样品孔中，再加18ul的标准品稀释液至样品孔中。。
我用标准曲线计算出样品浓度后，我的样品实际浓度，是否需要在测出值上乘以10倍。还是，其它。我一直没搞明白，问了周围的人，他们一个人给我一个答案。郁闷之中。。。。。。

=============

需要乘以10

作者: 8princess8 时间: 2013-2-20 14:06

目的蛋白是什么？
我以前用santa的抗体很多
但是近期看大家的言论觉得santa的抗体好像有一定问题

================================

目的蛋白是CDK2 一周了没结果很奇怪

作者: kswl870 时间: 2013-2-20 14:06

请问一下,蛋白样品的浓度太高了,用什么稀释?谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 15:12

目的蛋白是CDK2 一周了没结果很奇怪

==============================

考虑一下目的蛋白有没有提取出来

作者: NBA 时间: 2013-2-20 16:26

请问一下,蛋白样品的浓度太高了,用什么稀释?谢谢

==========

裂解液

作者: NBA 时间: 2013-2-20 16:27

请问一下,蛋白样品的浓度太高了,用什么稀释?谢谢

===================================================================

如果不知道裂解液配方或者是别人给你的样品，你不知道背景信息，那么用PBS稀释

作者: zzzz 时间: 2013-2-20 16:32

目的蛋白是CDK2 一周了没结果很奇怪

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原来一直用这个样品做的我是做好样品之后加lodding buffer煮沸变性后分装保存的 -20保存的不过时间可能长了点有一个多月了

作者: wood533 时间: 2013-2-20 16:38

老师你好，请再帮我分析一下转膜后出现这种情况的原因（做了好多次电泳，转膜后都出现这样的现像，请问这是什么原因呢？我觉得可能是做三明治的明胶海棉太老了，中间薄周围厚，有的地方都有了小洞，但别人也是用这些海棉做的，没有出现这种现像）转膜时电流300mA，时间2小时，目的蛋白80KD。

[ 本帖最后由 wood533 于 2013-2-20 16:40 编辑 ]

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作者: jujuba 时间: 2013-2-20 16:41

版主你好，请教条带大小分别为41KD、60KD、85KD的蛋白用NC膜湿转时的条件？电流和时间等。还有什么要注意的问题？先谢谢了

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-20 16:44

前辈您好，最近两个月来我一直在做半定量western，前一段时间做的如图1，可中间不知出现了什么问题，做的结果总是如图2，这两个阶段操作和试剂药品都没有变化，麻烦您分析一下是哪出了问题，谢谢！

图片附件: 73024967.snap.jpg (2013-2-20 16:44, 15.32 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14889

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-20 16:49

不好意思，第一次上传图，不太熟练。上面那个是图1，这个是图2，貌似显色发生了反转，蛋白条带反而不亮了，望您分析一下。

图片附件: 40054301.snap.jpg (2013-2-20 16:49, 16 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14890

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-20 16:50

还有问题想要问您，如下：
我的蛋白浓度太高了，在20-30ug/ul，我们的样品蛋白用5X的loading buff 稀释（按样品：buffer=4：1）后煮变性。如果我们取上样量为100ug。上样的样品体积太少了。。。。。我请教了一些同学，他们说，可以再加2X或者3X的loading buffer补充上样体积。是否可以。。。。还有请问，如何将5X的loading buffer 稀释成2X或者3Xloading buffer。谢谢，期待您的回答。。。。

作者: tuuu2 时间: 2013-2-20 16:50

各位前辈，请帮忙指点一下：
我前几天做四株癌细胞一目标蛋白表达量的比较，每株细胞设两个重复，前两株细胞目标蛋白表达均较高，条带较直，后两株细胞不表达，接着我又优势B-action想看看是不是样的问题，结果B-action比较弯，有点像逗号，并且后两个样中各有一个样B-action 没有表达，请问是哪里出了问题呀？我该注意些什么？急！！！！
先谢谢你们了！

作者: 2541 时间: 2013-2-20 16:51

请问如果我做组织蛋白如果不是新鲜做我的组织要怎么保存可以保存在液氮或者是﹣80°冰箱中吗？？

作者: yonger 时间: 2013-2-20 16:53

相关疾病：
肝癌
NBA你好，非常感谢你的帮助，我做WB也有两个月了，近来跑电泳考染后发现15kD以下蛋白就没了，蛋白从肝癌细胞和肝癌组织中分别提取的，胶浓度是15%的，电泳55v30分钟，80v50分钟，麻烦你帮我分析一下。

作者: 3N4G 时间: 2013-2-20 16:54

您好附图是我做的细胞提取蛋白胶片 5%脱脂奶粉室温封闭1h，santa一抗1：1500，用脱脂奶粉稀释，二抗1：5000，用TBST稀释，ECl反应1min，出来背景很深，看不到条带；之前做过一个蛋白可以看见条带，但就是在条带周围也有这样的背景，麻烦帮我分析一下原因

图片附件: 75032570.snap.jpg (2013-2-20 16:54, 14 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14891

作者: 101010 时间: 2013-2-20 16:54

向版主求助！我W的条带总是很弥散，而且很浓，曾出现过反影。调低一抗浓度合适吗？之前怀疑是蛋白讲解，但是新抽的蛋白也是这样。但用同门的蛋白一样的电泳及转膜条件就是很漂亮的条带！蛋白的抽提方法一样的，而且我也亲自抽过同门的蛋白。我的蛋白是110k，在160的位置有修饰后的条带。弥散的条带的位置是对的。电泳：80V浓缩胶后110v分离，300ma恒流湿转2.5～3h。不知问题出在哪里？非常感谢！！！

作者: NBA 时间: 2013-2-20 16:55

原来一直用这个样品做的我是做好样品之后加lodding buffer煮沸变性后分装保存的 -20保存的不过时间可能长了点有一个多月了，

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不知道你这个蛋白是不是容易降解
换新样品试试

作者: NBA 时间: 2013-2-20 16:56

老师你好，请再帮我分析一下转膜后出现这种情况的原因（做了好多次电泳，转膜后都出现这样的现像，请问这是什么原因呢？我觉得可能是做三明治的明胶海棉太老了，中间薄周围厚，有的地方都有了小洞，但别人也是用这些海棉做的，没有出现这种现像）转膜时电流300mA，时间2小时，目的蛋白80KD。

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感觉像是胶与膜之间有挪动
转移时温度太高

作者: is2011 时间: 2013-2-20 16:56

请问如何计算转膜电流和时间？

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:03

版主你好，请教条带大小分别为41KD、60KD、85KD的蛋白用NC膜湿转时的条件？电流和时间等。还有什么要注意的问题？先谢谢了

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可以选择一个适中的时间把这三个蛋白都搞定
300mA湿转，1h20min
0.45um孔径NC膜

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:03

不好意思，第一次上传图，不太熟练。上面那个是图1，这个是图2，貌似显色发生了反转，蛋白条带反而不亮了，望您分析一下。

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蛋白上样量要降低（降低一半试试）
同时抗体继续稀释

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:04

还有问题想要问您，如下：
我的蛋白浓度太高了，在20-30ug/ul，我们的样品蛋白用5X的loading buff 稀释（按样品：buffer=4：1）后煮变性。如果我们取上样量为100ug。上样的样品体积太少了。。。。。我请教了一些同学，他们说，可以再加2X或者3X的loading buffer补充上样体积。是否可以。。。。还有请问，如何将5X的loading buffer 稀释成2X或者3Xloading buffer。谢谢，期待您的回答。。。。

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可以用你的蛋白提取液把蛋白调整至浓度2或者3mg/ml
之后再加入5×loading不就可以了？
当然加入2×的也是可以的

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:09

各位前辈，请帮忙指点一下：
我前几天做四株癌细胞一目标蛋白表达量的比较，每株细胞设两个重复，前两株细胞目标蛋白表达均较高，条带较直，后两株细胞不表达，接着我又优势B-action想看看是不是样的问题，结果B-action比较弯，有点像逗号，并且后两个样中各有一个样B-action 没有表达，请问是哪里出了问题呀？我该注意些什么？急！！！！
先谢谢你们了！！！！

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建议把图贴上来
我认为转膜有些问题

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:10

请问如果我做组织蛋白如果不是新鲜做我的组织要怎么保存可以保存在液氮或者是﹣80°冰箱中吗？？

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-80度保存就行
如果有条件液氮更好

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:10

相关疾病：
肝癌

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NBA你好，非常感谢你的帮助，我做WB也有两个月了，近来跑电泳考染后发现15kD以下蛋白就没了，蛋白从肝癌细胞和肝癌组织中分别提取的，胶浓度是15%的，电泳55v30分钟，80v50分钟，麻烦你帮我分析一下。

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15K以下蛋白用SDS-PAGE就比较难分离了
用Tricine胶试试
不过tricine胶也不太好整

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:10

您好附图是我做的细胞提取蛋白胶片 5%脱脂奶粉室温封闭1h，santa一抗1：1500，用脱脂奶粉稀释，二抗1：5000，用TBST稀释，ECl反应1min，出来背景很深，看不到条带；之前做过一个蛋白可以看见条带，但就是在条带周围也有这样的背景，麻烦帮我分析一下原因

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降低一抗二抗浓度

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-20 17:11

向版主求助！我W的条带总是很弥散，而且很浓，曾出现过反影。调低一抗浓度合适吗？之前怀疑是蛋白讲解，但是新抽的蛋白也是这样。但用同门的蛋白一样的电泳及转膜条件就是很漂亮的条带！蛋白的抽提方法一样的，而且我也亲自抽过同门的蛋白。我的蛋白是110k，在160的位置有修饰后的条带。弥散的条带的位置是对的。电泳：80V浓缩胶后110v分离，300ma恒流湿转2.5～3h。不知问题出在哪里？非常感谢！！！

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延长分离胶聚合时间（可以4度过夜）
另外糖蛋白有些会出现弥散条带

作者: dongdongqiang 时间: 2013-2-20 17:11

版主你好，请您指教。
我们老板要我们测体液（血/尿）里面的目的蛋白，大概会按照国外文献的方法来检测（据报道脑脊液，尿液，泪液etc可以检得出来）：先用差速离心（20万G）获得蛋白样品，据文献说此时得到是“目的蛋白-Containing Membrane Particle”，然后再去做WB，ECL。
以往没做过WB。
问题：1. WB检测的是蛋白质吧，那么这种离心后得到的“目的蛋白-Containing Membrane Particle”老外既然作出来结果了，它跟平时做的WB会不会不一样。文献上好像就是平时WB的方法。
2.血/尿中的目的蛋白估计会很少，如何除杂，提高目的蛋白的检出率，就是说血清蛋白和尿蛋白一般WB的方法是怎样的。
3.定量WB的方法。
非常感谢。

作者: 987789 时间: 2013-2-20 17:12

请问：做WB的内参显影后总是连在一起成一条线是怎么回事？？大概能看出各个孔的条带，但是连线太厉害了。。后来我隔一个孔点样，内参倒是分开不连线了，但是边缘效应很明显，点在边上的样品，内参明显不如中间的亮真不晓得怎么办了。。。。
特此请教，谢谢～～

作者: 987789 时间: 2013-2-20 17:13

延长分离胶聚合时间（可以4度过夜）
另外糖蛋白有些会出现弥散条带

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感谢版主及时回复！我的胶都是4度过夜配好后第二天用的。此外帮同门W的基本都是漂亮的条带。希望你能帮我找找原因，不胜感激！

作者: 49888 时间: 2013-2-20 17:14

您说的抗体稀释是一抗、二抗都要稀释么？我的一抗浓度现在用的是1：1000，四度孵育过夜；二抗1：3000，37度一小时。

作者: gemei0115 时间: 2013-2-20 17:14

降低一抗二抗浓度

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之前做一个蛋白条带出来了但是也是背景有的地方很高而且条带看上去也不是很明显的如果我降低一抗二抗浓度的话蛋白条带会不会更不明显呢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:15

版主你好，请您指教。
我们老板要我们测体液（血/尿）里面的目的蛋白，大概会按照国外文献的方法来检测（据报道脑脊液，尿液，泪液etc可以检得出来）：先用差速离心（20万G）获得蛋白样品，据文献说此时得到是“目的蛋白-Containing Membrane Particle”，然后再去做WB，ECL。
以往没做过WB。
问题：1. WB检测的是蛋白质吧，那么这种离心后得到的“目的蛋白-Containing Membrane Particle”老外既然作出来结果了，它跟平时做的WB会不会不一样。文献上好像就是平时WB的方法。
2.血/尿中的目的蛋白估计会很少，如何除杂，提高目的蛋白的检出率，就是说血清蛋白和尿蛋白一般WB的方法是怎样的。
3.定量WB的方法。
非常感谢。

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这方面的WB没做过
WB是检测蛋白的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:15

请问：做WB的内参显影后总是连在一起成一条线是怎么回事？？大概能看出各个孔的条带，但是连线太厉害了。。后来我隔一个孔点样，内参倒是分开不连线了，但是边缘效应很明显，点在边上的样品，内参明显不如中间的亮真不晓得怎么办了。。。。
特此请教，谢谢～～

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降低上样量

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:18

感谢版主及时回复！我的胶都是4度过夜配好后第二天用的。此外帮同门W的基本都是漂亮的条带。希望你能帮我找找原因，不胜感激！

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转膜时降温
另外调整一下抗体稀释度

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:18

您说的抗体稀释是一抗、二抗都要稀释么？我的一抗浓度现在用的是1：1000，四度孵育过夜；二抗1：3000，37度一小时。

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是的

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:19

之前做一个蛋白条带出来了但是也是背景有的地方很高而且条带看上去也不是很明显的如果我降低一抗二抗浓度的话蛋白条带会不会更不明显呢

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在合适的稀释度时是不会的
现在摸索条件就是找一个合适的点

作者: tuuu2 时间: 2013-2-20 17:19

我用的是伯乐半干转，转移缓冲液配方是：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
蒸馏水至 1000ml
我做的蛋白是cPLA2-a，文献上分子量是85-114（好几个版本，具体不清楚是哪个），请问我的转膜条件：24V 50min可以吗，我做了3次，条带没怎么看到。
还有，背景很脏，我二抗浓度已经调整到1：10000了，背景还是脏，洗膜TBST，15min，3次。（另一个抗体一起洗膜的，背景就很干净）请问应该怎么调整。谢谢

作者: 831226 时间: 2013-2-20 17:20

VEGF我做过细胞总蛋白的
没有阳性条带
HIF-1没有问题
有结果
用胞浆、胞核蛋白抽提试剂来分别提取胞浆、胞核蛋白
因为HIF-1会在胞浆与胞核中移动
做WB时胞浆、胞核蛋白都要检测

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您好！正如你上次所说HIF-1a没有问题，可是我们实验室一直就没做出过这个蛋白，恳请问您一下你们是用的什么细胞？常氧培养还是低氧、缺氧？WB操作过程中有没有特殊的要求（因为有人说HIF-1a很不稳定，遇氧分解，收蛋白，定标等都应避免与氧接触，可是我们觉得这个条件很难实现）？急盼你的答案，谢谢！

[ 本帖最后由 831226 于 2013-2-20 17:22 编辑 ]

作者: 66+77 时间: 2013-2-20 17:23

再次打扰你，前几天做了个斑点印迹，拍的照片好奇怪，请你帮我分析一下啊

[ 本帖最后由 66+77 于 2013-2-20 17:29 编辑 ]

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作者: 66+77 时间: 2013-2-20 17:29

显的是内参

作者: 04906 时间: 2013-2-20 17:30

版主，你好
我最近做了western，跑GAPDH已经跑的很好了，但是目标蛋白就是没有任何条带。
我要提的蛋白是100kd左右的分泌型的蛋白（以前认为是膜蛋白），因为经费问题，裂解液是自己配的，和文献上对比少加了去氧胆酸钠和一些酶抑制剂，多加了0.1%sds。上样量达到了200ug，并做了阳性对照。一抗是abcam的，兔多抗，电泳用10%的胶，转膜用250ma 2小时，曝光用了30min，ECL用thermo的，二抗用kpl的goat抗兔的，只有一次看到杂带。内参是GAPDH的鼠抗，用康城的一抗，内参二抗也是kpl的hrp。
整张膜就是没有任何条带。只有一次在40kd左右出现了条带，后来就没有了，现在考虑究竟是
1.裂解液的问题，没有裂解好？我看到文献说是不是不需要加SDS，还是应该加上去氧胆酸钠，我手里有熊去氧胆酸，是不是就是去氧胆酸钠？但是GAPDH能做出来，说明裂解液没啥问题啊，分泌型的蛋白应该可以裂解出来的啊，为什么文献里还加了去氧胆酸钠？
2抗体的问题？我已经投诉了抗体。
3是不是考虑标本有问题？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:31

我用的是伯乐半干转，转移缓冲液配方是：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
蒸馏水至 1000ml
我做的蛋白是cPLA2-a，文献上分子量是85-114（好几个版本，具体不清楚是哪个），请问我的转膜条件：24V 50min可以吗，我做了3次，条带没怎么看到。
还有，背景很脏，我二抗浓度已经调整到1：10000了，背景还是脏，洗膜TBST，15min，3次。（另一个抗体一起洗膜的，背景就很干净）请问应该怎么调整。谢谢

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转膜条件肯定不行
建议：半干，1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜2h
你的原因首先就是蛋白没有转上
先把这个问题解决了再定下一步的实验条件

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:32

您好！正如你上次所说HIF-1a没有问题，可是我们实验室一直就没做出过这个蛋白，恳请问您一下你们是用的什么细胞？常氧培养还是低氧、缺氧？WB操作过程中有没有特殊的要求（因为有人说HIF-1a很不稳定，遇氧分解，收蛋白，定标等都应避免与氧接触，可是我们觉得这个条件很难实现）？急盼你的答案，谢谢！

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我们做的是大鼠骨骼肌组织
在常压低氧条件下运动
最近用santa 的抗体在做HIF-1alpha（Jurkat细胞）
暂时无结果

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:33

再次打扰你，前几天做了个斑点印迹，拍的照片好奇怪，请你帮我分析一下啊

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蛋白上样量太大
向外扩散了

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:33

版主，你好
我最近做了western，跑GAPDH已经跑的很好了，但是目标蛋白就是没有任何条带。
我要提的蛋白是100kd左右的分泌型的蛋白（以前认为是膜蛋白），因为经费问题，裂解液是自己配的，和文献上对比少加了去氧胆酸钠和一些酶抑制剂，多加了0.1%sds。上样量达到了200ug，并做了阳性对照。一抗是abcam的，兔多抗，电泳用10%的胶，转膜用250ma 2小时，曝光用了30min，ECL用thermo的，二抗用kpl的goat抗兔的，只有一次看到杂带。内参是GAPDH的鼠抗，用康城的一抗，内参二抗也是kpl的hrp。
整张膜就是没有任何条带。只有一次在40kd左右出现了条带，后来就没有了，现在考虑究竟是
1.裂解液的问题，没有裂解好？我看到文献说是不是不需要加SDS，还是应该加上去氧胆酸钠，我手里有熊去氧胆酸，是不是就是去氧胆酸钠？但是GAPDH能做出来，说明裂解液没啥问题啊，分泌型的蛋白应该可以裂解出来的啊，为什么文献里还加了去氧胆酸钠？
2抗体的问题？我已经投诉了抗体。
3是不是考虑标本有问题？

===================================================

1，你做的是什么来源的？组织还是细胞
如果是组织分泌型的可以做，但是细胞的话就分泌到培养液中了
2，脱氧胆酸钠是破膜的，同时能提取膜蛋白
3，蛋白酶抑制剂是非常重要的！
4，能做出GAPDH只能说明WB后续步骤没有问题
并不能说明能把你的目的蛋白提取出来

作者: 00无名指00 时间: 2013-2-20 17:34

你好，我做WB有一个月了，跑出来的条带总是几个孔连成一条线，请教过一些实验室的师兄师姐，有说是胶做得不好，也有说是上样量太大，但是减少上样量并严格按照碧云天PAGE胶配制试剂盒说明重复试验后还是很难看。放上今天曝的图，麻烦你帮我分析一下:
1.泳道间没有分开的原因？如何改进？
2.为什么同样大小的蛋白，几个泳道间位置也不太一样，中间跑得比两边快？
3.几乎每次电泳都会出现图3的情况，样品从孔底部像两边溢出（并没有刺穿孔），如何解决？

我的条件是电泳浓缩胶80V，分离胶100V；转膜250mA，100min；上样量10-20ug；每孔体积25ul；胶凝固时间是各30min。谢谢！

图片附件: 85723971.jpg (2013-2-20 17:34, 26.91 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14893

作者: 98776langtao 时间: 2013-2-20 17:34

请问一下，我想提取组织的蛋白。但标本数目不够，不能同时提取。需要加什么试剂吗？有同学说加蛋白酶抑制剂，但具体不知道怎么操作，不知道能不能指导一下，谢谢！

作者: 98776langtao 时间: 2013-2-20 17:35

版主你好：
再请教您一个问题。我用的是湿式电转。转移buffer 配方是：0.1%SDS，20%甲醇，Tris,Glysine.目的蛋白是17KD。可以推荐一下您认为合适的转膜条件吗？

作者: 98776langtao 时间: 2013-2-20 17:35

老师您好，我按您的意见重新做了一下western，把一抗和二抗的浓度都下调了一下，但ECL显色后仍是出现如图1的结果；然后我又在相同的western条件下用DAB显色，得到了如图二的结果，貌似蛋白条带出现了，但不是很清楚，您分析一下，我的实验可能是哪出了问题，会不会是显色底物或抗体的问题，谢谢。

图片附件: 81237274.snap.jpg (2013-2-20 17:35, 7.77 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14894

作者: 8princess8 时间: 2013-2-20 17:36

1，你做的是什么来源的？组织还是细胞
如果是组织分泌型的可以做，但是细胞的话就分泌到培养液中了
2，脱氧胆酸钠是破膜的，同时能提取膜蛋白
3，蛋白酶抑制剂是非常重要的！
4，能做出GAPDH只能说明WB后续步骤没有问题
并不能说明能把你的目的蛋白提取出来

================

用的是组织来源的。

作者: wood533 时间: 2013-2-20 17:37

请问老师我做的是10KD的SDF-1a目的蛋白做了1个多星期了目的蛋白一直未出条带。我们实验室用的是tris,甘氨酸-SDS-PAGE bio-rad 系统湿转请问老师该用什么条件？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:38

你好，我做WB有一个月了，跑出来的条带总是几个孔连成一条线，请教过一些实验室的师兄师姐，有说是胶做得不好，也有说是上样量太大，但是减少上样量并严格按照碧云天PAGE胶配制试剂盒说明重复试验后还是很难看。放上今天曝的图，麻烦你帮我分析一下:
1.泳道间没有分开的原因？如何改进？
2.为什么同样大小的蛋白，几个泳道间位置也不太一样，中间跑得比两边快？
3.几乎每次电泳都会出现图3的情况，样品从孔底部像两边溢出（并没有刺穿孔），如何解决？

我的条件是电泳浓缩胶80V，分离胶100V；转膜250mA，100min；上样量10-20ug；每孔体积25ul；胶凝固时间是各30min。谢谢！

==================================

1，蛋白定量可能有问题
2，上样量减少一半
3，分离胶聚合时间1h30min
4，位置不一致是因为梳孔之间有高低
5，跑电泳时凝胶底部有气泡
6，浓缩胶是不是有破裂的情况

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:38

请问一下，我想提取组织的蛋白。但标本数目不够，不能同时提取。需要加什么试剂吗？有同学说加蛋白酶抑制剂，但具体不知道怎么操作，不知道能不能指导一下，谢谢！

=====================================

-80或者液氮冻存
一块提取
另外蛋白酶抑制剂是在提取蛋白的时候加

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:39

版主你好：
再请教您一个问题。我用的是湿式电转。转移buffer 配方是：0.1%SDS，20%甲醇，Tris,Glysine.目的蛋白是17KD。可以推荐一下您认为合适的转膜条件吗？

===============

我选择用湿转
300mA 15~20min
用0.22um膜

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:39

老师您好，我按您的意见重新做了一下western，把一抗和二抗的浓度都下调了一下，但ECL显色后仍是出现如图1的结果；然后我又在相同的western条件下用DAB显色，得到了如图二的结果，貌似蛋白条带出现了，但不是很清楚，您分析一下，我的实验可能是哪出了问题，会不会是显色底物或抗体的问题，谢谢。

==========================

抗体稀释度需要加大
ECL敏感性高于DAB
也就是ECL操作能节省抗体

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:40

请问老师我做的是10KD的SDF-1a目的蛋白做了1个多星期了目的蛋白一直未出条带。我们实验室用的是tris,甘氨酸-SDS-PAGE bio-rad 系统湿转请问老师该用什么条件？

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用Tricine-SDS-PAGE试试吧

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:40

用的是组织来源的。

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继续做啊

作者: IAM007 时间: 2013-2-20 17:41

1，蛋白定量可能有问题
2，上样量减少一半
3，分离胶聚合时间1h30min
4，位置不一致是因为梳孔之间有高低
5，跑电泳时凝胶底部有气泡
6，浓缩胶是不是有破裂的情况

==========================================================

多谢指导！还想请问如何避免凝胶底部的气泡以及如何防止浓缩胶破裂？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:41

多谢指导！还想请问如何避免凝胶底部的气泡以及如何防止浓缩胶破裂？

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1,拔梳子时不能前后动，只能左右移动
2，胶底部的气泡要用灌胃针进行吹打

作者: cwcwcww 时间: 2013-2-20 17:42

我选择用湿转
300mA 15~20min
用0.22um膜

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15－20min？写错了吧，这么短的时间吗？

作者: wood533 时间: 2013-2-20 17:43

我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？

1、同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样大约几十微克。45V,30min左右跑两块胶，一块染色一块转膜，肉眼观察染色结果各组条带看不出明显差别。

2、转膜也是常规操作啊，60V，2h;后来改为180mA，2h 转完后染胶同时丽春红染膜（NC膜）一般都是胶上只有大分子有少量残留，小分子蛋白几乎没有残留；膜上条带似乎也是很均匀的至少不会如胶片上曝光的那样大的差别（见胶片）。

3、洗膜后奶粉封闭1--2h，一抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。
具体的情况见胶片上的条带，按理说是条带粗细一致的，但每次做的结果总是这样那样的问题。我也在园子里发了好多帖子求教战友，但问题至今无法解决。如今老板也在催结果，只能求救于您！请不赐吝教！甚为感激！

图片附件: 45175928.jpg (2013-2-20 17:43, 54.06 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14895

作者: wood533 时间: 2013-2-20 17:43

还有下面的图

图片附件: 54770780.jpg (2013-2-20 17:43, 38.11 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14896

作者: wood533 时间: 2013-2-20 17:44

前两张张似乎规律挺像，很无奈

图片附件: 87985692.jpg (2013-2-20 17:44, 59.53 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14897

作者: 8princess8 时间: 2013-2-20 17:44

请问 marker 跑的和标准的不一样可能是什么原因？

作者: bring 时间: 2013-2-20 17:45

有几个问题想请教：
基本信息：
目的蛋白三个：48Kd、53Kd、60Kd，由于分子量非常接近，每张胶只做一个目的蛋白。
内参：GAPDH，36Kd
电泳：恒压120V，90分钟，10%分离胶，5%浓缩胶
转膜:恒压20V，60分钟，PVDF膜，孔径0.45微米
封闭液：5%脱脂奶粉，PBST
一抗孵育4℃过夜
二抗室温一小时

1、Western Blot电泳时，条带总是会有一些弯曲、上翘是为什么？会影响实验结果吗？
2、BCA法测蛋白量，需要建立几条标曲？有人说每次至少建3条，看三条曲线的分布是否基本重合，以验证稳定性。只有建立的标曲稳定，测出来的蛋白含量才可信。是这样吗？
3、内参条带宽窄、深浅不一，是上样量不准吗？
4、如何计算上样量？
请指教~谢谢~

作者: 831226 时间: 2013-2-20 17:45

感谢热心的楼主解答的问题！
我想问问，楼主显色的时候一整张膜都亮是什么原因啊！显色出来的时候，背景很黑，但是也能看清目的条带！

作者: 831226 时间: 2013-2-20 17:46

附图：

图片附件: 40608764.snap.jpg (2013-2-20 17:46, 10.13 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14898

作者: orangecake 时间: 2013-2-20 17:46

请问老师，我做的细胞色素C，目的蛋白跑的还行，为什么内参（beta-actin）条带的灰度也有差异呢？已经进行过蛋白定量。谢谢

作者: pengke1983 时间: 2013-2-20 17:47

请教老师，我做WB大部分时候结果都挺好，有几次出来的结果就比较奇怪，就是样品里面所有的蛋白都在胶片上面有带。因为用的是hist-tag的抗体，理论上只有我自己表达的重组蛋白会有带，也就是每个泳道应该只有一条带。
说下我的条件：过夜封闭，一小时一抗，一小时二抗，转膜没有问题（膜上的彩虹marker很明显），转膜后的胶染色后发现除去marker完全转去膜，其他的泳道还是有很多蛋白带。
一抗和二抗的浓度应该都没有问题，之前做的结果都是很好看的。
这次会不会是我的上样量比较大？就出现了非特异性的结合呢?
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:47

15－20min？写错了吧，这么短的时间吗？

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胶厚度：1.0mm
300mA 15至20min
清楚了吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:48

我的WB结果beta-actin条带总是粗细不一，不知为何呢？

1、同一个样品，一管中加入待测样品和LB，混匀、煮5min ，离心一会，取上清于新EP管中，混匀后上样大约几十微克。45V,30min左右跑两块胶，一块染色一块转膜，肉眼观察染色结果各组条带看不出明显差别。

2、转膜也是常规操作啊，60V，2h;后来改为180mA，2h 转完后染胶同时丽春红染膜（NC膜）一般都是胶上只有大分子有少量残留，小分子蛋白几乎没有残留；膜上条带似乎也是很均匀的至少不会如胶片上曝光的那样大的差别（见胶片）。

3、洗膜后奶粉封闭1--2h，一抗过夜，洗膜、二抗1-2h;洗膜、ECL显影、曝光。
用的是乐扣最小的饭盒来封闭、洗膜、孵育抗体的。
具体的情况见胶片上的条带，按理说是条带粗细一致的，但每次做的结果总是这样那样的问题。我也在园子里发了好多帖子求教战友，但问题至今无法解决。如今老板也在催结果，只能求救于您！请不赐吝教！甚为感激！

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没太看懂你的意思
上的是同一个样？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:48

前两张张似乎规律挺像，很无奈

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从这张来看电泳跑的也有问题

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:48

请问 marker 跑的和标准的不一样可能是什么原因？

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什么种类marker？
你的标准是什么？

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:48

有几个问题想请教：
基本信息：
目的蛋白三个：48Kd、53Kd、60Kd，由于分子量非常接近，每张胶只做一个目的蛋白。
内参：GAPDH，36Kd
电泳：恒压120V，90分钟，10%分离胶，5%浓缩胶
转膜:恒压20V，60分钟，PVDF膜，孔径0.45微米
封闭液：5%脱脂奶粉，PBST
一抗孵育4℃过夜
二抗室温一小时

1、Western Blot电泳时，条带总是会有一些弯曲、上翘是为什么？会影响实验结果吗？
2、BCA法测蛋白量，需要建立几条标曲？有人说每次至少建3条，看三条曲线的分布是否基本重合，以验证稳定性。只有建立的标曲稳定，测出来的蛋白含量才可信。是这样吗？
3、内参条带宽窄、深浅不一，是上样量不准吗？
4、如何计算上样量？
请指教~谢谢~

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1，弯曲、上翘是由于分离胶没有聚合好，电泳是电压或电流太大引起
2，我一般采用3管平行对照做标准曲线
3，是的
4，通过蛋白浓度来计算上样量

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:49

感谢热心的楼主解答的问题！
我想问问，楼主显色的时候一整张膜都亮是什么原因啊！显色出来的时候，背景很黑，但是也能看清目的条带！

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1，膜没洗干净
2，二抗浓度太高
3，一抗质量不好

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:49

请问老师，我做的细胞色素C，目的蛋白跑的还行，为什么内参（beta-actin）条带的灰度也有差异呢？已经进行过蛋白定量。谢谢

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由于蛋白定量及调整蛋白浓度、上样误差引起
通过WB预实验内参结果来确定正式上样量

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:50

请教老师，我做WB大部分时候结果都挺好，有几次出来的结果就比较奇怪，就是样品里面所有的蛋白都在胶片上面有带。因为用的是hist-tag的抗体，理论上只有我自己表达的重组蛋白会有带，也就是每个泳道应该只有一条带。
说下我的条件：过夜封闭，一小时一抗，一小时二抗，转膜没有问题（膜上的彩虹marker很明显），转膜后的胶染色后发现除去marker完全转去膜，其他的泳道还是有很多蛋白带。
一抗和二抗的浓度应该都没有问题，之前做的结果都是很好看的。
这次会不会是我的上样量比较大？就出现了非特异性的结合呢?
谢谢

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his标签有可能降解（蛋白降解）

作者: lxh031 时间: 2013-2-20 17:50

你好，我在做磷酸化的P38和ERK。我想问下p-p38分子量是多少，说明书上说是43kd，但网上查的怎么是38kd？
还有我SDS-PAGE考染的，有明显条带，但在43-34kd之间好像没条带，很淡，隐隐约约的，20ul上的样，没定量，不知道是多少ug，是不是蛋白浓度太低？这样能做出WB结果吗？因为我做的WB背景总是很深，带又弱，很难辨认

作者: am10 时间: 2013-2-20 17:51

没太看懂你的意思
上的是同一个样？

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是的，同一个样品，等量上样，结果却相差很大，不知是什么原因？
还想请问，转膜的三明治中滤纸、胶、膜的大小如果不能完全一样大，那么它们的大小顺序是什么？

作者: wu11998866 时间: 2013-2-20 17:51

前辈你好！我最近做western正郁闷呢，内参出来了，但是目标蛋白始终没出现，我的目标蛋白108KD,75V恒压转膜2小时，预染marker转的很好，没染丽春红，直接封闭，一抗常温2小时，二抗1:1000 1小时,内参出来了，目标蛋白始终没有出现。转膜液没加0.1%的SDS,这个影响大吗？
我是从组织里用RIPA提的全蛋白，目标蛋白是膜蛋白。

作者: TAT 时间: 2013-2-20 17:51

各位大侠，各位前辈，在下实在快疯了。
WB做了大半年，原来很好做的指标现在做不出来了，条件前后一摸一样的，显影就是一片空白，一点带的影子都没有。二抗也换过了，难道一抗失效了？还没有过期呀，一直放在-20度的。蛋白做内参没有一点问题。
帮忙分析下可能的原因吧，万分感谢！

作者: mimili_901 时间: 2013-2-20 17:52

各位老师，有没有人做过130kd的BMPR2，请指教。标本取自大鼠肺组织，用普利莱公司的RIPA裂解液，BCA测蛋白浓度为5.8ug/ul。上样量做过10ul，30ul，45ul，60ul。用8%的胶，80V恒压电泳。考马斯亮蓝染色后发现70kd以下的条带很多，100kd以上的条带几乎看不见，170kd的条带又可见。我的BMPR2为130kd。我们实验室只有半干转膜仪，采用恒流，2mA/cm2转2个小时、2mA/cm2转2个半小时，2.5mA/cm2转2个半小时都做过，用立春红染膜看不见明显条带。一抗用BD公司的，1：500（推荐1：250-1：1000），二抗1：1000，没有条带显影。请各位老师指教。

作者: u234 时间: 2013-2-20 17:52

请问老师：
　　　我向两盘293T细胞里分别瞬时转染pEGFP空载体和带GFP标签的Parkin质粒，24小时后在荧光显微镜下两盘都可见绿色荧光(镜下看来荧光量不少)，用细胞裂解液来做western，用GFP的一抗，结果GFP-Parkin的道上什么也没有，pEGFP空载体的道上有很明显特异的GFP的条带，已排除了转膜不好的因素；请帮忙分析下原因呗，先行谢过~

其中GFP-Parkin大小约为79kD

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:53

你好，我在做磷酸化的P38和ERK。我想问下p-p38分子量是多少，说明书上说是43kd，但网上查的怎么是38kd？
还有我SDS-PAGE考染的，有明显条带，但在43-34kd之间好像没条带，很淡，隐隐约约的，20ul上的样，没定量，不知道是多少ug，是不是蛋白浓度太低？这样能做出WB结果吗？因为我做的WB背景总是很深，带又弱，很难辨认

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1，分子量问题看说明书
2，没测定蛋白浓度？不知道上了多少微克啊
3，磷酸化蛋白注意蛋白提取时加入磷酸酶抑制剂
4，背景问题需要认真解决

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:53

是的，同一个样品，等量上样，结果却相差很大，不知是什么原因？
还想请问，转膜的三明治中滤纸、胶、膜的大小如果不能完全一样大，那么它们的大小顺序是什么？

========================================

1，转膜时气泡没有完全赶好
2，孵育抗体的时候整个体系量太少抗体没有孵育好

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:54

前辈你好！我最近做western正郁闷呢，内参出来了，但是目标蛋白始终没出现，我的目标蛋白108KD,75V恒压转膜2小时，预染marker转的很好，没染丽春红，直接封闭，一抗常温2小时，二抗1:1000 1小时,内参出来了，目标蛋白始终没有出现。转膜液没加0.1%的SDS,这个影响大吗？
我是从组织里用RIPA提的全蛋白，目标蛋白是膜蛋白。

=================================

1，膜蛋白不好提取，有可能没有提出来
2，膜蛋白名称告诉我一下
3，抗体问题

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:54

各位大侠，各位前辈，在下实在快疯了。
WB做了大半年，原来很好做的指标现在做不出来了，条件前后一摸一样的，显影就是一片空白，一点带的影子都没有。二抗也换过了，难道一抗失效了？还没有过期呀，一直放在-20度的。蛋白做内参没有一点问题。
帮忙分析下可能的原因吧，万分感谢！

==============

1，抗体失效
2，蛋白降解

作者: NBA 时间: 2013-2-20 17:55

各位老师，有没有人做过130kd的BMPR2，请指教。标本取自大鼠肺组织，用普利莱公司的RIPA裂解液，BCA测蛋白浓度为5.8ug/ul。上样量做过10ul，30ul，45ul，60ul。用8%的胶，80V恒压电泳。考马斯亮蓝染色后发现70kd以下的条带很多，100kd以上的条带几乎看不见，170kd的条带又可见。我的BMPR2为130kd。我们实验室只有半干转膜仪，采用恒流，2mA/cm2转2个小时、2mA/cm2转2个半小时，2.5mA/cm2转2个半小时都做过，用立春红染膜看不见明显条带。一抗用BD公司的，1：500（推荐1：250-1：1000），二抗1：1000，没有条带显影。请各位老师指教。

==============================================

1，膜蛋白不好提取
2，普利莱的RIPA能提膜蛋白吗？我没用过，你咨询下
3，问题可能出现在蛋白提取上

作者: 987789 时间: 2013-2-20 17:57

：不知您是否做过膜蛋白，您用的哪家的裂解液，如果是自己配的，可否告知配方及提取过程？**。该裂解液只提膜蛋白还是胞浆蛋白、核蛋白都提了？谢谢！

作者: 8s5g 时间: 2013-2-20 17:58

1，膜蛋白不好提取，有可能没有提出来
2，膜蛋白名称告诉我一下
3，抗体问题

============================================================================================================

您的答复真快呀,谢谢！我的膜蛋白是GABAB受体，二抗稀释度我做过，不同稀释度都没有问题，一抗五月份做的免疫荧光还好着呢。建议的一抗稀释度为1：500~1：1000，我都用到1：200了还没出来。谢谢你，帮我找找看什么原因。

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:13

不知您是否做过膜蛋白，您用的哪家的裂解液，如果是自己配的，可否告知配方及提取过程？**。该裂解液只提膜蛋白还是胞浆蛋白、核蛋白都提了？谢谢！

=========================================

膜蛋白当然做过啊
要看什么膜蛋白
我没有用过单独的膜蛋白抽提试剂
另外胞浆、胞核有专门抽提这些组分的试剂盒
提取过程可以告诉你
以后邮箱用短消息的形式发

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:14

您的答复真快呀,谢谢！我的膜蛋白是GABAB受体，二抗稀释度我做过，不同稀释度都没有问题，一抗五月份做的免疫荧光还好着呢。建议的一抗稀释度为1：500~1：1000，我都用到1：200了还没出来。谢谢你，帮我找找看什么原因。

============================

你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

作者: tuuu2 时间: 2013-2-21 15:14

你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

==================================================================

一抗是abcam的，抗体号是ab75239，裂解液是***的全蛋白RIPA裂解液。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:15

QUOTE:

原帖由 tuuu2 于 2013-2-21 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你用哪家的抗体，抗体号是多少？
用什么裂解液？

==================================================================

一抗是abcam的，抗体号是ab75239，裂解液是***的全蛋白RIPA裂解液。谢谢！ ...

前段时间我一师弟做过这个蛋白
抗体可能不一样
全蛋白裂解液应该能提出这个蛋白
还有抗体有多长时间了？

作者: 33号 时间: 2013-2-21 15:16

各位前辈们，我想咨询一下,B-action 和GAPDH做内参有什么差别呀？细胞的状态对二者的表达有影响吗？为什么我的两株细胞一株B-action 能做出来，可是GAPDH不出来，另一株GAPDH能做出来，action 又不出来。能不能介绍一种所有细胞都表达的内参呀？？谢谢！！！

作者: gmjghh 时间: 2013-2-21 15:17

你好，我是做western的新手，现在在做B-actin摸条件，但是几次下来结果都一样，图在后面。具体步骤是：
1、thermo公司的细胞裂解液+pmsf裂解细胞。BCA试剂盒定量蛋白，2×sds上样缓冲液100度变性10min
2、10%的分离胶，100V电泳
3、100v转磨2小时，冰浴
4、5%脱脂奶封闭2小时
5、I抗sigma的单抗1：3000过夜
6、rockland公司的II抗1：1000 2小时，odyssey显色

我想了好多方面的问题，但是maker是好的，说明胶的配置没有问题，转膜也没有问题，刚开始我以为是I抗的问题，从其他人那里讨了一点做过正常的也不行，如果是封闭的不好，但是背景还是蛮干净的，应该不是封闭的问题。
是不是收集蛋白的时候只加PMSF一种蛋白酶抑制剂不行呢，有蛋白降解了？
谢谢！

图片附件: 19385268.jpg (2013-2-21 15:17, 12.46 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14903

作者: 66+77 时间: 2013-2-21 15:19

我也碰到了像楼上“不高兴和没头脑”一样的问题----“几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。”
太诡异了，同时做了两个膜，一个膜（目的1和内参1）洗的很漂亮，但是另一个膜（目的2和内参2）就整个很亮，还没有条带。两个膜除了用的一抗不一样外，其他条件都是相同的，更郁闷的是前段时间只是内参2出现这种情况，现在传染的目的2这样了（目的2，内参2不久前用一样的条件都洗出来过呀）。到底是咋回事呀，崩溃了。求老师帮忙解救一下啊。

作者: owanaka 时间: 2013-2-21 15:19

请问版主，IOD值怎样确定上样量？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:20

各位前辈们，我想咨询一下,B-action 和GAPDH做内参有什么差别呀？细胞的状态对二者的表达有影响吗？为什么我的两株细胞一株B-action 能做出来，可是GAPDH不出来，另一株GAPDH能做出来，action 又不出来。能不能介绍一种所有细胞都表达的内参呀？？谢谢！！！

==============================

beta-actin，GAPDH，beta-tubulin
在细胞内都有稳定表达

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:20

你好，我是做western的新手，现在在做B-actin摸条件，但是几次下来结果都一样，图在后面。具体步骤是：
1、thermo公司的细胞裂解液+pmsf裂解细胞。BCA试剂盒定量蛋白，2×sds上样缓冲液100度变性10min
2、10%的分离胶，100V电泳
3、100v转磨2小时，冰浴
4、5%脱脂奶封闭2小时
5、I抗sigma的单抗1：3000过夜
6、rockland公司的II抗1：1000 2小时，odyssey显色

我想了好多方面的问题，但是maker是好的，说明胶的配置没有问题，转膜也没有问题，刚开始我以为是I抗的问题，从其他人那里讨了一点做过正常的也不行，如果是封闭的不好，但是背景还是蛮干净的，应该不是封闭的问题。
是不是收集蛋白的时候只加PMSF一种蛋白酶抑制剂不行呢，有蛋白降解了？
谢谢！

=====================

目的蛋白没有提取出来

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:21

我也碰到了像楼上“不高兴和没头脑”一样的问题----“几乎整张膜都发光，像盏黑夜里的明灯，指引我走向失败。”
太诡异了，同时做了两个膜，一个膜（目的1和内参1）洗的很漂亮，但是另一个膜（目的2和内参2）就整个很亮，还没有条带。两个膜除了用的一抗不一样外，其他条件都是相同的，更郁闷的是前段时间只是内参2出现这种情况，现在传染的目的2这样了（目的2，内参2不久前用一样的条件都洗出来过呀）。到底是咋回事呀，崩溃了。求老师帮忙解救一下啊。

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说的具体点

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:21

请问版主，IOD值怎样确定上样量？谢谢

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计算内参IOD值，确定一个标准调整上样量

作者: tie8 时间: 2013-2-21 15:22

请问版主：我做的WB，以前做的还可以，休息2个月换了裂解液（同一个蛋白）ris-HCl: 50 mM, pH 7.4
NP-40: 1%
Na-deoxycholate: 0.25%
0.1%SDS
EDTA: 1 mM
PMSF: 0.5 mM
Aprotinin、1mM， leupeptin、 0.5nM
Na3VO4: 1 mM
NaF: 1 mM
一、二抗都是ABCAM的我用一抗1：10000、二抗1：5000，3%BSA稀释结果没有条带（5%奶粉封闭），整个膜上看到好多荧光成片的曝光出来只是几个点或片；3%BSA封闭能看到条带但整个背景很深，杂带很多。我怀疑我的蛋白提取有问题。我用actin做的内标内标出现条带但也有杂带，而且明显的三条杂带，这是内标多抗本身就会出现的吗？

作者: yonger 时间: 2013-2-21 15:22

前段时间我一师弟做过这个蛋白
抗体可能不一样
全蛋白裂解液应该能提出这个蛋白
还有抗体有多长时间了？

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抗体有半年了。

作者: bring 时间: 2013-2-21 15:23

版主你好：我要提的是胞浆蛋白分泌型的您是否可以提供专门的裂解液，在线等谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:24

请问版主：我做的WB，以前做的还可以，休息2个月换了裂解液（同一个蛋白）ris-HCl: 50 mM, pH 7.4
NP-40: 1%
Na-deoxycholate: 0.25%
0.1%SDS
EDTA: 1 mM
PMSF: 0.5 mM
Aprotinin、1mM， leupeptin、 0.5nM
Na3VO4: 1 mM
NaF: 1 mM
一、二抗都是ABCAM的我用一抗1：10000、二抗1：5000，3%BSA稀释结果没有条带（5%奶粉封闭），整个膜上看到好多荧光成片的曝光出来只是几个点或片；3%BSA封闭能看到条带但整个背景很深，杂带很多。我怀疑我的蛋白提取有问题。我用actin做的内标内标出现条带但也有杂带，而且明显的三条杂带，这是内标多抗本身就会出现的吗？

===============================

裂解液中可以加入150mM NaCl
整个过程中抗体换了吗？
所有的buffer换了吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:25

版主你好：我要提的是胞浆蛋白分泌型的您是否可以提供专门的裂解液，在线等谢谢

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呵呵
没有
分泌型蛋白你可以考虑用ELISA啊

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:28

版主你好：我要提的是胞浆蛋白分泌型的您是否可以提供专门的裂解液，在线等谢谢

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另外你做的是组织还是细胞？
如果组织的话你可以用提取总蛋白的形式来做WB

作者: yapuyapu 时间: 2013-2-21 15:28

抗体没有换，重新稀释的，只换个发光液；我怀疑氯化钠地影响

图片附件: 47492885.snap.jpg (2013-2-21 15:28, 21.17 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14904

作者: jkobn 时间: 2013-2-21 15:39

为什么我做的wb发光的时候看的到目的条带，但是显色时却什么都没有呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:39

抗体没有换，重新稀释的，只换个发光液；我怀疑氯化钠地影响

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目的蛋白都看不清楚在那啊
另外不能光着手拿胶片
整个系统可能有问题

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:39

为什么我做的wb发光的时候看的到目的条带，但是显色时却什么都没有呢？

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胶片有没有过期
显影、定影液重新配置

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-21 15:40

抗体没有换，重新稀释的，只换个发光液；我怀疑氯化钠地影响

目的蛋白都看不清楚在那啊
另外不能光着手拿胶片
整个系统可能有问题

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请问版主，前期怎么检查呀？我是新手，谢谢

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-21 15:42

你好，我是WB的新手，目的蛋白为74KD,66KD,11KD，想请问多克隆一抗和单克隆一抗的稀释液有什么不同吗？我都用的是5%的脱脂奶粉，74KD,66KD以及内参42KD我都是湿转90V，1小时，可是曝光出来只有一个连着一个的黑球球，我也出现过刚涂上发光液时条带很亮但是一会就不行了。特此向NBA老师请教，谢谢!

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-21 15:43

因为是新手，所以一些东西还不是很清楚，我的抗体都是100ul体积的，一般怎么进行分装？

蛋白提取后-80度保存，是分装后每次现用现变性好呢还是变性后放于-20度保存好呢？

想请楼主老师把如何摸索一抗和二抗浓度的步骤说的详细点，谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-2-21 15:54

老师您好：有几个问题请教：
1、我配的电泳液：甘氨酸144.1g，SDS10g，Tris 30.0g，定容到1l为储备液。用了几次均没有发生问题。这几天稀释的时候，室温下是清亮的，放在冰箱里就浑浊了。是怎么回事呀？是SDS的事吗？以前用同一瓶SDS配没发生过这种情况。
2，我做神经受体GABA A受体α1亚单位，分子量：52KD，上样量：80微克；胶浓度：10%,电泳条件：80U，20分钟；120U，60分钟；转膜：50U，70分钟；用PVDF膜，一抗ABCOM的，1：1000稀释，二抗santa，碱性磷酸酶的，1：3000稀释，现出现两个问题：1）表达不明显，是增加上样量？还是调整电涌或转膜时间？2）在43KD处出现明显的条带（我未作封闭），是不是可以用这个条带。因为有时只在这一处出现条带，有的时候在52KD,43KD均出现。
谢谢老师。

作者: ero11 时间: 2013-2-21 15:55

你好，我是WB的新手，目的蛋白为74KD,66KD,11KD，想请问多克隆一抗和单克隆一抗的稀释液有什么不同吗？我都用的是5%的脱脂奶粉，74KD,66KD以及内参42KD我都是湿转90V，1小时，可是曝光出来只有一个连着一个的黑球球，我也出现过刚涂上发光液时条带很亮但是一会就不行了。特此向NBA师请教，谢谢!

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我碰见过这样的情况，我加大一二抗的稀释倍数，尤其二抗就好些。另外可以考虑换一种好一些的发光液

作者: hold住 时间: 2013-2-21 15:55

1，分子量问题看说明书
2，没测定蛋白浓度？不知道上了多少微克啊
3，磷酸化蛋白注意蛋白提取时加入磷酸酶抑制剂
4，背景问题需要认真解决

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说明书上是说分子量43KD，那应该就是这么大了。后来我又新收了一批蛋白，用得是碧云天的P0013的裂解液，只含矾酸钠一种磷酸酶抑制剂，此外我还另加了PMSF。测了浓度是2ug/ul，上样40ug，用5%BSA封闭的，一抗1：1000，4度过夜，二抗1：10000，室温2h。曝光后结果和考染差不多，背景倒是没有了，但是基本上所有的条带都出来了，太明显了。当然目的条带也挺明显，可是这样的图没办法用啊。怎么办嘞！
麻烦了^^

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:56

你好，我是WB的新手，目的蛋白为74KD,66KD,11KD，想请问多克隆一抗和单克隆一抗的稀释液有什么不同吗？我都用的是5%的脱脂奶粉，74KD,66KD以及内参42KD我都是湿转90V，1小时，可是曝光出来只有一个连着一个的黑球球，我也出现过刚涂上发光液时条带很亮但是一会就不行了。特

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1，上样量太大
2，抗体浓度不合适
3，多克隆与单克隆抗体的稀释度要根据不同的抗体来说，每支抗体稀释度都是不同的
4，加大二抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:56

因为是新手，所以一些东西还不是很清楚，我的抗体都是100ul体积的，一般怎么进行分装？

蛋白提取后-80度保存，是分装后每次现用现变性好呢还是变性后放于-20度保存好呢？

想请楼主老师把如何摸索一抗和二抗浓度的步骤说的详细点，谢谢！

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蛋白样品-80度保存较好
抗体在-20度条件下结冰吗？如果不结冰就不用分装
一抗二抗的稀释度要看你抗体的说明书，说明书会有推荐的稀释度，用它推荐的稀释度做预实验

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:57

老师您好：有几个问题请教：
1、我配的电泳液：甘氨酸144.1g，SDS10g，Tris 30.0g，定容到1l为储备液。用了几次均没有发生问题。这几天稀释的时候，室温下是清亮的，放在冰箱里就浑浊了。是怎么回事呀？是SDS的事吗？以前用同一瓶SDS配没发生过这种情况。
2，我做神经受体GABA A受体α1亚单位，分子量：52KD，上样量：80微克；胶浓度：10%,电泳条件：80U，20分钟；120U，60分钟；转膜：50U，70分钟；用PVDF膜，一抗ABCOM的，1：1000稀释，二抗santa，碱性磷酸酶的，1：3000稀释，现出现两个问题：1）表达不明显，是增加上样量？还是调整电涌或转膜时间？2）在43KD处出现明显的条带（我未作封闭），是不是可以用这个条带。因为有时只在这一处出现条带，有的时候在52KD,43KD均出现。
谢谢老师。

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1，不用放在冰箱，SDS在4度会析出
2，看说明书这些条带出现位置是否正确

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:57

最近western 出了点问题，希望版主指点一下，看附件。

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上样体积有些大了
另外感觉你的溴酚蓝加的多了
拔梳子的时候是否前后动过？拔梳子切记不能前后动，只能左右动拔出梳子

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:57

说明书上是说分子量43KD，那应该就是这么大了。后来我又新收了一批蛋白，用得是碧云天的P0013的裂解液，只含矾酸钠一种磷酸酶抑制剂，此外我还另加了PMSF。测了浓度是2ug/ul，上样40ug，用5%BSA封闭的，一抗1：1000，4度过夜，二抗1：10000，室温2h。曝光后结果和考染差不多，背景倒是没有了，但是基本上所有的条带都出来了，太明显了。当然目的条带也挺明显，可是这样的图没办法用啊。怎么办嘞！
麻烦了^^

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1，一抗浓度不合适
2，一抗特异性不好
3，封闭等用BSA

作者: xingyi08 时间: 2013-2-21 15:58

楼主您好
分子量130KD的蛋白我用半干转 20V 1h45min PVDF膜上可见marker 但是胶考染后仍有条带这种现象正常吗？是不是应该全部转完才好？
非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-2-21 15:58

楼主您好
分子量130KD的蛋白我用半干转 20V 1h45min PVDF膜上可见marker 但是胶考染后仍有条带这种现象正常吗？是不是应该全部转完才好？
非常感谢

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130K的蛋白我会选择湿转
300mA 2h

作者: mamamiya 时间: 2013-2-21 15:59

请问楼主怎样可以曝出很干净的片子，除了封闭和抗体浓度外还要注意些什么？甲醇激活PVDF膜的时间长短对转膜效果会有很大影响吗？

作者: youyou99 时间: 2013-2-21 15:59

你好，想请教你个问题：我的目标蛋白一个是26kd的，一个是18kd的，用的内参是β-actin分子量是43kd的，这三种蛋白我一起湿转，100V，25min。结果43kd的和18kd的都转出来了，就是26kd的没转出来。转膜液是Tris，甘氨酸，水，和20%甲醇。膜是pvdf膜。应该不是贴膜的问题，因为膜的面积很大。请问你这事怎么回事啊，急啊！

作者: 831226 时间: 2013-2-21 16:00

各位前辈，请问我以前用过的脱脂奶粉，今年五月份就过期了，现在接着用对实验有没有影响？

作者: 831226 时间: 2013-2-21 16:00

各位前辈，我半干转后发现滤纸之间有许多小泡，尤其是最低的滤纸和石墨之间，这样对转膜有什么影响吗？是不是我以前内参变形跟这个有关系呀？有没有什么办法可以改进一下？我每次都很认真的赶气泡了，还是有.

作者: DDD 时间: 2013-2-21 16:01

我是早上现磨的心肌组织，共6组。下午测浓度，都很顺利。但是测完浓度样品加入Loading Buffer热变性后，有三组的样品变成了黄绿色，而其他三组还是正常的蓝色。

Loading buffer是好的，考虑是蛋白出问题。准备明天重新磨组织再看看。但是不知道是什么原因？？？还望各位指点。

作者: wood533 时间: 2013-2-21 16:03

有个问题请教楼主：

我按照你介绍选择二抗稀释倍数的方法

做了二抗点样NC膜之后DAB显色的试验

结果如图所示，请问我应该选择哪一个做为我二抗的稀释倍数呢

标示的数值对应的稀释倍数为

1、1：2500

2、1：4000

3、1：5000

4、1：6000

5、1：8000

6、1：10000

7、1：20000

请帮我看看方法对不对，并帮我选择一下合适的二抗稀释倍数

另外我对一抗的稀释度还不清楚，该怎么做呢？

图片附件: 57755299.jpg (2013-2-21 16:04, 20.46 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14906

作者: 2541 时间: 2013-2-21 16:15

今天转膜发生了一件奇怪的事：
转膜条件和以前一样，半干转，20V，1h
转膜之前，胶上有Maker
转膜之后，胶上，膜上都没有Maker了，下层滤纸上也看不见。
具体有没有转上，要看明天的显影结果了。

这是怎么回事呢？
很是疑惑。。。
请教了，谢谢~

作者: 831226 时间: 2013-2-21 16:16

请教高手一个问题，我们实验室的同学告诉我说如果第一次发光不理想，可以把膜洗洗，重新加上发光液，再次发光，（不是加抗体，只加发光液），并且他们说可以发出来，我试了一次，没有发出来，并且从理论上来讲，好像也是讲不通的，因为发光也不是和二抗反应吗？能把发光液洗掉吗？不知道有没有战友这样做过，多谢！！！！

作者: utt0989 时间: 2013-2-21 16:16

本人做了WB一段时间，只是现在想要数据处理了，我用的是ECL曝光之后，那X胶片就放着，扫描了一下，然后用quantity one软件处理，这样可以吗？
最近知道有人用凝胶成像系统，CCD照相，这个是在曝光的时候照的相还是最后将X胶片放进去用自带的软件进行数据处理？
谢了！

作者: 987789 时间: 2013-2-21 16:17

请问楼主怎样可以曝出很干净的片子，除了封闭和抗体浓度外还要注意些什么？甲醇激活PVDF膜的时间长短对转膜效果会有很大影响吗？

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漂亮的片子得看整个系统

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:17

你好，f想请教你个问题：我的目标蛋白一个是26kd的，一个是18kd的，用的内参是β-actin分子量是43kd的，这三种蛋白我一起湿转，100V，25min。结果43kd的和18kd的都转出来了，就是26kd的没转出来。转膜液是Tris，甘氨酸，水，和20%甲醇。膜是pvdf膜。应该不是贴膜的问题，因为膜的面积很大。请问你这事怎么回事啊，急啊！

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43K的都出来了26K可能没转出来
你用什么方法确定有没有转出来？

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:18

各位前辈，请问我以前用过的脱脂奶粉，今年五月份就过期了，现在接着用对实验有没有影响？

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再买一包新的

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:19

各位前辈，我半干转后发现滤纸之间有许多小泡，尤其是最低的滤纸和石墨之间，这样对转膜有什么影响吗？是不是我以前内参变形跟这个有关系呀？有没有什么办法可以改进一下？我每次都很认真的赶气泡了，还是有.

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气泡的问题你可以这样解决
加缓冲液，放滤纸，再加缓冲液，放膜.....每步都加上缓冲液进行

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:19

我是早上现磨的心肌组织，共6组。下午测浓度，都很顺利。但是测完浓度样品加入Loading Buffer热变性后，有三组的样品变成了黄绿色，而其他三组还是正常的蓝色。

Loading buffer是好的，考虑是蛋白出问题。准备明天重新磨组织再看看。但是不知道是什么原因？？？还望各位指点。

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是不是变性时污染了

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:20

有个问题请教楼主：

我按照你介绍选择二抗稀释倍数的方法

做了二抗点样NC膜之后DAB显色的试验

结果如图所示，请问我应该选择哪一个做为我二抗的稀释倍数呢

标示的数值对应的稀释倍数为

1、1：2500

2、1：4000

3、1：5000

4、1：6000

5、1：8000

6、1：10000

7、1：20000

请帮我看看方法对不对，并帮我选择一下合适的二抗稀释倍数

另外我对一抗的稀释度还不清楚，该怎么做呢？

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我会选择5或者6

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:21

今天转膜发生了一件奇怪的事：
转膜条件和以前一样，半干转，20V，1h
转膜之前，胶上有Maker
转膜之后，胶上，膜上都没有Maker了，下层滤纸上也看不见。
具体有没有转上，要看明天的显影结果了。

这是怎么回事呢？
很是疑惑。。。
请教了，谢谢~

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用丽春红染色看看啊

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:21

请教高手一个问题，我们实验室的同学告诉我说如果第一次发光不理想，可以把膜洗洗，重新加上发光液，再次发光，（不是加抗体，只加发光液），并且他们说可以发出来，我试了一次，没有发出来，并且从理论上来讲，好像也是讲不通的，因为发光也不是和二抗反应吗？能把发光液洗掉吗？不知道有没有战友这样做过，多谢！！！！

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可以
做过很多次
二抗中HRP催化ECL中的底物发光哦
你同学的意思是：有条带，但是不理想，你可以这样做
如果是什么都没有，再怎么加ECL都是没用的

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:22

本人做了WB一段时间，只是现在想要数据处理了，我用的是ECL曝光之后，那X胶片就放着，扫描了一下，然后用quantity one软件处理，这样可以吗？
最近知道有人用凝胶成像系统，CCD照相，这个是在曝光的时候照的相还是最后将X胶片放进去用自带的软件进行数据处理？
谢了！

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我会用CCD照相或者扫描
用ImageQuant TL软件读取IOD值
Quantity One我没用过
我们可以一起探讨

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:22

我会用CCD照相或者扫描
用ImageQuant TL软件读取IOD值
Quantity One我没用过
我们可以一起探讨

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恩扫描的话直接用ImageQuant TL软件可以直接读出灰度值来了吗？

作者: u234 时间: 2013-2-21 16:23

请问楼主，常规湿转时间太长了，你对快速转膜有什么了解吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:25

恩扫描的话直接用ImageQuant TL软件可以直接读出灰度值来了吗？

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现在还用灰度呢？
都用光密度了

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:25

请问楼主，常规湿转时间太长了，你对快速转膜有什么了解吗？

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了解一点
Invitrogen有快速转膜的仪器
听说是好像是7min
但是我没用过
不知道靠谱不

作者: star#room 时间: 2013-2-21 16:26

楼主，您好！我想请教您一个问题：我现在做的目的蛋白是VEGF，内参是tubulin，转膜条件为200mA 2h。刚开始做的时候我先摸了一下抗体浓度，VEGF：一抗 R&D的1：500；二抗 milinpore的1：1000；tubulin一抗博奥森的1：300；二抗 milinpore的1：1000；这个条件出来带了，而且挺明显的。后来我就直接用这个浓度做。其他条件都没有改变，可是就是出不来带，郁闷的是连tubulin也没有出来。请各位高手帮我解答一下，不胜感激！！

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:27

楼主，您好！我想请教您一个问题：我现在做的目的蛋白是VEGF，内参是tubulin，转膜条件为200mA 2h。刚开始做的时候我先摸了一下抗体浓度，VEGF：一抗 R&D的1：500；二抗 milinpore的1：1000；tubulin一抗博奥森的1：300；二抗 milinpore的1：1000；这个条件出来带了，而且挺明显的。后来我就直接用这个浓度做。其他条件都没有改变，可是就是出不来带，郁闷的是连tubulin也没有出来。请各位高手帮我解答一下，不胜感激！！

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1，抗原、抗体可能降解了（反复冻融等）
2，缓冲液新配

作者: jujuba 时间: 2013-2-21 16:28

谢谢楼主慷慨解答！但是我还有一个问题：摸浓度和我现在做wb就相差几天，抗体也是新定不就，所以我觉得应该好像不是抗体降解的问题。还有楼主说的缓冲液是电转液嘛？我液是新配的。呵呵楼主能再帮我想想还有可能是什么问题嘛？谢谢！！！

作者: is2011 时间: 2013-2-21 16:28

版主你好，请问怎样确定我的一抗有没有问题呢？

作者: orangecake 时间: 2013-2-21 16:29

请教楼主一个问题，我的74KD,66KD,及内参42KD的转膜条件都是90V，90mins。但是丽春红染色出来条带好像不是很明显，蛋白上样量是15ug。楼主帮我看看转膜条件合不合适。谢谢！

作者: yjf1026 时间: 2013-2-21 16:29

请问版主：这是我的问题（有两张图），请帮我看看，谢谢！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15622038&sty=3')

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:30

谢谢楼主慷慨解答！但是我还有一个问题：摸浓度和我现在做wb就相差几天，抗体也是新定不就，所以我觉得应该好像不是抗体降解的问题。还有楼主说的缓冲液是电转液嘛？我液是新配的。呵呵楼主能再帮我想想还有可能是什么问题嘛？谢谢！！！

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样品缓冲液
抗原有反复冻融吗

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:30

版主你好，请问怎样确定我的一抗有没有问题呢？

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用阳性对照样品来做

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:30

请教楼主一个问题，我的74KD,66KD,及内参42KD的转膜条件都是90V，90mins。但是丽春红染色出来条带好像不是很明显，蛋白上样量是15ug。楼主帮我看看转膜条件合不合适。谢谢！

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转膜我用恒流：300mA，1h30min
上样量15ug你是组织蛋白还是细胞蛋白？

作者: jujuba 时间: 2013-2-21 16:31

1，一抗浓度不合适
2，一抗特异性不好
3，封闭等用BSA

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我用的一抗是能交叉抗人、兔和小鼠的，是多抗吧？我试了几个一抗浓度，1：1000感觉条带不怎么清晰，1：4000基本没有条带了，1：2000效果相对最好，目的条带和杂带都很清晰，但杂带太多，虽然背景不太脏，但泳道中上下每条带之间都不干净，有点黑。我用的二抗始终是1：10000，是不是还需要摸一下二抗的浓度嘞？我二抗洗一小时的，每次5min。

作者: tangxin_80 时间: 2013-2-21 16:31

楼主你好，今天问了同学她建议我恒流250mA，2小时；我今天用你的转膜条件做一次。我的是组织蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:32

我用的一抗是能交叉抗人、兔和小鼠的，是多抗吧？我试了几个一抗浓度，1：1000感觉条带不怎么清晰，1：4000基本没有条带了，1：2000效果相对最好，目的条带和杂带都很清晰，但杂带太多，虽然背景不太脏，但泳道中上下每条带之间都不干净，有点黑。我用的二抗始终是1：10000，是不是还需要摸一下二抗的浓度嘞？我二抗洗一小时的，每次5min。

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不是说和人、兔和小鼠有甲叉反应就是多抗
要看抗体来源，说明书上有说明的
背景问题增加洗膜次数
特异性不好只能是换一抗了

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:32

楼主你好，今天问了同学她建议我恒流250mA，2小时；我今天用你的转膜条件做一次。我的是组织蛋白。

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那你先试试这个条件吧

作者: huifeng0516 时间: 2013-2-21 16:33

版主你好，考染没看到目的蛋白，能继续往下做吗？

作者: wood533 时间: 2013-2-21 16:34

您好，我做WB跑胶时，看加的样品跑的弥散，最后发光整个泳道都有显色，您说这是蛋白样品的问题，还是其他的什么问题呢？特此向NBA老师请教，谢谢!

作者: sunnyB 时间: 2013-2-21 16:36

您好，请问，分子量180KD的蛋白，用的彩虹Marker指示部分为分子量73KD的蛋白已经跑到胶底，电流为10mA，这是停止电游。转膜用的半干转，40mA1.5小时，后45mA30min。可是免疫反应后没有条带，大家都说是蛋白没有转上去。请帮忙分析一下原因。另外，我下次做的时候，电泳和转模时，电压，电流时间要多久呢。听说分子量打的用湿转比较好，半干转可以么。谢谢！

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-21 16:36

版主，您好！WB中膜上用丽春红染色可以看到目的蛋白条带，但是经过免疫反应以后，却什么也曝不出来，在暗室里也看不到亮亮的条带和背景，能帮忙分析下原因么？
PS：1.目的蛋白：27KD，
2.一抗：1：200 二抗：1：3000
3.显影定影液体都是新配的，没有问题。
谢谢您的解答

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:37

版主你好，考染没看到目的蛋白，能继续往下做吗？

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不建议你往下做

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:37

您好，我做WB跑胶时，看加的样品跑的弥散，最后发光整个泳道都有显色，您说这是蛋白样品的问题，还是其他的什么问题呢？特此向NBA老师请教，谢谢!

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蛋白SDS-PAGE染胶结果如何？

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:39

您好，请问，分子量180KD的蛋白，用的彩虹Marker指示部分为分子量73KD的蛋白已经跑到胶底，电流为10mA，这是停止电游。转膜用的半干转，40mA1.5小时，后45mA30min。可是免疫反应后没有条带，大家都说是蛋白没有转上去。请帮忙分析一下原因。另外，我下次做的时候，电泳和转模时，电压，电流时间要多久呢。听说分子量打的用湿转比较好，半干转可以么。谢谢！

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是不是膜蛋白？
膜蛋白不太好做
另外转膜建议湿转：300mA 2h或者2h30min

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:40

版主，您好！WB中膜上用丽春红染色可以看到目的蛋白条带，但是经过免疫反应以后，却什么也曝不出来，在暗室里也看不到亮亮的条带和背景，能帮忙分析下原因么？
PS：1.目的蛋白：27KD，
2.一抗：1：200 二抗：1：3000
3.显影定影液体都是新配的，没有问题。
谢谢您的解答

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蛋白名称告诉我
一抗是什么告诉我：货号及厂家

作者: eric930 时间: 2013-2-21 16:41

你好，
从组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳，400mA 10v 28min半干转，5%脱脂奶粉37度摇床封闭1小时，一抗 1：500 1%脱脂奶粉稀释（5%脱脂奶粉200+800TBST） 4°C孵过夜，国产二抗1：1000（已经做出来蛋白的条件），现在做的是相同的蛋白不同的组织。 37度摇床1小时。TBST洗膜3*10min（2抗后洗6*15min）。发光剂是碧云天ECL PLUS。
一抗 1：500 无条带
一抗 1：300 有的孔道有条带有些没有
做内参1：100到1：400 （效价低）也是同样的问题
染色后孔道都有清晰的带分开的不错（就是带很细）
请问fangweibin119
可能是那里出问题了？该如何解决

作者: remenb 时间: 2013-2-21 16:41

目的基因是核蛋白可以提总蛋白做出来吗，怎么检测提出来的蛋白的质量?PPARγ做过吗？
老师觉得AP显色怎么样

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:42

从组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳，400mA 10v 28min半干转，5%脱脂奶粉37度摇床封闭1小时，一抗 1：500 1%脱脂奶粉稀释（5%脱脂奶粉200+800TBST） 4°C孵过夜，国产二抗1：1000（已经做出来蛋白的条件），现在做的是相同的蛋白不同的组织。 37度摇床1小时。TBST洗膜3*10min（2抗后洗6*15min）。发光剂是碧云天ECL PLUS。
一抗 1：500 无条带
一抗 1：300 有的孔道有条带有些没有
做内参1：100到1：400 （效价低）也是同样的问题
染色后孔道都有清晰的带分开的不错（就是带很细）
请问fangweibin119
可能是那里出问题了？该如何解决

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加大上样量
内参抗体这么低的效价怎么往下做啊
内参抗体用量大
建议买其他厂家的

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:42

目的基因是核蛋白可以提总蛋白做出来吗，怎么检测提出来的蛋白的质量?PPARγ做过吗？
老师觉得AP显色怎么样

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我做的是PPAR-1 cleaved25蛋白
AP显色敏感性低
建议提取核蛋白

作者: zsxan1990 时间: 2013-2-21 16:43

请教版主各百分比的胶的配方，谢谢.
又：我跑胶时marker的第一条带老是看不见，是什么原因呢？

作者: abc816 时间: 2013-2-21 16:45

我加大以一下抗体浓度就出来带拉哈哈tubulin可能是效价较低，我用到1：100，二抗改为1：500，一抗过夜就OK拉。呵呵谢谢版主哦

作者: 04906 时间: 2013-2-21 16:48

碧云天的ECL plus 太强了，我建议你换一种了。我也用的碧云天的ECL plus 试用版，实在是太强了，把背景弄的很深，看不清楚目的条带~

作者: redbutterfly 时间: 2013-2-21 16:52

请教！为什么我的片子上会有这么多点点状的脏东西？同一张膜使用别的抗体和二抗曝出来都是没有问题，条带很清晰的。

图片附件: 40731229.snap.jpg (2013-2-21 16:52, 8 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14907

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:53

碧云天的ECL plus 太强了，我建议你换一种了。我也用的碧云天的ECL plus 试用版，实在是太强了，把背景弄的很深，看不清楚目的条带~

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呵呵
你建议我换一种吗？
弄糊涂了

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:54

可能是一抗的问题

作者: remenb 时间: 2013-2-21 16:56

我做Western Blot结果不稳定（有时有条带有时没得，背景时好时坏），现在我在想到底是抗体的原因还是转膜的原因；因为回想这一个月十几次Western Blot，我注意到我恒压转膜对应电流状态好时有180mA，然后掉到150mA（转膜10min的样子），或者是150mA然后120mA，最近150mA然后60或70mA（都是转膜10min左右后的变化）。有次试着用恒流转膜（200mA），对应电压大概180-190V的样子，结果转膜Marker条带非常不清晰，用丽春红染色后只见泳道不见蛋白条带。
现在兄弟很抓狂，不知如何分析改进？
请教了实验室的能人，建议重配转膜液和换转膜的装置；我转膜液前后已配了4，5次，装置也用的是实验室公用的，所以很迷茫。望不吝赐教！

作者: windy+++ 时间: 2013-2-21 16:56

老师，想求教一下转膜效率的问题！

两个上样量相同的样品A和B，分别跑两块胶，分别用两个三明治在同一个槽里湿转，随后的封闭，一抗，二抗和显色均是平行做的，重复几次后发现，杂同一个蛋白，一次是A的水平高下一次就又反过来了，因为样本量多和其他原因所以A和B没法在同一张膜上做，比较迷惑，1，是不是应该在两个槽里同时湿转？2，我三明治做的有问题？

谢谢您，耽误您的时间了！

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:57

QUOTE:

原帖由 windy+++ 于 2013-2-21 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
老师，想求教一下转膜效率的问题！

两个上样量相同的样品A和B，分别跑两块胶，分别用两个三明治在同一个槽里湿转，随后的封闭，一抗，二抗和显色均是平行做的，重复几次后发现，杂同一个蛋白，一次是A的水平高下一次就又反过来了，因为样 ...

1，涉及到蛋白定量问题：蛋白定量不准确
2，调整蛋白浓度问题
3，整个操作过程中的误差
建议你用内参来校正

作者: NBA 时间: 2013-2-21 16:57

我做Western Blot结果不稳定（有时有条带有时没得，背景时好时坏），现在我在想到底是抗体的原因还是转膜的原因；因为回想这一个月十几次Western Blot，我注意到我恒压转膜对应电流状态好时有180mA，然后掉到150mA（转膜10min的样子），或者是150mA然后120mA，最近150mA然后60或70mA（都是转膜10min左右后的变化）。有次试着用恒流转膜（200mA），对应电压大概180-190V的样子，结果转膜Marker条带非常不清晰，用丽春红染色后只见泳道不见蛋白条带。
现在兄弟很抓狂，不知如何分析改进？
请教了实验室的能人，建议重配转膜液和换转膜的装置；我转膜液前后已配了4，5次，装置也用的是实验室公用的，所以很迷茫。望不吝赐教！

=========================

肯定不是抗体的原因
我喜欢用恒流转膜 300mA
你的整个体系有问题
不是一两句话能说清楚的

作者: huifeng0516 时间: 2013-2-21 16:58

老师，还有一个问题：

新定的Abnova公司多抗，说明书里的图片显示在小鼠脑匀浆里可杂出53KD左右的目的条带，但我用同样的组织却杂出60多的特异条带，很亮，53KD处无清晰条带，这个可能是目的条带吗？如果是杂带，是否应该提高一抗浓度来探目的条带？

谢谢您的赐教！

作者: 831226 时间: 2013-2-21 16:58

特异性很强的话我认为它就是目的条带
53K与60K位置差别不是很大的
不用再提高一抗浓度了

作者: huifeng0516 时间: 2013-2-21 16:59

感谢NBA如此及时的回答！

麻烦您再帮我看一下，由于样品有限，我试图用湿转95V 1hr20min左右同时转18KD到86-100KD的一系列蛋白，大的蛋白能杂出，但18k的蛋白总是不好，如图所示，1-14道有的有信号有的没有，这是因为转过了吗？如果是，您有什么好的建议吗？

再次感谢您耐心的解答！

图片附件: 51706654.jpg (2013-2-21 16:59, 13.17 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14908

作者: glass 时间: 2013-2-21 17:00

肯定不是抗体的原因
我喜欢用恒流转膜 300mA
你的整个体系有问题
不是一两句话能说清楚的

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谢谢老师给我指出问题，能不能说具体些?!
兄弟现在是有力也用不上，尽是作无用功啊！

作者: duoduo 时间: 2013-2-21 17:00

请问老师做过nNOS吗，分子量是150KD，内参每次都可以做出来，就是没有目的条带，以前用的是10%的分离胶，现在用6%的分离胶还是做不出来，请老师给指点一下迷津！非常感谢!

作者: 3648755 时间: 2013-2-21 17:00

老师您好我想问您一下，WB产生非特异性的条带的原因有哪些？发光液的量过多会产生非特异条带吗？我今天曝光后见胶片上出现可见得泳道和一些小杂带（可以看到正常带的形状），不知道原因在那？还有预电泳（不上样提前跑了1小时）会对蛋白有何影响？转膜的时候蛋白会弥散吗？谢谢

作者: S6044 时间: 2013-2-21 17:01

老师，请教一下，为什么Western显影以后，背景总是很脏？常见的原因有哪些？应该在实验中注意什么？

作者: remenb 时间: 2013-2-21 17:02

cos, MSTO-211H, SW620细胞一般采用什么作为内参？我用的是GAPDH可以么？

作者: am10 时间: 2013-2-21 17:02

师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装-20度保存。
我的样品才提了3天，所以我觉得应该不会是已经发生变质了，难道使用之前还要进行离心吗，可是我已经分装了，每一管才30ul，请问应该是什么问题，如何解决，谢谢了！

作者: yjf1026 时间: 2013-2-21 17:03

组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳.10v 28min 半干转。
染色可见清晰分离好的条带。
孵抗后显影就是不见条带（有时见1.2孔条带，我一般上4-6孔）
内参可见条带（1抗是1：200 2抗是1：2000）。
请问老师实验那里出问题了该如何解决？谢谢。

作者: duoduo 时间: 2013-2-21 17:04

想问一个关于制抗体方面的问题，我要合成一个13个氨基酸的小肽，之后制它的抗体，问了一下上海生工，他们可以合成，但是因为小肽太小，要偶联一个BSA之类的蛋白才能打兔子制抗体。我看国外的文献又用17个氨基酸的小肽直接制抗体的，不知国内的公司是不是都要偶联蛋白，还有哪个公司做这方面比较强的？

作者: tianmei001 时间: 2013-2-21 17:04

蛋白爆出光来呈现月牙形是怎么回事？好像和邻近的泳道有交联，还有就是常说的蛋白弥散是怎么一回事？电泳的电流过高会出现吗？如130毫安谢谢楼主

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-21 17:04

请问实验结果的灰度值用什么软件可以测啊谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:05

麻烦您再帮我看一下，由于样品有限，我试图用湿转95V 1hr20min左右同时转18KD到86-100KD的一系列蛋白，大的蛋白能杂出，但18k的蛋白总是不好，如图所示，1-14道有的有信号有的没有，这是因为转过了吗？如果是，您有什么好的建议吗？

再次感谢您耐心的解答！

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用0.22 um的膜试试
小蛋白容易转过

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:07

请问老师做过nNOS吗，分子量是150KD，内参每次都可以做出来，就是没有目的条带，以前用的是10%的分离胶，现在用6%的分离胶还是做不出来，请fangweibin119 老师给指点一下迷津！非常感谢!

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1，我做过NOS
2，检查你的转膜条件
3，加大上样量，调整抗体浓度
4，换一抗

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:07

老师您好我想问您一下，WB产生非特异性的条带的原因有哪些？发光液的量过多会产生非特异条带吗？我今天曝光后见胶片上出现可见得泳道和一些小杂带（可以看到正常带的形状），不知道原因在那？还有预电泳（不上样提前跑了1小时）会对蛋白有何影响？转膜的时候蛋白会弥散吗？谢谢

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1，具体的东西在网上你可以搜一下，有很多
2，ECL敏感性高会有非特异性条带产生

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:08

cos, MSTO-211H, SW620细胞一般采用什么作为内参？我用的是GAPDH可以么？

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可以
还有beta-actin
beta-tubulin

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:09

师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装-20度保存。
我的样品才提了3天，所以我觉得应该不会是已经发生变质了，难道使用之前还要进行离心吗，可是我已经分装了，每一管才30ul，请问应该是什么问题，如何解决，谢谢了！

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变性后，上样之前短暂离心，取上清电泳
（蛋白浓度多大？）

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:09

组织提的蛋白，分子量52kd，上样量60ug，80v，120v电泳.10v 28min 半干转。
染色可见清晰分离好的条带。
孵抗后显影就是不见条带（有时见1.2孔条带，我一般上4-6孔）
内参可见条带（1抗是1：200 2抗是1：2000）。
请问老师实验那里出问题了该如何解决？谢谢。

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目的蛋白定位
上样量
抗体质量

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:09

想问一个关于制抗体方面的问题，我要合成一个13个氨基酸的小肽，之后制它的抗体，问了一下上海生工，他们可以合成，但是因为小肽太小，要偶联一个BSA之类的蛋白才能打兔子制抗体。我看国外的文献又用17个氨基酸的小肽直接制抗体的，不知国内的公司是不是都要偶联蛋白，还有哪个公司做这方面比较强的？

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一般都会偶联BSA或者KLH、OVA

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:10

蛋白爆出光来呈现月牙形是怎么回事？好像和邻近的泳道有交联，还有就是常说的蛋白弥散是怎么一回事？电泳的电流过高会出现吗？如130毫安谢谢楼主

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电泳时我一般采用稳压
电泳时过热
或者抗体孵育不完全都有可能造成

作者: NBA 时间: 2013-2-21 17:10

请问实验结果的灰度值用什么软件可以测啊谢谢

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上网搜搜
我一般用ImageQuant TL来读光密度

作者: utt0989 时间: 2013-2-21 17:10

1，具体的东西在网上你可以搜一下，有很多
2，ECL敏感性高会有非特异性条带产生

请问怎么样才能降低因为ECL敏感性高而产生的非特异性条带呢？

作者: utt0989 时间: 2013-2-21 17:11

还想请问下，电泳过程中底下不能压成一条线是什么原因？谢谢

作者: INK 时间: 2013-2-21 17:12

您好，请问下我想要提大鼠的脑组织蛋白，我是否可以今天裂解匀浆然后存放在-20°C然后我明天再哪去离心和测蛋白浓度，可以么？还有，我想问一下就是我裂解匀浆的时候20分钟裂解匀浆，然后再冰水里放30分钟，您看条件合适么？

作者: INK 时间: 2013-2-21 17:12

1，具体的东西在网上你可以搜一下，有很多
2，ECL敏感性高会有非特异性条带产生

请问怎么样才能降低因为ECL敏感性高而产生的非特异性条带呢？

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提高抗体稀释度

作者: INK 时间: 2013-2-21 17:13

还想请问下，电泳过程中底下不能压成一条线是什么原因？谢谢

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溴酚蓝在分离胶中跑到下半部会弥散

作者: yjf1026 时间: 2013-2-22 15:07

变性后，上样之前短暂离心，取上清电泳
（蛋白浓度多大？）

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版主您好！想向您请教一下具体的原理？因为我们实验室常规在电泳之前都要震荡混匀，我很困惑2种方法哪个对？谢谢！

作者: orangecake 时间: 2013-2-22 15:07

我用楼主的湿转条件300mA，90mins，转膜很成功！
上样量10微克蛋白，组织中提取的蛋白！做出来的内参如图！
但是目的蛋白有两个孔有很淡的条带！其余孔没有条带！是上样量太少了吗？要加大上样量或是增加目的蛋白抗体的浓度，这次目的蛋白一抗为1：1000；
进暗室曝光时，根本看不到条带，所以内参和目的蛋白一起共曝了10分钟！可结果竟然有条带！搞不懂为什么？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14927

作者: orangecake 时间: 2013-2-22 15:12

下面是目的蛋白，曝光时内参和目的蛋白没有对齐，目的蛋白应该再向右一点的，这样就和内参对应上了。内参一抗：1：2000；目的蛋白一抗：1：1000（推荐浓度）；二抗：1：10000

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14928

作者: mickeylin 时间: 2013-2-22 15:14

溴酚蓝在分离胶中跑到下半部会弥散

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但是有时是可以压成一条线的？会不会跟Tris-HCL的pH有关系呢？

作者: flower-201 时间: 2013-2-22 15:15

实验进展不好，84，91目的条带有。但内参和25，46的条带无论如何出不来。
标本量有限，增大上样量已不可能，应该怎么办？
用的抗体是CELLSIGNAL的。一抗推荐1：1000不变
二抗1：1000-3000
是哪里出了问题？
能给个解决问题的思路么

作者: duoduo 时间: 2013-2-22 15:15

你好，我想问一个问题：
我在转膜的时候如果一个转膜槽中转两块胶的话，那么靠近负极的那板老是转不好，就是像被水冲散了一样，是怎么一回事呢？
请帮忙回答，谢谢。

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:30

1，具体的东西在网上你可以搜一下，有很多
2，ECL敏感性高会有非特异性条带产生

请问怎么样才能降低因为ECL敏感性高而产生的非特异性条带呢？

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1，换用敏感性低的ECL
2，降低一抗、二抗的浓度

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:32

版主您好！想向您请教一下具体的原理？因为我们实验室常规在电泳之前都要震荡混匀，我很困惑2种方法哪个对？谢谢！

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SDS容易有沉淀，融化之后混匀
然后离心把杂志去掉

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:33

我用楼主的湿转条件300mA，90mins，转膜很成功！
上样量10微克蛋白，组织中提取的蛋白！做出来的内参如图！
但是目的蛋白有两个孔有很淡的条带！其余孔没有条带！是上样量太少了吗？要加大上样量或是增加目的蛋白抗体的浓度，这次目的蛋白一抗为1：1000；
进暗室曝光时，根本看不到条带，所以内参和目的蛋白一起共曝了10分钟！可结果竟然有条带！搞不懂为什么？

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应该在暗室加ECL

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:33

但是有时是可以压成一条线的？会不会跟Tris-HCL的pH有关系呢？

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样品缓冲液用的是6.8
电泳缓冲液一般是8.3
应该没问题
另外不要注意这个，而要注意染胶及转膜后染膜结果

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:34

实验进展不好，84，91目的条带有。但内参和25，46的条带无论如何出不来。
标本量有限，增大上样量已不可能，应该怎么办？
用的抗体是CELLSIGNAL的。一抗推荐1：1000不变
二抗1：1000-3000
是哪里出了问题？
能给个解决问题的思路么

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内参都做不出来你还做目的蛋白啊？
先把内参做好
换抗体

作者: H2O 时间: 2013-2-22 15:34

你好，我想问一个问题：
我在转膜的时候如果一个转膜槽中转两块胶的话，那么靠近负极的那板老是转不好，就是像被水冲散了一样，是怎么一回事呢？
请帮忙回答，谢谢。

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我没碰到过这样的问题
如果一块好一块不好，你可以考虑转移槽的问题

作者: wood533 时间: 2013-2-22 15:35

内参都做不出来你还做目的蛋白啊？
先把内参做好
换抗体

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说错了，时有时无，内参。不是没有

作者: NBA 时间: 2013-2-22 15:36

说错了，时有时无，内参。不是没有

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先做内参
稳定你的系统

作者: wood533 时间: 2013-2-22 15:38

先做内参
稳定你的系统

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请问下是不是只要内参出的来，目的条带出不来就是抗体的问题？
或者说只能加大上扬量？怎么才能确定是不是抗体的问题

作者: NBA 时间: 2013-2-22 15:41

请问下是不是只要内参出的来，目的条带出不来就是抗体的问题？
或者说只能加大上扬量？怎么才能确定是不是抗体的问题

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1，先确定内参说明你在整体的操作上没有问题，以及二抗也没有问题（内参、目的蛋白采用的二抗没有问题，如果目的蛋白与内参采用不同的二抗要确认二抗没有问题）
2，目的蛋白做不出来有以下几点
A：目的蛋白上样量不够
B：目的蛋白没有提取出来（不同蛋白在细胞中的定位不同：如核、膜等）
C：目的蛋白抗体特异性不好
D：检查抗体的cross reaction的物种
E：用阳性对照样品来确定
F：ECL敏感性不够
G：抗体的稀释度有问题
H：抗体买回来之后的保存条件、避免反复冻融及污染
排除这些问题之后基本上就可以确认目的蛋白抗体有问题了

作者: 831226 时间: 2013-2-22 15:49

师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装-20度保存。
我的样品才提了3天，所以我觉得应该不会是已经发生变质了，难道使用之前还要进行离心吗，可是我已经分装了，每一管才30ul，请问应该是什么问题，如何解决，谢谢了！

变性后，上样之前短暂离心，取上清电泳
（蛋白浓度多大？）

师兄你好，我照着你的方法做了，这样离心的话会不会把浓度变低了呢，我之前没有测蛋白浓度，所以也不清楚，不过我现在上同样的量的话感觉出来的荧光条带没有以前亮了。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:09

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-2-22 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
师兄你好，我的蛋白样品出现絮状沉淀，加样时感觉一团一团的，果然电泳的时候出现了明显的拖尾现象。
我是先裂解的蛋白，然后12000离心，我一般离心2次，每次5到10分钟，就是怕离心的不彻底，离心完之后就加入loading buffer变性分装 ...

1，蛋白浓度过高，加入sample buffer进行蛋白变性时容易有沉淀产生（血清进行电泳前如果不调整浓度直接加入sample buffer会有沉淀产生，因为SDS量还没有蛋白多）
2，蛋白浓度应该调整后进行变形
3，蛋白离心的时候有一些杂质被吸出来

作者: flower-201 时间: 2013-2-23 11:10

老师：
我买的ABCOM的GABAAR α1 抗体，做大鼠脑组织（大脑皮层、海马、小脑），大鼠用农药处理。
做出的结果条带总是不清晰，
上样量用到80微克，
电泳条件：80U，20分钟；120U,70分钟；
转膜：PVDF,50U,70-90分钟;
一抗1：1000，
二抗：1：3000（碱性磷酸酶的）

怎么改进呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:10

QUOTE:

原帖由 flower-201 于 2013-2-23 11:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师：
我买的ABCOM的GABAAR α1 抗体，做大鼠脑组织（大脑皮层、海马、小脑），大鼠用农药处理。
做出的结果条带总是不清晰，
上样量用到80微克，
电泳条件：80U，20分钟；120U,70分钟；
转膜：PVDF,50U,70-90分钟;
一抗1：1000，
二抗：1：3000（碱 ...

用ECL方法试试

作者: eric930 时间: 2013-2-23 11:11

您好，请教下，为什么我的western做出来的图都非常难看，关键是我的marker，我重来没有看见好看的我跑的marker。。无论电流大小。都会出现marker小分子扩散，拖尾。要么就是marker被挤成原点。大分子的都还蛮漂亮。小分子的真是难看，我觉得弄得我的目的蛋白分子量都不准。请您告诉我，如何能够跑出漂亮的marker。

作者: zwsyrt 时间: 2013-2-23 11:19

老师您好，再次向您请教western的问题。
我做了很长时间的western，做的蛋白分子量是92KD，一抗的推荐浓度是1：500，但是做的时候背景很高，2抗的浓度也降了一倍，但是背景还是很高，洗膜也洗了很多遍，但出来的片子背景就是黑的，想知道这是为什么。谢谢老师。

作者: wsll 时间: 2013-2-23 11:19

楼主你好，我用BCA法测定的蛋白浓度，根据标准曲线计算出来的浓度比曲线的最高值要大很多(曲线标准品的最高浓度是0.5mg/ml,计算出来的样品浓度最小的是0.85mg/ml，最大的是4mg/ml)这样得到的样品浓度是不是不准呀？

我的样品上样达到了100ug，目的蛋白一抗1：500（推荐浓度为1：1000）但是压片20分钟后条带还是不太清楚，一开始2抗1：10000，后来1：5000还是不行；国外老板用15ug就可以做出来，一抗体1：1000，虽然抗体的公司不一样但是我的这个是CST的也不差呀，他的2抗1：2000.现在很困惑，不知道下一步怎么调整！
内参做出来但是表达不太一致，是不是蛋白测定有问题的原因呀？谢谢楼主！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:20

您好，请教下，为什么我的western做出来的图都非常难看，关键是我的marker，我重来没有看见好看的我跑的marker。。无论电流大小。都会出现marker小分子扩散，拖尾。要么就是marker被挤成原点。大分子的都还蛮漂亮。小分子的真是难看，我觉得弄得我的目的蛋白分子量都不准。请您告诉我，如何能够跑出漂亮的marker。

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用梯度胶

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:20

老师您好，再次向您请教western的问题。
我做了很长时间的western，做的蛋白分子量是92KD，一抗的推荐浓度是1：500，但是做的时候背景很高，2抗的浓度也降了一倍，但是背景还是很高，洗膜也洗了很多遍，但出来的片子背景就是黑的，想知道这是为什么。谢谢老师。

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1，一抗、二抗孵育在封闭体系中进行
2，在TBST中加入0.5M NaCl，0.2% SDS洗膜试试，这样同时也会降低目的条带的敏感性
3，继续稀释二抗做预实验
4，有些是因为一抗不太好

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:20

楼主你好，我用BCA法测定的蛋白浓度，根据标准曲线计算出来的浓度比曲线的最高值要大很多(曲线标准品的最高浓度是0.5mg/ml,计算出来的样品浓度最小的是0.85mg/ml，最大的是4mg/ml)这样得到的样品浓度是不是不准呀？

我的样品上样达到了100ug，目的蛋白一抗1：500（推荐浓度为1：1000）但是压片20分钟后条带还是不太清楚，一开始2抗1：10000，后来1：5000还是不行；国外老板用15ug就可以做出来，一抗体1：1000，虽然抗体的公司不一样但是我的这个是CST的也不差呀，他的2抗1：2000.现在很困惑，不知道下一步怎么调整！
内参做出来但是表达不太一致，是不是蛋白测定有问题的原因呀？谢谢楼主！

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BCA的标准品梯度为什么不从2mg/ml开始？
一抗CST的倒是不错，但是这里面涉及到目的蛋白的提取，你和国外老板比？
你们的系统条件一样吗？
就连最后一步在ECL的敏感性上都有很大的差别

作者: 3648755 时间: 2013-2-23 11:21

哦，可我的蛋白浓度已经是100ug啦，我也做过200ug的条带也还是不清楚，那我接下来是不是要做200ug，然后一抗浓度提到1：200？内参会不会太粗啦！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:22

QUOTE:

原帖由 3648755 于 2013-2-23 11:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
哦，可我的蛋白浓度已经是100ug啦，我也做过200ug的条带也还是不清楚，那我接下来是不是要做200ug，然后一抗浓度提到1：200？内参会不会太粗啦！

200ug一个泳道已经over loading了
呵呵
你的系统是不是该调整一下？
我认为你现在的问题可能出现在蛋白提取上

作者: XYZQ 时间: 2013-2-23 11:22

谢谢您，我下次用梯度看看，呵呵。对了还要请教您个问题，就是我用braford测蛋白浓度，蛋白的浓度相差很大。最大的有13微克每微升，最小的才3.57.。。这样的话我该如何上样呢，还是按所有的60微克上样？那最大的上5微升，最小的上20微升么

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:23

QUOTE:

原帖由 XYZQ 于 2013-2-23 11:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢您，我下次用梯度看看，呵呵。对了还要请教您个问题，就是我用braford测蛋白浓度，蛋白的浓度相差很大。最大的有13微克每微升，最小的才3.57.。。这样的话我该如何上样呢，还是按所有的60微克上样？那最大的上5微升，最小的上20 ...

建议用BCA来定量
定量后用蛋白抽提试剂与loading buffer把蛋白调整至浓度一致再上样
等体积

作者: PINK 时间: 2013-2-23 11:23

非常感谢版主发布这个帖子，我正好最近准备做Weasternblot，在做之前想把问题及细节尽量弄清楚，尽量少走弯路。
我们这边实验室做Westernblot的技术不是很成熟，就是转膜经常转不上，用内参之后膜上经常都是什么也没有，是不是这边的转膜电压，电泳液及转膜液出了问题，或是转膜的方法不对，请教版主，请版主告知详细的操作步骤及配液方法，越详细越好，十分感谢！

作者: hyuu 时间: 2013-2-23 11:24

建议用BCA来定量
定量后用蛋白抽提试剂与loading buffer把蛋白调整至浓度一致再上样
等体积

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谢谢您的帮助，可是我有个不明白的地方。蛋白抽提试剂是什么啊。我的loadingbuffer是2倍的。难道不是提取的200微升的蛋白就加200微升的buffer么。这个怎么把蛋白浓度调一致啊。。用一倍的loading buffer稀释弄的蛋白么？这样把浓度调一致？我用的裂解液RIPA提的组织蛋白。浓度调一致后再煮沸？然后就可以上样？

作者: PINK 时间: 2013-2-23 11:24

我的一抗要求用PBS稀释，我可以用TBS稀释吗？还有，PBS怎么配？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:25

谢谢您的帮助，可是我有个不明白的地方。蛋白抽提试剂是什么啊。我的loadingbuffer是2倍的。难道不是提取的200微升的蛋白就加200微升的buffer么。这个怎么把蛋白浓度调一致啊。。用一倍的loading buffer稀释弄的蛋白么？这样把浓度调一致？我用的裂解液RIPA提的组织蛋白。浓度调一致后再煮沸？然后就可以上样？

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1，蛋白抽提试剂就是你的裂解液（lysis buffer or extraction buffer）
2，计算好蛋白浓度，比如10mg/ml，我要调整至终浓度为2mg/ml
那么你可以取10ul 10mg/ml样品+ 15ul lysis buffer + 25ul 2倍loading，终浓度为2mg/ml，变性后电泳（如果换用5倍loading算法请自己去琢磨）

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:25

我的一抗要求用PBS稀释，我可以用TBS稀释吗？还有，PBS怎么配？谢谢！

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PBS及TBS稀释均可

作者: PINK 时间: 2013-2-23 11:26

请问楼主我做小分子量目的蛋白分子量10kd,请那个公司的蛋白marker比较好？推荐一下

作者: zsxan1990 时间: 2013-2-23 11:28

版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

作者: kuaizige 时间: 2013-2-23 11:28

大家好！我是新手第一次做western 为什么我的内参还出现两条条带啊

作者: yapuyapu 时间: 2013-2-23 11:29

我是新手！近期做Westernblot老不出结果！我的蛋白是68kd，用的条件是80V稳压，2h，转膜后，一抗和二抗孵育了，显色后，不出结果！怎么回事？
后来有改变条件，稳流200mA，3h，结果还是一样，仍旧不出结果！各位大侠到底咋回事呢？请指教一下！

作者: u234 时间: 2013-2-23 11:29

谢谢您！明白了！呵呵！又增长知识了！~~但是。还有个小问题。。用裂解液稀释蛋白的时候，裂解液里需要另外再加PMSF么。。所说的蛋白抽提试剂是加了蛋白酶抑制剂的裂解液么？还是纯粹的ripa?

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:30

请问楼主我做小分子量目的蛋白分子量10kd,请那个公司的蛋白marker比较好？推荐一下

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Fermentas #SM1891

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:30

版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

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蛋白MIX是什么意思？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:31

大家好！我是新手第一次做western 为什么我的内参还出现两条条带啊

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1，一抗浓度太高
2，一抗特异性不好

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:32

我是新手！近期做Westernblot老不出结果！我的蛋白是68kd，用的条件是80V稳压，2h，转膜后，一抗和二抗孵育了，显色后，不出结果！怎么回事？
后来有改变条件，稳流200mA，3h，结果还是一样，仍旧不出结果！各位大侠到底咋回事呢？请指教一下！

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呵呵
问题说的太简单了
WB是个系统，任何一个环节有问题都可能影响最后结果
转膜后你用丽春红染膜了吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:32

谢谢您！明白了！呵呵！又增长知识了！~~但是。还有个小问题。。用裂解液稀释蛋白的时候，裂解液里需要另外再加PMSF么。。所说的蛋白抽提试剂是加了蛋白酶抑制剂的裂解液么？还是纯粹的ripa?

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调整蛋白的浓度的时候我不加PMSF

作者: DONT 时间: 2013-2-23 11:33

楼主你好，我最近配胶，分离胶凝固之后上界面总是出现密密的锯齿，偶尔会正常，我每次都拼命混匀，玻璃板也都反复洗干净，一直找不到原因，非常苦恼。考虑过试剂的问题，但是实验室有人用同样的试剂就不会出现这个问题，现在配胶都有心理阴影了。

作者: DONT 时间: 2013-2-23 11:33

还要咨询一个问题，因为我们实验室没有封口机，所以一抗用的很费，有没有好办法能够省一抗呢？非常感谢！

作者: ritou1985 时间: 2013-2-23 11:33

我做兔肌球蛋白的WB，分子量在200KD左右，一抗选的MILLIPORE的Anti-Myosin Heavy Chain,Clone,二抗选的碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。选择β-actin作为内参合适不？操作上具体怎么做比较好？还有没有什么需要注意的？
恳请熟悉的朋友赐教！谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:50

楼主你好，我最近配胶，分离胶凝固之后上界面总是出现密密的锯齿，偶尔会正常，我每次都拼命混匀，玻璃板也都反复洗干净，一直找不到原因，非常苦恼。考虑过试剂的问题，但是实验室有人用同样的试剂就不会出现这个问题，现在配胶都有心理阴影了。

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那就看看人家配胶时的手法
你用饱和异丁醇封胶试试

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:51

还要咨询一个问题，因为我们实验室没有封口机，所以一抗用的很费，有没有好办法能够省一抗呢？非常感谢！

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不知道你的膜有多大
这个问题打字说不清楚

作者: NBA 时间: 2013-2-23 11:51

我做兔肌球蛋白的WB，分子量在200KD左右，一抗选的MILLIPORE的Anti-Myosin Heavy Chain,Clone,二抗选的碧云天的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。选择β-actin作为内参合适不？操作上具体怎么做比较好？还有没有什么需要注意的？
恳请熟悉的朋友赐教！谢谢！

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你算问对人了
MHC所有亚型我都做过
不知道你的电泳槽是什么型号，分离胶能有多高
通过其他方式联系

作者: yjf1026 时间: 2013-2-23 11:52

版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

蛋白MIX是什么意思？

所有样品按等浓度混合摸条件

作者: orangecake 时间: 2013-2-23 11:52

谢谢。以后还有不懂再问。反正我做的现在做的我快不行了。熬不住了总是很难看。。要么就不出。恩。谢谢您，以后再向您请教

作者: wood533 时间: 2013-2-23 11:53

版主你好！我最近几次WB出现蛋白在浓缩胶内不能压缩成细条带，溴酚蓝到底后，考马斯亮蓝染胶发现分离胶内没有条带，沿着泳道都是浅蓝色的，但是同一块胶内其他人的样品是好的，可以染出条带的。所有提蛋白和电泳的条件都一样，只是loading buffer是新配制的，我怀疑是这个的问题，重新配制了一次还是出现同样的问题，我配的是5×的buffer，按下面的配方配的1 M Tris·Cl (pH 6.8) 1.25 ml，SDS （电泳级） 0.5 g，溴酚蓝（BPB） 25 mg，甘油 2.5 ml，用前加25ul 2-ME ,崩溃中。麻烦您帮我分析下要怎么改进

作者: NBA 时间: 2013-2-23 12:07

版主你好！我最近几次WB出现蛋白在浓缩胶内不能压缩成细条带，溴酚蓝到底后，考马斯亮蓝染胶发现分离胶内没有条带，沿着泳道都是浅蓝色的，但是同一块胶内其他人的样品是好的，可以染出条带的。所有提蛋白和电泳的条件都一样，只是loading buffer是新配制的，我怀疑是这个的问题，重新配制了一次还是出现同样的问题，我配的是5×的buffer，按下面的配方配的1 M Tris·Cl (pH 6.8) 1.25 ml，SDS （电泳级） 0.5 g，溴酚蓝（BPB） 25 mg，甘油 2.5 ml，用前加25ul 2-ME ,崩溃中。麻烦您帮我分析下要怎么改进

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用他的loading试试

作者: NBA 时间: 2013-2-23 12:07

版主你好：我用蛋白MIX摸条件好好的，结果上样却没有条带，我一抗、二抗都是5%的脱脂奶粉稀释。封闭也是脱脂奶粉。请问可能是什么原因呀？谢谢

蛋白MIX是什么意思？

所有样品按等浓度混合摸条件

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问题很多
也就是说整个系统我现在不知道你在什么地方出现了问题
你说的太简单了

作者: hustwb 时间: 2013-2-23 12:21

请问下做磷酸化的抗体是不是不能用脱脂奶粉封闭？用BSA封闭么？

作者: jkobn 时间: 2013-2-23 12:21

您好，我用western blotting检测内皮细胞tie-2（酪氨酸蛋白激酶受体）表达，按照抗体说明书其分子量应在145KD，但我的条带在72KD，请您帮我分析这是什么原因，我的实验过程大概是：用RIPA强裂解液（加入1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂）裂解，130000rpm离心15min，收集上清，蛋白定量，用6％分离胶电泳，然后转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，加一抗（santa，1：500），4度过夜，用PBST洗3次，PBS洗两次，加二抗（santa，1：5000），室温2h，洗涤，加发光试剂，曝光，显影，定影。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 12:21

请问下做磷酸化的抗体是不是不能用脱脂奶粉封闭？用BSA封闭么？

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有用奶粉做磷酸化蛋白的
但是建议你用BSA

作者: NBA 时间: 2013-2-23 12:22

您好，我用western blotting检测内皮细胞tie-2（酪氨酸蛋白激酶受体）表达，按照抗体说明书其分子量应在145KD，但我的条带在72KD，请您帮我分析这是什么原因，我的实验过程大概是：用RIPA强裂解液（加入1mM PMSF作为蛋白酶抑制剂）裂解，130000rpm离心15min，收集上清，蛋白定量，用6％分离胶电泳，然后转移到PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭1h，加一抗（santa，1：500），4度过夜，用PBST洗3次，PBS洗两次，加二抗（santa，1：5000），室温2h，洗涤，加发光试剂，曝光，显影，定影。

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你这个蛋白是二聚体吗？

作者: hustwb 时间: 2013-2-23 14:15

tie-2是个膜受体，结构见附件的图。谢谢您！

图片附件: 19817506.snap.jpg (2013-2-23 14:15, 59.16 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14961

作者: NBA 时间: 2013-2-23 14:27

你可以试试CST的tie-2抗体

作者: 49888 时间: 2013-2-23 14:27

您好，我想问一下是否是提取条件剧烈而使tie-2受体断裂所致，但同一样品我还检测了另一受体KDR,其结构跟上述tie-2相似，分子量也是150KD，结果在150KD处有带，但非常细，在70多KD处带也比较粗。

作者: 131415 时间: 2013-2-23 15:17

您好，我想问一下是否是提取条件剧烈而使tie-2受体断裂所致，但同一样品我还检测了另一受体KDR,其结构跟上述tie-2相似，分子量也是150KD，结果在150KD处有带，但非常细，在70多KD处带也比较粗。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:20

您好，我想问一下是否是提取条件剧烈而使tie-2受体断裂所致，但同一样品我还检测了另一受体KDR,其结构跟上述tie-2相似，分子量也是150KD，结果在150KD处有带，但非常细，在70多KD处带也比较粗。

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条件剧烈导致这样的情况我认为不太可能
我认为是一抗的原因

作者: vivian4123 时间: 2013-2-23 15:22

你好，我也做了很久的WB了，但总是时好时坏。上星期第一次做的结果很好，第二天再做，相同的条件，相同的试剂，就怎么也曝不出来了，转膜丽春红染色是有条带的，但是曝光后除了actin内参能曝出来，需要的目的条带的片子上干干净净，什么也没有，已经连着一个星期了，今天刚刚又失败了。目的蛋白的一抗应该不会转天就坏了吧(一抗都是新鲜使用，不重复用，按说明书保存在负80冰箱中)，这一个星期里，我把一抗孵育时间都加长为室温两个半小时，二抗加长为2小时（原来一抗孵育2小时，二抗45min），我怕洗膜时间长，又将洗膜减少到两次，每次10min（原来是洗三次，前两次10min，第三次5min），但曝光片子上依然是白茫茫大地真干净！总是碰到这样的问题，说不出就不出了，哪怕前一天还做的好好的！

作者: bling 时间: 2013-2-23 15:22

版主，请教个问题，提取蛋白后，用上样缓冲液和裂解液配平好的蛋白放在-40度的冰箱里可以保存多久？

作者: tianmei001 时间: 2013-2-23 15:23

请大家帮我分析一下：
我做真核细胞转染过表达一个基因，质粒DNA带有GFP，两组，24h，48h，看蛋白的表达量，我做出来的似乎与正常组没什么差异，RT-PCR有明显过表达，而且过表达的基因是不是应该有两条带，一个事细胞自身表达的，另一个是带有GFP的表达的，可我只做出来一条带！

作者: owanaka 时间: 2013-2-23 15:23

版主你好：我问的问题老感觉你不想答复，我摸条件梯度，条带都很好，就是上样时不出现条带，我的系统条件没有改变呀！

谢谢

作者: gmjghh 时间: 2013-2-23 15:24

版主，你好！我是WB新手，但是，一直做得很顺利；但是，最近半个月吧，HRP-ECL法，什么都做不出来，包括内参Actin(Santa sc-1616，1：2000稀释，之前一直没问题)，也没有任何背景；但是，ECL显不出之后，洗一洗膜，重新孵育AP二抗，AP显色很漂亮，很干净（至少说明一抗是没有问题的）；我仔细检查核对过之前的二抗是匹配的，AB液进口的国产的普通的超敏的都试过，就是出不来（今天还在保鲜膜上点上没有稀释二抗，测试各种显色液，都有明显荧光，很强）；显影液，定影液都是新配的，别人试用，效果很好。

之前有看到别人经验，发光液碰到金属很容易淬灭，我确实使用了金属眼科镊子将膜从反应液里提出来，吸水纸洗掉多余反应液，然后转移到保鲜膜，压片，但是，别人都用金属镊子也，都没事；还听说，有些劣质保鲜膜会淬灭光信号，但是，我们实验室都用佳能牌保鲜膜，别人都能做出来呀！

很郁闷，很受挫！

作者: gmjghh 时间: 2013-2-23 15:24

请教！为什么我的片子上会有这么多点点状的脏东西？同一张膜使用别的抗体和二抗曝出来都是没有问题，条带很清晰的。

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封闭用的牛奶建议过滤一下先，如果牛奶溶解得不好，容易产生斑点问题；

另外，洗膜要干净；

压片的时候，注意将保鲜膜弄平整，没有气泡；

个人经验，呵呵。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:25

你好，我也做了很久的WB了，但总是时好时坏。上星期第一次做的结果很好，第二天再做，相同的条件，相同的试剂，就怎么也曝不出来了，转膜丽春红染色是有条带的，但是曝光后除了actin内参能曝出来，需要的目的条带的片子上干干净净，什么也没有，已经连着一个星期了，今天刚刚又失败了。目的蛋白的一抗应该不会转天就坏了吧(一抗都是新鲜使用，不重复用，按说明书保存在负80冰箱中)，这一个星期里，我把一抗孵育时间都加长为室温两个半小时，二抗加长为2小时（原来一抗孵育2小时，二抗45min），我怕洗膜时间长，又将洗膜减少到两次，每次10min（原来是洗三次，前两次10min，第三次5min），但曝光片子上依然是白茫茫大地真干净！总是碰到这样的问题，说不出就不出了，哪怕前一天还做的好好的！
亟需您的回答！我的QQ号：249642024。

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1，是不是抗体稀释的缓冲液有问题了？
2，一抗孵育建议4度过夜

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:25

版主，请教个问题，提取蛋白后，用上样缓冲液和裂解液配平好的蛋白放在-40度的冰箱里可以保存多久？

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建议尽快使用吧
放置1到2个月没有问题

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:26

版主你好：我问的问题老感觉你不想答复，我摸条件梯度，条带都很好，就是上样时不出现条带，我的系统条件没有改变呀！

谢谢

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你做的东西我都不清楚，怎么答复你？
摸条件梯度是什么意思
上样时不出现条带又是什么意思？（是转膜后丽春红染色膜上没有条带，还是SDS-PAGE后染胶没有蛋白条带？）

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:26

版主，你好！我是WB新手，但是，一直做得很顺利；但是，最近半个月吧，HRP-ECL法，什么都做不出来，包括内参Actin(Santa sc-1616，1：2000稀释，之前一直没问题)，也没有任何背景；但是，ECL显不出之后，洗一洗膜，重新孵育AP二抗，AP显色很漂亮，很干净（至少说明一抗是没有问题的）；我仔细检查核对过之前的二抗是匹配的，AB液进口的国产的普通的超敏的都试过，就是出不来（今天还在保鲜膜上点上没有稀释二抗，测试各种显色液，都有明显荧光，很强）；显影液，定影液都是新配的，别人试用，效果很好。

之前有看到别人经验，发光液碰到金属很容易淬灭，我确实使用了金属眼科镊子将膜从反应液里提出来，吸水纸洗掉多余反应液，然后转移到保鲜膜，压片，但是，别人都用金属镊子也，都没事；还听说，有些劣质保鲜膜会淬灭光信号，但是，我们实验室都用佳能牌保鲜膜，别人都能做出来呀！

很郁闷，很受挫！

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1，加上ECL后在暗室能不能看见光？
2，胶片与显影液、定影液是不是匹配
3，你用什么来源的一抗，什么二抗？

作者: junhun 时间: 2013-2-23 15:27

您好，请问，HRP标记的2抗除了用DAB和ECL显色外，还有什么显色方法，AP标记的2抗呢？用什么方法检测呢？

作者: yonger 时间: 2013-2-23 15:28

呵呵
问题说的太简单了
WB是个系统，任何一个环节有问题都可能影响最后结果
转膜后你用丽春红染膜了吗？

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不用丽春红染色直接加一抗孵育！
总是不出结果很是着急，现在二抗都用完了！唉

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-23 15:28

你好，我做bcl-2;bax;bcl-xl，刚开始单独做了bcl-2出结果了，但是结果非常不清晰。后来再做一次结果三种基因加上actin结果三种基因都没出结果。共有四个样，actin只显了一个影。
到底是那个步骤出了问题。
我完全按照步骤来。
制胶，加样，电泳，浓缩胶90u,分离胶110u,在分离胶中，buffer及marker分离的断断续续的。
后来就是转膜了，我的基因分子量不大，20多kDa,所以用了恒压50v,1.5小时。再后来就是洗膜，脱脂奶粉封闭1小时。加一抗4度过夜，洗膜加二抗封闭1小时，洗膜再ECL染色。
如果能回复将万分感谢！！！

作者: tianmei001 时间: 2013-2-23 15:29

版主您好，向您请教个问题：我的膜大约30cm2，目标蛋白43kd，请问应该用什么样的条件呢？
我用恒压50v，80分钟，但是感觉效果不是很好。

作者: qumm1985 时间: 2013-2-23 15:29

你好版主：
我可能没说清楚，现在请教怎样确定上样量的多少呀？

作者: IAM007 时间: 2013-2-23 15:30

老师，您好！
做WB，目的蛋白分子量100kDa，曝光后发现有粗粗的一条带，但这条带位于最上一条marker（250kDa）还靠上的位置，没有其他杂带。请问这是蛋白没有跑下来还是怎么回事？如果是蛋白没有跑下来，哪个环节出现问题会造成这种情况，胶是10%，买的成品应该没有问题。谢谢指导！

作者: plaa 时间: 2013-2-23 15:30

最近在做LPS（脂多糖、内毒素）对HUVEC（脐静脉内皮细胞）刺激后测定ICAM-1的实验。
查过相关的文献，检测ICAM-1蛋白很少有人用Western-Blot的方法，有部分人应用ELISA或流式细胞仪，请问是因为蛋白表达量低使得WB不能检测到？还是有别的原因？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:31

您好，请问，HRP标记的2抗除了用DAB和ECL显色外，还有什么显色方法，AP标记的2抗呢？用什么方法检测呢？

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HRP标记还可以用在ELISA中，用TMB显色（如果没记错的话）
AP的检测方法好像是BICP/NBT
你自己上网搜搜

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:31

不用丽春红染色直接加一抗孵育！
总是不出结果很是着急，现在二抗都用完了！唉

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用丽春红染色来看转膜效果
别盲目做

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:32

你好，我做bcl-2;bax;bcl-xl，刚开始单独做了bcl-2出结果了，但是结果非常不清晰。后来再做一次结果三种基因加上actin结果三种基因都没出结果。共有四个样，actin只显了一个影。
到底是那个步骤出了问题。
我完全按照步骤来。
制胶，加样，电泳，浓缩胶90u,分离胶110u,在分离胶中，buffer及marker分离的断断续续的。
后来就是转膜了，我的基因分子量不大，20多kDa,所以用了恒压50v,1.5小时。再后来就是洗膜，脱脂奶粉封闭1小时。加一抗4度过夜，洗膜加二抗封闭1小时，洗膜再ECL染色。
如果能回复将万分感谢！！！

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1，蛋白提取出来没有
2，转膜后膜上有没有蛋白？
第三才是考虑抗体问题
有兴趣短信息联系
这些我都做过

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:33

版主您好，向您请教个问题：我的膜大约30cm2，目标蛋白43kd，请问应该用什么样的条件呢？
我用恒压50v，80分钟，但是感觉效果不是很好。

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湿转还是半干转？
我喜欢用恒流
湿转：300mA 1h
半干 1.2mA 每平方厘米膜面积，1h

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:33

你好版主：
我可能没说清楚，现在请教怎样确定上样量的多少呀？

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先跑电泳染胶看条带
看泳道间是否串道
条带是否清晰

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:57

老师，您好！
做WB，目的蛋白分子量100kDa，曝光后发现有粗粗的一条带，但这条带位于最上一条marker（250kDa）还靠上的位置，没有其他杂带。请问这是蛋白没有跑下来还是怎么回事？如果是蛋白没有跑下来，哪个环节出现问题会造成这种情况，胶是10%，买的成品应该没有问题。谢谢指导！

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胶要用8%
10%的浓度有些高了

作者: NBA 时间: 2013-2-23 15:58

最近在做LPS（脂多糖、内毒素）对HUVEC（脐静脉内皮细胞）刺激后测定ICAM-1的实验。
查过相关的文献，检测ICAM-1蛋白很少有人用Western-Blot的方法，有部分人应用ELISA或流式细胞仪，请问是因为蛋白表达量低使得WB不能检测到？还是有别的原因？
谢谢！

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是不是一种分泌型的蛋白？
你看看这篇文献
cuturl('http://cancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/68/11/4097')

作者: 2541 时间: 2013-2-23 16:01

我之前做的一直都还挺正常的为什么今天就没带了啊~~愁···条件没变啊···

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:06

我之前做的一直都还挺正常的为什么今天就没带了啊~~愁···条件没变啊···

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找原因
是不是换缓冲液等东西了

作者: loli 时间: 2013-2-23 16:06

你好版主：
我可能没说清楚，现在请教怎样确定上样量的多少呀？

先跑电泳染胶看条带
看泳道间是否串道
条带是否清晰

谢谢，我染过胶没有串道，转印后染过胶和膜，胶上没条带，膜上有很多条带。之后我就用同样的条件电泳转印，封闭2小时后一抗4度过夜，然后二抗室温两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

作者: 04906 时间: 2013-2-23 16:07

麻烦斑竹问一下：

我做了3次了，beta-actin不齐，有的样品有条带，有的样品没有或者很浅。除了加样，测浓度问题以外。还会在哪里出问题？我是组织蛋白~~

谢谢~~

作者: newway 时间: 2013-2-23 16:08

胶要用8%
10%的浓度有些高了

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谢谢版主！
用7.5%的胶跑了一次，结果还是那样。并且，把膜洗了，作了个内参GAPDH（37kDa ），曝光后条带清楚的显示在约60kDa 的位置上。请版主帮忙分析一下可能的原因。与目的蛋白是膜蛋白有关吗？Thanks！

作者: 987789 时间: 2013-2-23 16:09

请教版主！
我检测34kDa的目的蛋白，上样40微克，20微升；浓缩胶12%，分离胶5%；膜是0.22的，湿转100v，1.5h。封闭2h。一抗1：200，4°过夜。二抗1：1000，2h。碧云天的ECL发光。
结果内参actin可以清楚的看到发光带，能曝出来，但目的蛋白的膜连荧光都看不到，不能曝出条带。
请版主帮忙分析下，非常感谢!

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:10

谢谢，我染过胶没有串道，转印后染过胶和膜，胶上没条带，膜上有很多条带。之后我就用同样的条件电泳转印，封闭2小时后一抗4度过夜，然后二抗室温两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

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这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:10

麻烦斑竹问一下：

我做了3次了，beta-actin不齐，有的样品有条带，有的样品没有或者很浅。除了加样，测浓度问题以外。还会在哪里出问题？我是组织蛋白~~

谢谢~~

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先跑电泳染胶看结果后再进行下一步调整

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:11

请教版主！
我检测34kDa的目的蛋白，上样40微克，20微升；浓缩胶12%，分离胶5%；膜是0.22的，湿转100v，1.5h。封闭2h。一抗1：200，4°过夜。二抗1：1000，2h。碧云天的ECL发光。
结果内参actin可以清楚的看到发光带，能曝出来，但目的蛋白的膜连荧光都看不到，不能曝出条带。
请版主帮忙分析下，非常感谢!

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1、目的蛋白没有提取出来
2、如果做过一抗的不同稀释度，你可以考虑是不是一抗有问题
3、抗体能不能识别你的种属

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:12

谢谢版主！
用7.5%的胶跑了一次，结果还是那样。并且，把膜洗了，作了个内参GAPDH（37kDa ），曝光后条带清楚的显示在约60kDa 的位置上。请版主帮忙分析一下可能的原因。与目的蛋白是膜蛋白有关吗？Thanks！

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分子量marker有问题没？

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:12

湿转还是半干转？
我喜欢用恒流
湿转：300mA 1h
半干 1.2mA 每平方厘米膜面积，1h

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谢谢版主。
我用的是nc膜，请问使用时和PVDF膜有什么区别嘛？

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:13

谢谢版主。
我用的是nc膜，请问使用时和PVDF膜有什么区别嘛？

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湿转

作者: 987789 时间: 2013-2-23 16:14

1X电泳缓冲液跑80V电泳电流很低。经常只有3-4A，而以前用0.5X的都很好。直接重新加点5X的里面就很好，一般都是25A左右。会是缓冲液的问题么？我怀疑离子浓度度不够？另外两块玻璃板中间的电泳缓冲液面经常有下降，不知道是不是没有卡好，以前未碰到过这样的问题。卡之前也检查过了。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:15

谢谢版主。
我用的是nc膜，请问使用时和PVDF膜有什么区别嘛？

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NC膜直接可以用，在转缓里平衡一下即可
PVDF膜需要用无水甲醇活化，活化后在转缓中平衡待用

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:15

1X电泳缓冲液跑80V电泳电流很低。经常只有3-4A，而以前用0.5X的都很好。直接重新加点5X的里面就很好，一般都是25A左右。会是缓冲液的问题么？我怀疑离子浓度度不够？另外两块玻璃板中间的电泳缓冲液面经常有下降，不知道是不是没有卡好，以前未碰到过这样的问题。卡之前也检查过了。

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1，你的11X电泳缓冲液重复使用？
2，重新加点5倍的是什么意思？
3，电泳槽里槽的液体平面要注意

作者: one 时间: 2013-2-23 16:16

1，你的11X电泳缓冲液重复使用？
2，重新加点5倍的是什么意思？
3，电泳槽里槽的液体平面要注意

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从未反复使用过缓冲液。
一般是5X稀释成1X使用。因为电泳跑不动。怀疑离子强度不够，所以直接将5X倒入电泳槽。
就是您说的这个两块玻璃板电泳槽液体平面，感觉总在漏，不断降低。不清楚怎么回事

作者: 969 时间: 2013-2-23 16:16

前辈好，新手上路，有问题想请教：配胶用了放在室温下的30%预制聚丙烯酰胺会有什么影响呢？这块胶还能用吗？另外，今天曝光后胶片背景上出现像散弹枪打的一样的好多黑点点，请帮助分析一下原因，多谢！第一张是曝光三分钟的：

图片附件: 13735642.snap.jpg (2013-2-23 16:16, 17.98 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14963

作者: 969 时间: 2013-2-23 16:17

这是第二张，第二个三分钟的：

图片附件: 56619211.snap.jpg (2013-2-23 16:17, 18.02 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14964

作者: 969 时间: 2013-2-23 16:17

第三张，曝光15分钟的：

图片附件: 35229733.snap.jpg (2013-2-23 16:17, 21.87 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14965

作者: 969 时间: 2013-2-23 16:18

第四张，曝光30分钟的，四张总共爆了50分钟左右：

图片附件: 97891604.snap.jpg (2013-2-23 16:18, 19.61 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14966

作者: 969 时间: 2013-2-23 16:18

分子量marker有问题没？

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也怀疑过Marker的问题，用新的marker试过了，一样的结果。这会不会与蛋白的提取有关，我做的是膜蛋白，用机械方法提取的蛋白，没有用超声。会不会是蛋白提取的不彻底？Thanks！

作者: 8princess8 时间: 2013-2-23 16:19

请问版主，用脱脂奶和BSA封闭怎么选择呢？我配的脱脂奶总是有颗粒不溶，有什么好方法溶解吗？我觉得这样会影响封闭和抗体孵育的效果，谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-2-23 16:20

从未反复使用过缓冲液。
一般是5X稀释成1X使用。因为电泳跑不动。怀疑离子强度不够，所以直接将5X倒入电泳槽。
就是您说的这个两块玻璃板电泳槽液体平面，感觉总在漏，不断降低。不清楚怎么回事

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赞同版主！首先考虑电泳液不足。我刚遇到过，加了电泳液就好，可能和N×没有关系。电泳槽的设计必定有它的道理，按标准加好才能“泳”动。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:22

从未反复使用过缓冲液。
一般是5X稀释成1X使用。因为电泳跑不动。怀疑离子强度不够，所以直接将5X倒入电泳槽。
就是您说的这个两块玻璃板电泳槽液体平面，感觉总在漏，不断降低。不清楚怎么回事

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那就不是离子强度问题
你的缓冲液在漏怎么能跑电泳？
换电泳槽或者把现有的槽弄好再跑电泳吧

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:22

第四张，曝光30分钟的，四张总共爆了50分钟左右：

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1，奶粉或者BSA有颗粒附着在膜上
2，是不是用的血清？血清容易产生这样的问题
3，在整个操作过程中东西要干净

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:23

也怀疑过Marker的问题，用新的marker试过了，一样的结果。这会不会与蛋白的提取有关，我做的是膜蛋白，用机械方法提取的蛋白，没有用超声。会不会是蛋白提取的不彻底？Thanks！

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做什么蛋白？
建议看看文献，有些时候蛋白的分子量通过WB检测会有一定变化的

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:24

请问版主，用脱脂奶和BSA封闭怎么选择呢？我配的脱脂奶总是有颗粒不溶，有什么好方法溶解吗？我觉得这样会影响封闭和抗体孵育的效果，谢谢！

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市面上买的脱脂奶粉就可以啊
挺好溶的
你用的是什么奶粉？
做一些特定蛋白的时候需要选择BSA

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:25

两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

作者: kuohao17 时间: 2013-2-23 16:27

1，奶粉或者BSA有颗粒附着在膜上
2，是不是用的血清？血清容易产生这样的问题
3，在整个操作过程中东西要干净

多谢，封闭我用的是5%脱脂奶粉，东西也都是超水冲洗过至少两遍的，今天再严格一下试一试。

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:27

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

之前我也有过关于裂解液的困惑。小了解了一下，仅供参考。根据变构剂强弱及成分的相互作用裂解液大致分为弱、中、强效。您讲的这个配方好像是中效的。建议您可以在碧云天的网站查询各种裂解液，有配方的对比，可能有所帮助。希望有用！

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:29

市面上买的脱脂奶粉就可以啊
挺好溶的
你用的是什么奶粉？
做一些特定蛋白的时候需要选择BSA

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我用的是光明脱脂奶。希望版主能讲两种封闭的选择讲详细些，谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:30

用梯度胶

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版主您好！我W没有多久，弱弱的问一下梯度胶在什么情况下使用？怎么配呢？因为我之前没有听过，见笑！谢谢！

作者: star#room 时间: 2013-2-23 16:30

你好，我做wb上样是一个总蛋白，一个Co-IP蛋白，还有一个总蛋白，前两个用我们的特定一抗，后面用actin抗体。转膜后用丽春红染有条带，ECL显影，IP结果和actin有明显清晰条带，就是总蛋白的没显影，这是什么原因呢？PS：IP是用我们的特定一抗。

作者: 3N4G 时间: 2013-2-23 16:31

您好！我在做P53，WB出来的结果很不好，有的跑出3条带，其中有一条是60左右，一条53左右，但所有的细胞都跑出了40左右的条带，这是怎么回事？一抗是用的santa cruz p53 (Pab 1801)二抗是goat anti-mouse.谢谢！

作者: 131415 时间: 2013-2-23 16:31

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

之前我也有过关于裂解液的困惑。小了解了一下，仅供参考。根据变构剂强弱及成分的相互作用裂解液大致分为弱、中、强效。您讲的这个配方好像是中效的。建议您可以在碧云天的网站查询各种裂解液，有配方的对比，可能有所帮助。希望有用！

碧云天也没有1*PBS的裂解液呀

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-23 16:32

碧云天也没有1*PBS的裂解液呀

cuturl('http://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm')。个人认为选择的关键是变构剂，是不是不必太注意PBS呢，按照常规配方吧。看看这个网址的链接，是碧云天的，希望有用吧！

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:33

我们实验室原来是配裂解液的，现在也买碧云天的了，不贵，方便些。我个人认为蛋白提取很关键的一步。仅供参考！

作者: 98776langtao 时间: 2013-2-23 16:33

我们实验室原来是配裂解液的，现在也买碧云天的了，不贵，方便些。我个人认为蛋白提取很关键的一步。仅供参考！

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能不能讲下你提单白的一些经验和操作。谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-2-23 16:34

请问,我做的蛋白分别是25kd、38kd和43kd的，之前做的除了操作上不够严谨，显影后条带不是很均匀外，其他问题不大，条带颜色较浓，背景没有明显的颜色和杂带
但从某一天开始，试剂、抗体、试验条件均未更改，就什么都做不出来
重新配抗体、重新购买抗体均不能做出来，连内参也没有一点条带
试验设备应该没有问题，使用同一套设备的同学能做出来
这样大概已经有2个星期了，很急，请教能不能帮我分析一下原因
我的实验条件是：
从组织提的蛋白，上样，70v，100v电泳
0.2PVDF膜Bio-rad半干转1mA/cm2 60-65分钟
5%脱脂奶粉室温封闭1小时
santa一抗 1：400，TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温摇3小时，TBST洗膜3*10min
碧云天二抗1：1000TBST稀释（推荐1：1000）室温80分钟,TBST洗膜3*10min
发光剂是碧云天ECL，从来没有看到过任何荧光，之前做的压片5分钟条带明显，现在第一次压片就压20分钟，什么都没有
恳请帮忙~~~多谢

作者: duoduo 时间: 2013-2-23 16:34

因为是刚开始想摸条件，便做了B-actin，分子量42kd。用的是六一厂的湿性转膜仪。
转摸条件：4摄氏度、35mA、2小时。（胶大小约6.0*2.5cm）
一抗：1：100 5%脱脂奶粉稀释的（说明书建议1:100--1:1000）
二抗：1：1000 TBST稀释的（说明书建议1:1000--1:3000）
用的是ECL发光，但是暗室里在已与ECL充分作用的PVDF上却没有见到荧光，胶片上无任何条带。
补充：转完膜后，PVDF膜上可见到MARKER的印迹，二抗单独与ECL作用也可见到荧光。
请问楼主是哪个环节出了问题？（是膜的问题、还是膜上没有转上去蛋白、还是一抗与膜上的蛋白未结合，还是二抗与一抗不结合）

作者: ukonptp 时间: 2013-2-23 16:35

请教一下版主
我一抗加叠氮钠记错浓度；
把0.02%的叠氮钠加成0.2%
请问对实验有何影响？
有没有什么补救措施？
谢谢！

作者: www.1 时间: 2013-2-23 16:35

因为是刚开始想摸条件，便做了B-actin，分子量42kd。用的是六一厂的湿性转膜仪。
转摸条件：4摄氏度、35mA、2小时。（胶大小约6.0*2.5cm）
一抗：1：100 5%脱脂奶粉稀释的（说明书建议1:100--1:1000）
二抗：1：1000 TBST稀释的（说明书建议1:1000--1:3000）
用的是ECL发光，但是暗室里在已与ECL充分作用的PVDF上却没有见到荧光，胶片上无任何条带。
补充：转完膜后，PVDF膜上可见到MARKER的印迹，二抗单独与ECL作用也可见到荧光。
请问楼主是哪个环节出了问题？（是膜的问题、还是膜上没有转上去蛋白、还是一抗与膜上的蛋白未结合，还是二抗与一抗不结合）

你可以试一下BSA封闭，和BSA稀释抗体

作者: 987789 时间: 2013-2-23 16:36

斑竹，前不久我们交流过WB做骨骼肌肌球蛋白重链MHC亚型的话题。现在，我发觉好象很难寻觅到可以分出MHC-I，MHC-IIa和MHC-IIb条带的一抗。不少公司都问到这3个蛋白亚型的分子量的问题，但好象文献中只笼统的说到200-220Kd。下一步，不知道该怎么办了。请您在指导一下。谢谢1

作者: 49888 时间: 2013-2-23 16:37

两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

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裂解液有很多种啊
还有只有1% NP-40的配方
因此我认为这个不是主要原因

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:37

两个小时，这样用样品的混合蛋白按10，20，40，80微克，ECL显色，胶片曝光有条带而且蛋白量不同条带有明显的区别，然后我用同样的条件做单个的样品按40微克上样，结果没有看到荧光条带而且胶片曝光也没有条带，我重复多次都一样，而且染膜能看见膜上有很多条带，染胶无条带。我晕掉了，这可能是什么原因？谢谢

这样的问题我也不知道
第一次你有结果，说明操作你没有问题
建议你仔细找找缓冲液等的问题

谢谢，我现在用的RIPA全细胞裂解液，做的总是不是很好，以前我用过别人给的一种裂解液：1*PBS;1%NP-40;0.5%的去氧胆酸钠；0.1%SDS；PMSF.我想请教版主这个裂解液成分对不对，感觉1*PBS是等渗的呀？谢谢

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关于裂解液问题：我现在可以提供总蛋白裂解液，胞浆胞核蛋白裂解液，还有stripping buffer

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:38

版主您好！我W没有多久，弱弱的问一下梯度胶在什么情况下使用？怎么配呢？因为我之前没有听过，见笑！谢谢！

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做大分子量蛋白
同时还想保留内参
配制需要梯度混匀仪（也叫梯度混合器）
蠕动泵
磁力搅拌器
怎么配你可以参考Biorad的说明书或者《蛋白质技术手册》

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:38

您好！我在做P53，WB出来的结果很不好，有的跑出3条带，其中有一条是60左右，一条53左右，但所有的细胞都跑出了40左右的条带，这是怎么回事？一抗是用的santa cruz p53 (Pab 1801)二抗是goat anti-mouse.谢谢！

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你试试Epitomics的p53抗体
效果很好

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:38

请问,我做的蛋白分别是25kd、38kd和43kd的，之前做的除了操作上不够严谨，显影后条带不是很均匀外，其他问题不大，条带颜色较浓，背景没有明显的颜色和杂带
但从某一天开始，试剂、抗体、试验条件均未更改，就什么都做不出来
重新配抗体、重新购买抗体均不能做出来，连内参也没有一点条带
试验设备应该没有问题，使用同一套设备的同学能做出来
这样大概已经有2个星期了，很急，请教能不能帮我分析一下原因
我的实验条件是：
从组织提的蛋白，上样，70v，100v电泳
0.2PVDF膜Bio-rad半干转1mA/cm2 60-65分钟
5%脱脂奶粉室温封闭1小时
santa一抗 1：400，TBST稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温摇3小时，TBST洗膜3*10min
碧云天二抗1：1000TBST稀释（推荐1：1000）室温80分钟,TBST洗膜3*10min
发光剂是碧云天ECL，从来没有看到过任何荧光，之前做的压片5分钟条带明显，现在第一次压片就压20分钟，什么都没有
恳请帮忙~~~多谢

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问题不好判断
中间换过什么试剂没有？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:39

因为是刚开始想摸条件，便做了B-actin，分子量42kd。用的是六一厂的湿性转膜仪。
转摸条件：4摄氏度、35mA、2小时。（胶大小约6.0*2.5cm）
一抗：1：100 5%脱脂奶粉稀释的（说明书建议1:100--1:1000）
二抗：1：1000 TBST稀释的（说明书建议1:1000--1:3000）
用的是ECL发光，但是暗室里在已与ECL充分作用的PVDF上却没有见到荧光，胶片上无任何条带。
补充：转完膜后，PVDF膜上可见到MARKER的印迹，二抗单独与ECL作用也可见到荧光。
请问楼主是哪个环节出了问题？（是膜的问题、还是膜上没有转上去蛋白、还是一抗与膜上的蛋白未结合，还是二抗与一抗不结合）

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转膜后检测过膜上是否转上蛋白了吗

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:39

斑竹，前不久我们交流过WB做骨骼肌肌球蛋白重链MHC亚型的话题。现在，我发觉好象很难寻觅到可以分出MHC-I，MHC-IIa和MHC-IIb条带的一抗。不少公司都问到这3个蛋白亚型的分子量的问题，但好象文献中只笼统的说到200-220Kd。下一步，不知道该怎么办了。请您在指导一下。谢谢1

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这三个亚型本来就很难分辨
可以用银染来做MHC的分型
电泳要跑几十个小时吧才能分出来
抗体只有I与II

作者: H2O 时间: 2013-2-23 16:39

试剂的配方都没有换
所用的tris-base和甘氨酸什么的都还是原来那一大瓶
跟我共用相同试剂的同学一个抗体能做出来，但beta-actin做不出来
我之前beta-actin还可以，但现在所有都做不出来

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:40

请教一下版主
我一抗加叠氮钠记错浓度；
把0.02%的叠氮钠加成0.2%
请问对实验有何影响？
有没有什么补救措施？
谢谢！

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不知道你要做什么实验？
在wB中NaN3会影响HRP活性

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:40

试剂的配方都没有换
所用的tris-base和甘氨酸什么的都还是原来那一大瓶
跟我共用相同试剂的同学一个抗体能做出来，但beta-actin做不出来
我之前beta-actin还可以，但现在所有都做不出来

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beta-actin 抗体问题呢？

作者: 04906 时间: 2013-2-23 16:41

半月前刚买回来的原装santa的TGF-beta抗体，第一次做1：400非常浓，我改成1：600以后还有条带，然后就跟beta-actin一样再也没有做出来过

作者: 04906 时间: 2013-2-23 16:41

另外，CTGF和TNF-alpha就从来都没有做出来过了

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:42

QUOTE:

原帖由 04906 于 2013-2-23 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

另外，CTGF和TNF-alpha就从来都没有做出来过了

在技术上应该不存在问题
你考虑抗体吧

作者: 2541 时间: 2013-2-23 16:43

您好，请问下。为什么相同量的蛋白上样量，只有一个孔出actin，其他的不出。。相当怪异啊。。目的蛋白更是都没有。。100微克的蛋白啊。。我同在一个槽里的都出actin了。就这个4个样。。只出一个孔。。这是为什么呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:44

您好，请问下。为什么相同量的蛋白上样量，只有一个孔出actin，其他的不出。。相当怪异啊。。目的蛋白更是都没有。。100微克的蛋白啊。。我同在一个槽里的都出actin了。就这个4个样。。只出一个孔。。这是为什么呢？

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你的样品染过胶吗？
我认为是样品的问题

作者: 9900 时间: 2013-2-23 16:44

你的样品染过胶吗？
我认为是样品的问题

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我没染胶。。只染了膜。丽春红染的。有条带。，但是一个孔道只有一条。丽春红染色该是非特异的条带吧，就这个孔，只有一条，就一条，横的一条，其他的还有竖的宽电泳跑道，这个孔没有。其他的三个都有明显的竖的跑道，但是ACTIN就一个孔有，不是这个只有一条的孔。。这个是样品问题么？我提的样品还测了浓度的。。。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-2-23 16:45

老师你好！

请教一下：我的目的蛋白，分子量88kD左右，分别于28，18℃诱导，裂解细胞提取上清和沉淀蛋白。
10%SDS-page，转膜恒流200mA，1.5h
5%脱脂奶粉封闭1h，一抗稀释，4℃过夜。二抗稀释1：5000，常温1.5h。

结果是marker染色了，分别是75KD和100KD，1道和4道都是mark，同样。
空白对照(BL21，Ecoli)应该没有目的条带，结果却显示清晰地一条，且和实验组的相同。

是什么原因？封闭时间不够？还是膜没有洗干净？还是其它？

图片附件: 61107685.snap.jpg (2013-2-23 16:45, 12.99 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=14969

作者: ukonptp 时间: 2013-2-23 16:46

老师，你好！
我最近做WB都遇到几个很苦恼的问题，请老师指教
1、几次跑电泳时到溴酚蓝距低端约2cm时几个胶道就跑成曲线了，电泳时间也很久，总共快4个小时
2、溴酚蓝弥散比较严重，条带很不好
3、有次marker在浓缩胶就分离了
4、之前怀疑电泳缓冲液的问题，今天换了新的缓冲液，还是跑斜了，并且marker跑成两个驼峰一样的，溴酚蓝弥散也比较明显，似乎也成驼峰状。今天用的缓冲液体系是，15gTris碱，72g甘氨酸，5gSDS，溶解于1L去离子水，用时稀释为1*。浓缩胶5%，分离胶12%。
图片是我之前做的一次跑斜了的，上面是目的蛋白17kd，下面是Actin，只有前半部分减到了。另一个目的蛋白P53和marker相差10kd以上，没减到。
急，请老师指教可能的原因，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:47

我没染胶。。只染了膜。丽春红染的。有条带。，但是一个孔道只有一条。丽春红染色该是非特异的条带吧，就这个孔，只有一条，就一条，横的一条，其他的还有竖的宽电泳跑道，这个孔没有。其他的三个都有明显的竖的跑道，但是ACTIN就一个孔有，不是这个只有一条的孔。。这个是样品问题么？我提的样品还测了浓度的。。。

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兄弟
电泳就有问题
你是纯化后的蛋白样品电泳？
如果是总蛋白不可能只是一条带啊
先把电泳跑好吧

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:47

老师你好！

请教一下：我的目的蛋白，分子量88kD左右，分别于28，18℃诱导，裂解细胞提取上清和沉淀蛋白。
10%SDS-page，转膜恒流200mA，1.5h
5%脱脂奶粉封闭1h，一抗稀释，4℃过夜。二抗稀释1：5000，常温1.5h。

结果是marker染色了，分别是75KD和100KD，1道和4道都是mark，同样。
空白对照(BL21，Ecoli)应该没有目的条带，结果却显示清晰地一条，且和实验组的相同。

是什么原因？封闭时间不够？还是膜没有洗干净？还是其它？

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是不是应该检查你的诱导条件？
另外一抗再稀释下

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:48

老师，你好！
我最近做WB都遇到几个很苦恼的问题，请老师指教
1、几次跑电泳时到溴酚蓝距低端约2cm时几个胶道就跑成曲线了，电泳时间也很久，总共快4个小时
2、溴酚蓝弥散比较严重，条带很不好
3、有次marker在浓缩胶就分离了
4、之前怀疑电泳缓冲液的问题，今天换了新的缓冲液，还是跑斜了，并且marker跑成两个驼峰一样的，溴酚蓝弥散也比较明显，似乎也成驼峰状。今天用的缓冲液体系是，15gTris碱，72g甘氨酸，5gSDS，溶解于1L去离子水，用时稀释为1*。浓缩胶5%，分离胶12%。
图片是我之前做的一次跑斜了的，上面是目的蛋白17kd，下面是Actin，只有前半部分减到了。另一个目的蛋白P53和marker相差10kd以上，没减到。
急，请老师指教可能的原因，谢谢！

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1，是不是拔梳子时把浓缩胶与分离胶给弄分离了？
2，分离胶聚合不好，可以4度聚合过夜
3，胶底部有气泡，但是有气泡不会成这个样子
4，P53很好做，提取蛋白也没什么难度
5，另外是不是你的实验台斜了啊
其他的我没见你操作就不知道了

作者: duoduo 时间: 2013-2-23 16:48

谢谢版主，今天我又跑了。。跑个梯度。。看看效果怎么样。从跑的样子看。。还不错哦。。嘿嘿。。等待明天的曝光结果。今天等下还要曝光昨天做的。。也许。。会有转机。。我快不行了。。。

作者: 04906 时间: 2013-2-23 16:49

是不是应该检查你的诱导条件？
另外一抗再稀释下

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谢谢老师，我是WB得新手，想再请教一下
1我现在一抗是1：2000，已经是说明书上最大的建议浓度了，建议稀释多少？
2 marker是不该染色的，我的却有条带显示，是一抗的原因吗？想不通啊

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:49

谢谢版主，今天我又跑了。。跑个梯度。。看看效果怎么样。从跑的样子看。。还不错哦。。嘿嘿。。等待明天的曝光结果。今天等下还要曝光昨天做的。。也许。。会有转机。。我快不行了。。。

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跑的样子？
转膜后染膜观察转膜效果吧

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:50

谢谢老师，我是WB得新手，想再请教一下
1我现在一抗是1：2000，已经是说明书上最大的建议浓度了，建议稀释多少？
2 marker是不该染色的，我的却有条带显示，是一抗的原因吗？想不通啊

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Marker也是蛋白，有很多是重组蛋白，带着标签
与你的抗体有反应很正常啊
1：4000稀释试试

作者: INK 时间: 2013-2-23 16:50

LZ.你好，刚开始做WESTERN，遇到的问题是这样的，提取内皮细胞的蛋白，测浓度符合WESTERN要求，上样为20vl，蛋白含量40vg，结果跑了3次了，总是marker跑得很好，考马斯亮蓝染胶没有任何条带，一直找不出原因。很急！恳请楼主帮忙分析一下！谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:51

LZ.你好，刚开始做WESTERN，遇到的问题是这样的，提取内皮细胞的蛋白，测浓度符合WESTERN要求，上样为20vl，蛋白含量40vg，结果跑了3次了，总是marker跑得很好，考马斯亮蓝染胶没有任何条带，一直找不出原因。很急！恳请楼主帮忙分析一下！谢谢！

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那你有没有考虑蛋白浓度测试时有问题？
建议用别人的样品跑一次电泳试试
然后确认是不是你的蛋白没有提取出来

作者: avi317 时间: 2013-2-23 16:52

请问做western-blot时，目的蛋白是胞外蛋白，内参用什么比较合适？胞内的可以吗？谢谢。

作者: pencil菲 时间: 2013-2-23 16:53

最近跑电泳的图像已经发到您的邮箱。126的，谢谢帮忙看下又没什么问题

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:54

请问做western-blot时，目的蛋白是胞外蛋白，内参用什么比较合适？胞内的可以吗？谢谢。

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你做组织还是细胞啊？
如果做组织的话可以选择胞内的内参
另外建议你参考文献上所说

作者: DNA 时间: 2013-2-23 16:54

请问楼主：有做过人FSH（约30K）的WB吗？

我最近在做，
用恒压80V 2h转（电流约200mA,跟温度有关啊）
一抗santa,1:150
二抗：invitrogen 1:10000
GE ECL显影

结果：目的蛋白处没有任何条带

但Marker 有清晰条带，

请问我该如何改进？

谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-23 16:55

请问楼主：有做过人FSH（约30K）的WB吗？

我最近在做，
用恒压80V 2h转（电流约200mA,跟温度有关啊）
一抗santa,1:150
二抗：invitrogen 1:10000
GE ECL显影

结果：目的蛋白处没有任何条带

但Marker 有清晰条带，

请问我该如何改进？

谢谢！

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你这个蛋白是分泌型的蛋白
做组织来源的还是细胞？

作者: mimili_901 时间: 2013-2-23 16:55

你好，请问一下：
我做的是ps1,28kd左右，刚开始几次用牛奶封闭（光明脱脂奶）做不出来，后来该用1%bsa封闭居然做出来（虽然同时加大了上样量），只是非特异带太多，看园子里战友都说两者封闭效果差不多，于是在接下来的几次里再次改用牛奶封闭（bsa太贵，而且杂带确实很多），而且上样量>=上次做出来的上样量，其他条件都没有变过。但都没有做出来，直接一片空白，
我真的想知道bsa或牛奶封闭在能不能做出来这方面起到这么大的决定作用？
谢谢！

作者: PCR 时间: 2013-2-23 16:56

版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！

作者: fsdd817 时间: 2013-2-23 16:57

你好，我现在在做cleaved-caspase-3的WB，可是已经做了好几次了，每次都是白板，希望fangweibin119老师帮帮我，以下是我跑WB的条件:

1 膜是0.45um,电转时间120min
2 15%和10%的胶都试过
3 一抗是cell signaling 公司的，浓度为1：500，二抗是中衫的，1：2000，封闭液5%的奶粉
谢谢!

作者: BOSS2011 时间: 2013-2-23 16:58

你好，我现在在做cleaved-caspase-3的WB，可是已经做了好几次了，每次都是白板，希望fangweibin119老师帮帮我，以下是我跑WB的条件:

1 膜是0.45um,电转时间120min
2 15%和10%的胶都试过
3 一抗是cell signaling 公司的，浓度为1：500，二抗是中衫的，1：2000，封闭液5%的奶粉
谢谢!

我觉得可能原因：１．你的蛋白没有被激活，因为你做的是cleaved-caspase-3，需要caspase-３被激活才可以；２．蛋白上样量少了；３．ＥＣＬ问题；４．转膜问题；５．其他

作者: ero11 时间: 2013-2-23 16:58

请问大侠，NC膜和PVDF膜怎么使用，您能详细给我解答吗，谢谢！

作者: qqq111 时间: 2013-2-23 16:59

哪位能给我解释一下：在做wb时，上样量、一抗浓度、二抗浓度、ecl发光液之间的量的关系。这四者之间到底有没有关系？怎样的关系？我现在怀疑上样量过大会造成：wb的结果是空白的片子。

作者: 831226 时间: 2013-2-23 16:59

> >我推测会不会是你配胶和凝胶有问题呢？再者，电泳的时间如果必须那么长应该降温的。当然后者不至于出来斜的。仅供参考，希望有用。
>
> 蒽，我想也是分离胶凝固的时间短了，不到一个小时，电泳时间太长后来太热是不是会把下面的分离胶给融了。
> 还有我想再请教您一下，我做的目的蛋白p53曝光时间30分钟，没做出来，actin做出来了，抗体是santa cruz兔多抗，浓度1：200，不知道是不是曝光时间不够还是怎么回事？上样量约50ug。看您在前面说p53很容易做出来，我做了几次都没做出来。。。不过曝光时间都在30分钟以内，没试过过夜曝光。
> 再次感谢您~

不必客气！其实我也是新手，观点仅供参考！一般我是配好ECL后稍震荡混匀后放在暗房中，做一下其他准备工作，约1-2分钟后在暗房孵育，关门，看到荧光后转移至保鲜膜中，开始压片。有时候是会过几分钟在保鲜膜中的荧光更亮，也可以理解，但前提是之前要见到荧光的。我一般看不到荧光是不会先曝光的。其实如果二抗的浓度合适，荧光没有那么容易淬灭的。据说如果加上ECL5s内出现荧光，说明二抗浓度过高，而且这种一般淬灭也较快。P53我没有做过，您可能看错贴了，请另外问做过的高手吧，祝好运！
关于胶会不会温度高再融我说不好，不太清楚。最好前一晚配好，在4度过夜让胶充分交联好些。个人经验，分离胶需至少常温1h后再动它，再加浓缩胶。仅供参考哈，希望有用，goodluck！

作者: october7 时间: 2013-2-23 17:00

楼主你好，今天我的内参加上发光液后立马就可以在PVDF膜上看到很明显的黄黑色条带，到暗室曝光时，条带的地方却是黑色的，曝光出来的条带是白色的，背景是黑色的，只有条带的轮廓，请帮我分析一下原因，昨天的结果还是好好的，一样的条件就是二抗孵育的时间由1小时延长到了2小时

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:01

你好，请问一下：
我做的是ps1,28kd左右，刚开始几次用牛奶封闭（光明脱脂奶）做不出来，后来该用1%bsa封闭居然做出来（虽然同时加大了上样量），只是非特异带太多，看园子里战友都说两者封闭效果差不多，于是在接下来的几次里再次改用牛奶封闭（bsa太贵，而且杂带确实很多），而且上样量>=上次做出来的上样量，其他条件都没有变过。但都没有做出来，直接一片空白，
我真的想知道bsa或牛奶封闭在能不能做出来这方面起到这么大的决定作用？
谢谢！

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两者的封闭效果是有不同
有些蛋白有不同的要求，如磷酸化蛋白就需要用BSA
BSA的使用浓度要高一些，至少3%

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:02

版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！

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每个泳道上样量一致吗？
内参条带是不是参差不齐？
如果是这样的话浓度低的要提高上样量

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:02

请问大侠，NC膜和PVDF膜怎么使用，您能详细给我解答吗，谢谢！

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NC膜在转移缓冲液中平衡后直接使用
PVDF用无水甲醇活化10S左右，用蒸馏水洗去无水甲醇，然后在转移缓冲液中平衡后直接使用

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:03

楼主你好，今天我的内参加上发光液后立马就可以在PVDF膜上看到很明显的黄黑色条带，到暗室曝光时，条带的地方却是黑色的，曝光出来的条带是白色的，背景是黑色的，只有条带的轮廓，请帮我分析一下原因，昨天的结果还是好好的，一样的条件就是二抗孵育的时间由1小时延长到了2小时

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膜是不是没有活化好

作者: kulee 时间: 2013-2-23 17:03

我一直在做wb，结果是时好时坏。做xiap蛋白，好几天没有结果了，今天出了个beta-actin.但是和以前的内参结果不一样

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:04

QUOTE:

原帖由 kulee 于 2013-2-23 17:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一直在做wb，结果是时好时坏。做xiap蛋白，好几天没有结果了，今天出了个beta-actin.但是和以前的内参结果不一样

样品多长时间了
中间冻融过吗

作者: kulee 时间: 2013-2-23 17:05

没冻融过谢谢。谢谢
新提取的
同一个样品，不同的上样量，会出现这样的结果，是上样量太大了吗？还是1，2抗的浓度需要再调整呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:06

同一个样品，不同的上样量，会出现这样的结果，是上样量太大了吗？还是1，2抗的浓度需要再调整呢？

=======================================

从内参条带来看上样是太大了
抗原含量太高把抗体都结合完了（一抗不够）
出现部分结合不好
另外你的孵育体系是多少ml？

作者: langlang 时间: 2013-2-23 17:06

膜是不是没有活化好

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请问版主这种情况为何不考虑是二抗过剩呢？他的这种情况不是“反影”吗？和抗体过剩的反影怎么区别呢？谢谢！

作者: 2541 时间: 2013-2-23 17:07

从内参条带来看上样是太大了
抗原含量太高把抗体都结合完了（一抗不够）
出现部分结合不好
另外你的孵育体系是多少ml？

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孵育体系: 1,2抗都是4ml.

作者: windy+++ 时间: 2013-2-23 17:07

版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！

每个泳道上样量一致吗？
内参条带是不是参差不齐？
如果是这样的话浓度低的要提高上样量

上样量没有问题啊，内参很均匀啊，跟选的组织也没关系的，不知道还有什么因素没考虑到

作者: any333 时间: 2013-2-23 17:08

老师您好，我要做的是膜蛋白，想问问提蛋白时要注意什么，裂解液和各种抑制剂需要哪些。另外，我想问下120-130kd蛋白，湿转NC膜需要什么条件，PVDF膜什么条件（恒流？恒压？多大，多长时间），多谢

作者: is2011 时间: 2013-2-23 17:08

你好，我想问一下转膜时maker有一些转到滤纸上了，这时蛋白是否也转过了？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:08

请问版主这种情况为何不考虑是二抗过剩呢？他的这种情况不是“反影”吗？和抗体过剩的反影怎么区别呢？谢谢！

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呵呵
可以这么考虑
上样量太大，抗体特异性不好、浓度太高均可出现这种情况
另外我做植物蛋白的时候也容易出现这种情况（用兔血清）

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:09

孵育体系: 1,2抗都是4ml.

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那你认为在孵育抗体的时候膜能充分接触液体吗？
同时液体能均匀流动吗？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:10

版主，我做得wb内参都出来了，目的条带有得泳道有有的泳道没有，按说应该都有的，内参都出来了，应该可以排除提蛋白得问题，我这个蛋白是提取得组织的蛋白，组织的这种目的蛋白含量应该不低得，提取过程也没什么问题得，想请教下这个可能得原因？多谢！！！

每个泳道上样量一致吗？
内参条带是不是参差不齐？
如果是这样的话浓度低的要提高上样量

上样量没有问题啊，内参很均匀啊，跟选的组织也没关系的，不知道还有什么因素没考虑到

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告我蛋白名称
内参出来只能说明蛋白提取、WB过程没有问题
但是能不能把目的蛋白提取出来就不一定了
如果是核蛋白或者膜蛋白，提取就麻烦一些

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:10

你好，我想问一下转膜时maker有一些转到滤纸上了，这时蛋白是否也转过了？

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用丽春红染色鉴定

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:11

老师您好，我要做的是膜蛋白，想问问提蛋白时要注意什么，裂解液和各种抑制剂需要哪些。另外，我想问下120-130kd蛋白，湿转NC膜需要什么条件，PVDF膜什么条件（恒流？恒压？多大，多长时间），多谢

========================================

1，注意膜蛋白提取
2，NC膜与PVDF膜没有太大区别
NC膜在缓冲液中平衡后即可使用
PVDF膜用无水甲醇活化后用缓冲液平衡后使用
PVDF膜机械强度、蛋白载量高于NC膜
3，转膜条件：300mA 恒流 2h或者2h30min均可

作者: KGZ564 时间: 2013-2-23 17:11

蛋白用SDS-PAGE染色，转膜后膜用丽春红染色，这是不可忽略的步骤
您说的蛋白染色是跑完胶后用卡玛斯亮蓝染胶么？再用洗脱液洗去？
还麻烦老师给个比较好的查询蛋白定位的网站，谢谢

作者: yonger 时间: 2013-2-23 17:12

你好，我最近做P38MAPK的检测，第一次的时候四个目的组的条带都出来了，但是两个强表达的组还可以条带，两个弱表达的不是很亮，而且有个组的条带中间是断开的，第二次做的时候就只有两个强表达组的条带出来了，两个弱表达的条带没有。两次做的条件是完全一样的，想问问楼主是什么原因啊？
不胜感谢！

作者: yonger 时间: 2013-2-23 17:12

您好！
我做的蛋白的分子量是40左右，内参用的是β-actin，平时转膜是湿转200mA，3小时。内参做的结果很好。但是昨天转膜的时候发现转膜结束的时候膜基本上干了，看上去很斑驳。用的是碧云天的封闭液，4度封闭过夜之后再在摇床上常温封闭一个小时，封闭结束之后膜跟以前没有什么变化。
想请问楼主转膜转干的原因是什么？这样会不会影响实验结果？
O(∩_∩)O谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:15

蛋白用SDS-PAGE染色，转膜后膜用丽春红染色，这是不可忽略的步骤
您说的蛋白染色是跑完胶后用卡玛斯亮蓝染胶么？再用洗脱液洗去？
还麻烦老师给个比较好的查询蛋白定位的网站，谢谢

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跑完胶后然色，常用考马斯亮蓝系列染色液。染色之后要脱色液脱色才能看到条带

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:15

你好，我最近做P38MAPK的检测，第一次的时候四个目的组的条带都出来了，但是两个强表达的组还可以条带，两个弱表达的不是很亮，而且有个组的条带中间是断开的，第二次做的时候就只有两个强表达组的条带出来了，两个弱表达的条带没有。两次做的条件是完全一样的，想问问楼主是什么原因啊？
不胜感谢！

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每次用新的一抗孵育（我一般一抗最多用两次）
中间断开的条带有可能是转膜时有气泡

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:16

您好！
我做的蛋白的分子量是40左右，内参用的是β-actin，平时转膜是湿转200mA，3小时。内参做的结果很好。但是昨天转膜的时候发现转膜结束的时候膜基本上干了，看上去很斑驳。用的是碧云天的封闭液，4度封闭过夜之后再在摇床上常温封闭一个小时，封闭结束之后膜跟以前没有什么变化。
想请问楼主转膜转干的原因是什么？这样会不会影响实验结果？
O(∩_∩)O谢谢

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我个人认为PVDF膜不能干燥，因为干燥后就容易出现你出现的斑驳
另外NC膜就不会存在这种情况
RT封闭30min或者4度过夜
你在湿转槽中转膜怎么会转干？
另外40K的蛋白 300mA 1h足以

作者: 00无名指00 时间: 2013-2-23 17:16

跑完胶后然色，常用考马斯亮蓝系列染色液。染色之后要脱色液脱色才能看到条带

已经已经收到您的短信息，谢谢！！很多抗体推荐4度过夜。请问这个时间一般最好是多少，我一般是晚上六点1抗孕育。第二天早上9点结束，请问这个时间正常么？一般最好是多少？

作者: vcve 时间: 2013-2-23 17:41

跑完胶后然色，常用考马斯亮蓝系列染色液。染色之后要脱色液脱色才能看到条带

已经已经收到您的短信息，谢谢！！很多抗体推荐4度过夜。请问这个时间一般最好是多少，我一般是晚上六点1抗孕育。第二天早上9点结束，请问这个时间正常么？一般最好是多少？

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谢谢！！很多抗体推荐4度过夜。请问这个时间一般最好是多少，我一般是晚上六点1抗孕育。第二天早上9点结束，请问这个时间正常么？一般最好是多少？

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:44

已经已经收到您的短信息，谢谢！！很多抗体推荐4度过夜。请问这个时间一般最好是多少，我一般是晚上六点1抗孕育。第二天早上9点结束，请问这个时间正常么？一般最好是多少？

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我的理解是：过夜一般在12h左右，时间长一些也没有关系。我试过4度孵育5天的，结果照样很好

作者: wmp1234 时间: 2013-2-23 17:44

我的理解是：过夜一般在12h左右，时间长一些也没有关系。我试过4度孵育5天的，结果照样很好

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谢谢解答。最近内参有杂带，怀疑是一抗孕育时间过长的原因。后来减少一抗浓度，有好转。

作者: ROSE李 时间: 2013-2-23 17:44

请问哪位前辈做过E-cadherin 呀，我最近做的E-cadherin 都是出来两个条带，重复收了几次样都是这样，不同的药物干预后也是同样的。我是从细胞里提取蛋白，用的是上海生工的RIPA强裂解液。是裂解方法的问题还是什么原因呀？请哪位前辈指点一下。非常感谢。

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:45

我的理解是：过夜一般在12h左右，时间长一些也没有关系。我试过4度孵育5天的，结果照样很好

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谢谢解答。最近内参有杂带，怀疑是一抗孕育时间过长的原因。后来减少一抗浓度，有好转。

杂带与抗体特异性、抗体浓度、抗原是否降解有关
与孵育时间不存在直接关系

作者: NBA 时间: 2013-2-23 17:45

请问哪位前辈做过E-cadherin 呀，我最近做的E-cadherin 都是出来两个条带，重复收了几次样都是这样，不同的药物干预后也是同样的。我是从细胞里提取蛋白，用的是上海生工的RIPA强裂解液。是裂解方法的问题还是什么原因呀？请哪位前辈指点一下。非常感谢。

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抗体不同浓度试过吗？
1，抗体特异性问题，有些抗体就是不同的特异性条带，这也正常
2，蛋白本身特点
3，抗原降解

作者: PCR 时间: 2013-2-23 17:46

版主你好：我要做WB现在找到一个单抗，种属很适合我做的（猫）但抗体没有注明应用（未注明：WB.IP等信息）我可不可以用呀？是不是一般的抗体未特殊说明的都可以做WB呀？

作者: yapuyapu 时间: 2013-2-23 17:46

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢

作者: 831226 时间: 2013-2-23 17:47

你好，最近在做分子量为190KD的蛋白，用的是10%的胶，100V电泳2小时，转膜也是100V2小时，最后没有做出来，不知道转膜时间及电流该多大，还有7.5%的胶配方知道是多少吗？请教了，谢谢

作者: 101010 时间: 2013-2-23 17:47

你这个蛋白是分泌型的蛋白
做组织来源的还是细胞？

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一个尿液里提纯的，0.2mg/ml
还有就是基因工程的了，CHO分泌的

转膜的条件合适吗？

一抗会不与变性的蛋白反应吗？（如果原来做抗体的蛋白分子量与我的目的蛋白不用，因糖基化程度不同，会影响我的蛋白跟这个抗体结合？）

谢谢！

作者: nn255 时间: 2013-2-27 12:00

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:01

QUOTE:

原帖由 nn255 于 2013-2-27 12:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢 ...

可以选择8%的胶
配制方法参考《蛋白质技术手册》或者一些网站上的资料
转膜我一般用恒流
像这个蛋白用300mA恒流，2h30min左右

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:01

老师您好，谢谢你的回答，我就是想问您膜蛋白提取时，具体的步骤及注意事项，我做很久了，各方面问题也思考很多，希望得到您详细回答。另外NC膜和PVDF膜转膜都是300mA ,两个小时到两个半小时吗（120-130kd），谢谢

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时间你可以自己选择，时间上没有严格的限制
如果说膜蛋白丰度较大一般可以采用RIPA强配方
如果说丰度较小的话可以采用膜蛋白提取试剂盒

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:06

一个尿液里提纯的，0.2mg/ml
还有就是基因工程的了，CHO分泌的

转膜的条件合适吗？

一抗会不与变性的蛋白反应吗？（如果原来做抗体的蛋白分子量与我的目的蛋白不用，因糖基化程度不同，会影响我的蛋白跟这个抗体结合？）

谢谢！

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一般的WB抗原都是变性的，所以说大部分情况下是识别的

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:07

你好，版主，问一个问题：我上样量一样，但是跑出来的条带怎么有粗有细，粗的不好看而且还很模糊。怎么样才能让其变得很细且很清晰。
我附图如下：

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1，转膜时有气泡
2，孵育抗体时部分没有孵育好
3，ECL孵育是否完全

作者: jrwyyplt 时间: 2013-2-27 12:07

大家好，我刚开始做wb，我从细胞中提的蛋白，我是从视网膜色素细胞（rpe）中提取的蛋白，浓度大概在10ug/ul以上，上了20ul，100v，120v电泳，转膜前，pvdf在甲醇中泡10min，然后和滤纸，垫片，一起在转膜缓冲液中泡30min，100v，100min湿转，转后在pvdf上可以看到mark的痕迹，其它没有痕迹。没有立春红染色。但是同跑的一块胶我做了考马斯染色，有条带的。5%脱脂奶粉TBST室温封闭1小时，santa一抗 1：200TBST稀释（推荐1：200-1：1000）4°C孵过夜，tbst 3*10min，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1+小时。都是TBST洗膜4*15min。
发光剂是国产ECL。暗室曝光2min，（我的膜用两层保鲜膜包裹，正反面用两张x胶片，用手压住2min），显影1min，定影出来都是黑色的胶片，似乎没有任何信号，我不知道原因。请高手赐教！！！
那我现在能不能这样做：膜我放在4度冰箱，拿出来用tbst洗3遍，再用二抗孵育，再用ecl，显影，定影。

这样可以么？

还有就是我买了康成的HRP标记的gapdh，请问这内参什么时候加入啊？

图片附件: 19048899.snap.jpg (2013-2-27 12:07, 15.88 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15008

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:08

大家好，我刚开始做wb，我从细胞中提的蛋白，我是从视网膜色素细胞（rpe）中提取的蛋白，浓度大概在10ug/ul以上，上了20ul，100v，120v电泳，转膜前，pvdf在甲醇中泡10min，然后和滤纸，垫片，一起在转膜缓冲液中泡30min，100v，100min湿转，转后在pvdf上可以看到mark的痕迹，其它没有痕迹。没有立春红染色。但是同跑的一块胶我做了考马斯染色，有条带的。5%脱脂奶粉TBST室温封闭1小时，santa一抗 1：200TBST稀释（推荐1：200-1：1000）4°C孵过夜，tbst 3*10min，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1+小时。都是TBST洗膜4*15min。
发光剂是国产ECL。暗室曝光2min，（我的膜用两层保鲜膜包裹，正反面用两张x胶片，用手压住2min），显影1min，定影出来都是黑色的胶片，似乎没有任何信号，我不知道原因。请高手赐教！！！
那我现在能不能这样做：膜我放在4度冰箱，拿出来用tbst洗3遍，再用二抗孵育，再用ecl，显影，定影。

这样可以么？

还有就是我买了康成的HRP标记的gapdh，请问这内参什么时候加入啊？

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胶片曝光了，暗室中不是很暗吧

作者: jrwyyplt 时间: 2013-2-27 12:08

我用手电筒，外面罩了个红色塑料袋~~~条件简陋啊

作者: mimili_901 时间: 2013-2-27 12:09

版主你好！
我提的蛋白的浓度比较低，只有1.6mg/ml，上样的时候能不能少上一些啊？像我这种情况，在保证实验结果的前提下，多少合适啊？麻烦了

作者: mimili_901 时间: 2013-2-27 12:09

版主你好！我做WB时要做370KDa的ATM，没法跟别的抗原分子量很小的蛋白一块电泳和转膜，像这样的蛋白，电泳时间（100V,60mA)和转模时间，一般设在多少为宜？谢谢了

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:10

我用手电筒，外面罩了个红色塑料袋~~~条件简陋啊

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把红色塑料袋换一下
你这张胶片就是被整体曝光了

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:11

版主你好！
我提的蛋白的浓度比较低，只有1.6mg/ml，上样的时候能不能少上一些啊？像我这种情况，在保证实验结果的前提下，多少合适啊？麻烦了

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不知道你要做什么蛋白
加上5倍loading后浓度就是：1.28了
上样孔一般能上25ul
如果蛋白丰度可以的话上20ug~30ug就够了

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:12

版主你好！我做WB时要做370KDa的ATM，没法跟别的抗原分子量很小的蛋白一块电泳和转膜，像这样的蛋白，电泳时间（100V,60mA)和转模时间，一般设在多少为宜？谢谢了

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不知道你有没有梯度胶
如果没有的话不知道你有没有中型电泳槽（分离胶高度达到10cm，参考六一厂 DYCZ-24EN）
小型电泳槽没法同时把目的蛋白及内参都保留在膜上一起杂交
小分子量的蛋白只能再跑一次电泳来确定
你的这个蛋白是核蛋白
需要用胞浆、胞核蛋白抽提试剂盒来提取（不明白的地方站内信息联系）

作者: guagua 时间: 2013-2-27 12:13

最近做实验,总是出现好多带,就是没有目的条带,请斑主帮看下可能是什么原因啊
10%胶,上面是22KD,下面100KD的.电泳40mA,2h,转膜100V，2h，封闭5%牛奶2h，一抗（1：200，santa cruz）4度过夜，二抗（1：15000）2h,ECL发光。

图片附件: 69039857.snap.jpg (2013-2-27 12:13, 13.63 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15009

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:19

最近做实验,总是出现好多带,就是没有目的条带,请斑主帮看下可能是什么原因啊
10%胶,上面是22KD,下面100KD的.电泳40mA,2h,转膜100V，2h，封闭5%牛奶2h，一抗（1：200，santa cruz）4度过夜，二抗（1：15000）2h,ECL发光。

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你做的是什么蛋白啊

作者: youyou99 时间: 2013-2-27 12:20

相关疾病：
黑色素瘤

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你做的是什么蛋白啊

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是人黑色素瘤细胞的TIMP1 和 RECK (MMP的抑制因子)

作者: tuuu2 时间: 2013-2-27 12:21

我今天把上次的膜用tbst洗了一下，再加1：5000的gapdh，1h，再用tbst洗，然后ecl，拿到暗室后，发现一点荧光都没有。x胶片拿出来都没有印记的，黑色的一片。还是不知道原因~~~

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:22

我今天把上次的膜用tbst洗了一下，再加1：5000的gapdh，1h，再用tbst洗，然后ecl，拿到暗室后，发现一点荧光都没有。x胶片拿出来都没有印记的，黑色的一片。还是不知道原因~~~

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黑色的一片是你的胶片整体曝光了
造成胶片这样的原因有：1，暗室外界漏进的光太强；2，手电上的红布不合适，导致胶片走光，3，胶片过期，4，显影液与胶片不配套

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:23

相关疾病：
黑色素瘤

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是人黑色素瘤细胞的TIMP1 和 RECK (MMP的抑制因子)

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1，确定二抗稀释度
2，确定后用几个不同的一抗稀释度来摸条件
3，注意膜蛋白提取方法

作者: vcve 时间: 2013-2-27 12:24

谢谢楼主再三帮我解决问题！！我今天定了碧云天的显影剂和定影及，和ecl显影液，我用红色灯泡再试试！！！还有用立春红染色看看，再三感谢

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:25

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2013-2-27 12:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
谢谢楼主再三帮我解决问题！！我今天定了碧云天的显影剂和定影及，和ecl显影液，我用红色灯泡再试试！！！还有用立春红染色看看，再三感谢

转膜后先用丽春红染色
再进行后续步骤

作者: vcve 时间: 2013-2-27 12:25

楼主您好！
最近一个新问题让我伤透了脑筋
一周之前配了一套制胶的试剂，是Tris和甘氨酸是老板新给的，Tris看样子是过期的（不认为是过期的问题，因为以前开始摸索条件时就用的是肯定过期的Tris，效果很好），甘氨酸是新的。胶凝固没有问题，40分钟之内就能凝固好，室温为15°左右。跑的时候特别慢，以前成功的经验是4%浓缩胶（大概1.5cm）60V，20多分钟就能跑到12%分离胶界面，然后压缩成一条细线，看着就高兴！
现在半个多小时过去了，也到不了分离胶的界面，时间再往后延长，MARKER能慢慢的进入分离胶，但是看不到以前的那种浓缩现象，分离范围很窄，慢是主要问题，包括所有的样品都是这个样子。电极丝上的气泡很多，估计不是电流的问题。
怀疑是丙烯酰胺的问题（已经有四个多月了），把它倒到锥形瓶内，很清凉透明，没有杂质沉淀，重新配置了（sigma粉剂没有过期），没有过滤，因为以前就是这么做的，效果很好，也验证了PH为5.5左右，小于7，合乎文章上说的；
也怀疑是调节PH时错用了冰乙酸，因此重新配置分离胶、浓缩胶和电泳液，又用盐酸调pH，盐酸浓度大概为浓盐酸的一半，pH仪来调整；
将新配的东西重新来做，慢的原因没有一点改变。
补充一点：一周之前配的胶由于跑的很慢，一个多小时后就终止了。maker慢慢的全部进入分离胶后分离的条带变少了，分子量大的由分离状态变为融合状态，而且小分子量的条带几乎就不再往下跑了。卸下玻璃板时发现分离胶又隐约分了三层，marker的带主要集中在其中的第二层，第一层也有，但是最底下的那层几乎没有marker的条带进入，不明白为什么？
如果楼主能给学生指明方向，学生不尽感激！

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:26

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2013-2-27 12:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主您好！
最近一个新问题让我伤透了脑筋
一周之前配了一套制胶的试剂，是Tris和甘氨酸是老板新给的，Tris看样子是过期的（不认为是过期的问题，因为以前开始摸索条件时就用的是肯定过期的Tris，效果很好），甘氨酸是新的。胶凝固 ...

1，你用冰醋酸调那个试剂的pH？
2，用盐酸又是调整那个试剂？
3，我认为是你的浓缩胶与分离胶缓冲液pH的问题
4，你检查一下电泳槽的接触点

作者: vcve 时间: 2013-2-27 12:27

谢谢楼主的及时解答！
我是重新配的浓缩胶与分离胶，再用盐酸调，不是在原来的旧液基础上调的
至于说电泳槽的接触点，我每次都能发现电极丝上的气泡很多，应该不是电源接触的问题
现在重新配了SDS，正在等待结果
再次感谢楼主，有了确定的结果再反馈给楼主啊

作者: ladyhuahua 时间: 2013-2-27 12:27

谢谢楼主的及时解答！
我是重新配的浓缩胶与分离胶，再用盐酸调，不是在原来的旧液基础上调的
至于说电泳槽的接触点，我每次都能发现电极丝上的气泡很多，应该不是电源接触的问题
现在重新配了SDS，正在等待结果
再次感谢楼主，有了确定的结果再反馈给楼主啊

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我有一次是因为电泳液没有加足，使得无法“泳”动，不知你是不是这个原因，仅供参考！

作者: mysmdbl 时间: 2013-2-27 12:27

transfer buffer 中tris base and Glycin 的作用是什么？如果Glycin加多了会怎么样？

作者: vcve 时间: 2013-2-27 12:28

我有一次是因为电泳液没有加足，使得无法“泳”动，不知你是不是这个原因，仅供参考！

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电泳液的量是充足的，两者内外槽有一定的落差，内槽的液体也高于矮的薄玻璃板，谢谢这位热心人

作者: mysmdbl 时间: 2013-2-27 12:29

电泳液的量是充足的，两者内外槽有一定的落差，内槽的液体也高于矮的薄玻璃板，谢谢这位热心人

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不谢！请问你每次都是这样吗？我的意思是我们都是要保持液面一样高啊，由于是相通的，内槽的液面总归要下降和外面的一致的。如果单纯是内槽的液面够高也没用的，必然会直接影响电泳到。如果持平就不存在我讲的这个情况了。

作者: mysmdbl 时间: 2013-2-27 12:30

请问版主，我相同的上样量和抗体浓度，有时候出现反影有时又是会背景很深很窄的条带，试过很多次了，对上样和抗体浓度也降低试过，但是又会出现白板的情况，很郁闷，不知您建议如何摸索？我的是核蛋白。ECL显影时会看到先有弱的荧光，但后面会看到背景出现，即一片荧光。非常感谢！

作者: vcve 时间: 2013-2-27 12:30

1，你用冰醋酸调那个试剂的pH？
2，用盐酸又是调整那个试剂？
3，我认为是你的浓缩胶与分离胶缓冲液pH的问题
4，你检查一下电泳槽的接触点

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错误找到了，真是佩服楼主的博闻强识！
“4，你检查一下电泳槽的接触点”，就是这方面的原因，电泳槽没有问题，但是电泳仪有问题，是正极的接线孔有问题，换了另外一组接线孔电泳的速度就上来了！非常欣慰！
补充一点，我犯了一个错误--认为内槽的电极丝有气泡就断言电泳仪和电泳槽都没有问题，其实内槽是负极，它有气泡（应该是氢气吧）只能说明负极的连接没有问题；而外槽的电极一般气泡（应该是氧气吧）不是很明显，所以无法直接判断正极的接线是否正确。
感谢每一位留意此贴的同仁们

作者: remenb 时间: 2013-2-27 12:31

弱弱的问一下：立春红能重复使用么？

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:32

弱弱的问一下：立春红能重复使用么？

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可以
但是不建议重复使用多次

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:32

transfer buffer 中tris base and Glycin 的作用是什么？如果Glycin加多了会怎么样？

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缓冲及电极液
glycine的浓度有一定的范围

作者: S6044 时间: 2013-2-27 12:33

你好版主！我也是WB的新手，做了多次没有结果之后，看到了你的答疑帖，发现你经验很多，所以请你帮忙解答疑问。
我要做的蛋白是水通道AQP4，32KD。先把AQP4转染细胞，一组做免疫荧光显示转进去了，效率也行。另一组提取蛋白， actin WB的条带很好。
电泳用5%浓缩胶，10%的分离胶，上样每孔150ug蛋白（之前用75ug没爆出带）。转膜200mA，3h，转后考染胶无条带。
抗体用的是chemicon的一抗，说明书上写显出来的是38KD，实验室人一直用1：400稀释，结果不错，所以我也用这个浓度。
二抗sigma，1：10000，也是实验室常用浓度。
底物是millpore HRP。
如图是不同曝光时间2-10min的结果，右边是最后考染膜。片中显示的五道从左开始分别是只加上样buffer的保护孔、可显影的marker、转染AQP4的一种亚型的细胞蛋白、第二种亚型的、第三种亚型的。片子和膜都是原位摆放的，三个片子中部较粗的带几乎是和膜中部较粗的带是同一位置的。膜上的最右边是普通marker，中间最粗的是40，下面是30、24.
我的疑问：
1，好像曝光出来的带就是膜上的蛋白带，但是我的目的蛋白是膜蛋白，丰度不会那么高，请问片子上30多的主带是不是目的蛋白？
2，为什么会有那么多杂带？
3，第一种亚型的分子量是上面所说的，第二种和第三种要比第一种小2-4KD，那在片中两道明显的主带却不见有差别。
4，第二道的marker为显影可见的，以前爆出来过清晰的几条带，可是这把为什么乱七八糟？
5，第一道保护孔里没上蛋白，也没有溢进去蛋白，为什么还有带？
6，AQP4文献一般说32-34kD，为什么一抗的说明书说他们产品显得是38kD？
7，我这个预染marker的有些条带我感觉不准，跟别人的marker一起跑不一致，是否marker市场存在这样的问题？请您推荐一款准确的marker产品。
请解答，多谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15010

作者: S6044 时间: 2013-2-27 12:33

另一个案例：鼠脑提的蛋白（-20中存放较长时间的），还是做AQP4，没有曝出带，后染膜发现蛋白带很不清晰，模糊成一团，如图，请问是什么原因导致条带不清晰？这是暴不出带的只要原因吗？

作者: gemei0115 时间: 2013-2-27 12:34

我刚刚做这个，请问一下一抗和二抗的稀释度应该怎么估算啊，今天做了一次，一抗是小鼠腹水，1：5000稀释的，二抗1：8000稀释的，每次都洗了很久，但是结果背景颜色很黑，是怎么回事啊

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-2-27 12:34

请教一个关于凝胶配制的问题。
通常情况下，都是配的30% Acr/bic（29：1），碧云天里还有出售40% Acr/bic（39：1）。不知道这2者之间的区别是什么？我参考到一些文献，有把Acr与bic的比值提高到50：1，那他们的质量分数该是多少呢？还是30%么？即能不能按30% Acr/bic（50：1）配？

作者: ROSE李 时间: 2013-2-27 12:34

我的19KD蛋白，该怎么转膜啊，bio-rad湿转

作者: wu11998866 时间: 2013-2-27 12:35

你好。我在做WB时条带是这样子的（条带不连续）。请你帮我分析一下。

图片附件: 43870704.snap.jpg (2013-2-27 12:35, 2.71 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15011

作者: nut6694 时间: 2013-2-27 12:36

您好！
前段时间做的内参的条带很好，背景也不错。但是最近开始做目的之后发现开始出现问题。我的内参和目的的分子量比较接近，所以用的条件基本上一致。不知道是什么原因？我的样本量一共是四个，正常应该是两边的比较弱表达，中间的两个条带是强表达组。想请斑竹指教一下，O(∩_∩)O谢谢

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15012

作者: nut6694 时间: 2013-2-27 12:36

还有就是有时候条带出现好像拖尾的情况，在曝光的过程中我应该没有动过片子。

图片附件: 36809810.snap.jpg (2013-2-27 12:36, 16.17 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15013

作者: nut6694 时间: 2013-2-27 12:36

上面的这个是我的最终的目的，一共是六个，但是奇怪的是中间的一个条带没有出来，可能是什么原因呢？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15014

作者: yapuyapu 时间: 2013-2-27 12:37

请问版主，最近western 经常遇到一个怪问题，我在转模前制作三明治的时候，仔细检查过没有气泡，也用波棒擀过，但每次转完膜后当我掀起滤纸后，总是很伤心的发现:胶与膜之间有数个明显的气泡，不明白呀？why?

作者: wmp1234 时间: 2013-2-27 12:37

SDS-PAGE之后，胶经过了考马斯亮蓝染色和甲醇脱色后，这块胶还能不能用于转膜后做WB？

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:37

膜上的最右边是普通marker，中间最粗的是40，下面是30、24.
我的疑问：
1，好像曝光出来的带就是膜上的蛋白带，但是我的目的蛋白是膜蛋白，丰度不会那么高，请问片子上30多的主带是不是目的蛋白？
2，为什么会有那么多杂带？
3，第一种亚型的分子量是上面所说的，第二种和第三种要比第一种小2-4KD，那在片中两道明显的主带却不见有差别。
4，第二道的marker为显影可见的，以前爆出来过清晰的几条带，可是这把为什么乱七八糟？
5，第一道保护孔里没上蛋白，也没有溢进去蛋白，为什么还有带？
6，AQP4文献一般说32-34kD，为什么一抗的说明书说他们产品显得是38kD？
7，我这个预染marker的有些条带我感觉不准，跟别人的marker一起跑不一致，是否marker市场存在这样的问题？请您推荐一款准确的marker产品。
请解答，多谢！

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1、转染的细胞应该有特异性表达的条带，如染膜所示，会有条带较粗的情况
2、杂带问题与抗体有关，抗体质量、稀释度调整等
3、抗体是不是重复使用了？marker的显影与曝光时间、一抗、二抗等有关
4、marker中的蛋白影响了边上的泳道
5、不同厂家的说明是不一样的
6，预染marker肯定不准啊，需要通过预实验预染marker与非预染marker染胶后确定分子量位置，预染marker是转膜及电泳时的一个可见标志
7、30多的主带应该是目的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:38

另一个案例：鼠脑提的蛋白（-20中存放较长时间的），还是做AQP4，没有曝出带，后染膜发现蛋白带很不清晰，模糊成一团，如图，请问是什么原因导致条带不清晰？这是暴不出带的只要原因吗？

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这个组织提取蛋白电泳存在很大问题
条带模糊，请先把电泳跑好
但是你上次细胞的那个蛋白条带还行

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:39

我刚刚做这个，请问一下一抗和二抗的稀释度应该怎么估算啊，今天做了一次，一抗是小鼠腹水，1：5000稀释的，二抗1：8000稀释的，每次都洗了很久，但是结果背景颜色很黑，是怎么回事啊

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1、确定二抗稀释度与ECL的敏感性，也可以说是两者的合适比例问题
在NC膜上点膜确定二抗的稀释度，可参考我的其他帖子，不细说了
2、确定二抗后再做几个一抗的稀释度，如果有ELISA结果，那么稀释度可以除以10或者100来做WB的稀释度
3、背景与封闭、抗体、腹水质量有关
4、你的这个背景是什么意思？是胶片整体发黑还是在有膜的那一块发黑？

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:39

请教一个关于凝胶配制的问题。
通常情况下，都是配的30% Acr/bic（29：1），碧云天里还有出售40% Acr/bic（39：1）。不知道这2者之间的区别是什么？我参考到一些文献，有把Acr与bic的比值提高到50：1，那他们的质量分数该是多少呢？还是30%么？即能不能按30% Acr/bic（50：1）配？

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可以按30% Acr/bic（50：1）配

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:48

我的19KD蛋白，该怎么转膜啊，bio-rad湿转

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300mA 恒流 20min
0.22um膜

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:48

你好。我在做WB时条带是这样子的（条带不连续）。请你帮我分析一下。

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1，抗体孵育
2，转膜没有转好，膜与胶可能有挪动等
3，请先电泳染胶看蛋白条带
4，转膜后丽春红等染色看转膜效果再行后续步骤

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:49

上面的这个是我的最终的目的，一共是六个，但是奇怪的是中间的一个条带没有出来，可能是什么原因呢？

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1，转膜后用丽春红等染色证明转膜效果没问题
2，注意抗体孵育时膜是不是全部在液体中

作者: kuohao17 时间: 2013-2-27 12:49

请问一下我的试验有何问题？？谢谢
转膜用GE按玛西亚半湿转印仪，400mA 1h，能看到预染marker已转上，然后封闭过夜（封闭液为1%的BSA，用PBS配制），然后PBST漂洗三次，然后一抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），用PBST漂洗三次，二抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），PBST漂洗三次，然后漂洗三次，最后用NBT/BCIP显色，结果一片空白。。。

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:49

请问版主，最近western 经常遇到一个怪问题，我在转模前制作三明治的时候，仔细检查过没有气泡，也用波棒擀过，但每次转完膜后当我掀起滤纸后，总是很伤心的发现:胶与膜之间有数个明显的气泡，不明白呀？why?

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染膜后检测
如果有气泡处条带完整就没有什么大问题

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:50

SDS-PAGE之后，胶经过了考马斯亮蓝染色和甲醇脱色后，这块胶还能不能用于转膜后做WB？

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不能

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:50

请问一下我的试验有何问题？？谢谢
转膜用GE按玛西亚半湿转印仪，400mA 1h，能看到预染marker已转上，然后封闭过夜（封闭液为1%的BSA，用PBS配制），然后PBST漂洗三次，然后一抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），用PBST漂洗三次，二抗孵育2h（抗体稀释液为用PBS配制的1%的BSA），PBST漂洗三次，然后漂洗三次，最后用NBT/BCIP显色，结果一片空白。。。

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1、先进行蛋白电泳后的染胶，看蛋白提取情况
2、你的检测方法敏感性不够
3、目的蛋白定位在那？
4、抗体问题

作者: one 时间: 2013-2-27 12:51

请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

图片附件: 73199383.snap.jpg (2013-2-27 12:51, 23.65 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15015

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-2-27 12:52

请问做WESTERN的凝胶配好之后放在四度过夜之后还能用吗？

作者: lxh031 时间: 2013-2-27 12:52

1、先进行蛋白电泳后的染胶，看蛋白提取情况
2、你的检测方法敏感性不够
3、目的蛋白定位在那？
4、抗体问题

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我做了两块胶，染了一块另一块转膜，电泳跑的不错。抗体前面做了dot blot已经确定了稀释浓度，应该没问题，我的目的就是看看目的蛋白的特异性反应。另外，是不是我的半湿法转移的步骤有误？一般情况半湿法转62KD的蛋白要电压电流时间要什么
条件？

作者: lxh031 时间: 2013-2-27 12:52

还有，抗体稀释的时候用PBS稀释好呢还是用含有1%BSA的PBS稀释好呢？

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:53

请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

====================

这么小的还没做过
不知道如何回答
是电泳还没有跑出来吧

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:54

请问做WESTERN的凝胶配好之后放在四度过夜之后还能用吗？

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可以的
4度过夜效果会更好

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:54

我做了两块胶，染了一块另一块转膜，电泳跑的不错。抗体前面做了dot blot已经确定了稀释浓度，应该没问题，我的目的就是看看目的蛋白的特异性反应。另外，是不是我的半湿法转移的步骤有误？一般情况半湿法转62KD的蛋白要电压电流时间要什么
条件？

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恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min就ok了

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:55

还有，抗体稀释的时候用PBS稀释好呢还是用含有1%BSA的PBS稀释好呢？

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我一般用5%奶粉PBST或者TBST来稀释
还有就是3%BSA-PBST或者TBST

作者: kuohao17 时间: 2013-2-27 12:55

1，转膜后用丽春红等染色证明转膜效果没问题
2，注意抗体孵育时膜是不是全部在液体中

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转膜结束后我用考马斯亮蓝染色，泳道的蛋白条带都有。我抗体孵育的时候是用的杂交袋，膜应该都在液体里。我用的是碧云天的预染的maker，目的在第三和第四条带之间，有没有可能是maker不准啊？
谢谢楼主！O(∩_∩)O~

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:56

转膜结束后我用考马斯亮蓝染色，泳道的蛋白条带都有。我抗体孵育的时候是用的杂交袋，膜应该都在液体里。我用的是碧云天的预染的maker，目的在第三和第四条带之间，有没有可能是maker不准啊？
谢谢楼主！O(∩_∩)O~

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当然有可能是marker不准
另外做WB不要在marker上矫情
如果条带非常特异，抗体是买大公司商业化的，分子量位置有些差异，都可以确定为是目的蛋白
有些东西你可以参考Abcam公司的说明书

作者: zsxan1990 时间: 2013-2-27 12:56

再问一下，如果我的分离胶按30% Acr/bic（50：1）配，那么我的积层胶怎么配呢？30% Acr/bic（29：1）？还是30% Acr/bic（50：1）？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:57

再问一下，如果我的分离胶按30% Acr/bic（50：1）配，那么我的积层胶怎么配呢？30% Acr/bic（29：1）？还是30% Acr/bic（50：1）？
谢谢！

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与分离胶相同

作者: NBA 时间: 2013-2-27 12:59

请问版主，我相同的上样量和抗体浓度，有时候出现反影有时又是会背景很深很窄的条带，试过很多次了，对上样和抗体浓度也降低试过，但是又会出现白板的情况，很郁闷，不知您建议如何摸索？我的是核蛋白。ECL显影时会看到先有弱的荧光，但后面会看到背景出现，即一片荧光。非常感谢！

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这种情况可能与抗体质量有关

作者: bs4665 时间: 2013-2-27 12:59

版主，我用你说得方法，恒流，恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min ，转膜后用李春红染色，可什么都没有啊

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:00

版主，我用你说得方法，恒流，恒流，1.2mA每平方厘米膜面积
1h30min ，转膜后用李春红染色，可什么都没有啊

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什么都没有就不用往后做了
说明那个步骤有问题呗
你染过电泳后的胶吗？

作者: yychen 时间: 2013-2-27 13:00

我做了两块，那块电泳后染色的条带很好啊

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:01

我做了两块，那块电泳后染色的条带很好啊

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1、膜过期了
2、转膜没有转上

作者: 子衿青青 时间: 2013-2-27 13:02

感谢版主回复，太难了，做了很久，现在还没解决。

独孤一鹤 wrote:
请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

这么小的还没做过
不知道如何回答
是电泳还没有跑出来吧

作者: shenkunjie 时间: 2013-2-27 13:02

不好意思
把你这个帖子忘了
我看你一直在回别人的帖子
这种情况可能与抗体质量有关

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呵呵，我只是间接的把自己的低级错误给大家晒一下希望有用而已，非常感谢您给大家这个平台！我用其他的细胞模型相同的抗体及wb条件做出条带很漂亮，不知还有其他可能？谢谢！

作者: 131415 时间: 2013-2-27 13:03

天冷之前，WB做得还比较顺利，天冷后，发现胶不容易凝了，版主，给点好的建议吧！
最近两次actin跑出来是这样的，帮我分析分析吧

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:03

感谢版主回复，太难了，做了很久，现在还没解决。

请各位大虾分析分析一下我做的western 到底是什么原因？
我跑的是amyloid beta 42，分子量4kD，图中前面五个泳道是标准品，后面的是果蝇组织提取物，为什么全都聚集在上面了呢？同上样量有关吗?用的是16%的tricine胶。

这么小的还没做过
不知道如何回答
是电泳还没有跑出来吧

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你试试其他方法吧
这样的多肽确实不好做哦
如ELISA等

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:04

呵呵，我只是间接的把自己的低级错误给大家晒一下希望有用而已，非常感谢您给大家这个平台！我用其他的细胞模型相同的抗体及wb条件做出条带很漂亮，不知还有其他可能？谢谢！

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你这么说的话那问题就出现在这次的样品上，而与你的操作及抗体无关了
呵呵
我出现过这样的情况：HepG2细胞做同一抗体的WB很好
做Hamster 肝组织WB就不太好，有两条带

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:04

天冷之前，WB做得还比较顺利，天冷后，发现胶不容易凝了，版主，给点好的建议吧！
最近两次actin跑出来是这样的，帮我分析分析吧

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我感觉是你曝光的时候挪动了胶片

作者: xue258 时间: 2013-2-27 13:05

请问楼主一个问题。用pvdf膜转膜之前，要用甲醇泡多久好。有人说不超过15秒，可还有人说20分钟以上，众说纷纭。请问这里面的学问。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:05

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2013-2-27 13:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主一个问题。用pvdf膜转膜之前，要用甲醇泡多久好。有人说不超过15秒，可还有人说20分钟以上，众说纷纭。请问这里面的学问。谢谢

我一般是处理15S左右（Millipore的PVDF membrane）

作者: zranqi_1 时间: 2013-2-27 13:06

最近准备用western测细胞表面抗原的表达，此抗原表达很弱，不知道应该选择单抗还是多抗啊？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:06

QUOTE:

原帖由 zranqi_1 于 2013-2-27 13:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近准备用western测细胞表面抗原的表达，此抗原表达很弱，不知道应该选择单抗还是多抗啊？谢谢

什么蛋白？

作者: zranqi_1 时间: 2013-2-27 13:07 标题: 回复 #2085 NBA 的帖子

最近准备做western测细胞表面抗原的表达，此抗原表达很弱，请问这种情况下应该选单抗还是多抗？谢谢

作者: zranqi_1 时间: 2013-2-27 13:08

内皮细胞表面的CD36

作者: vcve 时间: 2013-2-27 13:09

楼主，您好！
我在第62页提问过问题，当时在您的建议下做了调整，问题多少解决了，但是其中还存在好多问题，不过我都解决掉了。
想补充的是一些经验：
1、电泳如果跑的很慢，尤其是浓缩胶里，而且到了分界面还不能浓缩；到了分离胶里跑的也慢，又在溴酚蓝前面多出一条近乎与分界面平行的折光线，遇到这种情况一定要考虑甘氨酸的问题啊！！！（如果是pH值的问题不会出现下面那条折光线的）我就是新买的甘氨酸，结果不敢确信是它的毛病，结果多浪费了好多天，深刻的教训啊！
2、如果跑胶有问题，一定要把胶版卸下来，仔细的查找蛛丝马迹，可能会打开思路。

作者: caihong 时间: 2013-2-27 13:10

近期做wb,用NBT/BCIP直接在膜上显色，转印后胶考染，发现没有蛋白条带，但用NBT/BCIP显色时候整张膜都是dance蓝紫色，跟本没发现蛋白条带，什么原因呢？？？急！

作者: utt0989 时间: 2013-2-27 13:10

请教前辈：
从细胞提的蛋白，分子量90kd和70kd，上样量30ug，5%胶70v，8%胶120v电泳，200mA两小时湿转，5%BSA室温封闭1小时或4°过夜都做过，santa一抗（多克隆） 1：200-1：1000 5%BSA稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温3小时，碧云天二抗1：2000 5%BSA稀释（推荐1：500-1：2000）室温1小时。都是PBST洗膜6*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光，曝光片子几乎全黑。

作者: utt0989 时间: 2013-2-27 13:11

补充说明：
每次的actin都很好

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:18

最近准备做western测细胞表面抗原的表达，此抗原表达很弱，请问这种情况下应该选单抗还是多抗？谢谢

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单抗和多抗我认为没有不是影响选择的决定性因素
要看效果如何
我比较喜欢用多抗

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:19

版主你好，我做蛋白印迹的时候老是但定量不准，导致内参没有意义，应当怎么解决？谢谢了！以下是图

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先从蛋白定量下手
之后通过预实验来确定上样量的变化
另外、内参就是一个校正，不需要特别整齐
你可以参考science及nature

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:19

请教前辈：
从细胞提的蛋白，分子量90kd和70kd，上样量30ug，5%胶70v，8%胶120v电泳，200mA两小时湿转，5%BSA室温封闭1小时或4°过夜都做过，santa一抗（多克隆） 1：200-1：1000 5%BSA稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜或室温3小时，碧云天二抗1：2000 5%BSA稀释（推荐1：500-1：2000）室温1小时。都是PBST洗膜6*10min。
发光剂是碧云天ECL PLUS。几乎整张膜都发光，曝光片子几乎全黑。

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曝光多长时间？

作者: vera+ 时间: 2013-2-27 13:20

请教前辈：
我第一次做WB,没有条带。所以想问问具体步骤，是不是什么细节有错误。
我的样品是hiv-1病毒和producer细胞的细胞裂解液。一般情况下病毒产量都不会很少，而且已经ELISA测了病毒的衣壳蛋白p24含量和细胞裂解液的浓度。每个条带上样量是，对应100ng的p24的病毒量，或5ug总蛋白的细胞裂解液。
操作如下：（我做过很多的蛋白质电泳，电泳应该没有问题，而且预染marker很正常，凝胶是买的没有过期，整个实验室都在用，没有问题。）
湿转：190mA,1hr，两板胶。蛋白质marker使用的是bio-rad的10-250kd的marker，marker中高于75kd的条带有部分没有转完，在胶上还有一些，但是大部分都转到膜上了；marker中小分子量的条带没有问题，都转到膜上了。
问题1：转膜完成后是否需要洗膜，然后再加溶解在pbst的5% milk封闭，如果需要清洗，那么没有洗会有什么结果？
封闭：4度，过夜，没有shake，蛋白所在的那一面向上，密闭的盒子里。
问题2：封闭完成后是否需要清洗膜，再加1抗（WAK4，p24 from mouse）。如果需要清洗，那么没有洗会出现什么情况？我这次就没有洗呢，我很担心是因为没有洗造成的没有条带。wak4是什么意思呢？
1抗：WAK4 anti-p24 1000倍稀释，1hr, RT。实验室其他人使用的1000倍稀释，说没有问题，但是非特异条带会比较多，但是我的没有条带，我很郁闷呢。
洗膜3次，每次10分钟，shake，RT。
问题3：抗体用什么稀释呢？是TBST吗？
2抗：anti-mouse IgG peroxidase(sigma A9917, 我用的10000稀释，使用说明书推荐80000-160000倍稀释使用), 1hr, RT。二抗是刚刚买来的，新的，我开的封，没有人用过，所以不知道稀释倍数，如果二抗加的过多，会对结果有什么影响？
洗膜3次，每次10分钟，shake，RT。
ECL（和老板一起做的，应该没有问题）
曝光时间1秒、2秒、10秒、20秒、40秒、1分。结果2秒以内没有条带，10秒以后在条带间出现了黑色的背景，1分曝光的片子都不能看了，蛋白marker是白的，其他地方都是黑的。
问题4：蛋白质marker是否应该留着显影，曝光后蛋白质marker为什么是白的？是否正常？老板说我的结果是opposite的。因为一抗大家都在用，所以没有问题；封闭的牛奶大家都在用，也应该没问题；转膜正常；TBST是老板配的，直接给我用了，没有问题的；我想稀释抗体的操作我应该也没有问题；二抗是新买的sigma的，我不怀疑会有问题，只可能是我用的超量了；ECL试剂盒时间有些长，过期了，但是大家都在用，每个人的片子都很好，也应该没有问题，而且操作是和老板一起的，包括曝光也是和老板一起做的。所以我想是不是我的中间过程的操作细节有问题，否则至少应该有条带，而不是白板（短时间曝光）或黑板（长时间曝光）。
谢谢前辈了，真的很急，老板说明天重做，但是不知道应该怎样改进试验条件，谢谢哟

作者: ending 时间: 2013-2-27 13:21

多谢版主前些日子对我问题的耐心解答！！！现在我又重做一次，用新的碧云天ecl染，用x曝光，我的gapdh孵育了16小时，这次我用x光片盒压片爆光了30min，终于出结果了。但是不是太好，图片上比较浓的应该是gapdh，淡一些的是我的目的蛋白c-fos。我想请问：如何让结果更好一些，这看上去不太好的~~~~还有就是我跑胶用了预染的蛋白marker，这个marker也转上了膜，最后会不会在x胶片上也曝光了，显现出来？本来中间两个泳道是marker的。

谢谢了！！

作者: yes4 时间: 2013-2-27 13:21

曝光的图片1s、2s的

作者: yes4 时间: 2013-2-27 13:21

哦，错了上一张是10s、20s的，这一张是1s、2s的

作者: yes4 时间: 2013-2-27 13:22

最后一张是40s和1min的
我确定没有弄返了膜的方向，请前辈指教

作者: yes4 时间: 2013-2-27 13:23

曝光多长时间？

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曝光1min

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:23

曝光时间1秒、2秒、10秒、20秒、40秒、1分。结果2秒以内没有条带，10秒以后在条带间出现了黑色的背景，1分曝光的片子都不能看了，蛋白marker是白的，其他地方都是黑的。
问题4：蛋白质marker是否应该留着显影，曝光后蛋白质marker为什么是白的？是否正常？老板说我的结果是opposite的。因为一抗大家都在用，所以没有问题；封闭的牛奶大家都在用，也应该没问题；转膜正常；TBST是老板配的，直接给我用了，没有问题的；我想稀释抗体的操作我应该也没有问题；二抗是新买的sigma的，我不怀疑会有问题，只可能是我用的超量了；ECL试剂盒时间有些长，过期了，但是大家都在用，每个人的片子都很好，也应该没有问题，而且操作是和老板一起的，包括曝光也是和老板一起做的。所以我想是不是我的中间过程的操作细节有问题，否则至少应该有条带，而不是白板（短时间曝光）或黑板（长时间曝光）。
谢谢前辈了，真的很急，老板说明天重做，但是不知道应该怎样改进试验条件，谢谢哟

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1，封闭后洗不洗膜没有太大影响
2，稀释抗体用奶粉-TBST
3，二抗稀释度太高了
4，如果抗体没有问题，那么可能是目的蛋白没有提取出来

作者: NBA 时间: 2013-2-27 13:24

多谢版主前些日子对我问题的耐心解答！！！现在我又重做一次，用新的碧云天ecl染，用x曝光，我的gapdh孵育了16小时，这次我用x光片盒压片爆光了30min，终于出结果了。但是不是太好，图片上比较浓的应该是gapdh，淡一些的是我的目的蛋白c-fos。我想请问：如何让结果更好一些，这看上去不太好的~~~~还有就是我跑胶用了预染的蛋白marker，这个marker也转上了膜，最后会不会在x胶片上也曝光了，显现出来？本来中间两个泳道是marker的。

谢谢了！！！！

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1，marker的事一两句说不清楚
2，GAPDH怎么做成这个样子哦，还得改进下
3，一般情况GAPDH曝光在10S左右
4，建议用别的ECL试试

作者: JK.jon 时间: 2013-2-27 13:25

请教楼主，ecl液冲洗膜的时间多久比较好，有的是冲一下即可，有的人要放好几分钟。请问这有什么根据吗

作者: KGZ564 时间: 2013-2-27 13:25

1，封闭后洗不洗膜没有太大影响
2，稀释抗体用奶粉-TBST
3，二抗稀释度太高了
4，如果抗体没有问题，那么可能是目的蛋白没有提取出来

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谢谢前辈，是二抗的问题，今天试了其他的一抗和相同的一抗，用不同的二抗，都得到了比较漂亮的条带；又重复了与第一次相同的一抗和二抗，确实没有条带。谢谢您。

作者: c86v 时间: 2013-2-27 13:26

楼主我近期做了两次WB，有一个共同的问题是转膜没转上，转后丽春红染色没有带，别人转的膜我一起染了有很清晰的带。我和别人用的不同的PVDF膜，不同的甲醇，不同的电泳仪。我的膜是bio rad的PVDF 0.2微米，一直保存在4度冰箱，有塑料袋包裹，不知道保存多长时间了，看盒子上也没有使用期限，没有保存温度。甲醇我用的是北京化工厂的，10块一瓶的，09年产。电泳仪我的比较低挡，以前是跑DNA电泳的，不能恒流，我是手动一直看着它维持电流在200mA左右，不稳，在190-210mA间浮动，我的蛋白30-40KD，转3h。蛋白上样量100ug，蛋白提的没问题，我跑过蛋白胶考染很漂亮。我的操作自认为问题不大，跟别人的一样，就算有瑕疵也不会造成完全转不上膜的情况。近两次WB丽春红染后虽然没带，有一次继续做免疫反应和曝光，没有任何着色。
通过我的这些描述，楼主你能指出我的问题在哪吗？

作者: KGZ564 时间: 2013-2-27 13:26

请教楼主：
凝胶转膜后，PVDF膜经封闭后，可以在4度放多长时间呢？还有怎样做内参呢，在什么情况下需要做内参？二抗的稀释度怎样测？二抗的说明书上的检测方法是dot/blot，不明白这是什么意思？谢谢前辈了

作者: greenbee 时间: 2013-3-1 15:06

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

作者: 雪花子 时间: 2013-3-1 15:09

想问下您知道dtt母液如何配制及保存条件吗？
做双向的时候要用

作者: 雪花子 时间: 2013-3-1 15:17

请教一个关于2×SDS样品缓冲液的配制问题：

参阅《分子克隆实验指南》（第2版），配方如下：

100mmol/L Tris.HCl,pH 6.8
200mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
4% SDS
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油

书中提到不含DTT的缓冲液可室温保存，临用前加入1mol/L DTT贮存液。1mol/L DTT贮存液的配制方法：用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

请问这个怎么过滤啊？
是不是这个过滤步骤是必须的？
是否可以不加DTT？

谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:30

请教楼主，ecl液冲洗膜的时间多久比较好，有的是冲一下即可，有的人要放好几分钟。请问这有什么根据吗

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ECL液冲洗膜式什么意思？
ECL孵育还是ECL孵育完成后把ECL洗去？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:32

楼主我近期做了两次WB，有一个共同的问题是转膜没转上，转后丽春红染色没有带，别人转的膜我一起染了有很清晰的带。我和别人用的不同的PVDF膜，不同的甲醇，不同的电泳仪。我的膜是bio rad的PVDF 0.2微米，一直保存在4度冰箱，有塑料袋包裹，不知道保存多长时间了，看盒子上也没有使用期限，没有保存温度。甲醇我用的是北京化工厂的，10块一瓶的，09年产。电泳仪我的比较低挡，以前是跑DNA电泳的，不能恒流，我是手动一直看着它维持电流在200mA左右，不稳，在190-210mA间浮动，我的蛋白30-40KD，转3h。蛋白上样量100ug，蛋白提的没问题，我跑过蛋白胶考染很漂亮。我的操作自认为问题不大，跟别人的一样，就算有瑕疵也不会造成完全转不上膜的情况。近两次WB丽春红染后虽然没带，有一次继续做免疫反应和曝光，没有任何着色。
通过我的这些描述，楼主你能指出我的问题在哪吗？

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用你同学的PVDF膜试试

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:32

请教楼主：
凝胶转膜后，PVDF膜经封闭后，可以在4度放多长时间呢？还有怎样做内参呢，在什么情况下需要做内参？二抗的稀释度怎样测？二抗的说明书上的检测方法是dot/blot，不明白这是什么意思？谢谢前辈了

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dot blot你可以搜我以前的帖子，有详细的说明，需要用NC膜来做
PVDF膜封闭放置4度没试过
-20度半年没问题
如果你需要半定量的时候就需要做内参
内参怎么做方法同你目的蛋白的抗体孵育及检测

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:50

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

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你用湿转还是半干转？
背景的问题与洗膜及二抗浓度太高有关
加大洗膜次数
降低二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:50

想问下您知道dtt母液如何配制及保存条件吗？
做双向的时候要用

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2M DTT，MQ水配制
-20度分装保存

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:51

请教一个关于2×SDS样品缓冲液的配制问题：

参阅《分子克隆实验指南》（第2版），配方如下：

100mmol/L Tris.HCl,pH 6.8
200mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
4% SDS
0.2% 溴酚蓝
20% 甘油

书中提到不含DTT的缓冲液可室温保存，临用前加入1mol/L DTT贮存液。1mol/L DTT贮存液的配制方法：用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

请问这个怎么过滤啊？
是不是这个过滤步骤是必须的？
是否可以不加DTT？

谢谢！

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常用的是还原电泳，需要用DTT，如果不用可以用beta-巯基乙醇代替
我一般都不过滤

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-1 15:53

楼主最近得你的指点，弄明白了很多问题。再次感谢！这次我用脑组织提的蛋白做WB的actin，蛋白用BCA试剂盒定量，上样量分别是左65ug和右100ug。转膜完用立春红染色什么没有，然后继续做封闭1h，一抗1：400过夜，二抗1：4000两小时。加底物时看见右道光较明显，左道光很弱，但是有光。压片两次分别3min和30min，显影结果如图：3min的只能看见右道有黑点，大小在45附近差不多对，30min才勉强看到左道有浅浅的东西。后来考染膜的图像在右侧。请问：
1，我爆出来的椭圆形黑点是带吗？实验室有人说不是带，是背景，带应该是条形。
2，膜用立春红染没有带，后来考染有带是什么原因？是上样量少吗？可是我上了65-100ug不够多吗。
3，我在北方，长春，冬季很冷，暗室里也凉，这对底物反应和显色曝光有没有影响？明明左道有光却曝的极弱是什么原因？
4，看我考染的膜，条带不是很清晰，是转膜的问题吗？该怎么改进？
谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15034

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:54

楼主最近得你的指点，弄明白了很多问题。再次感谢！这次我用脑组织提的蛋白做WB的actin，蛋白用BCA试剂盒定量，上样量分别是左65ug和右100ug。转膜完用立春红染色什么没有，然后继续做封闭1h，一抗1：400过夜，二抗1：4000两小时。加底物时看见右道光较明显，左道光很弱，但是有光。压片两次分别3min和30min，显影结果如图：3min的只能看见右道有黑点，大小在45附近差不多对，30min才勉强看到左道有浅浅的东西。后来考染膜的图像在右侧。请问：
1，我爆出来的椭圆形黑点是带吗？实验室有人说不是带，是背景，带应该是条形。
2，膜用立春红染没有带，后来考染有带是什么原因？是上样量少吗？可是我上了65-100ug不够多吗。
3，我在北方，长春，冬季很冷，暗室里也凉，这对底物反应和显色曝光有没有影响？明明左道有光却曝的极弱是什么原因？
4，看我考染的膜，条带不是很清晰，是转膜的问题吗？该怎么改进？
谢谢！

==============================================

你用的是纯化后的蛋白吗？
考染的结果有点像纯化后的膜
不像是提取组织总蛋白的条带，我认为问题可能出现在这
你提的蛋白条带太少了

作者: wood533 时间: 2013-3-1 15:56

dot blot你可以搜我以前的帖子，有详细的说明，需要用NC膜来做
PVDF膜封闭放置4度没试过
-20度半年没问题
如果你需要半定量的时候就需要做内参
内参怎么做方法同你目的蛋白的抗体孵育及检测

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谢谢前辈的指点，已经放-20度保存了，准备慢慢的用来优化条件

作者: wood533 时间: 2013-3-1 15:56

你用的是纯化后的蛋白吗？
考染的结果有点像纯化后的膜
不像是提取组织总蛋白的条带，我认为问题可能出现在这
你提的蛋白条带太少了

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我的蛋白就是组织提取的总蛋白，没经过纯化。我单独跑过蛋白胶考染，蛋白条带实际上是很多的，如图的前两道。转完膜就是这个样子，请问是什么原因？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15035

作者: NBA 时间: 2013-3-1 15:57

我的蛋白就是组织提取的总蛋白，没经过纯化。我单独跑过蛋白胶考染，蛋白条带实际上是很多的，如图的前两道。转完膜就是这个样子，请问是什么原因？

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1，膜过期没有
2，用什么转移体系？
3，转移条件

作者: yonger 时间: 2013-3-1 15:57

ECL液冲洗膜式什么意思？
ECL孵育还是ECL孵育完成后把ECL洗去？

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是ecl现象的时间，不是把ecl洗去。另外楼主请教您个问题，我要把b-actin蛋白制成0.25mg每ml的浓度，上样10微克，可actin得斑点总也出不来，请问是我的溶液配制的不对吗？我用1倍sample buffer溶解的b-actin。谢谢

作者: gemei0115 时间: 2013-3-1 16:01

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

你用湿转还是半干转？
背景的问题与洗膜及二抗浓度太高有关
加大洗膜次数
降低二抗浓度

谢谢楼主：
我用的是湿转。洗膜TBST洗10分钟3次。二抗1：5000稀释。

图片附件: 75808267.jpg (2013-3-1 16:01, 49.66 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15036

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-1 16:17

1 上面是改进后的图，背景太高，应该出现两条距离很近的带，可是基本分不清楚。以为条带很亮，只压片30秒，显影时一看到条带就定影大概20秒。请教老师，压片，显影，定影的时间一般是多久。如何调整好一些？
2 这次条带发光时间特别短只有1~2分钟就焠灭了，基本没时间调整，往常会亮十分钟左右，不知道是什么原因？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:17

请教楼主：

最近做western总出问题，一直在改善条件，最近又出新问题了，请教老师帮分析一下：
1 发光以后背景很高，好像是所有蛋白条带都有，目的条带强一些，可是图没法用，而且蛋白marker没有条带，但是在暗室可以看到目的条带，看不到发光MARKER,压片后很多非特异性的条带。
2 又做一次换了NC膜，转完膜整个膜都花了，有些地方膜上白色的东西掉了，像掉漆了一样，一片一片的，无法继续试验，是膜的问题还是其他问题？有人说是膜干了，但用之前用转膜缓冲液浸泡了10分钟的。电泳100伏45分钟浓缩胶，150伏70分钟跑分离胶，跑完胶上有9条预染MARKER的条带。转膜用300毫安120分钟，预染MARKER转到膜上了，很淡，但是用TBST漂洗后就掉了，会是什么原因呢？

你用湿转还是半干转？
背景的问题与洗膜及二抗浓度太高有关
加大洗膜次数
降低二抗浓度

谢谢楼主：
我用的是湿转。洗膜TBST洗10分钟3次。二抗1：5000稀释。

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你只上了一个样品吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:18

1 上面是改进后的图，背景太高，应该出现两条距离很近的带，可是基本分不清楚。以为条带很亮，只压片30秒，显影时一看到条带就定影大概20秒。请教老师，压片，显影，定影的时间一般是多久。如何调整好一些？
2 这次条带发光时间特别短只有1~2分钟就焠灭了，基本没时间调整，往常会亮十分钟左右，不知道是什么原因？

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二抗浓度还是太高
荧光淬灭与HRP浓度有关，太高淬灭快
另外金属物质也容易造成这种现象

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-3-1 16:18

你只上了一个样品吗？

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谢谢楼主：
1.扫描的时候片子是竖放的，上了8个样。有一个是对照，条带都出来了，就是不清楚，应该有两条的，发光时也可以看到两条，但是压片后就融合了，而且背景很高，条带不清晰。
2.封闭完了要洗膜吗？用TBST?
3.请教TBST与TBS在作用上有什么不同？什么时候用TBS？什么时候用TBST？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:22

谢谢楼主：
1.扫描的时候片子是竖放的，上了8个样。有一个是对照，条带都出来了，就是不清楚，应该有两条的，发光时也可以看到两条，但是压片后就融合了，而且背景很高，条带不清晰。
2.封闭完了要洗膜吗？用TBST?
3.请教TBST与TBS在作用上有什么不同？什么时候用TBS？什么时候用TBST？

才开始做，很多东西不懂，麻烦fangweibin119老师了！谢谢

======================================================

封闭完成后用TBST漂洗一次即可进行后续步骤
TBST就是在TBS中加入0.05%~0.1%Tween-20或者Triton X-100

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-3-1 16:23

请问楼主，之前您有告诉我为了分离胶更好的交联，可在4度进行。那么是配好后直接放入还是室温一段时间再放入。因为我试过直接放入过夜后第2天上浓缩胶，发现电泳条带很弥散？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:29

请问楼主，之前您有告诉我为了分离胶更好的交联，可在4度进行。那么是配好后直接放入还是室温一段时间再放入。因为我试过直接放入过夜后第2天上浓缩胶，发现电泳条带很弥散？谢谢！

==============================================

配好后直接放在4度能聚合的更好
或者配制好后放在RT 等聚合后放在4度过夜
电泳条带的弥散与你的：1）胶缓冲液有关（Tris-HCl）
2）样品缓冲液
3）样品缓冲液中的还原剂等

作者: fsdd817 时间: 2013-3-1 16:31

请问：
我做的指标是一个磷酸化蛋白，但抗体没有标明是磷酸化的抗体（abcam的）但可以做WB。
蛋白分子量是156，做了两个月了，也没有目的条带，Actin有。
免疫组化出结果了，不知道WB哪个环节出问题了？提蛋白的时候是不是需要加磷酸酶来去磷酸化呢？
谢谢

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-1 16:44

请教版主：
曝光后很多非特异性条带，连预染MARKER都出来了，为什么呢？

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-1 16:45

接上帖，最亮的那个应该是目的条带，但是为什么很不规则呢？
曝光后将膜清晰后增强发光，即重新封闭加一抗二抗再暴光，非特异条带是不见了，可是目的条带也只剩两条了，形状很怪异，请问可能是哪里出了问题呢？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:45

请问：
我做的指标是一个磷酸化蛋白，但抗体没有标明是磷酸化的抗体（abcam的）但可以做WB。
蛋白分子量是156，做了两个月了，也没有目的条带，Actin有。
免疫组化出结果了，不知道WB哪个环节出问题了？提蛋白的时候是不是需要加磷酸酶来去磷酸化呢？
谢谢

=================================

1，做磷酸化蛋白一定要用磷酸化抗体
2，提取蛋白时需要加入磷酸酶抑制剂

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:46

请教版主：
曝光后很多非特异性条带，连预染MARKER都出来了，为什么呢？

==========================================================================================

1，预染marker也是蛋白，有些是天然蛋白纯化，有些是重组表达蛋白，既然是蛋白那么肯定会有些抗体有反应
2，非特异性条带有没有关系，要能确定目的条带才行。非特异性条带与你的抗体本身及抗体的稀释度有关

作者: NBA 时间: 2013-3-1 16:51

接上帖，最亮的那个应该是目的条带，但是为什么很不规则呢？
曝光后将膜清晰后增强发光，即重新封闭加一抗二抗再暴光，非特异条带是不见了，可是目的条带也只剩两条了，形状很怪异，请问可能是哪里出了问题呢？谢谢

====================

条带的形状与电泳有关

作者: glass 时间: 2013-3-1 16:56

我想问下，每次加ECL去压片的时候，压片的时间长短都会影响目的条带的灰度

得出的不同批次的条带都不一样，即使同一批的样品重复几次的灰度结果都会不一样

这个时候应该怎么分析啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 17:19

每张膜上有对照
与内参做对比
之后再与对照做对比

作者: jujuba 时间: 2013-3-1 17:21

样品/内参，对照/内参
然后这两个再比？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 17:21

品/内参，对照/内参
然后这两个再比？

==================================================

对照样品1目的蛋白/对照样品1内参=对照蛋白数值

样品2目的蛋白/样品2内参=样品2蛋白数值

把对照蛋白数值作为1或者100（这个自己定，就是作为标准）
样品2/对照，样品3/对照.......

作者: H2O 时间: 2013-3-1 17:22

请问做western，ECL显影后，内参较均匀，呈长方块状，而目的蛋白却呈哑铃状，一边粗一边细，是咋回事？多谢解答，不胜感激！

作者: H2O 时间: 2013-3-1 17:27

请问转膜时间，电流依据什么确定？我的目的蛋白在30KD到60KD之间，请问多大电流？多长时间合适？我用的仪器是Bio-rad的，多谢啦，不胜感激！

作者: H2O 时间: 2013-3-1 17:27

请问稀释抗体用PBST于TBST有什么区别？哪一种较好？不用脱脂奶粉孵育对结果有影响吗？多谢了，本人初做，不太明白，多谢了

作者: H2O 时间: 2013-3-1 17:27

请问做western，ECL显影后，内参较均匀，呈长方块状，而目的蛋白却呈哑铃状，一边粗一边细，是咋回事？多谢解答，不胜感激！
另外请问转膜时间，电流依据什么确定？我的目的蛋白在30KD到60KD之间，请问多大电流？多长时间合适？我用的仪器是Bio-rad的，多谢啦，不胜感激！

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-1 17:28

我最近做WB我的目的蛋白是90KD的膜蛋白，用的是santa cruz的单抗，但出现的条带确实在35KD，我用的是蛋白预染Marker。曝光时间长也没有杂带。这是不是我要的呀？版主帮忙分析一下，或有什么办法验证呀？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 17:46

请问做western，ECL显影后，内参较均匀，呈长方块状，而目的蛋白却呈哑铃状，一边粗一边细，是咋回事？多谢解答，不胜感激！

==================

目的蛋白分子量多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 17:46

请问转膜时间，电流依据什么确定？我的目的蛋白在30KD到60KD之间，请问多大电流？多长时间合适？我用的仪器是Bio-rad的，多谢啦，不胜感激！

==============

半干还是湿转？

作者: NBA 时间: 2013-3-1 17:54

请问稀释抗体用PBST于TBST有什么区别？哪一种较好？不用脱脂奶粉孵育对结果有影响吗？多谢了，本人初做，不太明白，多谢了

==================

两种我都用过
现在多使用TBST

作者: NBA 时间: 2013-3-2 08:50

我最近做WB我的目的蛋白是90KD的膜蛋白，用的是santa cruz的单抗，但出现的条带确实在35KD，我用的是蛋白预染Marker。曝光时间长也没有杂带。这是不是我要的呀？版主帮忙分析一下，或有什么办法验证呀？

===========================

这个你得问问santa的技术支持
35K的条带很特异啊？

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-2 08:50

我的目的蛋白是105Kd左右的，8%、10%和12%的胶我都试过，但在跑浓缩胶时就看到marker已经分离开了，三种浓度的胶都会出现这种情况，而且我在边缘泳道已经加了预防空载的蛋白，但marker在跑的过程中还是会稍向外倾斜，这些都是怎么回事呢？请楼主帮助解答一下，谢谢！另外，内参β-actin一抗浓度是1：200，二抗1：4000，但总是会出现四个条带，条带都很浓，背景还可以，但很难确定哪个才是β-actin，请问需不需要再调节抗体浓度？谢谢！

作者: duoduo 时间: 2013-3-2 08:51

对照样品1目的蛋白/对照样品1内参=对照蛋白数值

样品2目的蛋白/样品2内参=样品2蛋白数值

把对照蛋白数值作为1或者100（这个自己定，就是作为标准）
样品2/对照，样品3/对照.......

============================================

其实，每次做都应该有个对照才对是吧？

要不然也不好比较的

例如我们做akt，正常情况下也有p-akt表达

要看某个时间点的p-akt表达变化

应该每次都把正常情况下的p-akt表达作为对照是吧

作者: NBA 时间: 2013-3-2 08:51

我的目的蛋白是105Kd左右的，8%、10%和12%的胶我都试过，但在跑浓缩胶时就看到marker已经分离开了，三种浓度的胶都会出现这种情况，而且我在边缘泳道已经加了预防空载的蛋白，但marker在跑的过程中还是会稍向外倾斜，这些都是怎么回事呢？请楼主帮助解答一下，谢谢！另外，内参β-actin一抗浓度是1：200，二抗1：4000，但总是会出现四个条带，条带都很浓，背景还可以，但很难确定哪个才是β-actin，请问需不需要再调节抗体浓度？谢谢！

===========================================================================

1，最好把图片放上来
2，beta-actin都有四个条带的话：一是一抗浓度，你用1：1000，1：2000试试，二是抗体质量
3，Marker在浓缩胶中一般是不会跑开的，浓缩胶高度有多少？
4，可能浓缩胶，分离胶的缓冲液pH有问题

作者: flower-201 时间: 2013-3-2 08:56

我最近做WB我的目的蛋白是90KD的膜蛋白，用的是santa cruz的单抗，但出现的条带确实在35KD，我用的是蛋白预染Marker。曝光时间长也没有杂带。这是不是我要的呀？版主帮忙分析一下，或有什么办法验证呀？

这个你得问问santa的技术支持
35K的条带很特异啊？

条带非常特异，整块膜（全胶转）未见其他杂带。

作者: flower-201 时间: 2013-3-2 08:57

我的目的蛋白是105Kd左右的，8%、10%和12%的胶我都试过，但在跑浓缩胶时就看到marker已经分离开了，三种浓度的胶都会出现这种情况，而且我在边缘泳道已经加了预防空载的蛋白，但marker在跑的过程中还是会稍向外倾斜，这些都是怎么回事呢？请楼主帮助解答一下，谢谢！另外，内参一抗浓度是1：200，二抗1：4000，但总是会出现四个条带，条带都很浓，背景还可以，但很难确定哪个才是β-actin，请问需不需要再调节抗体浓度？谢谢！

1，最好把图片放上来
2，beta-actin都有四个条带的话：一是一抗浓度，你用1：1000，1：2000试试，二是抗体质量
3，Marker在浓缩胶中一般是不会跑开的，浓缩胶高度有多少？
4，可能浓缩胶，分离胶的缓冲液pH有问题
点击个人资料，里面有QQ号，上QQ吧

我用β-actin1：20000，和二抗1：7000，也会有4条带但第一条要清楚些，后来我还是换内标了。

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-2 08:57

1，最好把图片放上来
2，beta-actin都有四个条带的话：一是一抗浓度，你用1：1000，1：2000试试，二是抗体质量
3，Marker在浓缩胶中一般是不会跑开的，浓缩胶高度有多少？
4，可能浓缩胶，分离胶的缓冲液pH有问题
点击个人资料，里面有QQ号，上QQ吧

===========================================================================

浓缩胶高度大概1cm稍多一点，怀疑是pH值和抗体浓度的问题，调整过后再向前辈请教，谢谢！

作者: TAT 时间: 2013-3-2 08:58

我最近提蛋白总出现问题，大鼠小肠组织，220mg组织加1ml裂解液（自己配置的），12000rpm10min，取上清160ul+40ul 5*loading buffer，煮沸5min后冷却，发现全是絮状的东西，上样时样品都下不去，试着跑电泳，结果蓝色的东西跑下去了，而孔里还是留有那些絮状的东西。后来用别人提取的蛋白（已经测试过没问题）+我们的5*loading buffer，同样出现上次问题。loading buffer一直放在4度，出现这样的问题会是什么原因啊？

以前取同样的小肠组织，只是裂解液是直接购买的碧云天的，loading buffer 是2*的，直接和蛋白以1：1的比列加的，没有出现上述问题。
另外我想请教版主loading buffer 的倍数怎么确定的，有用2*，有用5*，为什么用不同倍数的？

谢谢

作者: u234 时间: 2013-3-2 09:09

我要做ERK1/2的WB，因为是个新手，能否介绍一下它的WB条件，如胶的浓度，跑胶的时间，干转时间等，还有ERK1/2的分子量为44/42,应该如何解决内参问题。万分感谢

作者: orangecake 时间: 2013-3-2 09:10

老师，我最近做wb，条带两边总是有些翘，如图。
电泳条件：80V 20min;100V,60min 预染marker没问题，就是整体条带是上宽下窄，像是梯形
转膜条件:300MA 60MIN

凝完胶后没有洗加样孔，而是观察了一下每个加样孔，看上去都蛮平整的；我们老板让我用薄滤纸伸到孔里把两边底角多余的胶吸走，但我没见有多余的啊。。。
他说还有可能是样本不均匀，怎么才能弄均匀呢？谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15037

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:11

我最近提蛋白总出现问题，大鼠小肠组织，220mg组织加1ml裂解液（自己配置的），12000rpm10min，取上清160ul+40ul 5*loading buffer，煮沸5min后冷却，发现全是絮状的东西，上样时样品都下不去，试着跑电泳，结果蓝色的东西跑下去了，而孔里还是留有那些絮状的东西。后来用别人提取的蛋白（已经测试过没问题）+我们的5*loading buffer，同样出现上次问题。loading buffer一直放在4度，出现这样的问题会是什么原因啊？

以前取同样的小肠组织，只是裂解液是直接购买的碧云天的，loading buffer 是2*的，直接和蛋白以1：1的比列加的，没有出现上述问题。
另外我想请教版主loading buffer 的倍数怎么确定的，有用2*，有用5*，为什么用不同倍数的？

谢谢

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loading中SDS量少，不能溶解蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:12

我要做ERK1/2的WB，因为是个新手，能否介绍一下它的WB条件，如胶的浓度，跑胶的时间，干转时间等，还有ERK1/2的分子量为44/42,应该如何解决内参问题。万分感谢

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12%分离胶
溴酚蓝跑至胶底部转膜
干转：1.2mA每平方厘米膜面积，1h30min
内参选择用beta-tubulin 55K
或者GAPDH 37K

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:12

老师，我最近做wb，条带两边总是有些翘，如图。
电泳条件：80V 20min;100V,60min 预染marker没问题，就是整体条带是上宽下窄，像是梯形
转膜条件:300MA 60MIN

凝完胶后没有洗加样孔，而是观察了一下每个加样孔，看上去都蛮平整的；我们老板让我用薄滤纸伸到孔里把两边底角多余的胶吸走，但我没见有多余的啊。。。
他说还有可能是样本不均匀，怎么才能弄均匀呢？谢谢！

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出现这种情况也正常
你试试分离胶电泳150V

作者: dog002 时间: 2013-3-2 09:13

MHC亚型分离，分子量大，现在电泳时间70-80V，18-20小时，作为内参的β-actin很容易跑不见了。有老师建议用梯度胶，可我们实验室没有梯度胶搅拌器，如果手工灌不均匀梯度胶，可行否？具体有没有什么好的建议？

现在买了MHC-I，MHC-II两个一抗，外加抗β-actin的抗体，一下子就3个一抗了，这个在后面WB转膜孵育的时候，怎么操作比较好呢？同时孵，有影响没有呢？

烦请斑竹赐教！

万分感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:17

QUOTE:

原帖由 dog002 于 2013-3-2 09:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
MHC亚型分离，分子量大，现在电泳时间70-80V，18-20小时，作为内参的β-actin很容易跑不见了。有老师建议用梯度胶，可我们实验室没有梯度胶搅拌器，如果手工灌不均匀梯度胶，可行否？具体有没有什么好的建议？

现在买了MHC-I，MHC-II两 ...

你的电泳槽什么型号？
胶的高度有多少？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-2 09:17

请问版主，我W的结果在目的条带的位置全部表现为像大气泡一样的黑色（我也很难描述准确），以前也遇到过。另外的标本相同的指标不是，而且b-actin也是好的，不知是什么原因？如何改良呢？谢谢！

作者: 831226 时间: 2013-3-2 09:18

图今天没有拷，就是黑色一团，在目的条带的位置100多
k，但是又看着圆圆的。如果实在难以想象那就等明天了呵呵。很为难您啊。谢谢版主！

作者: 831226 时间: 2013-3-2 09:18

我用的是碧云天的ECL化学发光试剂，以前的时候用的很好，之后条带量。昨天晚上用的时候发现AB液体一混之后，EP管就开始发亮，仿佛荧光棒一样，亮度亮到可以看清楚暗室中的东西。滴到膜上之后不光整张膜都亮，所有沾到发光液的地方都在亮。好像夜空中的繁星。根本就没法曝光，恳请斑竹赐教。
PS:我在加AB液的时候换枪头了，EP管也是新的，刚刚消完毒的。而且我用了实验室的其他不同五个人的，不同批次和厂家的，都出现了这个情况，以前的时后都没有。发光液没有过期。最早的是今年八月份买的。最晚的是十一月份买的。

作者: mamamiya 时间: 2013-3-2 09:22

请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做co-IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？

2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？

3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？

4、在我的试验中，两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异，如何做IP，比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢？是不是只能靠调整上样量啊？例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍，那在做IP时，将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊？有没有其他的办法啊？

5、还有一个ICC的荧光二抗的问题，我使用的是proteintech的cy3兔抗，厂家推荐是1：20-100，我稀释到1：600都有假阳性（用PBS代替一抗），用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊？

作者: mamamiya 时间: 2013-3-2 09:30

还有，对于我这次做co-IP的结果很是有点搞不懂，希望高人指教：
第一次做忘记上总蛋白的对照了，但是上清都有目的条带出来，应该可以作为参考吧！
问题是：
我顺便又孵了一下actin和GAPDH,但是出来的条带很是奇怪，GAPDH 的条带是符合预期的，在两个上清中都有，而beads中没有，可是为啥actin在所有的beads中和IgG上清中有，而在IP的上清中没有呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:30

请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？

2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？

3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？

4、在我的试验中，两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异，如何做IP，比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢？是不是只能靠调整上样量啊？例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍，那在做IP时，将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊？有没有其他的办法啊？

5、还有一个ICC的荧光二抗的问题，我使用的是proteintech的cy3兔抗，厂家推荐是1：20-100，我稀释到1：600都有假阳性（用PBS代替一抗），用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊？

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你的问题我不是很明白
不好意思
你为什么不用WB试试？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:36

还有，对于我这次做IP的结果很是有点搞不懂，希望高人指教：
第一次做忘记上总蛋白的对照了，但是上清都有目的条带出来，应该可以作为参考吧！
问题是：
我顺便又孵了一下actin和GAPDH,但是出来的条带很是奇怪，GAPDH 的条带是符合预期的，在两个上清中都有，而beads中没有，可是为啥actin在所有的beads中和IgG上清中有，而在IP的上清中没有呢？

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抗体与actin有非特异性结合

作者: vcve 时间: 2013-3-2 09:36

请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？

2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？

3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？

4、在我的试验中，两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异，如何做IP，比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢？是不是只能靠调整上样量啊？例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍，那在做IP时，将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊？有没有其他的办法啊？

5、还有一个ICC的荧光二抗的问题，我使用的是proteintech的cy3兔抗，厂家推荐是1：20-100，我稀释到1：600都有假阳性（用PBS代替一抗），用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊？

你的问题我不是很明白
不好意思
你为什么不用WB试试？

不好意思是co-IP。漏写了，我是想做CRT和另一个分子伴侣的相互作用。请指教！

作者: vcve 时间: 2013-3-2 09:37

你的问题我不是很明白
不好意思
你为什么不用WB试试？

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不好意思是co-IP，漏写co了，是想做CRT和另一个分子伴侣之间的相互作用。谢谢

作者: 49888 时间: 2013-3-2 09:37

抗体与actin有非特异性结合

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如果是非特异结合的话，那为什么co-IP的上清也没有出来呢？

作者: wood533 时间: 2013-3-2 09:38

伯乐半干转膜仪，伯乐PVDF膜，转移缓冲液配方（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml

我试过1.5mA/cm2，2h，但只在95kD处有模糊条带（90ug蛋白，电泳后直接考染，110-130都有明显条带，转膜后，凝胶上肉眼看不见明显条带，但膜上丽春红染色液也看不到条带）。请教楼主，我该怎么改进，是不是转膜时间还要增加啊

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:40

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2013-3-2 09:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
伯乐半干转膜仪，伯乐PVDF膜，转移缓冲液配方（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml

我试过1.5mA/cm2，2h，但只在95kD处有模糊条带（90u ...

你的目的是什么？
请说清楚

作者: wood533 时间: 2013-3-2 09:40

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-2 09:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的目的是什么？
请说清楚

目的：110-130kD的转膜条件。
我按1.5mA/cm2，2h半干转膜，曝光出来只在95kD处有点条带，而且还不是很明显。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:41

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原帖由 wood533 于 2013-3-2 09:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

目的：110-130kD的转膜条件。
我按1.5mA/cm2，2h半干转膜，曝光出来只在95kD处有点条带，而且还不是很明显。

1、marker指示不准确
2、抗体非特异性结合

作者: loli 时间: 2013-3-2 09:41

楼主您好，我刚准备做WB，我的目的蛋白22KD，想请教一下配胶的浓度，跑胶时间电压，以及半干转转膜条件，还有该怎么样摸一抗二抗浓度呢，谢谢，问题有点弱，还是希望您能详细说说，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:41

QUOTE:

原帖由 loli 于 2013-3-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主您好，我刚准备做WB，我的目的蛋白22KD，想请教一下配胶的浓度，跑胶时间电压，以及半干转转膜条件，还有该怎么样摸一抗二抗浓度呢，谢谢，问题有点弱，还是希望您能详细说说，谢谢 ...

要说的东西太多了。。。。。。

作者: loli 时间: 2013-3-2 09:45

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-2 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要说的东西太多了。。。。。。

不好意思，问题太多了，学习了楼主先前的帖子，现我把问题再具体些，劳烦楼主给解答一下
1，我们实验室跑胶现用70V+100V,用于我的目的蛋白22K可以吗，
2，22KD的话膜用0.45还是0.22呢
3,转膜1.2mA每平方厘米,该转多少时间呢
4,楼主说先点杂交摸二抗浓度,是不是说封闭后洗膜,不加一抗,将不同浓度二抗点在膜上,待膜干后用ECL显影
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:46

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原帖由 loli 于 2013-3-2 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不好意思，问题太多了，学习了楼主先前的帖子，现我把问题再具体些，劳烦楼主给解答一下
1，我们实验室跑胶现用70V+100V,用于我的目的蛋白22K可以吗，
2，22KD的话膜用0.45还是0.22呢
3,转膜1.2mA每平方厘米,该转多少时间呢
4,楼 ...

1，可以用90V，溴酚蓝跑到分离胶调整电压150V
2，两种膜都可以用
3，转膜1.2mA每平方厘米，恒流，30min~40min
4，二抗点膜的话在干的NC膜上直接点稀释好的二抗，不用封闭等。在室温干燥后直接用ECL曝光，显影

作者: bamboo16 时间: 2013-3-2 09:46

斑竹，请问转完膜之后的PVDF膜在封闭液中4度封闭一周还能再接着用吗？
O(∩_∩)O谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 09:47

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原帖由 bamboo16 于 2013-3-2 09:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

斑竹，请问转完膜之后的PVDF膜在封闭液中4度封闭一周还能再接着用吗？
O(∩_∩)O谢谢

看奶粉长菌、结块没有
如果没有肯定没问题

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-2 09:52

最近做一对不同样本中目的蛋白的定量比较，杂了b-actin后发现很难保证上样量相同，我是一块胶同样的一对样品重复上样(40ug)，结果两两比较时actin一会高一会低，请问对于这种定量比较实验，老师有什么好的经验可以传授一二？比如备样，上样，转膜和曝光，其中有哪些要特别注意？O(∩_∩)O谢谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-2 09:53

我做western也做了好多次了，也算是初学者。有几次转膜完的时候发现胶条变皱了一个角，像是在空气中氧化的那样，是什么原因呢？是因为有气泡的原因吗？怎么样才能知道气泡都赶干净啦？每次我都赶好几遍的，可是还是会这样，真是愁人。希望帮忙解答一下

作者: flower-201 时间: 2013-3-2 10:35

请问我要检测血清里的蛋白，蛋白浓度有什么要求吗

作者: jkobn 时间: 2013-3-2 10:35

伯乐半干转膜仪，伯乐PVDF膜，转移缓冲液配方（48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％ SDS，20％甲醇）：
甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml

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我有2个目的蛋白，分别是110kD和130kD，用上述仪器和试剂，麻烦楼主推荐个转膜条件。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:36

最近做一对不同样本中目的蛋白的定量比较，杂了b-actin后发现很难保证上样量相同，我是一块胶同样的一对样品重复上样(40ug)，结果两两比较时actin一会高一会低，请问对于这种定量比较实验，老师有什么好的经验可以传授一二？比如备样，上样，转膜和曝光，其中有哪些要特别注意？O(∩_∩)O谢谢

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1，转膜时没有压好胶与膜
2，抗体孵育不完全
3，上样时样品有没有完全上进上样孔

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:36

请问我要检测血清里的蛋白，蛋白浓度有什么要求吗

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蛋白浓度调整至4mg/ml左右
浓度太高变性时容易有沉淀产生

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:36

我有2个目的蛋白，分别是110kD和130kD，用上述仪器和试剂，麻烦楼主推荐个转膜条件。

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恒流 1.2mA每平方厘米膜面积
110K与130K都可以选择2h30min

作者: kuaizige 时间: 2013-3-2 10:48

1，可以用90V，溴酚蓝跑到分离胶调整电压150V
2，两种膜都可以用
3，转膜1.2mA每平方厘米，恒流，30min~40min
4，二抗点膜的话在干的NC膜上直接点稀释好的二抗，不用封闭等。在室温干燥后直接用ECL曝光，显影

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谢谢斑竹，但是关于二抗点膜还是不太明白，是转膜后待膜干了，再点二抗吗，能不能将步骤给我讲讲，直接点二抗就能显影是什么原理呢，谢谢

作者: qqq111 时间: 2013-3-2 10:49

1，转膜时没有压好胶与膜
2，抗体孵育不完全
3，上样时样品有没有完全上进上样孔

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谢谢老师！您的建议很有启发！还想接着问一下：
1，转膜时没有压好胶与膜：我是湿转的，做三明治的时候每一层都用试管擀过，还多加了一层滤纸（一般两面各一层），是不是还有些细节没做到？
3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？

此外是不是上样的时候先稀释一下样品，上样体积大一点会更好的控制误差呢？

再次感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:49

谢谢老师！您的建议很有启发！还想接着问一下：
1，转膜时没有压好胶与膜：我是湿转的，做三明治的时候每一层都用试管擀过，还多加了一层滤纸（一般两面各一层），是不是还有些细节没做到？
3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？

此外是不是上样的时候先稀释一下样品，上样体积大一点会更好的控制误差呢？

再次感谢！

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3，上样时样品有没有完全上进上样孔：我是用吉尔森的黄枪头上样，是不是用专用的加样针会好些？或者是上样太慢？我每次都同时跑两块胶，加进去的样又扩散了？
用10ul的白枪头来加样

作者: 8princess8 时间: 2013-3-2 10:50

你好，我是新手想请教几个问题：
全病毒是否能跑蛋白电泳啊？我直接用乙脑病毒细胞培养液，1000rpm离心2min,取上清加上样buffer，煮沸5分钟，然后跑的蛋白电泳，按理说，应该是跑出来好多条带的，但是只在70kd处有一条带，正好与乙脑全病毒E蛋白大小相差不大，做了好几次都这样，是不是离心也可能把蛋白给离下来啊，还是不应该煮沸啊？
如果全病毒能跑蛋白电泳，打算用西尼罗河病毒E蛋白（两病毒同属一个血清群，存在血清学交叉反应）的单抗来做个western，证实一个这个单抗是否好用，您觉得可行么？

作者: am10 时间: 2013-3-2 10:50

斑竹你好，我是已把之前的帖子都看了一遍了，学了不少知识，但是关于二抗点杂交您没作过详细的步骤介绍啊，劳烦您再给讲讲
还有半干转1.2mA每平方厘米，我膜很小的，15～20平方厘米吧，那不就是说电流用的很小？
我蛋白22K现用15%分离胶，5%浓缩胶，电泳时电压大小和分子量什么关系呢，大电压的话跑的时间比较短，小蛋白会不会容易跑过了呢，谢谢

作者: 831226 时间: 2013-3-2 10:51

你好，我最近在跑胶时出现很奇怪的问题，就是marker中间条带会竖起来，（marker是260-10kD），在90kD以上marker很正常，但是70-30kD中间条带的地方marker就竖着，这是什么原因造成的呢？会是胶凝的不均匀造成的吗？我在配制7.5%的胶时会放在37度烘箱半小时，差不多凝了。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:51

斑竹你好，我是已把之前的帖子都看了一遍了，学了不少知识，但是关于二抗点杂交您没作过详细的步骤介绍啊，劳烦您再给讲讲
还有半干转1.2mA每平方厘米，我膜很小的，15～20平方厘米吧，那不就是说电流用的很小？
我蛋白22K现用15%分离胶，5%浓缩胶，电泳时电压大小和分子量什么关系呢，大电压的话跑的时间比较短，小蛋白会不会容易跑过了呢，谢谢

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1，电泳时溴酚蓝跑至胶底部，22K蛋白肯定还在胶内
2，蛋白在浓缩胶内一般用80V或者90V跑，溴酚蓝进入分离胶后改称150~180V
电压不能太高
3，转膜电流是很小
4，用PBS稀释二抗，1：1000，2000，4000，8000，。。。。
在NC膜上把每个梯度的稀释二抗点膜：每个点1ul
在室温下干燥后加上ECL孵育，孵育完成后进行曝光操作

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-2 10:52

版主，你好！可否帮我分析下western结果？

我做的是香蕉果实一个转录因子的western，大小26 kDa左右，上样30 ug，我们做过考染，条带比较清晰，抗体是委托公司通过原核表达，蛋白纯化和兔血清纯化得来的，二抗是promega的羊抗兔带AP标记。我们的转膜条件是100 毫安转6 h，封闭液是3%BSA+TBST，4度封闭过夜，一抗浓度1：2000，反应3 h，二抗使用浓度1：5000（采用TBST+0.5%BSA稀释），反应1 h。NBT和BCIP显色。我这个图片显色时间较长。得到的结果是杂带多，目的条带为图片箭头所示。是不是封闭不好还是一抗使用浓度高了？多谢了！

另外，我订购了一个进口的封闭液（不是BSA的），我是否还可以用采用TBST+0.5%BSA来稀释二抗？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-2 10:52

我用的膜是Bio-Rad PVDF膜（0.2 um的）

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:52

版主，你好！可否帮我分析下western结果？

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1、你的电泳跑的很好
2、转膜时间不需要这么长，以我的经验 300mA恒流，30min
3、从结果来看一抗浓度太高，需要继续稀释一抗，做一个梯度，稀释2、5、10倍
4、二抗可以直接用TBST稀释，RT孵育30~40min就行

作者: 831226 时间: 2013-3-2 10:53

多谢版主的解答，这两天按照你提供的建议重新做一下。
另外，还有一个问题想问问你，我们订的一个进口封闭液到了，是GenWay公司的，我看其产品介绍它是Phosphate Buffered saline/fish gelatin配制的封闭液。我看了园子里的一些帖子，用AP标记，BCIP/NBT显色的最好不要用PBS Buffer的。我打算用Phosphate Buffered saline/fish gelatin来封闭，用它来稀释一抗，一抗反应后再用TBST洗3次，二抗用TBST稀释，反应 1 h，最后用BCIP/NBT显色。这样是否可以？是否我得改用PBS buffer，不用TBST buffer了，但这样又不能用BCIP/NBT来显色了。
麻烦版主了！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:53

多谢版主的解答，这两天按照你提供的建议重新做一下。
另外，还有一个问题想问问你，我们订的一个进口封闭液到了，是GenWay公司的，我看其产品介绍它是Phosphate Buffered saline/fish gelatin配制的封闭液。我看了园子里的一些帖子，用AP标记，BCIP/NBT显色的最好不要用PBS Buffer的。我打算用Phosphate Buffered saline/fish gelatin来封闭，用它来稀释一抗，一抗反应后再用TBST洗3次，二抗用TBST稀释，反应 1 h，最后用BCIP/NBT显色。这样是否可以？是否我得改用PBS buffer，不用TBST buffer了，但这样又不能用BCIP/NBT来显色了。
麻烦版主了！

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直接用TBST不就行了啊
你们那配置TBST麻烦？

作者: orangecake 时间: 2013-3-2 10:54

呵呵，不是的，因为我这次订的封闭液Phosphate Buffered saline/fish gelatin，它已经用PBS buffer溶解了的。如果我用这个buffer来封闭，一抗用这个封闭液来稀释，接下来二抗用TBST稀释是否可以？对最后的显色是否有影响？

作者: yes4 时间: 2013-3-2 10:55

你好！我想问一下同一张膜重新孵育同一种抗体要怎么处理？也跟孵育另外一种抗体一样要先淬灭吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:55

请教大家几个问题：
1、我做的是人肿瘤细胞，钙网蛋白（calreticulin， CRT/CALR），刚开始用的是abcam的兔源多抗ab4，怎么都没有条带，投诉后换了同样是兔多抗的ab2904，条带出来了（单一且位置符合）。但是现在由于做co-IP，换了个其他实验室使用的很好的stressgen的鼠单抗，居然又没有出来（条件和他们实验室一样，甚至增加了3倍的浓度，延长孵育时间都没有），而且用的是同一张膜，先用的abcam的兔多抗,条带很强，但是由于和IgG重链没有分开，所以重新洗膜后再孵stressgen的鼠单抗，结果连阳性对照都没有出来，再用同一张膜重新孵育abcam的兔多抗，又出来了，这是什么原因呢？

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还是抗体的原因，换成1：1000，4度48小时，室温2小时，条带就出来了。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:56

2、接上面的问题，对于同一张膜，同一个蛋白使用不同的来源的抗体，条带应该在一个位置吗？

==

在

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:56

3、再接上面的问题，我的IP目的蛋白是64KDa，IgG重链是50，我现在用的是12.5%的胶，120V跑上层，80V下层跑3小时，结果由于IgG太强，掩盖了目的蛋白的信息，本来想换鼠源性的抗体来回避这个问题的，但是由于那个鼠源性的抗体一直没有出来，那只有在兔源抗体上想办法了。我除了降低IP的抗体浓度以外（厂家只说可以做IP，但是没有推荐浓度，ICC的推荐浓度是1/300，我这次做IP用的是1/100），还想通过改变下层胶的浓度是电泳时间来再将64-50两个条带拉开一些，有没有什么建议啊？有说如果电泳时间过长会使条带弥散，最长可以跑多长时间？

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降低IP抗体浓度至1：300，换成8%的下层胶80V3小时，条带分开了。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:59

4、在我的试验中，两种不同的细胞A和B蛋白本来表达就有差异，如何做IP，比较这两个不同细胞中A蛋白与B蛋白结合能力的强弱呢？是不是只能靠调整上样量啊？例如在药物处理后的细胞中A蛋白的量是未处理细胞的两倍，那在做IP时，将药物处理后的细胞的蛋白量少上一半啊？有没有其他的办法啊？

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貌似只有这种办法了！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 10:59

5、还有一个ICC的荧光二抗的问题，我使用的是proteintech的cy3兔抗，厂家推荐是1：20-100，我稀释到1：600都有假阳性（用PBS代替一抗），用没有哪位用过该厂家的该荧光二抗啊？

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是固定液的问题，本来为了看内质网是用戊二醛，结果即使不加II抗，也是全片假阳性，换成PFA后就好了，当然同样的条件内质网染色会弱，后来延长染色时间也解决了。

作者: 3648755 时间: 2013-3-2 11:00

您好;
请问460KDa的蛋白western的电泳和转膜条件？半干转合不合适？需要多大电压，谢谢
6%的胶能检测吗？是不是一定需要梯度胶？梯度胶要怎么配制？谢谢

作者: 3648755 时间: 2013-3-2 11:00

请教各位，有没有遇见过抗体结成冰块的，今天收到santa的抗体居然结成冰块了，应该4度保存的，不知对抗体质量影响大吗

作者: DONT 时间: 2013-3-2 11:01

请教一下版主：
我的目的基因是44KD，内参选GADPH（37KD），一抗敷育时需要把膜剪开分别敷育吗？还是直接加目的蛋白的一抗和二抗，PBST清洗后再加GADPH的一抗和二抗？谢谢

作者: moonlight45 时间: 2013-3-2 11:01

版主你好：
我做western一直问题不断，没次压片后各泳道之间都是连在一起的，条带模糊不清，不知道是什么原因，考染胶时泳道分的很开，条带也很清晰，丽春红染膜也还好，可是压片效果总不好。
蛋白：46KD左右。目的蛋白有两个条带，大小差别不大

15%的分离胶，5%的浓缩胶
电泳：70V30分钟，110V120分钟
转膜：湿转220毫安120分钟
5%脱脂奶粉封闭，室温摇床5小时
一抗：1：400（推荐1：200-1：400）室温摇床1小时，4℃过夜
TBST10分钟*3次，TBS10分钟1次
二抗1：5000室温摇床1小时
TBST10分钟*3次，TBS10分钟1次

图片附件: 29850534.jpg (2013-3-2 11:02, 7.47 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15038

作者: 2541 时间: 2013-3-2 11:03

层粘连蛋白的western blotting 有谁做过啊？层粘连蛋白能做western blotting 吗？它的分子量是820KD。请师兄师姐们不吝赐教，谢谢。

作者: 04906 时间: 2013-3-2 11:38

版主，你好！
就我的western blot问题再此向你请教。

我做的是香蕉果实一个转录因子的western，大小26 kDa左右，上样30 ug，我们做过考染，条带比较清晰，抗体是委托公司通过原核表达，蛋白纯化和兔血清纯化得来的，我们的转膜条件是100 毫安转5 h，封闭液是订购GenWay公司的。4度封闭过夜。

第一次做的一抗浓度1：2000（封闭液稀释），反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，promeag公司）使用浓度1：5000（采用TBST稀释），反应1 h。NBT和BCIP显色。得到的结果是杂带多，目的条带为图片箭头所示（见图1）。

按照你给的意见，第二次做的一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，得到的结果是条带少，且目的条带很微弱。而其中一个大小在50 kDa左右的杂带非常明显（见图2）。

同时，我们还做了一个二抗为HRP标记的，一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（抗兔HRP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，普利莱超敏发光液ECL显色，孵育3 min，压片1.5 min，奇怪的是，这次显示出来的一个很明显的杂带在15-10 kDa之间，而目的条带也不是非常明显（见图3）。

是不是我第二次做的一抗浓度过低？还有，我第二次做的两张图片，只是二抗不同，显色方法不一样，显示出来的明显杂带怎么会差别这么大？请版主再帮忙分析下，多谢了！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:39

版主，你好！我想问一下同一张膜重新孵育同一种抗体要怎么处理？也跟孵育另外一种抗体一样要先淬灭吗？

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1、分子量离得比较近的话可以选择用Stripping buffer
2、分子量差别10K以上，可以在第一种目的蛋白曝光后，直接洗去ECL进行后面新一抗的孵育
3、同一种抗体的话可以直接孵育，但是效果可能会差一些，可参考用stripping buffer处理后进行孵育同一种一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:39

您好;
请问460KDa的蛋白western的电泳和转膜条件？半干转合不合适？需要多大电压，谢谢
6%的胶能检测吗？是不是一定需要梯度胶？梯度胶要怎么配制？谢谢

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梯度胶配制请参考《蛋白质技术手册》、汪家政

这么大的蛋白没试过半干转
我做这么大的蛋白都用湿转的

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:39

请教各位，有没有遇见过抗体结成冰块的，今天收到santa的抗体居然结成冰块了，应该4度保存的，不知对抗体质量影响大吗

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避免反复冻融就是怕结冰了之后发生融化、再冻。。。
但是一次应该不会有很大影响

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:40

请教一下版主：
我的目的基因是44KD，内参选GADPH（37KD），一抗敷育时需要把膜剪开分别敷育吗？还是直接加目的蛋白的一抗和二抗，PBST清洗后再加GADPH的一抗和二抗？谢谢

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相差7KD不好剪开
可以按你后面的说法做
直接加目的蛋白的一抗和二抗，PBST清洗后再加GADPH的一抗和二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:40

层粘连蛋白的western blotting 有谁做过啊？层粘连蛋白能做western blotting 吗？它的分子量是820KD。请师兄师姐们不吝赐教，谢谢。

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用梯度胶试试

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:41

版主，你好！
就我的western blot问题再此向你请教。

我做的是香蕉果实一个转录因子的western，大小26 kDa左右，上样30 ug，我们做过考染，条带比较清晰，抗体是委托公司通过原核表达，蛋白纯化和兔血清纯化得来的，我们的转膜条件是100 毫安转5 h，封闭液是订购GenWay公司的。4度封闭过夜。

第一次做的一抗浓度1：2000（封闭液稀释），反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，promeag公司）使用浓度1：5000（采用TBST稀释），反应1 h。NBT和BCIP显色。得到的结果是杂带多，目的条带为图片箭头所示（见图1）。

按照你给的意见，第二次做的一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（羊抗兔AP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，得到的结果是条带少，且目的条带很微弱。而其中一个大小在50 kDa左右的杂带非常明显（见图2）。

同时，我们还做了一个二抗为HRP标记的，一抗浓度1：5000，反应3 h，二抗（抗兔HRP标记，使用浓度1：5000，反应2 h，普利莱超敏发光液ECL显色，孵育3 min，压片1.5 min，奇怪的是，这次显示出来的一个很明显的杂带在15-10 kDa之间，而目的条带也不是非常明显（见图3）。

是不是我第二次做的一抗浓度过低？还有，我第二次做的两张图片，只是二抗不同，显色方法不一样，显示出来的明显杂带怎么会差别这么大？请版主再帮忙分析下，多谢了！

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1、我认为一抗的特异性不是很好，不知道你是做了Protein A纯化还是抗原亲和纯化后的抗体？
2、二抗与样品中的蛋白有非特异性结合，你可以直接用AP、HRP标记的二抗与转膜后的膜上蛋白反应进行检测，以确定是不是二抗对蛋白有非特异性结合
3、一抗的可能性比较大

作者: summerxx 时间: 2013-3-2 11:45

一抗是用Protein A纯化纯化的，是委托公司做的，是不是这种方法得到的一抗的特异性比抗原亲和纯化后的抗体差些？我也怀疑一抗可能不是非常理想
我再按照你的建议试试二抗与蛋白是否有非特异结合。多谢版主的耐心解答。

作者: remenb 时间: 2013-3-2 11:46

版主，你好！
我是个wb新手~ 虽然按照师兄姐的wb步骤做过了wb，但是对于原理方面的东西掌握的不是很扎实，目前遇到一个问题不知道怎么解决，恳请您的帮助！
目前我想从6~7种不同的卵巢癌细胞株中看同一种蛋白的表达情况，选择表达最高的和最低的做后续试验，我是这样设想的：收细胞提蛋白测定浓度以后按照每种细胞40微升总蛋白上样，由于目的带靠（47kd）近β-actin，所以准备上两块板子，1块做目的带，一块做β-actin，然后看表达情况，由于牵扯细胞比较多蛋白提起来比较麻烦所以我想问问这样设计有问题么？如果β-actin的亮度不一致怎么办？是否还需要先做一次β-actin来调整上样浓度？另外提蛋白的时候到底需不需要用超声？实验室有的人用有的人不用~ 都说可以，想问下版主的意见！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-2 11:46

版主你好：
我想想问个问题，我现在要用Western Blot方法半定量检测癌细胞EC109和放射抗拒细胞TE13R120中几种蛋白含量。因临床工作比较繁忙，有没有公司专门做这个的啊，有的话，可否告诉我他们的联系方式，呵呵，谢谢了！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-2 11:47

烦请版主帮我分析一下这是什么原因引起的？谢谢！

图片附件: 33728234.snap.jpg (2013-3-2 11:47, 5.41 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15039

作者: sunnyB 时间: 2013-3-2 11:47

我最近跑的WB，marker在分离胶中部时还可以清楚的看到，但是等溴酚蓝跑出来后marker 就看不清了，切胶时彩色marker红色条带以上的带子都几乎看不见，以下的条带很松散变宽了，之前都还好，不知为什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:48

版主，你好！
我是个wb新手~ 虽然按照师兄姐的wb步骤做过了wb，但是对于原理方面的东西掌握的不是很扎实，目前遇到一个问题不知道怎么解决，恳请您的帮助！
目前我想从6~7种不同的卵巢癌细胞株中看同一种蛋白的表达情况，选择表达最高的和最低的做后续试验，我是这样设想的：收细胞提蛋白测定浓度以后按照每种细胞40微升总蛋白上样，由于目的带靠（47kd）近β-actin，所以准备上两块板子，1块做目的带，一块做β-actin，然后看表达情况，由于牵扯细胞比较多蛋白提起来比较麻烦所以我想问问这样设计有问题么？如果β-actin的亮度不一致怎么办？是否还需要先做一次β-actin来调整上样浓度？另外提蛋白的时候到底需不需要用超声？实验室有的人用有的人不用~ 都说可以，想问下版主的意见！

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1、不同种细胞间即使上样量都为40ug，但是内参结果一般不会一致，beta-actin在不同细胞株内的表达是不同的
2、预实验时你可以通过两次平行实验来确定选择那两种细胞株进行后续实验
，先不用调整内参，而是用目的蛋白与beta-actin做比值，看半定量结果
3、可以选择GAPDH或者beta-tubulin

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:48

版主你好：
我想想问个问题，我现在要用Western Blot方法半定量检测癌细胞EC109和放射抗拒细胞TE13R120中几种蛋白含量。因临床工作比较繁忙，有没有公司专门做这个的啊，有的话，可否告诉我他们的联系方式，呵呵，谢谢了！！！

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看短信息
也可上网以WB技术服务为关键词搜索

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:48

我最近跑的WB，marker在分离胶中部时还可以清楚的看到，但是等溴酚蓝跑出来后marker 就看不清了，切胶时彩色marker红色条带以上的带子都几乎看不见，以下的条带很松散变宽了，之前都还好，不知为什么？

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1、marker在不同的胶浓度中表现出来的形式是不一样的
2、溴酚蓝跑出胶外，电泳时间长了对marker也有影响
3、加大marker的上样量

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:48

烦请版主帮我分析一下这是什么原因引起的？谢谢！

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能把情况描述一下吗？
胶片上有目的蛋白条带吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:55

能把情况描述一下吗？
胶片上有目的蛋白条带吗？

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感谢你的及时回复！不好意思！最上的膜上看到的条带是我的目的，最下的指标是也是一样的，但是不知为何会出现一团一团的？已经有多次了！再次感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:55

感谢你的及时回复！不好意思！最上的膜上看到的条带是我的目的，最下的指标是也是一样的，但是不知为何会出现一团一团的？已经有多次了！再次感谢！

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感觉像是被污染了

作者: fsdd817 时间: 2013-3-2 11:56

斑竹你好，最近做WESTERN，出现的问题是显影的时候条带总是出不全，例如有时control组的条带不出来，用一抗二抗去除液处理后重做有会出来，但其他原来出来的地方可能又会没有，一直不明白是什么问题，自己觉得可能是显影方法有问题，特请斑竹分析，并请教正确的显影方法，谢谢！

作者: zwsyrt 时间: 2013-3-2 11:56

最近做p-akt的western blot，ECL一直做不出来，连AKT也做不出来，DAB显色效果怎么样，能不能试下普通显色啊！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:57

最近做p-akt的western blot，ECL一直做不出来，连AKT也做不出来，DAB显色效果怎么样，能不能试下普通显色啊！

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akt与p-akt还是比较好做的
DAB的效果比ECL差很多呗
为什么要选择DAB法呢？
你用什么裂解液、一抗、二抗、ECL，告诉我厂家及货号吧

作者: fsdd817 时间: 2013-3-2 11:57

现在正在做，请教斑竹B-actin半干转，1.0ma/cm2，一般转多长时间？半小时是不是短了？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 11:58

现在正在做，请教斑竹B-actin半干转，1.0ma/cm2，一般转多长时间？半小时是不是短了？谢谢！

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30min肯定能做出条带来
但是延长时间转膜会更加充分一些
1h

作者: vera+ 时间: 2013-3-2 11:58

kt与p-akt还是比较好做的
DAB的效果比ECL差很多呗
为什么要选择DAB法呢？
你用什么裂解液、一抗、二抗、ECL，告诉我厂家及货号吧

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裂解液是自己配制的：5mlTris-hcl pH7.4, 3ml NaCl,定容到75ml，10ml10%NP-40,2.5ml10%Na-deoxycholate，摇晃至溶液澄清；1ml100mMEDTA，定容至100ml，2-8度保存，临用前加入抑制剂并立即使用：100ulaprotinin, 100ulleupeptin, 500ulpmsf, 500ulNa3VO4, 500ulNaF.
一抗是CST的，1：1000稀释，AKT抗体货号#9272，p-akt#4060；二抗是博士德的，货号BA1054，1：2000稀释；发光底物是SuperSignal West Pico (Pierce），货号3972.

作者: vera+ 时间: 2013-3-2 11:59

补充一下，有一次看到信号，压片怎么也压不出来，所以才想用DAB显色法试试，呵呵，谢谢斑竹啊！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:00

裂解液是自己配制的：5mlTris-hcl pH7.4, 3ml NaCl,定容到75ml，10ml10%NP-40,2.5ml10%Na-deoxycholate，摇晃至溶液澄清；1ml100mMEDTA，定容至100ml，2-8度保存，临用前加入抑制剂并立即使用：100ulaprotinin, 100ulleupeptin, 500ulpmsf, 500ulNa3VO4, 500ulNaF.
一抗是CST的，1：1000稀释，AKT抗体货号#9272，p-akt#4060；二抗是博士德的，货号BA1054，1：2000稀释；发光底物是SuperSignal West Pico (Pierce），货号3972.

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1、SuperSignal West Pico (Pierce），货号肯定不是3972
2、裂解液没什么大问题
3、后续实验条件呢？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-2 12:01

我最近在跑分子量110左右的目的蛋白，出现很奇怪的现象：彩色marker 跑到在分离胶中部时可以看的很清楚，但是等溴酚兰跑掉彩色marker 就看不清楚了（切胶是只能看到73红色以下的marker，73以上的基本看不到了，而且maeker的形状也不是条形的，变得很宽很散）。

作者: 2541 时间: 2013-3-2 12:02

请教下NBA检测磷酸化因子，提蛋白的时候，有什么注意事项吗？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:03

我最近在跑分子量110左右的目的蛋白，出现很奇怪的现象：彩色marker 跑到在分离胶中部时可以看的很清楚，但是等溴酚兰跑掉彩色marker 就看不清楚了（切胶是只能看到73红色以下的marker，73以上的基本看不到了，而且maeker的形状也不是条形的，变得很宽很散）。

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电泳时间长了会对marker造成不同的影响
加大上样量试试

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:03

QUOTE:

原帖由 2541 于 2013-3-2 12:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教下NBA检测磷酸化因子，提蛋白的时候，有什么注意事项吗？谢谢

注意防止磷酸化蛋白降解
最好使用蛋白酶与磷酸酶抑制剂，PMSF

作者: jkobn 时间: 2013-3-2 12:04

现在有一个棘手的问题,我在做WB之前用酶标仪定了上样的总蛋白量,但做了ACTIN后却总不能达成一致.总是不一致.请问这估计是什么原因?有什么比较好的解决办法?谢谢,急盼解答

作者: hustwb 时间: 2013-3-2 12:05

版主好，这是我昨天的结果，最上面是目的条带，下面两个分别是B-actin十分钟和过夜压片的结果，第一张B-actin图像出不全（应该8条带），第二张出全了，可也有背景了，片子上换能分清背景的条带，扫描了就分不清了。
实验条件：15%的胶（目的条带分子量15），半干转1mA/cm2，半小时，5%脱脂奶粉封闭1小时，1抗孵育2小时，2抗1小时。中间洗膜都是3个10分钟。这次已确保膜孵育时完全覆盖的问题。
请斑竹帮忙分析B-actin做不好的可能原因在哪里？谢谢！

图片附件: 72979542.snap.jpg (2013-3-2 12:05, 22.15 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15040

作者: hustwb 时间: 2013-3-2 12:05

补充，总蛋白上样量均为20ug

作者: kswl870 时间: 2013-3-2 12:06

版主，又一次来请教你了。
根据前两次你的意见，今天重新做了一次，ECL显色后杂带很少，背景也不错，就是出来的两条带与预测的分子量差别较大，预测应该是在26 kDa左右出现条带，但实际出来的两条带分子量在10 kDa左右。具体见图片，转膜是100毫安，5h，室温封闭2 h，然后4度封闭过夜，一抗1比3000，反应3 h，二抗1比5000，反应2 h，ECL发光液孵育3min（是普利莱超敏发光液），压片 5 min。
恳请版主再帮忙分析下，这次出现的分子量大小不一致的原因是什么？难道是转膜过程中目的蛋白出现了降解？如果是这样，如何改进呢？
非常感谢版主！

图片附件: 55104458.snap.jpg (2013-3-2 12:06, 21.43 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15041

作者: tianmei001 时间: 2013-3-2 12:07

你好，我想请问一下以下两个问题
1.内参怎么选择：我要测的是从SD大鼠分离的一种细胞的一个磷酸化蛋白的表达，不知道具体该买哪种内参？一定要做内参吗？
2.我的一抗写着 Applications: IHC:1:50-1:100，请问是什么意思，是使用时的稀释比例吗？
非常之感谢！急用！

作者: avi317 时间: 2013-3-2 12:08

你好！我的胶片洗出来的时候都是片子中间黑色有的脱落，还有显影液黑色絮状的，还能不能用啊？谢谢啊

作者: avi317 时间: 2013-3-2 12:16

我的整个背景都很黑，想知道什么原因？

作者: summerxx 时间: 2013-3-2 12:17

你好，我补充一下，我要检测的是p38。
提蛋白问题：我孵育的是12孔板，是消化后在加裂解液裂解，还是裂解后用细胞刮刮下来呢？裂解液中是不是可以加PMSF和另一种磷酸化酶抑制剂？
多谢，敬请老师尽量早些回复我哦。

作者: hold住 时间: 2013-3-2 12:18

我的实验有两个处理，每个处理有六个样品，请问做western blot的话，是否这12个样品都要在一张胶上同时做呢？一般western 每个处理做几个样品啊？
为什么看到的图片大多数一个处理只有一条带呢，这能说明问题吗？
还有一个问题，我的实验要检测3种蛋白的表达量有无差异，内参要做几次啊？

作者: xyw5 时间: 2013-3-2 12:18

现正在做WB，有一些问题难以解决，希望fangweibin119可以给我解疑释惑。我做的是小分子蛋白，分子量在37、21KD，用10%的胶跑，转膜是恒流280mA,1小时。但是在实验中发现每次转膜后，PVDF膜上Mark（师姐留下来的，德国公司）条带都不明显，蓝色条带几乎没有，红色的隐约可见，ECL发光可见目的蛋白条带影，只是条带表现为分组不明显，粗、黑或者呈圆点状不成线状，请老师指点一下，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:18

现在有一个棘手的问题,我在做WB之前用酶标仪定了上样的总蛋白量,但做了ACTIN后却总不能达成一致.总是不一致.请问这估计是什么原因?有什么比较好的解决办法?谢谢,急盼解答

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1、用什么定量方法？
2、蛋白定量准确性如何
3、可以通过内参的WB结果，计算积分光密度（IOD），然后再调整总蛋白上样量

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:19

版主，又一次来请教你了。
根据前两次你的意见，今天重新做了一次，ECL显色后杂带很少，背景也不错，就是出来的两条带与预测的分子量差别较大，预测应该是在26 kDa左右出现条带，但实际出来的两条带分子量在10 kDa左右。具体见图片，转膜是100毫安，5h，室温封闭2 h，然后4度封闭过夜，一抗1比3000，反应3 h，二抗1比5000，反应2 h，ECL发光液孵育3min（是普利莱超敏发光液），压片 5 min。
恳请版主再帮忙分析下，这次出现的分子量大小不一致的原因是什么？难道是转膜过程中目的蛋白出现了降解？如果是这样，如何改进呢？
非常感谢版主！

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1、分子量怎么不标上呢
2、你用的什么Marker？
3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:19

你好，我想请问一下以下两个问题
1.内参怎么选择：我要测的是从SD大鼠分离的一种细胞的一个磷酸化蛋白的表达，不知道具体该买哪种内参？一定要做内参吗？
2.我的一抗写着 Applications: IHC:1:50-1:100，请问是什么意思，是使用时的稀释比例吗？
非常之感谢！急用！

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1、内参肯定是要用的，而且最好能做非磷酸化蛋白
2、不知道你的分子量多少，如果是总蛋白的话可以参考用beta-tubulin 55K，beta-actin 43K，GAPDH 37K，选择与你分子量差异较大的内参
3、Applications: IHC:1:50-1:100 意思是免疫组化应用的稀释度是1：50-100

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:20

你好！我的胶片洗出来的时候都是片子中间黑色有的脱落，还有显影液黑色絮状的，还能不能用啊？谢谢啊

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显影液成酱油色就不能用了

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:20

我的整个背景都很黑，想知道什么原因？

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1、二抗浓度高
2、一抗特异性不好
3、ECL质量较差
4、曝光时间较长
5、显影时间太长
6、胶片被整体曝光了

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:21

你好，我补充一下，我要检测的是p38。
提蛋白问题：我孵育的是12孔板，是消化后在加裂解液裂解，还是裂解后用细胞刮刮下来呢？裂解液中是不是可以加PMSF和另一种磷酸化酶抑制剂？
多谢，敬请老师尽量早些回复我哦。

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1、可以再12孔板直接加裂解液，不用消化
2、裂解液中要加蛋白酶、磷酸酶抑制剂与PMSF（PMSF现用现加，在水溶液里30分钟降解）

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:22

我的实验有两个处理，每个处理有六个样品，请问做western blot的话，是否这12个样品都要在一张胶上同时做呢？一般western 每个处理做几个样品啊？
为什么看到的图片大多数一个处理只有一条带呢，这能说明问题吗？
还有一个问题，我的实验要检测3种蛋白的表达量有无差异，内参要做几次啊？

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1、所有样品都做最好、然后每个样品重复三次（当然没有必要这么做）
2、内参最好每次都做

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:23

现正在做WB，有一些问题难以解决，希望fangweibin119可以给我解疑释惑。我做的是小分子蛋白，分子量在37、21KD，用10%的胶跑，转膜是恒流280mA,1小时。但是在实验中发现每次转膜后，PVDF膜上Mark（师姐留下来的，德国公司）条带都不明显，蓝色条带几乎没有，红色的隐约可见，ECL发光可见目的蛋白条带影，只是条带表现为分组不明显，粗、黑或者呈圆点状不成线状，请老师指点一下，谢谢！

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1、可以选择12%分离胶
2、Marker过期了？是不是反复冻融次数太多？
3、曝光结果可能是洗膜不彻底照成的

作者: remenb 时间: 2013-3-2 12:23

1、分子量怎么不标上呢
我已经标出分子量了。

2、你用的什么Marker？
我们用的Bio-Rad的Precision Plus Protein standards（双色）marker，共8条带，从250-10 kDa，转膜后可以看到marker都转到膜上了，但在杂交洗膜过程中，marker颜色强度逐渐减弱，曝光后在X胶片上只出来两条带。

3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
我们的浓缩胶是3%，分离胶是12%（采用如下单体贮液：丙烯酰胺19.55g，甲叉0.45 g，定容到50 ml）

这两天换不同样品杂交，还是出来这两条带，当时公司给我一抗的时候，纯化出来的蛋白分子量是26 kDa，现在我们杂交出来的条带差10 kDa，杂交结果可否用呢，出现这样的情况是啥原因呢？多谢版主了。

图片附件: 72807188.jpg (2013-3-2 12:23, 24.53 KB) / 该附件被下载次数 141
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15042

作者: xue258 时间: 2013-3-2 12:24

请问版主有没有做过p-eNOS?乙酰胆碱可以用来做刺激剂吗？我反复做都做不出来，总蛋白和内参都做得出来，磷酸酶抑制剂也加了，谢谢！

作者: IAM007 时间: 2013-3-2 12:24

谢谢老师指点，那我换换marker试试。另外还想请教一个问题，我的跑胶时间过长，一般积层胶用60-70v*1小时，分离胶100V*4-5小时甚至跑过7小时的，但溴酚蓝仍未跑至底线，且17-10KD的marker也没跑开，隐于溴酚蓝中，每次的电泳缓冲液都是新鲜配制同时也注意了降温，想请教老师跑胶跑不开，电泳时间过长应该还考虑哪些方面的影响呢？电泳时间长对WB有何影响？

作者: flower-201 时间: 2013-3-2 12:25

非常感谢您的指导！因为是刚开始做所以不太懂，谢谢您的细致解释!我的蛋白是38kDa的。十二孔板直接加裂解液裂解多久呢，30分钟还是5分钟，要用细胞刮么？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:26

1、分子量怎么不标上呢
我已经标出分子量了。

2、你用的什么Marker？
我们用的Bio-Rad的Precision Plus Protein standards（双色）marker，共8条带，从250-10 kDa，转膜后可以看到marker都转到膜上了，但在杂交洗膜过程中，marker颜色强度逐渐减弱，曝光后在X胶片上只出来两条带。

3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
我们的浓缩胶是3%，分离胶是12%（采用如下单体贮液：丙烯酰胺19.55g，甲叉0.45 g，定容到50 ml）

这两天换不同样品杂交，还是出来这两条带，当时公司给我一抗的时候，纯化出来的蛋白分子量是26 kDa，现在我们杂交出来的条带差10 kDa，杂交结果可否用呢，出现这样的情况是啥原因呢？多谢版主了。

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你检测的是纯化后的蛋白还是内源性蛋白？
有可能是你的目的条带降解了

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:27

请问版主有没有做过p-eNOS?乙酰胆碱可以用来做刺激剂吗？我反复做都做不出来，总蛋白和内参都做得出来，磷酸酶抑制剂也加了，谢谢！

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不好意思哈
我只做过WB方面的实验
对乙酰胆碱有关的实验设计没有涉及过
总蛋白与内参都做的出来的话，现在的情况如下
1、换一抗
2、磷酸化蛋白可能较少，需要用更加灵敏的ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:28

谢谢老师指点，那我换换marker试试。另外还想请教一个问题，我的跑胶时间过长，一般积层胶用60-70v*1小时，分离胶100V*4-5小时甚至跑过7小时的，但溴酚蓝仍未跑至底线，且17-10KD的marker也没跑开，隐于溴酚蓝中，每次的电泳缓冲液都是新鲜配制同时也注意了降温，想请教老师跑胶跑不开，电泳时间过长应该还考虑哪些方面的影响呢？电泳时间长对WB有何影响？

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电泳可以采用90V，溴酚蓝进入分离胶采用150~180V
你跑这么长时间的电泳竟然没有到底？
pH有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:28

非常感谢您的指导！因为是刚开始做所以不太懂，谢谢您的细致解释!我的蛋白是38kDa的。十二孔板直接加裂解液裂解多久呢，30分钟还是5分钟，要用细胞刮么？

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1、38K的蛋白可以选用beta-tubulin作为内参
2、12孔板具体加裂解液的量我不是很懂，你告诉我细胞计数量，我可以告诉你加多少裂解液
3、直接加裂解液你可以看到细胞从壁上掉下来，2min左右，把它们收集到EP管中，放置在冰上孵育20min，期间需要振荡几次
4、不需要细胞刮

作者: kuaizige 时间: 2013-3-2 12:29

1、分子量怎么不标上呢
我已经标出分子量了。

2、你用的什么Marker？
我们用的Bio-Rad的Precision Plus Protein standards（双色）marker，共8条带，从250-10 kDa，转膜后可以看到marker都转到膜上了，但在杂交洗膜过程中，marker颜色强度逐渐减弱，曝光后在X胶片上只出来两条带。

3、不同的marker在不同的胶浓度里表现是不一样的
我们的浓缩胶是3%，分离胶是12%（采用如下单体贮液：丙烯酰胺19.55g，甲叉0.45 g，定容到50 ml）

这两天换不同样品杂交，还是出来这两条带，当时公司给我一抗的时候，纯化出来的蛋白分子量是26 kDa，现在我们杂交出来的条带差10 kDa，杂交结果可否用呢，出现这样的情况是啥原因呢？多谢版主了。

你检测的是纯化后的蛋白还是内源性蛋白？
有可能是你的目的条带降解了

我检测的是从香蕉果实里面提出来的总蛋白，采用酚抽提法提取的。我100毫安转了5 h，是不是转得时间太长了导致目的条带降解？我如何来避免目的条带降解呢？
多谢版主!

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:30

蛋白降解主要在蛋白提取的过程中
我没做过用酚抽提蛋白
不能给你建议

作者: 987789 时间: 2013-3-2 12:30

我在做ERK磷酸化的WB.一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给点建议，谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:31

QUOTE:

原帖由 987789 于 2013-3-2 12:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在做ERK磷酸化的WB.一抗是cell signaling的，稀释度按照他的说明书1：2000稀释。
第一次做的时候做出来了。
可是后来我用同样的样本重复就再也看不到条带。把其他同学做出来过的阳性样本再做也压不出条带来。
麻烦您给 ...

1、检查TBST等的pH
2、不要重复使用抗体多次

作者: caihong 时间: 2013-3-2 12:31

斑竹，您好！非常感谢您的解答。我现在还是把我整个western blot 的过程写一下：
首先我的目的蛋白是分子量为55kDa.5%的浓缩胶，10%的分离胶。电泳在浓缩胶是80v。到分离胶是150v。湿转100mA 100分钟。5%的脱脂奶粉室温2-3小时。一抗4度过夜，洗膜二抗37度一小时洗膜加发光液显影谢谢我的整个这个可合适，因为一直都没做出来。谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-2 12:32

看了您的WB经验后，很受启发，先感谢您的无私分享。
我现在也在做WB，我的内参b-actin（42KD）做的相当好，但是我的目的蛋白FAK（125KD）、phospho-FAK（125KD）的都没有做出来。我用的细胞分别为Hela及NIH3T3细胞　细胞数量为100万左右，收集细胞后，直接用国内公司的RIPA试剂加PSMF裂解。经考染后，发现总体蛋白条带不是很亮，特别是100KD以上的，我想是不是因为国产的RIPA的效果不大好，细胞蛋白的提量太少了？想请教您：您用的是国产还是进口的RIPA，或是自己配制的？效果如何？可否给点建议。谢谢先。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-2 12:32

我还怀疑是不是自己操作出问题，我就是按试剂说明书操作的：1.100万细胞加200ul的RIPA　buffer现加2ul的PMSF；2.吹打细胞，冰浴20min；3.4度，12000转离心10min,收集上清到新管。没感觉自己出了什么问题，为什么我的细胞目的蛋白就那么少呢？

作者: duoduo 时间: 2013-3-2 12:32

斑竹好，最近在做施万细胞的两个神经生长因子受体p75和TrkA的表达情况，是不是需要用专门的膜蛋白裂解液来提这两个蛋白啊，用一般的组织蛋白裂解液不知能否？谢谢！

作者: ending 时间: 2013-3-2 12:33

，打算这几天更换一下Tris-Hcl再看看。另外还有几个问题想再请教一下老师。
1、溴酚蓝跑得比较弥散，在积层胶（5%）时也不能压成线，应考虑哪些方面的影响？
2、marker是否需要变性？说明书上提示不能煮沸，可师姐说要变性，究竟是应该怎样做？

作者: owanaka 时间: 2013-3-2 12:35

版主好！
我是新手，刚接触WB，我老板的医院之前一直不做WB，师兄们都在学校做，都是现成的东西做，到我时因为在医院做了，所以试剂、抗体等都要自己买，如果买abcam的抗体，自己摸条件，想请教版主大概的预算经费。多谢了~~

作者: nut6694 时间: 2013-3-2 12:36

谢谢老师，下次我计数了我再请教您。还有问题哦：
1.您能否给我推荐一个电泳和转膜的条件以及一抗二抗的稀释度等？
2.做磷酸化蛋白是不是一般都该用BSA封闭呢；一抗二抗怎么稀释呢，是不是也该用含百分之几的BSA的TBST稀释？
3.转膜时用恒压或者恒流有什么区别，我该用什么呢
我还没有做过Western，自己的师兄师姐也都没有做这方面的实验，问题可多了，很希望能得到您的建议，麻烦了

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-2 12:36

遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？因为样品较少，希望能先现找到错误，再尝试。多谢啦！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-2 12:37

1.想请问一下，我们实验室做WB，在isolation完protein之后，按1：1的比例加好laemmli buffer，加热30min后-80℃保存，然后上样时按照测得的浓度和蛋白量得到上样的体积（每个孔的体积都是不一样的）这样的方法严谨么？

谢谢啦

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-2 12:37

您好，感谢您已经回答了这么多问题。您已经就二抗稀释度操作详细解答，但是如何确定最佳稀释度，我有疑问，我已经做完点杂交，但因为各稀释度都阳性且没有背景，是否须进一步稀释二抗。我用的是super signal显影，二抗稀释已经达100000。是否选择阴性结果的前一稀释为最合适？多谢。

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:38

斑竹，您好！非常感谢您的解答。我现在还是把我整个western blot 的过程写一下：
首先我的目的蛋白是分子量为55kDa.5%的浓缩胶，10%的分离胶。电泳在浓缩胶是80v。到分离胶是150v。湿转100mA 100分钟。5%的脱脂奶粉室温2-3小时。一抗4度过夜，洗膜二抗37度一小时洗膜加发光液显影谢谢我的整个这个可合适，因为一直都没做出来。谢谢

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1、一抗稀释度不合适或者一抗质量不好，与抗原没有反应
2、ECL敏感性太低

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:38

看了您的WB经验后，很受启发，先感谢您的无私分享。
我现在也在做WB，我的内参b-actin（42KD）做的相当好，但是我的目的蛋白FAK（125KD）、phospho-FAK（125KD）的都没有做出来。我用的细胞分别为Hela及NIH3T3细胞　细胞数量为100万左右，收集细胞后，直接用国内公司的RIPA试剂加PSMF裂解。经考染后，发现总体蛋白条带不是很亮，特别是100KD以上的，我想是不是因为国产的RIPA的效果不大好，细胞蛋白的提量太少了？想请教您：您用的是国产还是进口的RIPA，或是自己配制的？效果如何？可否给点建议。谢谢先。

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我用自己配制的裂解液
我们公司卖的裂解液产品也是我配制的
效果还可以吧
100K以上蛋白本身含量并不高
可以先加大上样量试试
另外你用的什么一抗、ECL？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:39

我还怀疑是不是自己操作出问题，我就是按试剂说明书操作的：1.100万细胞加200ul的RIPA　buffer现加2ul的PMSF；2.吹打细胞，冰浴20min；3.4度，12000转离心10min,收集上清到新管。没感觉自己出了什么问题，为什么我的细胞目的蛋白就那么少呢？

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减少RIPA的使用量
步骤及过程没有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:39

打算这几天更换一下Tris-Hcl再看看。另外还有几个问题想再请教一下老师。
1、溴酚蓝跑得比较弥散，在积层胶（5%）时也不能压成线，应考虑哪些方面的影响？
2、marker是否需要变性？说明书上提示不能煮沸，可师姐说要变性，究竟是应该怎样做？

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marker是否需要变性要看说明书
如我们公司我配制的marker就是不需要变性的

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:40

斑竹好，最近在做施万细胞的两个神经生长因子受体p75和TrkA的表达情况，是不是需要用专门的膜蛋白裂解液来提这两个蛋白啊，用一般的组织蛋白裂解液不知能否？谢谢！

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我刚做过Trk B，用santa的一抗，效果很好
不需要专门提取膜蛋白来做
1、用提取总蛋白的RIPA强即可
2、选择敏感性高的ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:41

谢谢老师，下次我计数了我再请教您。还有问题哦：
1.您能否给我推荐一个电泳和转膜的条件以及一抗二抗的稀释度等？
2.做磷酸化蛋白是不是一般都该用BSA封闭呢；一抗二抗怎么稀释呢，是不是也该用含百分之几的BSA的TBST稀释？
3.转膜时用恒压或者恒流有什么区别，我该用什么呢
我还没有做过Western，自己的师兄师姐也都没有做这方面的实验，问题可多了，很希望能得到您的建议，麻烦了

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1、电泳及转膜条件是一个复合的选项，大部分时间与经验有关，不能给你确切的答复。不知道你的蛋白分子量及胶的厚度等
2、最好选择用BSA，3~5%BSA-TBST均可
3、转膜恒压与恒流与个人习惯有关，都可以选择，我习惯恒流

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:41

遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？因为样品较少，希望能先现找到错误，再尝试。多谢啦！

=============================

确定转膜电极没有装反？
样品转膜前SDS-PAGE染过吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:41

1.想请问一下，我们实验室做WB，在isolation完protein之后，按1：1的比例加好laemmli buffer，加热30min后-80℃保存，然后上样时按照测得的浓度和蛋白量得到上样的体积（每个孔的体积都是不一样的）这样的方法严谨么？

谢谢啦

===================

不严谨
用1×的loading补足

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:42

您好，感谢您已经回答了这么多问题。您已经就二抗稀释度操作详细解答，但是如何确定最佳稀释度，我有疑问，我已经做完点杂交，但因为各稀释度都阳性且没有背景，是否须进一步稀释二抗。我用的是super signal显影，二抗稀释已经达100000。是否选择阴性结果的前一稀释为最合适？多谢。

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不用继续稀释了
二抗稀释度的选择选择一个中间梯度

作者: hold住 时间: 2013-3-2 12:42

请问，我打算做一个分子量400kd的胞浆蛋白，请问分离胶，浓缩胶该用什么浓度啊，还有跑胶时的电压改用多少呢，以及300ma转膜，大概需要多长时间谢谢，我也是刚做，不吝赐教！

作者: BUK 时间: 2013-3-2 12:43

请教版主：
电泳时定压状态下，电流非常小，除了电泳仪的问题外，其他还存在哪些因素？
定压80V时，电流只有不到10mA，定压120V时也只有十几mA。
谢谢斑竹^_^

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:44

请问，我打算做一个分子量400kd的胞浆蛋白，请问分离胶，浓缩胶该用什么浓度啊，还有跑胶时的电压改用多少呢，以及300ma转膜，大概需要多长时间谢谢，我也是刚做，不吝赐教！

===========================

能做梯度胶吗？最好用梯度胶
如果没有梯度胶可以选择6%分离胶
电泳时间延长
300mA 3h差不多了

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:45

请教版主：
电泳时定压状态下，电流非常小，除了电泳仪的问题外，其他还存在哪些因素？
定压80V时，电流只有不到10mA，定压120V时也只有十几mA。
谢谢斑竹^_^

===============================

电泳时定压状态下，电流本来就较小

作者: BUK 时间: 2013-3-2 12:46

不严谨
用1×的loading补足

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请问是不是事先加loading buffer本身就不严谨呢？是不是应该先加protein，再用loading buffer 将各个孔补足到20微升呢？

作者: BUK 时间: 2013-3-2 12:47

请问斑竹，我们实验室转膜是用恒流150mA，半干法，转16个小时，这个方法可以么？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:48

请问是不是事先加loading buffer本身就不严谨呢？是不是应该先加protein，再用loading buffer 将各个孔补足到20微升呢？

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浓度调整至一致，上样体积一致，总蛋白量一致

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:48

请问斑竹，我们实验室转膜是用恒流150mA，半干法，转16个小时，这个方法可以么？

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转什么蛋白啊
用这么长时间
多少平方厘米膜面积

作者: BUK 时间: 2013-3-2 12:49

转什么蛋白啊
用这么长时间
多少平方厘米膜面积

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我们实验室转什么都用这么长时间，膜大概是12cm×12cm左右吧

作者: NBA 时间: 2013-3-2 12:50

我们实验室转什么都用这么长时间，膜大概是12cm×12cm左右吧

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多大分子量蛋白？

作者: zhezhe 时间: 2013-3-2 12:50

请问老师：

曝光后背景颜色深该怎么解决？除了一抗、二抗的纯度，洗膜时间，还有哪些因素么？

跑β-actin的条带连成一片是否与上样量过多有关？

多谢版主~~

作者: jujuba 时间: 2013-3-2 12:50

请教一下老师：
我刚学western一个多月，最近做了几次，一抗分别用的是β-actin（1：1000）和smad3(鼠单克隆抗体1:200)，背景很干净，只有些许大分子杂带，但没有出现想要的条带.
我实验的条件是：蛋白上样量80ug，上样总体积20ul。电泳液和转移液都是新配的，电泳：5%积层胶 80v 45min ；10%分离胶 120v 2h。转膜用的是PVDF膜，2.5h，350mA。一抗过夜，二抗结合2h，用的是millipore的发光，暗盒曝光30s，90s，3min。
一抗购自santa cruz ，β-actin买了有大半年了，曾经被人放在-20℃中一两周，smad3是新近购买的。因为2009年12月底时做过一次相同条件的，但蛋白上样量是50ug，β-actin条带十分清晰，但有一两条颜色稍淡，所以就决定提高蛋白上样量，结果只出现一次，但是相当的深浅不一，之后就再也没出来过。考虑到效价降低我昨天做时就把浓度调整到1：500，仍旧不行。而smad3则一直未出现过较好的条带，有时背景是有点深但呈斑驳状的，条带若有似无。这次我也将浓度调到1：100，背景洗的很干净，仍无条带。
望老师帮我指条明路啊！！

作者: 131415 时间: 2013-3-2 12:51

相关疾病：
高血压
楼主您好，刚开始做很多地方不懂，我想问一下，高血压1型和3型胶原分子量大小怎么知道啊？内参老是做不出来是怎么回事？

作者: 131415 时间: 2013-3-2 12:51

胸主动脉外膜成纤维细胞TGF-β1、SM α-actin、I型及III型胶原肽蛋白，这四种蛋白的分子量怎么知道？这些指标跑电泳时所用的电压和时间该如何控制？配什么浓度的分离胶和浓缩胶合适？转膜时用多少电流，多长时间？我的问题比较低级，希望老师耐心解答。谢谢

作者: wmp1234 时间: 2013-3-2 12:52

我有两个问题请前辈指点下：
1.提取的核蛋白可以用β-Actin作为内参么？
2.同样的WB条件，但每次出来的条带都不一样（也有时候是前几个泳道的带出来了，有时候又是另外几个泳道的条带出来），但是Mark都能出来，这是什么原因呢？
谢谢先！！！

作者: gogo 时间: 2013-3-2 12:53

我做的蛋白分子量是220，上样按100ul上的，湿转3.5小时，牛奶封闭了10min,一抗1：200用牛奶稀释4°过夜，二抗1：1500 2小时，显色甬道很深，目的蛋白很浅，我该怎么做？

作者: qiangren789 时间: 2013-3-2 12:54

我用自己配制的裂解液
我们公司卖的裂解液产品也是我配制的
效果还可以吧
100K以上蛋白本身含量并不高
可以先加大上样量试试
另外你用的什么一抗、ECL？

===============================================================================================================

谢谢您的回复。
我用的一抗是从文献中查到的，分别购于SIGMA和Calbiochem公司。ECL为碧云天公司。我还想请教您：直接从细胞板上加提取液提取细胞　和把细胞消化到EP管中，再加提取液有取别吗？我比较下，从板上直接提取蛋白的要好很多，不知您有没有这样的经验？您在哪家公司，不方便公开说，就短信告诉我吧，谢谢先。

作者: BUK 时间: 2013-3-2 12:54

多大分子量蛋白？

============================================================

就是TH，60左右吧，我们用的一抗浓度是1：200，000，会不会太低了呢?
另外想问下版主，如果我想查使用多少浓度的抗体，该去哪里找呢？

作者: remenb 时间: 2013-3-2 12:55

请教老师：

1.我想重复使用用曝过光的膜，是必须洗脱抗体重孵一抗还是不洗脱直接再孵二抗就行？

2.我用两株不同细胞的蛋白裂解物做WB，孵同一种一抗，结果是一株曝出两条带（其中一条是目的大小，另一条距离很近），而另一株就只有一条目的条带，这可能是什么原因？

谢谢！

作者: wsll 时间: 2013-3-2 12:57

请问，第一次做，我有三个蛋白要做WB，一个是28kD、57kD、130KD，请问可在同一条件下跑胶，及胶的浓度？转膜的时候条件是什么？时间，电压等，谢谢！

作者: c86v 时间: 2013-3-2 14:14

检测磷酸化p38蛋白表达量的，分子量38kDa,电泳浓缩胶80v，分离胶150v；转膜可以恒流多大及多长时间比较合适呢？

作者: guagua 时间: 2013-3-2 14:17

第一张是湿转，恒压60V，90min转膜后，胶考染的结果，蛋白转的很斑驳，不知道什么原因

这一张是p-P 70（89KD左右）的BLOT图，不知道是不是目的条带

图片附件: 80609546.snap.jpg (2013-3-2 14:17, 13.11 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15043

作者: guagua 时间: 2013-3-2 14:36

这张膜对应的胶，我们也进行考染了，结果请看附件

我们想问的问题是：1 从第一张图片来看，我们转膜过程存在什么样的问题，可能的原因在哪？有什么建议吗（我们用的是Invitrogen 4%-12%的预制胶） 2 第二张图上，100KD底下的那条带是不是目的蛋白p-P70呢？条带斑驳的原因会不会是蛋白转的不好呢?

作者: wood533 时间: 2013-3-2 14:36

我是一名新手，做大鼠海马钙调蛋白，内源性的，分子量：16.7kd，版主建议用0.22um孔径膜，是不是用0.45的就做不出结果？另外劳烦版主给一点转膜（湿转）的建议。谢谢

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-2 14:36

上次请教的问题还没得到版主的回答，今天又出现啦。请版主百忙中给指教一下：
遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:37

请问老师：

曝光后背景颜色深该怎么解决？除了一抗、二抗的纯度，洗膜时间，还有哪些因素么？

跑β-actin的条带连成一片是否与上样量过多有关？

多谢版主~~

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1、连成一片与上样量大有关（还有ECL敏感性高、曝光时间长等）
2、背景深还有可能是抗体孵育时间过长、ECL敏感性（这点与二抗还有关系）

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:38

请教一下老师：
我刚学western一个多月，最近做了几次，一抗分别用的是β-actin（1：1000）和smad3(鼠单克隆抗体1:200)，背景很干净，只有些许大分子杂带，但没有出现想要的条带.
我实验的条件是：蛋白上样量80ug，上样总体积20ul。电泳液和转移液都是新配的，电泳：5%积层胶 80v 45min ；10%分离胶 120v 2h。转膜用的是PVDF膜，2.5h，350mA。一抗过夜，二抗结合2h，用的是millipore的发光，暗盒曝光30s，90s，3min。
一抗购自santa cruz ，β-actin买了有大半年了，曾经被人放在-20℃中一两周，smad3是新近购买的。因为2009年12月底时做过一次相同条件的，但蛋白上样量是50ug，β-actin条带十分清晰，但有一两条颜色稍淡，所以就决定提高蛋白上样量，结果只出现一次，但是相当的深浅不一，之后就再也没出来过。考虑到效价降低我昨天做时就把浓度调整到1：500，仍旧不行。而smad3则一直未出现过较好的条带，有时背景是有点深但呈斑驳状的，条带若有似无。这次我也将浓度调到1：100，背景洗的很干净，仍无条带。
望老师帮我指条明路啊！！

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1、santa的beta-actin抗体还是很不错的。在-20冻着不会有太大影响，融化后抗体会有部分降解
2、等beta-actin的条件摸好后如果smad3还是不能出结果，我建议你换抗体吧

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:38

楼主您好，刚开始做很多地方不懂，我想问一下，高血压1型和3型胶原分子量大小怎么知道啊？内参老是做不出来是怎么回事？

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狂晕
做不出来问题很多
你这两句话好难回答

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:39

胸主动脉外膜成纤维细胞TGF-β1、SM α-actin、I型及III型胶原肽蛋白，这四种蛋白的分子量怎么知道？这些指标跑电泳时所用的电压和时间该如何控制？配什么浓度的分离胶和浓缩胶合适？转膜时用多少电流，多长时间？我的问题比较低级，希望老师耐心解答。谢谢

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1、分子量具体多少请参考文献与你想要买的抗体说明书上所标记的
2、分离胶浓度与你的目的蛋白分子量有关，选择不同的胶浓度。浓缩胶选择5%就可以（分子量很大的话可以选择4%）
3、转膜电流可以采用300mA恒流、时间与胶厚度、浓度、分子量大小有关
4、电泳电压可以选择90V进分离胶后换150或者180V，时间通过marker来确定

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:39

我有两个问题请前辈指点下：
1.提取的核蛋白可以用β-Actin作为内参么？
2.同样的WB条件，但每次出来的条带都不一样（也有时候是前几个泳道的带出来了，有时候又是另外几个泳道的条带出来），但是Mark都能出来，这是什么原因呢？
谢谢先！！！

=============================================

1、加大一抗孵育体系
2、转膜后用丽春红染色检查转膜是否一致
3、marker是纯蛋白，转到膜上不管多少都会有一些条带

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:40

我做的蛋白分子量是220，上样按100ul上的，湿转3.5小时，牛奶封闭了10min,一抗1：200用牛奶稀释4°过夜，二抗1：1500 2小时，显色甬道很深，目的蛋白很浅，我该怎么做？

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泳道深？条带浅？
是不是胶被污染了？
有时候不同的一抗也会有这样的情况
封闭延长到30min

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:40

谢谢您的回复。
我用的一抗是从文献中查到的，分别购于SIGMA和Calbiochem公司。ECL为碧云天公司。我还想请教您：直接从细胞板上加提取液提取细胞　和把细胞消化到EP管中，再加提取液有取别吗？我比较下，从板上直接提取蛋白的要好很多，不知您有没有这样的经验？您在哪家公司，不方便公开说，就短信告诉我吧，谢谢先。

=============================================================================================================

1、这两家公司的抗体都不错
2、碧云天公司的ECL敏感性稍微差了点，可以用更加敏感的ECL
3、有些客户拿过来的时候是消化后的细胞收集在EP管中提取蛋白，如果是我自己做的话我喜欢直接加裂解液到培养板或皿提取蛋白。你说的这个经验当然有了。呵呵

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:41

就是TH，60左右吧，我们用的一抗浓度是1：200，000，会不会太低了呢?
另外想问下版主，如果我想查使用多少浓度的抗体，该去哪里找呢？

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看抗体说明书啊

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:41

请教老师：

1.我想重复使用用曝过光的膜，是必须洗脱抗体重孵一抗还是不洗脱直接再孵二抗就行？

2.我用两株不同细胞的蛋白裂解物做WB，孵同一种一抗，结果是一株曝出两条带（其中一条是目的大小，另一条距离很近），而另一株就只有一条目的条带，这可能是什么原因？

谢谢！

=================================================================================

1、第一条没理解你要具体怎么做
2、与细胞株本身的蛋白有关（如果操作上都一致的话：裂解液相同、同一批次提取蛋白。。。。。）

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:41

请问，第一次做，我有三个蛋白要做WB，一个是28kD、57kD、130KD，请问可在同一条件下跑胶，及胶的浓度？转膜的时候条件是什么？时间，电压等，谢谢！

===============

还是分开做吧

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:44

检测磷酸化p38蛋白表达量的，分子量38kDa,电泳浓缩胶80v，分离胶150v；转膜可以恒流多大及多长时间比较合适呢？

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恒流湿转 300mA 1h

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:45

这张膜对应的胶，我们也进行考染了，结果请看附件

我们想问的问题是：1 从第一张图片来看，我们转膜过程存在什么样的问题，可能的原因在哪？有什么建议吗（我们用的是Invitrogen 4%-12%的预制胶） 2 第二张图上，100KD底下的那条带是不是目的蛋白p-P70呢？条带斑驳的原因会不会是蛋白转的不好呢?

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感觉蛋白处理的不好

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:48

我是一名新手，做大鼠海马钙调蛋白，内源性的，分子量：16.7kd，版主建议用0.22um孔径膜，是不是用0.45的就做不出结果？另外劳烦版主给一点转膜（湿转）的建议。谢谢

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0.45um的膜不容易截留16.7K的蛋白
湿转300mA，0.22um膜，30min

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:50

上次请教的问题还没得到版主的回答，今天又出现啦。请版主百忙中给指教一下：
遇到个古怪的情况，郁闷好几天了，请教下高人。蛋白64kd，电泳没什么问题，上样量也算过了40~60ug，跑完marker很清楚。之后转膜，安装没问题，电转液没问题，270mA，70min之后，膜上染色没条带，胶染过没条带，连marker都不见了。有什么地方可能会有问题呢？

==============================

用什么染膜的？
正负极没问题？
在转膜之前SDS-PAGE胶染过吗？

作者: glass 时间: 2013-3-2 14:52

那我现在的整个流程没有问题吧？
另外，我还有个问题想请教一下，我们用的是冠龙牌的显影粉，单蒸水配的，放在棕色瓶里保存，倒出来时还是淡黄色的，可用一次就变成棕黄色了，不知道是天冷的缘故还是为什么，想问一下一般啥牌子的显影液比较好。

作者: utt0989 时间: 2013-3-2 14:52

做两个分子量21KD，30KD的蛋白，12%的分离胶，120V，5%浓缩胶，60V，用BIO-BAD半干转膜，10-15V 15-30Min 都试过了，丽春红染色，膜上蛋白印迹较淡，抗体标记后未见目的蛋白条带，同一块胶上的B-Actin曝光较理想，请教目的蛋白的转膜条件？还是抗体的问题？？一抗是兔抗大鼠的BIOWorld5UL试用装抗体，二抗是中衫的山羊抗兔，浓度均是按照说明书上推荐的最大浓度，年底想赶紧把实验结束掉......特此请教！多谢！！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 14:55

那我现在的整个流程没有问题吧？
另外，我还有个问题想请教一下，我们用的是冠龙牌的显影粉，单蒸水配的，放在棕色瓶里保存，倒出来时还是淡黄色的，可用一次就变成棕黄色了，不知道是天冷的缘故还是为什么，想问一下一般啥牌子的显影液比较好。

=========================================

显影粉没有太大影响
只要型号对就行
我是用自来水配制的，好像是天津一公司生产的
变黄色不是天冷的缘故，而是氧化了
用完后用密封的东西保存可以重复用多次

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:06

做两个分子量21KD，30KD的蛋白，12%的分离胶，120V，5%浓缩胶，60V，用BIO-BAD半干转膜，10-15V 15-30Min 都试过了，丽春红染色，膜上蛋白印迹较淡，抗体标记后未见目的蛋白条带，同一块胶上的B-Actin曝光较理想，请教目的蛋白的转膜条件？还是抗体的问题？？一抗是兔抗大鼠的BIOWorld5UL试用装抗体，二抗是中衫的山羊抗兔，浓度均是按照说明书上推荐的最大浓度，年底想赶紧把实验结束掉......特此请教！多谢！！

============================================

如果让我选择的话
转膜条件我会选择：半干 1.2mA/平方厘米膜面积，1h
目的蛋白是和谁呢么？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:31

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-3-2 14:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做两个分子量21KD，30KD的蛋白，12%的分离胶，120V，5%浓缩胶，60V，用BIO-BAD半干转膜，10-15V 15-30Min 都试过了，丽春红染色，膜上蛋白印迹较淡，抗体标记后未见目的蛋白条带，同一块胶上的B-Actin曝光较理想，请教目的蛋白的转膜条件？还 ...

我问你目的蛋白是什么

作者: sunnyB 时间: 2013-3-2 15:32

1、第一条没理解你要具体怎么做

=============================================================================================================

不好意思，我的意思是我已经曝过一次光，因为曝出来的图像效果不好，暂时将那张膜保存在TBST里，准备下次重新曝光，在这种情况下，那张膜我是应该洗脱后重孵一抗，还是在不用孵一抗只需放回二抗中再孵一小时就行？谢谢！

作者: vcve 时间: 2013-3-2 15:32

如果我做的是血清样品应该用什么内参比较好呢？我现在用的是β-actin,也能出来比较好的条带

作者: utt0989 时间: 2013-3-2 15:41

我有两个问题想要请教一下:
第一个:转移缓冲液到底该用哪个配方好呢?是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g呢还是甘氨酸 3g Tris 14.4g SDS 1g 甲醇 200ml 加蒸馏水至 1000ml呢?
第二个:TBST中加0.1%的Tween-20呢还是0.05%的Tween-20呢?

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-2 15:42

非常感谢你的回答！！
我做的是TIMP2，大鼠的，SantaCruz的抗体标记的是21KD，BIOworld抗体标记在34-26之间，所以一并问了！
BIO-BAD的半干转膜仪，连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源，设置恒压的较为方便，再请教一下，恒压转膜条件？？
胶面积较小，设置恒流的话，计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位，只能精确到0.01A，所以设置条件不准确！如何解决？
还有一个问题，最近是新鲜配制的丙烯酰胺，若是这个不准确的话，会有什么样的影响？？
谢谢~~~

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:44

不好意思，我的意思是我已经曝过一次光，因为曝出来的图像效果不好，暂时将那张膜保存在TBST里，准备下次重新曝光，在这种情况下，那张膜我是应该洗脱后重孵一抗，还是在不用孵一抗只需放回二抗中再孵一小时就行？谢谢！

======================================

1、你要在TBST里放置多长时间再次曝光？
2、如果时间长的话可以从一抗、二抗开始

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:45

如果我做的是血清样品应该用什么内参比较好呢？我现在用的是β-actin,也能出来比较好的条带

==========

GAPDH

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:46

我有两个问题想要请教一下:
第一个:转移缓冲液到底该用哪个配方好呢?是Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g呢还是甘氨酸 3g Tris 14.4g SDS 1g 甲醇 200ml 加蒸馏水至 1000ml呢?
第二个:TBST中加0.1%的Tween-20呢还是0.05%的Tween-20呢?

=========================================================================

1、转移缓冲液分湿转与半干转，两者是有区别的。你的第一个配方是半干的，第二个是时装的
2、Tween-20两者均可选

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:48

非常感谢你的回答！！
我做的是TIMP2，大鼠的，SantaCruz的抗体标记的是21KD，BIOworld抗体标记在34-26之间，所以一并问了！
BIO-BAD的半干转膜仪，连接的是BIO-BAD自家的PowerPac HC Power Supply电源，设置恒压的较为方便，再请教一下，恒压转膜条件？？
胶面积较小，设置恒流的话，计算出来只有20几个mA ,而电源设置选项上只有A单位，只能精确到0.01A，所以设置条件不准确！如何解决？
还有一个问题，最近是新鲜配制的丙烯酰胺，若是这个不准确的话，会有什么样的影响？？
谢谢~~~

===========================

1、恒压我没做过，不好意思
2、丙烯酰胺怎么会不准确？
3、电流大点小点可以调整啊

作者: utt0989 时间: 2013-3-2 15:49

你好，我现在有个问题急需请教：
本来western条件挺稳定的，前几天实验室里九月份配的Acr-Bis用完了，师兄做的时候临时用的以前买的碧云天的成品，跑浓缩胶时发现条带不压缩，曝光发现条带很粗。当天我也做了一次情况相同。我们怀疑是Acr-Bis的问题，第二天重新配制，昨天我们两个各自重复一遍，发现问题仍没解决，仔细观察发现跑浓缩胶时条带不压缩，marker有分开，进入分离胶慢慢的却看到溴酚蓝略变窄，曝光后条带仍很粗。
这两三个月基本上每天都有人做western，除了Acr-Bis其它配胶的东西都没换。
感谢回答！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-2 15:51

请问制胶的时候胶老是不凝最常见的是什么问题？已经排除过硫酸铵。

作者: H2O 时间: 2013-3-2 15:51

我感觉是不是灌完胶，让胶多凝一段时间，这样才能聚合的好，跑得条带才好看

作者: kuaizige 时间: 2013-3-2 15:52

老师您好，请教个问题
最近我们的western blot 配胶，4度过夜，第二天加marker，发现，电泳过程中，marker逐渐消失，从大分子量到小分子量逐渐消失的，不知道您遇到过这种情况没？请指点
我们更换了电泳液，重新定制了AA胶，或者自己配置tris，换了进口的电泳槽，这些方法都实验过了，但是仍然没有改善，不知问题出在哪里了。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-2 15:53

请问制胶的时候胶老是不凝最常见的是什么问题？已经排除过硫酸铵。

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我们以前也碰到这种问题，那时候配胶都要加10ul过硫酸铵才能凝，后来才知道是AP的原因，重新配制AP，不用的时候-20保存，用时拿出来一支而且注意避光就好了。

作者: gmjghh 时间: 2013-3-2 15:54

第一个:还是转印缓冲液的问题.如果湿转的话,是Tris碱 3g,甘氨酸 14.4g 甲醇 200ml,SDS 1g这个配方好呢?还是其中成分都减半,Tris碱 1.45g,甘氨酸 7.2,甲醇 200ml??
而且有的人加SDS,有的人不加,说加了蛋白容易转过,我到底是加还是不加呢?
第二个:附件里是我用Tris-base 5.8g 甘氨酸 2.9g 甲醇 200ml SDS 0.37g缓冲液湿转的,转印之后用丽春红染色后,感觉只能看见泳道,但蛋白条带比较模糊.一抗浓度提到最高,1:1000,四度摇床过夜;二抗浓度1:1000,室温2小时.结果条带特别窄,感觉还没有胶里面相应的考染蛋白条带宽呢.而且有的泳道有,有的泳道没有.到底是怎么回事呢?

作者: glass 时间: 2013-3-2 15:56

版主您好，我想问一下，蛋白分子量是44KD和89kD到转膜恒流300mA要转多长时间。

作者: kuohao17 时间: 2013-3-2 15:56

斑竹你好，我最近做的western blot结果很不理想，结果见图，上面是我的蛋白170kd，下面是内参GAPDH，上面的条带明显都散开了。
我的条件是10%的胶，先80V跑，再换120V跑。湿法转膜恒流350mA，90min。脱脂奶粉封闭2h，后孵一抗摇2h后放冰箱4℃过夜，洗膜后二抗稀释5000倍孵一小时，然后停电了我就让他在室温静置了4个多小时，然后手震荡洗膜1个多小时。
由于是新手，很多问题还不明白，望斑竹不吝赐教啊，谢谢！

图片附件: 73554934.jpg (2013-3-2 15:57, 62.09 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15044

作者: pengke1983 时间: 2013-3-2 15:57

我在做western的时候，遇到了一个问题，希望老师能够给予帮助，我在这里先谢谢了！
我提的是小鼠肿瘤组织的蛋白，想考察三种蛋白，VEGF，P53，HIF，在显影的时候就发现，无论我的一抗是什么，都会在50-70Kd之间出现三条带，而且强度要高于我的目标条带，P53条带自然也就看不到了，被掩盖在里面了。我想问一下老师，这个是怎么回事啊？有遇到过这个情况的吗？
我附的图上面很浓的几条就是我不知道的条带，下面的是我的目的条带。
这个倒是可以剪下来，但是P53的条带刚好在那个区间里面，就没法做了，请老师指教。

图片附件: 81696389.jpg (2013-3-2 15:57, 11.21 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15045

作者: jkobn 时间: 2013-3-2 15:58

请问一下
我做的是Cyclin E、CDK2和p21三个蛋白
12%的胶80v跑到溴酚蓝到最底部
Cyclin E Bio-Red半干转膜仪30min 0.45um PVDF膜
CDK2 半干转膜20min 0.45um PVDF膜
p21 半干转膜10min 0.22um PVDF膜
试过很多条件预染MARKER 很清楚的转过去了
考染转完的胶也基本上没剩下多少东西
一抗都是CST的推荐配比1：1000，室温孵育1-2h，4度过夜
二抗CST的抗兔1：1000；SC的抗鼠1：2000，室温孵育1-2h
TMB显色
Cyclin E 可以看到一些模糊的、不清楚的条带
其他两种蛋白只有一些背景完全看不到条带
一抗的配比最高试过1：600也没有什么改善
麻烦楼主帮我分析一下吧
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:59

你好，我现在有个问题急需请教：
本来western条件挺稳定的，前几天实验室里九月份配的Acr-Bis用完了，师兄做的时候临时用的以前买的碧云天的成品，跑浓缩胶时发现条带不压缩，曝光发现条带很粗。当天我也做了一次情况相同。我们怀疑是Acr-Bis的问题，第二天重新配制，昨天我们两个各自重复一遍，发现问题仍没解决，仔细观察发现跑浓缩胶时条带不压缩，marker有分开，进入分离胶慢慢的却看到溴酚蓝略变窄，曝光后条带仍很粗。
这两三个月基本上每天都有人做western，除了Acr-Bis其它配胶的东西都没换。
感谢回答！

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检查缓冲液的pH

作者: NBA 时间: 2013-3-2 15:59

再问个关于蛋白样品保存的问题，现在我的部分样品经过与Loading Buffer一起煮过后，放在-20度冰箱，反复冻融用于实验，现在感觉蛋白有部分降解还是别的原因，内参上样量一样，但是曝光后的条带粗细不均，试过多种的转膜条件，都是类似，刚开始的时候内参条带非常均匀，请问是不是蛋白降解的缘故？？
蛋白样品提取后，应该如何保存及有利于反复的实验使用？？分装？？-80度？？加Loading Buffer的时机？？
谢谢~

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做WB前从-80取出样品，变性，分装后-20度保存，几个月没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:00

请问制胶的时候胶老是不凝最常见的是什么问题？已经排除过硫酸铵。

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温度
APS
TEMED

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:03

老师您好，请教个问题
最近我们的western blot 配胶，4度过夜，第二天加marker，发现，电泳过程中，marker逐渐消失，从大分子量到小分子量逐渐消失的，不知道您遇到过这种情况没？请指点
我们更换了电泳液，重新定制了AA胶，或者自己配置tris，换了进口的电泳槽，这些方法都实验过了，但是仍然没有改善，不知问题出在哪里了。

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marker降解

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:05

版主您好，我想问一下，蛋白分子量是44KD和89kD到转膜恒流300mA要转多长时间。

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1h for 44K
1h30min for 89K

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:06

竹你好，我最近做的western blot结果很不理想，结果见图，上面是我的蛋白170kd，下面是内参GAPDH，上面的条带明显都散开了。
我的条件是10%的胶，先80V跑，再换120V跑。湿法转膜恒流350mA，90min。脱脂奶粉封闭2h，后孵一抗摇2h后放冰箱4℃过夜，洗膜后二抗稀释5000倍孵一小时，然后停电了我就让他在室温静置了4个多小时，然后手震荡洗膜1个多小时。
由于是新手，很多问题还不明白，望斑竹不吝赐教啊，谢谢！

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什么蛋白？
抗体呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:06

我在做western的时候，遇到了一个问题，希望老师能够给予帮助，我在这里先谢谢了！
我提的是小鼠肿瘤组织的蛋白，想考察三种蛋白，VEGF，P53，HIF，在显影的时候就发现，无论我的一抗是什么，都会在50-70Kd之间出现三条带，而且强度要高于我的目标条带，P53条带自然也就看不到了，被掩盖在里面了。我想问一下老师，这个是怎么回事啊？有遇到过这个情况的吗？
我附的图上面很浓的几条就是我不知道的条带，下面的是我的目的条带。
这个倒是可以剪下来，但是P53的条带刚好在那个区间里面，就没法做了，请老师指教。

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样品被污染了？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:07

请问一下
我做的是Cyclin E、CDK2和p21三个蛋白
12%的胶80v跑到溴酚蓝到最底部
Cyclin E Bio-Red半干转膜仪30min 0.45um PVDF膜
CDK2 半干转膜20min 0.45um PVDF膜
p21 半干转膜10min 0.22um PVDF膜
试过很多条件预染MARKER 很清楚的转过去了
考染转完的胶也基本上没剩下多少东西
一抗都是CST的推荐配比1：1000，室温孵育1-2h，4度过夜
二抗CST的抗兔1：1000；SC的抗鼠1：2000，室温孵育1-2h
TMB显色
Cyclin E 可以看到一些模糊的、不清楚的条带
其他两种蛋白只有一些背景完全看不到条带
一抗的配比最高试过1：600也没有什么改善
麻烦楼主帮我分析一下吧
谢谢

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TMB敏感性要稍差
建议换ECL或者其他更加敏感的方法
延长转膜时间

作者: ero11 时间: 2013-3-2 16:09

1.mTOR（250KD左右）和p21 半干转（PVDF膜）的转膜条件，每平方厘米XX毫安是要根据膜的大小计算一下电流值吗，例如1*5cm 要多大电流？
2.如果转膜时间长，pvdf膜甲醇激活多长时间合适，滤纸可以多垫几层吗？
3.分离胶mtor用8%，p21 用12%（还是用15%好些？）可以吗？
4.未染marker 丽春红染色能看否看见
谢谢！！！

作者: abc816 时间: 2013-3-2 16:10

你好，我刚刚开始跑western，用RIPA提的总蛋白，BCA法测定在5ug/ul左右，上样50ug，8%分离胶电泳，恒压110V电转NC膜，配方是tris3g，甘氨酸14.4，甲醇200ml，定容1000ml，marker非常清晰，然后5%牛奶封闭RT2h，一抗1;1000 4°过夜，二抗1：2000 RT1h，然后用碧云天的ECL孵育曝光。36KD的GAPDH加上ECL后很快产生荧光，但是用保鲜膜包裹后发现荧光变弱。同样操作条件下，GAPDH的条带很强，10s就可以，但是56KD，120KD，142KD的目的蛋白从来没出现过（即使曝光10min也没有条带，56KD的曾用Thermo的发光液出现过一次，但是不太好）。
问题：
1.抗体浓度太低会不出现条带，而太高也会没条带吗？
2.发光液对结果影响很大吗？对于难检测的蛋白是不是灵敏度越高越好（比如GE Advanced ECL）？
3.孵育1抗2抗的时候，用的是铝制小盒，会不会对蛋白造成影响？
4.某个发光液的说明书上说，曝光可以长达1~10h，对于表达量很低的蛋白可以很好的显影，这样说有没有道理？
5.一抗是鼠单抗的，写着抗“哺乳动物”或“未在其他物种测试过”，除了可以用在人的蛋白检测之外，是否可以用在其他物种？比如，兔？
6，对于100KD以上的蛋白，电转时可否用乙醇代替甲醇？延长电转时间是否会效果好点？是否有更好的电转液配方适合100KD以上的大蛋白？
7.如何避免ECL荧光的迅速淬灭？
谢谢

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-2 16:10

楼主您好。我的条带跑出来宽窄不一，我搜了一下论坛，有人说跟样品的盐离子浓度有关系，楼主能否解释一下这其中的道理，还有如何降低样品盐离子浓度呢？谢谢

作者: yonger 时间: 2013-3-2 16:11

老师，你好。最近做SRC1 ABCAM的抗体上面介绍的 SRC1的分子量为160 但是说条带出现在200处这是什么原因啊做这个大分子量的蛋白条件是什么啊转膜液有什么要求谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-2 16:12

请问版主有没有做过HES蛋白的WB，它的分子量到底是多大？我算的是29KD左右，可是说明书上在34左右。我做了很多次，总是不太好，隐约在27附近能看到一条带，但是还有一条很明显的带在十几KD那里，这是怎么回事？

作者: DONT 时间: 2013-3-2 16:12

请问曝出来的胶片在哪扫描？有专门的扫描仪还是一般打印地方的扫描仪就可？测灰度值的软件用哪个比较好？麻烦推荐下，急！多谢了！

作者: 66+77 时间: 2013-3-2 16:13

请问膜蛋白上样前加热变性的温度和时间有什么特殊要求吗？我看到有的资料上说是65度15分钟，而不是常用的100度5分钟。

作者: 131415 时间: 2013-3-2 16:22

使用的是碧云天的成品装的转膜液配方，说明书上说是使用“乙醇”配制！
内参做的很好，但是目的蛋白始终不稳定，感觉是转膜不稳定造成的，试了多种转膜条件，问题依旧！
想咨询一下，是否跟这个转膜液的配方有关？？
同时，这个配方上说的是湿转液的配方，但是，问了些人，说半干转和湿转的转膜液配方通用的，不知道您的意见如何，特此咨询！谢谢！！

作者: 131415 时间: 2013-3-2 16:24

请问,哪位做过bax和bcl-2的Western blotting实验呢?请问,转膜条件该如何设置好呢?
我今天做了一次bax的WB,过程如下,请各位帮我看看,问题出在哪一步呢?
电泳:5%浓缩胶 12%分离胶 100v 180v 电泳2h30min
转印:200mA 1h
封闭:5%脱脂奶粉室温2小时
santa cruz的bax单抗,1:500,4度孵育过夜
10分钟/次,TBST洗涤3次
1:1000稀释二抗,室温2小时
15分钟/次,TBST洗涤3次
ECL显色,结果什么也没有
到底什么原因呢?着急啊!

作者: hold住 时间: 2013-3-2 16:25

我是新手。
最近做了两块胶：分离胶10%，积层胶5%。电泳条件看我的预染Marker的位置。
电转用的是湿转，也是两块一起。条件是用的100V，1hr40min。卸下来后看marker转在PVDF膜上的效果很好，但是用立春红染色，PBST洗后，没有看到明显的蛋白条带。
几天前，也遇到过这个问题，当时其中一个没有条带，就直接扔了。另外一个有条带，但是也比较弱，压了抗体，也没有结果，其中包括actin。
请问，这种情况下，会是条件不够，还是哪里出现问题了。有marker被转上去了，应该不会是正负极弄错了呀！
请赐教！

作者: mamamiya 时间: 2013-3-2 16:25

最近在做WB,丽春红膜染色发现只有上部有蛋白条带，而在34KD处以下则无，不知什么原因，我的实验基本步骤如下，恳请斑竹能指点一下。目的蛋白37KD，21KD。
1、电泳：积层胶65-70V*60-90分钟；分离胶（12%）100V*5-6小时；电泳仪是Tanon公司EPS300，电泳液的PH值问题已经过仔细核对，应该不存在，电泳时间过长不知还应考虑哪些方面的影响？
2、转膜：转膜液现配先用，湿转，配方：甘氨酸2.9，Tris碱5.8，SDS0.37,甲醇200ml，加水至1000ml,280mA*60分钟。

请赐教，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:28

1.mTOR（250KD左右）和p21 半干转（PVDF膜）的转膜条件，每平方厘米XX毫安是要根据膜的大小计算一下电流值吗，例如1*5cm 要多大电流？
2.如果转膜时间长，pvdf膜甲醇激活多长时间合适，滤纸可以多垫几层吗？
3.分离胶mtor用8%，p21 用12%（还是用15%好些？）可以吗？
4.未染marker 丽春红染色能看否看见
5.Abcam如何搜目的蛋白的cellular location

谢谢！！！

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1：电流 1.2*1*5
2：Millipore的PVDF膜 10s
3：可以
4：一般情况下能看见条带，条带看见与否取决于转膜效果与marker单条带蛋白浓度
5：在每个抗体说明中均有

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:30

你好，我刚刚开始跑western，用RIPA提的总蛋白，BCA法测定在5ug/ul左右，上样50ug，8%分离胶电泳，恒压110V电转NC膜，配方是tris3g，甘氨酸14.4，甲醇200ml，定容1000ml，marker非常清晰，然后5%牛奶封闭RT2h，一抗1;1000 4°过夜，二抗1：2000 RT1h，然后用碧云天的ECL孵育曝光。36KD的GAPDH加上ECL后很快产生荧光，但是用保鲜膜包裹后发现荧光变弱。同样操作条件下，GAPDH的条带很强，10s就可以，但是56KD，120KD，142KD的目的蛋白从来没出现过（即使曝光10min也没有条带，56KD的曾用Thermo的发光液出现过一次，但是不太好）。
问题：
1.抗体浓度太低会不出现条带，而太高也会没条带吗？
2.发光液对结果影响很大吗？对于难检测的蛋白是不是灵敏度越高越好（比如GE Advanced ECL）？
3.孵育1抗2抗的时候，用的是铝制小盒，会不会对蛋白造成影响？
4.某个发光液的说明书上说，曝光可以长达1~10h，对于表达量很低的蛋白可以很好的显影，这样说有没有道理？
5.一抗是鼠单抗的，写着抗“哺乳动物”或“未在其他物种测试过”，除了可以用在人的蛋白检测之外，是否可以用在其他物种？比如，兔？
6，对于100KD以上的蛋白，电转时可否用乙醇代替甲醇？延长电转时间是否会效果好点？是否有更好的电转液配方适合100KD以上的大蛋白？
7.如何避免ECL荧光的迅速淬灭？
谢谢

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1，太高有时候也不出，不知道如何解释
2，影响很大，不是越高越好，敏感性要合适
3，建议用塑料的
4，呵呵，我个人认为曝光超过10min就没有意义了
5，要通过你的预实验验证，如果抗体说明书没有标明还是别随便用
6，我都是用甲醇的，你的配方是湿转的，建议300mA 恒流 100K蛋白用时2h，注意降温
7，膜污染，二抗浓度太高都可能造成ECL荧光淬灭

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:30

老师，你好。最近做SRC1 ABCAM的抗体上面介绍的 SRC1的分子量为160 但是说条带出现在200处这是什么原因啊做这个大分子量的蛋白条件是什么啊转膜液有什么要求谢谢！

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160与200K本身在胶上就不能清楚的分辨
如果在160K处条带非常特异，没有杂带
我认为这就是结果没有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:30

请问版主有没有做过HES蛋白的WB，它的分子量到底是多大？我算的是29KD左右，可是说明书上在34左右。我做了很多次，总是不太好，隐约在27附近能看到一条带，但是还有一条很明显的带在十几KD那里，这是怎么回事？

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没做过呢
试过调整抗体浓度了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:31

请问曝出来的胶片在哪扫描？有专门的扫描仪还是一般打印地方的扫描仪就可？测灰度值的软件用哪个比较好？麻烦推荐下，急！多谢了！

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一般的扫描仪就可以
我不测定灰度值
用ImageQuant TL软件测试IOD

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:31

请问膜蛋白上样前加热变性的温度和时间有什么特殊要求吗？我看到有的资料上说是65度15分钟，而不是常用的100度5分钟。

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对某些特殊的蛋白可能用65度15min
我一般采用100度5min

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:32

使用的是碧云天的成品装的转膜液配方，说明书上说是使用“乙醇”配制！
内参做的很好，但是目的蛋白始终不稳定，感觉是转膜不稳定造成的，试了多种转膜条件，问题依旧！
想咨询一下，是否跟这个转膜液的配方有关？？
同时，这个配方上说的是湿转液的配方，但是，问了些人，说半干转和湿转的转膜液配方通用的，不知道您的意见如何，特此咨询！谢谢！！

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呵呵
湿转与半干我用不同的配方

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:32

请问,哪位做过bax和bcl-2的Western blotting实验呢?请问,转膜条件该如何设置好呢?
我今天做了一次bax的WB,过程如下,请各位帮我看看,问题出在哪一步呢?
电泳:5%浓缩胶 12%分离胶 100v 180v 电泳2h30min
转印:200mA 1h
封闭:5%脱脂奶粉室温2小时
santa cruz的bax单抗,1:500,4度孵育过夜
10分钟/次,TBST洗涤3次
1:1000稀释二抗,室温2小时
15分钟/次,TBST洗涤3次
ECL显色,结果什么也没有
到底什么原因呢?着急啊!

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加大上样量
调整抗体浓度
用1：100，1:200试试

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:32

我是新手。
最近做了两块胶：分离胶10%，积层胶5%。电泳条件看我的预染Marker的位置。
电转用的是湿转，也是两块一起。条件是用的100V，1hr40min。卸下来后看marker转在PVDF膜上的效果很好，但是用立春红染色，PBST洗后，没有看到明显的蛋白条带。
几天前，也遇到过这个问题，当时其中一个没有条带，就直接扔了。另外一个有条带，但是也比较弱，压了抗体，也没有结果，其中包括actin。
请问，这种情况下，会是条件不够，还是哪里出现问题了。有marker被转上去了，应该不会是正负极弄错了呀！
请赐教！

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1，蛋白上样量少
2，丽春红染色剂敏感性差
3，转膜不充分

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:32

最近在做WB,丽春红膜染色发现只有上部有蛋白条带，而在34KD处以下则无，不知什么原因，我的实验基本步骤如下，恳请斑竹能指点一下。目的蛋白37KD，21KD。
1、电泳：积层胶65-70V*60-90分钟；分离胶（12%）100V*5-6小时；电泳仪是Tanon公司EPS300，电泳液的PH值问题已经过仔细核对，应该不存在，电泳时间过长不知还应考虑哪些方面的影响？
2、转膜：转膜液现配先用，湿转，配方：甘氨酸2.9，Tris碱5.8，SDS0.37,甲醇200ml，加水至1000ml,280mA*60分钟。

请赐教，谢谢！

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SDS-PAGE染过吗？

作者: fei1226com 时间: 2013-3-2 16:33

我是新手，还没开始做，请问10KD左右的蛋白能做western吗？谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-3-2 16:33

我是新手，还没开始做，请问10KD左右的蛋白能做western吗？谢谢！

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是什么蛋白啊？
10Kd的可以做
Tris胶不行的话就用Tricine胶

作者: kulee 时间: 2013-3-2 16:34

你好，我是新手，想做癌症标本的WB，能不能介绍一下标本取材的注意事项，特别是我们实验室没有小的液氮罐，有没有什么别的容器可以替代？因为不可能把那个大的液氮罐天天往手术室里抱，而标本不是要求离休30分钟内就要泡入液氮嘛

作者: 3648755 时间: 2013-3-2 16:34

谢谢斑竹的指点，因为染胶后不能进行下续实验故没做，下次试试看。

作者: am10 时间: 2013-3-2 16:35

蛋白样品加了Loading Buffer、煮沸后放冰箱，每次操作时，是混匀样品后上样，还是吸取上清液上样？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:35

你好，我是新手，想做癌症标本的WB，能不能介绍一下标本取材的注意事项，特别是我们实验室没有小的液氮罐，有没有什么别的容器可以替代？因为不可能把那个大的液氮罐天天往手术室里抱，而标本不是要求离休30分钟内就要泡入液氮嘛

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取材后用锡纸包上、完成后尽快冻入液氮或者放入-80度保存

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:36

蛋白样品加了Loading Buffer、煮沸后放冰箱，每次操作时，是混匀样品后上样，还是吸取上清液上样？

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建议变性后充分混匀
分装
每次拿一小管

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-2 16:36

首先非常感谢版主的点拨！
再问问半干转膜时候，做三明治结构时赶气泡的技巧？
最近几次曝光后都发现有条带中间显影弱，貌似气泡的影响.....
如何避免滤纸、膜、胶三者之间的气泡？

作者: am10 时间: 2013-3-2 16:37

我在做有关NADPH氧化酶的亚单位p40的western, 目标条带并未出现在40KD附近,而是出现在55-70KD附近,请问这是怎么回事?请各位高手帮帮忙!

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-2 16:37

相关疾病：
水疱
您好：
请教个问题，我做WESTERN 有段时间了，是提心肌组织的蛋白，前几个月做的内参很漂亮。现在内参有，但很模糊，就象被水泡模糊的样子，有时就不出了，可是同时上样的心肌细胞的内参和目的就很漂亮，心肌细胞用的裂解液（碧云天（强）和碧云天的PMSF ）和我的心肌组织是相同的裂解液。唯一不同的就是我的是心肌组织，后来怀疑是不是裂解液有问题。心肌组织是新做的模型，-80度保存。用了新的裂解液还是老样子。真不知道咋么回事？
弄了三个月了，这个问题就是不知道怎么回事？万分着急，谢谢！

作者: avi317 时间: 2013-3-2 16:38

就我的western杂交结果像您请教。
我做的材料是草莓果实，蛋白上样量30微克。目的蛋白26 kDa左右。12%浓缩胶，3%分离胶跑完后100毫安恒流转5h，膜是PVDF膜，4度封闭过夜，然后室温封闭2 h，一抗为通过原核表达，免疫兔子，兔血清纯化的多克隆抗体，浓度1比2500，室温反应3 h，TBST洗膜3次/10 min，二抗为promega羊抗兔HRP，浓度1比5000，室温反应2h，而后TBST2和TBS各洗3次，每次10 min，最后用普利莱的超敏发光液孵育3 min，压片1 min，曝光后什么条带都看不到（见附件图片）。
版主帮我分析下啥原因，是不是一抗和二抗的浓度高了？
多谢！

作者: pengke1983 时间: 2013-3-2 16:38

补充：请问我这个有可能是蛋白提取的不好吗？
心肌组织取出后，马上投入到冰生理盐水中洗去血液，后用刀片切成小块，液氮冻存，后转到-80度冰箱中。
提蛋白时用的是碧云天（强）和碧云天的PMSF 100:1加的，液氮低温研磨后加入裂解液和PMSF混合液，大概100mg心肌组织加400微升上述裂解夜。混匀后冰上40分钟，12000转离心20分钟，取上清，加入loading buffer，95 10min变性。
请问下一步我该怎么办，是否需要换裂解液，是换成裂解力度不太强的吗，裂解力度太强是否也不好呢，请问老师，心肌组织的膜蛋白裂解，用碧云天的哪个类型的裂解液好呢？

作者: one 时间: 2013-3-2 16:39

我做western blot的时候杂带特别多，但是不知道是什么原因，还有刚处理的样品，曝光之后actin的条带位置不对。希望多多指教，O(∩_∩)O谢谢！

作者: u234 时间: 2013-3-2 16:39

版主你好，我想请问一下，WB洗膜怎样才能洗的彻底又不会让蛋白损失太多，做出的结果又可用？

作者: moonlight45 时间: 2013-3-2 16:39

请问分子量很小的蛋白质，2KD左右，能用westernbloting检测吗？能检测出来吗？
不可以的话，该用什么方法啊？
我只要知道该蛋白质有没有表达就可以。谢谢！

作者: plaa 时间: 2013-3-2 16:40

没注意把4度保存的抗体放到-20度了，第二天发现后重新放回到4度，请问抗体会不会失效，或者抗体的效价会不会受到影响？

作者: wsll 时间: 2013-3-2 16:40

请问版主，我最近做的iNOS和eNOS的蛋白表达，WB用的分离胶是10%，电泳和电转均是恒压，条件都为100v,90分钟；5%脱脂奶粉封闭2h，RT。一抗都是Abcam的多抗，4度过夜，预计分子量分别为131kDa,135kDa，但ECL曝光出来条带位置均在55kDa左右，不知道问题出在哪？

作者: 831226 时间: 2013-3-2 16:41

取材后用锡纸包上、完成后尽快冻入液氮或者放入-80度保存

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谢谢，我想再问一下，您所谓的这个锡纸就商场卖的那种就可以吗，要不要特殊处理的？

作者: S6044 时间: 2013-3-2 16:41

我是新手，最近开始做western，过程如下：1.年前提取的脑组织蛋白，测浓度1-2mg/ml，制成样品后于-20度保存2.用碧云天配胶试剂盒配12%分离胶，上样25ul，电泳浓缩胶80v 30min
分离胶100v 1h30min3.转膜：目的31kd 250mA45min，膜孔径0.22 4.37度封闭90min(封闭液为5%脱脂奶粉) 5.一抗4度过夜（1：500，为abcam多克隆抗体）6.二抗37度90min(1:5000)7.碧云天ecl发光试剂盒。
问题如下：1.每次显色是条带下方均有杂带2.显色1-2min后出现粗、深条带
附图如下，期待您的解答！

作者: popo520 时间: 2013-3-2 16:41

各位老师，想向大家请教一个问题。我调取了肝细胞生长因子（HGF）A链的一段基因，编码大概20KD的蛋白，现在做western-blog，买了抗HGF，A链的一抗，分子量为69KD，请问，我在查看目的蛋白大小位置的时候，是出现20KD为阳性还是69KD为阳性啊？

作者: popo520 时间: 2013-3-2 16:42

各位老师，想向大家请教一个问题。我调取了肝细胞生长因子（HGF）A链的一段基因，编码大概20KD的蛋白，现在做western-blog，买了抗HGF，A链的一抗，分子量为69KD，请问，我在查看目的蛋白大小位置的时候，是出现20KD为阳性还是69KD为阳性啊？

作者: ending 时间: 2013-3-2 16:42

各位高手，请教个问题
糖皮质激素受体属于磷酸化蛋白么？
另外我做了几次都没有出带，用的是小鼠脑组织，
santa cruz的单克隆抗体1：100-1:10000,我用的是1：200，
国产二抗是1：5000，actin出的还行就是目的出不来。
用的是12.5%的胶，80v分离胶 120v浓缩胶共2h，
转膜180ma 2h,
5%去脂奶粉封闭（TBST稀释）1h，
3%TBST稀释奶粉液体孵育一抗，TBST洗膜3次，每次10min，4度过夜，
第二天再摇1h，然后3%TBST稀释奶粉液体孵育二抗 1h，TBST洗膜3次，每次10min,
加显色液显色5min，进暗室压片，actin能看到很亮的带，就是目的看不到条带，有的时候压片20分钟能够看到压出条带。
请各位高手指点一下,出现这种结果的原因是什么？

作者: PINK 时间: 2013-3-2 16:43

请教LZ一个问题：
我现在做的是核蛋白，66KD；步骤是：上样量50ug，12%的胶。转膜条件是350mA,70min,一抗2h，4℃过夜都试过，二抗1h，ECL发光。这个WB体系我做过很多次了，其他蛋白都没有出过问题。这个一抗我以前做过，也可以出来结果。现在换了一种蛋白做，我在膜上可以看到荧光，不止我一个人看到，但是就是压不出来条带，压片时间延长到20-30min也这是为什么？是胶片的问题，还是显影定影液的问题？请指点一下，不胜感激！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-2 16:43

版主你好，我做的是糖皮质激素受体，是一种胞浆蛋白，用常规的RIPA+蛋白酶抑制剂提取蛋白可以么？

作者: 66+77 时间: 2013-3-2 16:44

Western blot和免疫组化的区别是什么？

作者: avi317 时间: 2013-3-2 16:44

老师，您好。我现在做的蛋白都在20kd左右。我用15%的胶。电泳浓缩胶是80v分离是150v跑胶时间大概三个小时。转膜是100v100分钟。最后没有目的条带，或者看到了结果也不好
1:现在我的问题是每当跑胶跑到分离胶和浓缩胶界面时就开始拖尾，前面的跑，后面界面上还留有不向前跑。这是什么原因呢？maker跑的很好的，只是上样空跑的不好
2:我转膜时间长不长呢？转膜之后我可以在膜上很清楚的看到18kdmaker的条带的，应该没有转过了吧。我用的是pvdf膜0.45um的

作者: 2541 时间: 2013-3-2 16:45

你好，我的蛋白是240KD,请问是用半干转还是湿转？具体实验条件该如何控制，我做western是新手，又碰上分子量这么大的蛋白，很棘手，多谢

作者: xue258 时间: 2013-3-2 16:45

老师你好，我用的是小鼠的单抗，该怎样选择二抗，山羊抗小鼠的二抗行么？

作者: xue258 时间: 2013-3-2 16:45

不知我前面的帖子你看到没有，这两天又做了一次wb，别的条件没有变就是转膜变为180ma，目的（95）的一抗1：100（1：100-1:1000)
二抗分为（1：5000-1:10000)为了摸二抗的浓度分为1：2000、1：3000、1：4000均没有看到荧光，压20分钟也没有条带，不过actin（43kd）出的很好
1、是不是单克隆抗体不是很好出带
2、转膜200ma 2h还是不能把目的蛋白转过来，但是maker的95那条印迹却很清楚。
3、12.5%的胶对目的蛋白不行
4、一抗的浓度还是太低
现在不知道是哪方面的原因，下一步该怎么办。盼望回复！

作者: 831226 时间: 2013-3-2 16:53

我没有做过WB，请教版主一个问题：我想同时测定细胞膜上某个基因的基因表达，细胞裂解后能否同时提取RNA和蛋白？再就是内参如何选择，一定要根据表达蛋白的分子量选吗？先行谢过啊！

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:54

首先非常感谢版主的点拨！
再问问半干转膜时候，做三明治结构时赶气泡的技巧？
最近几次曝光后都发现有条带中间显影弱，貌似气泡的影响.....
如何避免滤纸、膜、胶三者之间的气泡？

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不好意思到现在才给大家回帖

每次加滤纸、膜、胶的过程中先加缓冲液，加的缓冲液就要避免气泡

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:54

我在做有关NADPH氧化酶的亚单位p40的western, 目标条带并未出现在40KD附近,而是出现在55-70KD附近,请问这是怎么回事?请各位高手帮帮忙!!!!!

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出现的情况正常
抗体说明书中位置是多少？
另外Abcam上的解释是：蛋白的修饰，糖基化等作用都会影响条带位置的大小

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:54

就我的western杂交结果像您请教。
我做的材料是草莓果实，蛋白上样量30微克。目的蛋白26 kDa左右。12%浓缩胶，3%分离胶跑完后100毫安恒流转5h，膜是PVDF膜，4度封闭过夜，然后室温封闭2 h，一抗为通过原核表达，免疫兔子，兔血清纯化的多克隆抗体，浓度1比2500，室温反应3 h，TBST洗膜3次/10 min，二抗为promega羊抗兔HRP，浓度1比5000，室温反应2h，而后TBST2和TBS各洗3次，每次10 min，最后用普利莱的超敏发光液孵育3 min，压片1 min，曝光后什么条带都看不到（见附件图片）。
版主帮我分析下啥原因，是不是一抗和二抗的浓度高了？
多谢！

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多试几个不同浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:55

补充：请问我这个有可能是蛋白提取的不好吗？
心肌组织取出后，马上投入到冰生理盐水中洗去血液，后用刀片切成小块，液氮冻存，后转到-80度冰箱中。
提蛋白时用的是碧云天（强）和碧云天的PMSF 100:1加的，液氮低温研磨后加入裂解液和PMSF混合液，大概100mg心肌组织加400微升上述裂解夜。混匀后冰上40分钟，12000转离心20分钟，取上清，加入loading buffer，95 10min变性。
请问下一步我该怎么办，是否需要换裂解液，是换成裂解力度不太强的吗，裂解力度太强是否也不好呢，请问老师，心肌组织的膜蛋白裂解，用碧云天的哪个类型的裂解液好呢？

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心肌组织蛋白提取没问题
如果用WB来检测膜蛋白的话不建议采用膜蛋白提取试剂盒之类的产品
直接提取总蛋白就行
至于碧云天什么类型裂解液我就不清楚了，问问他们技术支持

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:56

我做western blot的时候杂带特别多，但是不知道是什么原因，还有刚处理的样品，曝光之后actin的条带位置不对。希望多多指教，O(∩_∩)O谢谢！

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1、位置不对有可能是Marker问题
2、如果位置出入一点是没有关系的
3、杂带多的话把一抗多调整几个稀释度试试

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:56

版主你好，我想请问一下，WB洗膜怎样才能洗的彻底又不会让蛋白损失太多，做出的结果又可用？

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什么意思啊？
没理解
正常洗膜出来的结果不能用？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:57

请问分子量很小的蛋白质，2KD左右，能用westernbloting检测吗？能检测出来吗？
不可以的话，该用什么方法啊？
我只要知道该蛋白质有没有表达就可以。谢谢！

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没做过这么小蛋白的WB
有方法说用Tris-Tricine胶可以

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:57

没注意把4度保存的抗体放到-20度了，第二天发现后重新放回到4度，请问抗体会不会失效，或者抗体的效价会不会受到影响？

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不会有太大的影响

作者: NBA 时间: 2013-3-2 16:59

请问版主，我最近做的iNOS和eNOS的蛋白表达，WB用的分离胶是10%，电泳和电转均是恒压，条件都为100v,90分钟；5%脱脂奶粉封闭2h，RT。一抗都是Abcam的多抗，4度过夜，预计分子量分别为131kDa,135kDa，但ECL曝光出来条带位置均在55kDa左右，不知道问题出在哪？

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呵呵
这个分子量差别的太远了
55K就是杂带了
在130K附近一点条带都没有？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:00

谢谢，我想再问一下，您所谓的这个锡纸就商场卖的那种就可以吗，要不要特殊处理的？

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不需要处理
超市买的就可以用

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:00

我是新手，最近开始做western，过程如下：1.年前提取的脑组织蛋白，测浓度1-2mg/ml，制成样品后于-20度保存2.用碧云天配胶试剂盒配12%分离胶，上样25ul，电泳浓缩胶80v 30min
分离胶100v 1h30min3.转膜：目的31kd 250mA45min，膜孔径0.22 4.37度封闭90min(封闭液为5%脱脂奶粉) 5.一抗4度过夜（1：500，为abcam多克隆抗体）6.二抗37度90min(1:5000)7.碧云天ecl发光试剂盒。
问题如下：1.每次显色是条带下方均有杂带2.显色1-2min后出现粗、深条带
附图如下，期待您的解答！

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样品时间太长了
有降解

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:01

位老师，想向大家请教一个问题。我调取了肝细胞生长因子（HGF）A链的一段基因，编码大概20KD的蛋白，现在做western-blog，买了抗HGF，A链的一抗，分子量为69KD，请问，我在查看目的蛋白大小位置的时候，是出现20KD为阳性还是69KD为阳性啊？

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应该是全长

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:01

各位高手，请教个问题
糖皮质激素受体属于磷酸化蛋白么？
另外我做了几次都没有出带，用的是小鼠脑组织，
santa cruz的单克隆抗体1：100-1:10000,我用的是1：200，
国产二抗是1：5000，actin出的还行就是目的出不来。
用的是12.5%的胶，80v分离胶 120v浓缩胶共2h，
转膜180ma 2h,
5%去脂奶粉封闭（TBST稀释）1h，
3%TBST稀释奶粉液体孵育一抗，TBST洗膜3次，每次10min，4度过夜，
第二天再摇1h，然后3%TBST稀释奶粉液体孵育二抗 1h，TBST洗膜3次，每次10min,
加显色液显色5min，进暗室压片，actin能看到很亮的带，就是目的看不到条带，有的时候压片20分钟能够看到压出条带。
请各位高手指点一下,出现这种结果的原因是什么？

==================================================================

1、不属于
2、糖皮质蛋白发生磷酸化后就属于磷酸化蛋白了
3、目的出不来可能这个蛋白没有提取出来、抗体的特异性不够、ECL的敏感性不够

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:02

请教LZ一个问题：
我现在做的是核蛋白，66KD；步骤是：上样量50ug，12%的胶。转膜条件是350mA,70min,一抗2h，4℃过夜都试过，二抗1h，ECL发光。这个WB体系我做过很多次了，其他蛋白都没有出过问题。这个一抗我以前做过，也可以出来结果。现在换了一种蛋白做，我在膜上可以看到荧光，不止我一个人看到，但是就是压不出来条带，压片时间延长到20-30min也这是为什么？是胶片的问题，还是显影定影液的问题？请指点一下，不胜感激！

==================

调整一下二抗浓度
稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:02

版主你好，我做的是糖皮质激素受体，是一种胞浆蛋白，用常规的RIPA+蛋白酶抑制剂提取蛋白可以么？

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可以的

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:03

老师，您好。我现在做的蛋白都在20kd左右。我用15%的胶。电泳浓缩胶是80v分离是150v跑胶时间大概三个小时。转膜是100v100分钟。最后没有目的条带，或者看到了结果也不好
1:现在我的问题是每当跑胶跑到分离胶和浓缩胶界面时就开始拖尾，前面的跑，后面界面上还留有不向前跑。这是什么原因呢？maker跑的很好的，只是上样空跑的不好
2:我转膜时间长不长呢？转膜之后我可以在膜上很清楚的看到18kdmaker的条带的，应该没有转过了吧。我用的是pvdf膜0.45um的

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1、拖尾可能loading不好
2、转膜时间长了

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:03

你好，我的蛋白是240KD,请问是用半干转还是湿转？具体实验条件该如何控制，我做western是新手，又碰上分子量这么大的蛋白，很棘手，多谢

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可以选择7.5%或者8%的分离胶
电泳多跑一会
湿转
300mA，3h

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:04

老师你好，我用的是小鼠的单抗，该怎样选择二抗，山羊抗小鼠的二抗行么？

==========

恩
没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:04

老师你好，
不知我前面的帖子你看到没有，这两天又做了一次wb，别的条件没有变就是转膜变为180ma，目的（95）的一抗1：100（1：100-1:1000)
二抗分为（1：5000-1:10000)为了摸二抗的浓度分为1：2000、1：3000、1：4000均没有看到荧光，压20分钟也没有条带，不过actin（43kd）出的很好
1、是不是单克隆抗体不是很好出带
2、转膜200ma 2h还是不能把目的蛋白转过来，但是maker的95那条印迹却很清楚。
3、12.5%的胶对目的蛋白不行
4、一抗的浓度还是太低
现在不知道是哪方面的原因，下一步该怎么办。盼望回复！

=====================================

1、转膜时间差不多了
2、在摸二抗浓度之前你做过一抗稀释度吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:05

我没有做过WB，请教版主一个问题：我想同时测定细胞膜上某个基因的基因表达，细胞裂解后能否同时提取RNA和蛋白？再就是内参如何选择，一定要根据表达蛋白的分子量选吗？先行谢过啊！

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原理上是可以同时提取的
但是我没做过
内参选择可以按照分子量来

作者: u234 时间: 2013-3-2 17:05

1、转膜时间差不多了
2、在摸二抗浓度之前你做过一抗稀释度吗？

==============================================================================================================

这两天又做了WB，一抗换成了1：50出现带了，说明书推荐的是1:100-1:1000,而且和膜比对条带分子量达到130了，而说明书上给的是95。现在就是不敢确定一抗这个浓度出带正常么？有可能96的分子量压出的片子确实接近130.
一抗的稀释度怎么做啊，这个我不会？
谢谢版主!

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:06

这两天又做了WB，一抗换成了1：50出现带了，说明书推荐的是1:100-1:1000,而且和膜比对条带分子量达到130了，而说明书上给的是95。现在就是不敢确定一抗这个浓度出带正常么？有可能96的分子量压出的片子确实接近130.
一抗的稀释度怎么做啊，这个我不会？
谢谢版主!

==============================

电泳
转膜
丽春红染色后把膜延泳道纵向剪开
每条可做一个稀释度

作者: okhaha 时间: 2013-3-2 17:06

电泳
转膜
丽春红染色后把膜延泳道纵向剪开
每条可做一个稀释度

===========================================

谢谢！后天就做个梯度试试。有什么问题再向你请教。

作者: pencil菲 时间: 2013-3-2 17:07

呵呵
这个分子量差别的太远了
55K就是杂带了
在130K附近一点条带都没有？

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iNOS130kDa附近有杂带，而eNOS背景很干净，55kDa-72kDa那条带很清楚，不知道问题出哪了？染胶和染膜都可见130kDa有蛋白条带,所以电泳、电转应该是没问题的。请问楼主，有没有可能是我提蛋白过程的问题，提磷酸化蛋白一定要加磷酸酶抑制剂吗？有什么需要特别注意的地方？

作者: avi317 时间: 2013-3-2 17:07

请教版主一个问题，western blot中NC膜杂完二抗后若不立即显色，应该将怎样保存膜不会影响以后的显色效果，TBS可以吗？放置一两天有没有问题？谢谢

作者: owanaka 时间: 2013-3-2 17:09

请教斑竹，都知道胶的浓度是要根据目的蛋白大小来确定的，我想问下这个范围具体是多少呢？30KD-100KD用12%的胶合适吗？

作者: 3N4G 时间: 2013-3-2 17:09

我测的目的蛋白是45KD的膜蛋白，前1次用1万离心提取蛋白，结果条带很模糊，还出现手拉手几乎成一直线的现象，出项这种现象的原因是什么？这次考虑用10万离心，中间还需要注意哪些问题，谢谢！

作者: owanaka 时间: 2013-3-2 17:09

版主您好，
求16KD蛋白的转膜条件：
我们的仪器是半干转的，说明书推荐最好是恒压。PVDF膜是0.45um的。
谢谢版主。

作者: popo520 时间: 2013-3-2 17:10

版主，你好。我也是个新手，想请教您一个问题。我在做WB摸条件的时候，最后加在膜上ECL以后，几乎看不到荧光。我现在只是在做内参，还没有做目的蛋白（120KD）。内参选择为GAPDH，分子量为37KD。我的大概流程是：提取大鼠顶枕皮层组织蛋白-lowry定量（6ug/ul）-上样，为摸条件上了两种不同的量（30ug,60ug），1.5h,先20mA,进胶后改为40mA。分离胶为15%。-转膜，半干式电印迹，1h,80V.(预染Marker都能转上，将胶染色后未见条带)-封闭，5%脱脂奶粉，室温摇床3h-加一抗（santa），5%脱脂奶粉稀释，摸条件（1：500，1：1000），推荐范围（1：200-1：1000）-4°孵育过夜-洗膜，TBST，每次10分钟，4次-国产二抗，5%BSA稀释，摸条件（1：2000，1：5000），推荐范围（1：5000-1：20000），室温2h-洗膜，同上-ECL发光。但是就是看不到荧光，而且压片5分钟，显色液里浸泡5分钟，X片上还是一片清晰。（X片没有曝光）请问应该从几方面考虑原因呢？非常感谢您!（后来将膜用丽春红染色5分钟后，能在膜上GAPDH位置看到很浅很浅的印迹）很期待您的回复！

作者: tie8 时间: 2013-3-2 17:11

您好，封膜的的时候如果是磷酸化蛋白的话不能用脱脂奶粉吧？用BSA，应该使用多少浓度的啊？
谢谢
CD133做western的话，一抗应该加多少啊

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:11

iNOS130kDa附近有杂带，而eNOS背景很干净，55kDa-72kDa那条带很清楚，不知道问题出哪了？染胶和染膜都可见130kDa有蛋白条带,所以电泳、电转应该是没问题的。请问楼主，有没有可能是我提蛋白过程的问题，提磷酸化蛋白一定要加磷酸酶抑制剂吗？有什么需要特别注意的地方？

=========================================

用什么抗体啊
磷酸化的蛋白最好加入蛋白抑制剂与磷酸酶抑制剂

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:12

请教版主一个问题，western blot中NC膜杂完二抗后若不立即显色，应该将怎样保存膜不会影响以后的显色效果，TBS可以吗？放置一两天有没有问题？谢谢

========================

在TBS中会影响HRP的活性
我觉得冻在-20度好一些

曝光后如果没有条带
可以从新加入二抗再孵育一次

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:13

请教斑竹，都知道胶的浓度是要根据目的蛋白大小来确定的，我想问下这个范围具体是多少呢？30KD-100KD用12%的胶合适吗？

===============

这个胶浓度可以

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:13

我测的目的蛋白是45KD的膜蛋白，前1次用1万离心提取蛋白，结果条带很模糊，还出现手拉手几乎成一直线的现象，出项这种现象的原因是什么？这次考虑用10万离心，中间还需要注意哪些问题，谢谢！

===============

上样量有点大

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:13

版主您好，
求16KD蛋白的转膜条件：
我们的仪器是半干转的，说明书推荐最好是恒压。PVDF膜是0.45um的。
谢谢版主。

=-===============================

我转膜没用过恒压的

一般用恒流，16K用0.45um膜不太好

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:17

版主，你好。我也是个新手，想请教您一个问题。我在做WB摸条件的时候，最后加在膜上ECL以后，几乎看不到荧光。我现在只是在做内参，还没有做目的蛋白（120KD）。内参选择为GAPDH，分子量为37KD。我的大概流程是：提取大鼠顶枕皮层组织蛋白-lowry定量（6ug/ul）-上样，为摸条件上了两种不同的量（30ug,60ug），1.5h,先20mA,进胶后改为40mA。分离胶为15%。-转膜，半干式电印迹，1h,80V.(预染Marker都能转上，将胶染色后未见条带)-封闭，5%脱脂奶粉，室温摇床3h-加一抗（santa），5%脱脂奶粉稀释，摸条件（1：500，1：1000），推荐范围（1：200-1：1000）-4°孵育过夜-洗膜，TBST，每次10分钟，4次-国产二抗，5%BSA稀释，摸条件（1：2000，1：5000），推荐范围（1：5000-1：20000），室温2h-洗膜，同上-ECL发光。但是就是看不到荧光，而且压片5分钟，显色液里浸泡5分钟，X片上还是一片清晰。（X片没有曝光）请问应该从几方面考虑原因呢？非常感谢您!（后来将膜用丽春红染色5分钟后，能在膜上GAPDH位置看到很浅很浅的印迹）很期待您的回复！

==================================

可能蛋白定量有问题
上样量太小
转膜后丽春红染色应该有条带才行

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:17

您好，封膜的的时候如果是磷酸化蛋白的话不能用脱脂奶粉吧？用BSA，应该使用多少浓度的啊？
谢谢
CD133做western的话，一抗应该加多少啊

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BSA我一般用3%的浓度

CD133一抗稀释度请参考抗体说明书

作者: 04906 时间: 2013-3-2 17:18

你好，本人WB新手，最近试验遇到这样的问题，就是我做磷酸化蛋白的定量，我做完磷酸化蛋白以后，想再压一次总蛋白看总蛋白表达量是否变化，但是发现加进去strip 缓冲液以后，55度30min，所显色的条带还是在（我显色的方法是NBT/BCIP），我的strip buffer应该没有问题，是不是NBT/BCIP这种显色方法不能strip啊？另外，我的蛋白大小是47KD，内参是37KD，感觉剪膜有点困难，怕剪错了，不知道是否可以先在同一张膜上杂交完目标蛋白以后，不strip直接就做内参？这样会不会影响内参的定量？

作者: 04906 时间: 2013-3-2 17:18

再问一个问题，蛋白我是煮了一次，然后保存在-80度冰箱中，下一次上样还需要煮吗？煮太多次有没有影响啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:19

你好，本人WB新手，最近试验遇到这样的问题，就是我做磷酸化蛋白的定量，我做完磷酸化蛋白以后，想再压一次总蛋白看总蛋白表达量是否变化，但是发现加进去strip 缓冲液以后，55度30min，所显色的条带还是在（我显色的方法是NBT/BCIP），我的strip buffer应该没有问题，是不是NBT/BCIP这种显色方法不能strip啊？另外，我的蛋白大小是47KD，内参是37KD，感觉剪膜有点困难，怕剪错了，不知道是否可以先在同一张膜上杂交完目标蛋白以后，不strip直接就做内参？这样会不会影响内参的定量？

====================================================

1、stripping buffer没问题是指什么？
配制没问题还是配方没问题？如果是网上流行的配方效果不佳
2、可以这么做内参

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:20

再问一个问题，蛋白我是煮了一次，然后保存在-80度冰箱中，下一次上样还需要煮吗？煮太多次有没有影响啊？

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不用再煮了

作者: INK 时间: 2013-3-2 17:20

您好老师，最近做western老是内参出不来，但目的蛋白做得还可以，换用别人做出结果的内参抗体还是一点条带都没有，我想请问一下这是什么原因。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-2 17:20

您好老师，最近做western老是内参出不来，但目的蛋白做得还可以，换用别人做出结果的内参抗体还是一点条带都没有，我想请问一下这是什么原因。谢谢

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换了别人的内参后，二抗换了吗？
目的蛋白的二抗与内参二抗一致吗？

作者: S6044 时间: 2013-3-2 17:21

老师，您好。我现在做的蛋白都在20kd左右。我用15%的胶。电泳浓缩胶是80v分离是150v跑胶时间大概三个小时。转膜是100v100分钟。最后没有目的条带，或者看到了结果也不好
1:现在我的问题是每当跑胶跑到分离胶和浓缩胶界面时就开始拖尾，前面的跑，后面界面上还留有不向前跑。这是什么原因呢？maker跑的很好的，只是上样空跑的不好
2:我转膜时间长不长呢？转膜之后我可以在膜上很清楚的看到18kdmaker的条带的，应该没有转过了吧。我用的是pvdf膜0.45um的

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我做的蛋白14KD，转膜时间为45分钟左右，结果还比较理想，觉得你一个小时应该可以了。

作者: wood533 时间: 2013-3-2 17:21

1、stripping buffer没问题是指什么？
配制没问题还是配方没问题？如果是网上流行的配方效果不佳
2、可以这么做内参

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我指的是配置没有问题我的配方是丁香园上面好像比较多人用的那个，不知道你的strip buffer配方是什么啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-4 14:46

我指的是配置没有问题我的配方是丁香园上面好像比较多人用的那个，不知道你的strip buffer配方是什么啊？

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我的配方是我自己琢磨的
有两个
不能告诉你啊。。。
在公司
没办法，谅解

作者: kuaizige 时间: 2013-3-4 14:47

260k的蛋白如果转膜成功了，那么，丽春红染色肯定能见到条带吗？
我用同一个样品，在内参蛋白的条带上丽春红染得很清楚，但在转印目的蛋白（260k，试了好多转印方法。。。)后，丽春红染见不到条带，但marker是转过去了。

作者: yes4 时间: 2013-3-4 14:49

我做的蛋白分子量为480KD，用6%的胶，250mA/3h转膜,结果做不出来，谁有成功的经验，请赐教，谢谢！

作者: lgm 时间: 2013-3-4 16:35

老师，我做的内参用12的分离胶。80v跑浓缩，120v跑分离。最后又条带。但是带不好看。宽窄不一样。是怎么回事啊。而且带很弱。很细，增加了上样量没有什么大变化。

作者: langlang 时间: 2013-3-4 16:35

版主你好，
我目前主要做的是小鼠肺组织的western，一直以来结果都是非特异的条带特别多，而且还是特别特异的那种出现在80到120kd区域，而自己的目的蛋白分子量是46kd条带特别弱。阳性对照条带单一，并且也有内参（GAPDH）出现，有时内参附近还有非特异条带。
用的一抗是santa cruz 的鼠源单抗1：250（推荐稀释范围1：100到1：1000）30度杂交1h或室温杂交2h;二抗是国产的中山金桥1：1000室温杂交1h或2h或2.5h或4度过夜再复温（推荐稀释范围1：500到1：1000）。这会跟转膜效率有关吗?bio-rad 半干转膜仪，15V恒压转膜1.5h或
恒流280mA 1h（四张膜，NC膜2.5*CM）。
是不是与我提的组织总蛋白有关?采用的是RIPA+罗氏的蛋白酶抑制剂为组织裂解液。
采用了以下两种取组织方法为达到去除western爆片出现非特异条：用胶原酶进行组织消化；用胰酶进行组织消化，其结果是导致我的目的条带很弱很弱，但是非特异条带很固执地依然存在。很苦恼！
O(∩_∩)O谢谢！

作者: langlang 时间: 2013-3-4 16:39

我这段时间做的结果背景都很脏，我的一抗是磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，请问使用磷酸化抗体的WB有哪些值得注意的地方？

作者: xyw5 时间: 2013-3-4 16:42

请教一下，我要做一个500kD的蛋白的western blot，用的是invitrogen的湿转系统，NC膜，用了pierce最灵敏的femto来发光。由于分子量很大，我在transfer buffer里面加了0.02%的SDS，10%甲醇，冰浴下45V转4个小时，预染marker转到了膜上，胶上没有肉眼可见的预染marker,western blot能够检测到条带，但是条带非常的微弱，需要曝光比较长的时间，造成背景就很高。另外，不知道是不是buffer的缓冲能力问题，开始45V电压下，电流只有两百多毫安，但不停的升高，大概两个小时后，电流就有400毫安了，由于我限定了电流最高值，后来电压会下降到40V以下。

请教一下高手，我用的转膜条件是否合适呢？另外，transfer buffer配方是否还需要改进？非常感谢。

作者: 831226 时间: 2013-3-4 16:42

您好！向您请教电泳慢考虑什么原因呢？现在我们实验室电泳到底需要2.5h以上，而以前只需110分。电泳液的配方没有变，复用次数不多，而且新的时候也是慢。变得是甘氨酸是新购入的，看到颜色没有之前那么白、亮，暗暗的，不知会不会是因为甘氨酸不纯引起吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:43

260k的蛋白如果转膜成功了，那么，丽春红染色肯定能见到条带吗？
我用同一个样品，在内参蛋白的条带上丽春红染得很清楚，但在转印目的蛋白（260k，试了好多转印方法。。。)后，丽春红染见不到条带，但marker是转过去了。

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如果不是纯化的蛋白
260K的转膜后丽春红染色不能看到明显的条带
如果是肌组织样本在225K附近有一些较深的条带，是MHC
大分子量的蛋白不是特别多，丽春红染色看不到明显的条带，你可以上最大的量，转膜后做WB

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:44

我做的蛋白分子量为480KD，用6%的胶，250mA/3h转膜,结果做不出来，谁有成功的经验，请赐教，谢谢！

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什么蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:44

老师，我做的内参用12的分离胶。80v跑浓缩，120v跑分离。最后又条带。但是带不好看。宽窄不一样。是怎么回事啊。而且带很弱。很细，增加了上样量没有什么大变化。

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与抗体的特异性
ECL的检测敏感性都有关系
宽窄不一可能是相邻泳道上样量不一致（上样体积也不一致）造成的

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:45

版主你好，
我目前主要做的是小鼠肺组织的western，一直以来结果都是非特异的条带特别多，而且还是特别特异的那种出现在80到120kd区域，而自己的目的蛋白分子量是46kd条带特别弱。阳性对照条带单一，并且也有内参（GAPDH）出现，有时内参附近还有非特异条带。
用的一抗是santa cruz 的鼠源单抗1：250（推荐稀释范围1：100到1：1000）30度杂交1h或室温杂交2h;二抗是国产的中山金桥1：1000室温杂交1h或2h或2.5h或4度过夜再复温（推荐稀释范围1：500到1：1000）。这会跟转膜效率有关吗?bio-rad 半干转膜仪，15V恒压转膜1.5h或
恒流280mA 1h（四张膜，NC膜2.5*CM）。
是不是与我提的组织总蛋白有关?采用的是RIPA+罗氏的蛋白酶抑制剂为组织裂解液。
采用了以下两种取组织方法为达到去除western爆片出现非特异条：用胶原酶进行组织消化；用胰酶进行组织消化，其结果是导致我的目的条带很弱很弱，但是非特异条带很固执地依然存在。很苦恼！
O(∩_∩)O谢谢！

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消化后提取蛋白做WB没试过
一抗的稀释度试试1：500、1：1000啊

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:48

我这段时间做的结果背景都很脏，我的一抗是磷酸化的丝氨酸和苏氨酸，请问使用磷酸化抗体的WB有哪些值得注意的地方？

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用BSA封闭试试

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:49

请教一下，我要做一个500kD的蛋白的western blot，用的是invitrogen的湿转系统，NC膜，用了pierce最灵敏的femto来发光。由于分子量很大，我在transfer buffer里面加了0.02%的SDS，10%甲醇，冰浴下45V转4个小时，预染marker转到了膜上，胶上没有肉眼可见的预染marker,western blot能够检测到条带，但是条带非常的微弱，需要曝光比较长的时间，造成背景就很高。另外，不知道是不是buffer的缓冲能力问题，开始45V电压下，电流只有两百多毫安，但不停的升高，大概两个小时后，电流就有400毫安了，由于我限定了电流最高值，后来电压会下降到40V以下。

请教一下高手，我用的转膜条件是否合适呢？另外，transfer buffer配方是否还需要改进？非常感谢。

多大浓度的胶？
试试恒流转啊，300mA 3h
Pierce Femto级别的ECL背景容易很高
需要稀释一抗及二抗（看说明书）

作者: NBA 时间: 2013-3-4 16:49

您好！向您请教电泳慢考虑什么原因呢？现在我们实验室电泳到底需要2.5h以上，而以前只需110分。电泳液的配方没有变，复用次数不多，而且新的时候也是慢。变得是甘氨酸是新购入的，看到颜色没有之前那么白、亮，暗暗的，不知会不会是因为甘氨酸不纯引起吗？谢谢！

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那就有可能是甘氨酸的问题

作者: www.1 时间: 2013-3-4 16:50

最近做western总是在70KD左右出现杂带，请斑竹帮忙看一下？目标蛋白应该在25KD左右

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作者: www.1 时间: 2013-3-4 16:59

刚开始做WB，遇到了很多问题。内参和目标蛋白大部分时间都跑不出来，偶尔跑出来条带也很弱，老师说可能是蛋白浓度太低。我的标本时外周血提取的单个核细胞，-20°冻的干细胞，直接用BIO-RAD Laemmli Sample Buffer加巯基乙醇裂解。同实验室的同学也是用的同样方法，测的目标蛋白也一样。都是外周血标本，他每次都跑得比较漂亮，内参和目的蛋白都很好。很郁闷啊！有几个问题请教一下斑竹
1、我想换用RIPA的裂解液？网上有很多种配方，斑竹可不可以推荐一下配方呢？
2、裂解细胞过程中的有哪些注意事项呢？友情提示一下！
3、裂解过程中超声的主要作用是什么？煮沸的作用又是什么呢？样品都需要煮沸吗？裂解液成分里有尿素的话是不是不能煮沸呢？
谢谢

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-4 17:05

您好，非常感谢您的指导，我用的是invitrogen的预制胶，3-8%的Tris-Acetate梯度胶，分离范围应该可以达到500kD左右的

其实我也一直不太明白，恒流和恒压对于电泳有什么不一样呢？其实我以前也用的恒流，不过因为invitrogen的说明书都用的恒压，所以也就改成恒压了，我再试试看300mA 3h。另外，关于到后来电流不断升高，表明电阻不断下降，是否需要中途更换一下transfer buffer? 还是说比如说用1.5X的buffer? 是否会存在预染marker容易转膜，但目标蛋白转不上去的情况？

关于背景问题，我曾经试过用millipore的ECL，但是什么东西都显影不出来，一张白膜。我感觉背景高可能主要还是因为条带信号实在太弱，曝光时间过长。因为我跑的是血浆样品，相对于背景信号，血浆IgG和二抗结合的信号就很强很清晰，虽说我已经用的是adsorb过的二抗。

您觉得是不是应该降低二抗浓度？我使用的是invitrogen的二抗，说明书推荐是1:500-1:2000，我都是用的1:2000的下限来做的。蛋白信号已经很弱了，我觉得一抗浓度可能不适合降低了。

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多大浓度的胶？
试试恒流转啊，300mA 3h
Pierce Femto级别的ECL背景容易很高
需要稀释一抗及二抗（看说明书）

作者: 33号 时间: 2013-3-4 17:05

我现在还有个问题-我的蛋白是在核内表达的，而我提取蛋白时用的是全细胞裂解液，这种情况下我用什么内参合适呢？（我要做肿瘤组织和正常组织对这蛋白的表达差异）。

作者: hold住 时间: 2013-3-4 17:06

与抗体的特异性
ECL的检测敏感性都有关系
宽窄不一可能是相邻泳道上样量不一致（上样体积也不一致）造成的

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谢谢老师，另外请教老师是不是上样的体积越小越好呢，这样的话就要求蛋白的浓度越高。是不是这样呢。我的蛋白浓度有27ug/ul这样的浓度高不高

作者: XYZQ 时间: 2013-3-4 17:10

请问：
1.内参不是本身存在于样品中的吗？为什么看到有人说什么时候加内参，在哪里买内参什么的？
2.为什么一抗不能标记呢？那样不就省去二抗了？非得标记二抗来显色的？

刚接触WB，问题比较白啊，><

作者: DONT 时间: 2013-3-4 17:11

老师您好，你看看我这张膜，我是用考马斯亮蓝染色的。带窄的地方是分子量较大的带，刚过浓缩胶。从这张膜上看我的转膜和电泳有问题没有？
做的内参，结果没有荧光。一抗4度过夜，二抗室温两个小时。可以证明的是二抗和ECL均没有问题。没有荧光可能是什么原因引起的呢？可不可以肯定的说就是一抗引起的呢

[ 本帖最后由 DONT 于 2013-3-4 17:15 编辑 ]

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作者: hold住 时间: 2013-3-4 17:15

NBA老师你好，这是我的WB大概步骤：不同蛋白样品中取出等量蛋白50μg，上样，10%分离胶分离，半干法转移至PVDF膜上，将此膜取下，剪角后在5%脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。将一抗按1:600比例稀释，与膜一起4℃孵育过夜。TBST洗涤2次每次10分钟，TBS洗膜一次，10分钟。按1：1000稀释HRP标记的二抗后孵育1-2小时，TBST洗涤2次，每次10分钟，TBS洗膜1次，10分钟。利用增强型化学发光试剂盒（ECL）检测蛋白表达。(蛋白分子量123KD,转膜45分钟)。现在存在以下几点问题：1.曝光时整张膜都是亮的。2.内参曝出两条带. 3.目的蛋白总曝不出来。请问问题都出在哪里？--------急急急！在线等！！谢谢！！

作者: owanaka 时间: 2013-3-4 17:16

你好，我提胞核和胞浆蛋白，然后根据所测的浓度，每孔15ug上样，跑actin，上面是胞核蛋白，下面是胞浆蛋白，感觉actin在每组表达不一，如胞核蛋白第3、4、5的表达高些，胞浆蛋白第4、5、6的表达高些。

请问是我测的蛋白浓度不准导致的吗？有没有办法调整上样量，使每组的actin表达一致？谢谢！

还有一个问题就是，每次提蛋白的时候，最后高速离心13000转*10分钟，经常发现上清的表面还漂着一层膜样的东西，不知道是什么？谢谢！

作者: xue258 时间: 2013-3-4 17:22

版主您好;
最近做western结果出现了几次背景高的情况，TBST洗涤也不管用，膜扔掉又觉得可惜，请教版主，有没有什么好的方法，可以去除高背景？谢谢

作者: tianmei001 时间: 2013-3-4 17:28

老师好，辛苦了，刚刚做western，做了几次，效果都不好，目的蛋白不出，还有杂带，问题一大堆，不知道哪里出了毛病。刚看到说转膜的事情，我的目的蛋白是67kd分子量，转膜15v，160ma以上，半干，90分钟。这个可以吗，会不会蛋白转过或者没转上去呢

作者: ukonptp 时间: 2013-3-4 17:38

您好！请问分子量分别是183kDa和100kDa的两种蛋白，如何分别选择分离胶的浓度，电泳的电压、时间以及转膜的时间和电流（转膜用的是湿转、PVDF膜）？谢谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-3-4 17:48

你好，我提胞核和胞浆蛋白，然后根据所测的浓度，每孔15ug上样，跑actin，上面是胞核蛋白，下面是胞浆蛋白，感觉actin在每组表达不一，如胞核蛋白第3、4、5的表达高些，胞浆蛋白第4、5、6的表达高些。

请问是我测的蛋白浓度不准导致的吗？有没有办法调整上样量，使每组的actin表达一致？谢谢！

还有一个问题就是，每次提蛋白的时候，最后高速离心13000转*10分钟，经常发现上清的表面还漂着一层膜样的东西，不知道是什么？谢谢！

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同问，我提蛋白的时候也遇到和他一样的问题，在上清下面有一层膜样的东西，我离心式13000转20min，不知道是不是离心转速太大，时间太久造成？

作者: ukonptp 时间: 2013-3-4 17:49

请教老师：我的目的蛋白是26KDa,浓缩胶5%，分离胶15%,电泳80V 50min，120V 60min，半干转恒流，电流为膜长X宽X0.8 一个半小时。0.5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗（bioworld）1：800 两小时，二抗1:1000 两小时然后曝光。没有条带，同样的条件跑10%的分离胶 β-actin和110KDa目标蛋白的条带很清晰。想请教您可能是什么原因造成26KDa目的蛋白没有条带？

作者: ritou1985 时间: 2013-3-5 14:48

请教高手，我第一次做WB，目的蛋白分子量是13kd，我选了5%的浓缩胶和15%的分离胶，电泳时浓缩胶用80V ，分离胶用120V ，结果电泳时发现泳道上没有明显压缩的条带，而是像一团云雾，且弥散到旁边的泳道，marker起初还能分离做出条带，不过是歪歪扭扭的，且到后面小分子量的条带都没跑出来。后来我换成了5%的浓缩胶和10%的分离胶，电泳时可以看见泳道上有明显压缩的条带朝胶的底部移动，且marker的条带很清晰，很直。我怀疑是我的胶的配方有问题。我的5%浓缩胶（5ml）的配方是：双蒸水3.42ml；30%Arc/Bic 0.833ml；1M Tris-Hcl（PH6.8） 0.625ml；10%SDS 50ul；10%APS 75ul；TEMED 7.5ul。15%分离胶（10ml）的配方是：双蒸水2.35ml；30%Arc/Bic 5ml；1.5M Tris-Hcl（PH8.8） 2.5ml；10%SDS 100ul；10%APS 50ul；TEMED 5ul。

作者: NBA 时间: 2013-3-5 14:50

最近做western总是在70KD左右出现杂带，请斑竹帮忙看一下？目标蛋白应该在25KD左右

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做的什么蛋白啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 14:51

刚开始做WB，遇到了很多问题。内参和目标蛋白大部分时间都跑不出来，偶尔跑出来条带也很弱，老师说可能是蛋白浓度太低。我的标本时外周血提取的单个核细胞，-20°冻的干细胞，直接用BIO-RAD Laemmli Sample Buffer加巯基乙醇裂解。同实验室的同学也是用的同样方法，测的目标蛋白也一样。都是外周血标本，他每次都跑得比较漂亮，内参和目的蛋白都很好。很郁闷啊！有几个问题请教一下斑竹
1、我想换用RIPA的裂解液？网上有很多种配方，斑竹可不可以推荐一下配方呢？
2、裂解细胞过程中的有哪些注意事项呢？友情提示一下！
3、裂解过程中超声的主要作用是什么？煮沸的作用又是什么呢？样品都需要煮沸吗？裂解液成分里有尿素的话是不是不能煮沸呢？
谢谢

=====================================================================

你同学做的很好的话
怎么不参考他的方法呢？
1、网上的配方出入不是很大，基本都可以使用，你看着不同的地方在蛋白酶抑制剂这一块
2、裂解液细胞在冰上操作，孵育20-30min，离心，收集上清
3、超声打破细胞膜、细菌壁等，同时可以打断DNA双链。煮沸的为了使样品变性
如果做非变性电泳不能煮沸
有尿素可以煮沸啊

作者: NBA 时间: 2013-3-5 14:51

看了你的精彩解答
为什么内参的分子量要大于目的蛋白呢？
如果做不同的蛋白，是不是转膜、洗膜、孵育抗体的时间条件都要重新摸嘛？

还有最近做了一个蛋白，条带是竖状的，加发光剂后就看见膜上亮的是一片竖状的，而不是一条横的带。一抗洗膜10min*3,二抗1.5H,二抗洗15*3.

谢谢~~

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为什么内参的分子量要大于目的蛋白呢？
什么意思啊？
是目的蛋白为什么要小于内参分子量吧？内参的分子量是已知的啊。。。

如果做不同的蛋白，是不是转膜、洗膜、孵育抗体的时间条件都要重新摸嘛？
很对

作者: NBA 时间: 2013-3-5 14:53

我现在还有个问题-我的蛋白是在核内表达的，而我提取蛋白时用的是全细胞裂解液，这种情况下我用什么内参合适呢？（我要做肿瘤组织和正常组织对这蛋白的表达差异）。

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全细胞裂解液可以用beta-actin、beta-tubulin、GAPDH做内参

作者: NBA 时间: 2013-3-5 14:55

谢谢老师，另外请教老师是不是上样的体积越小越好呢，这样的话就要求蛋白的浓度越高。是不是这样呢。我的蛋白浓度有27ug/ul这样的浓度高不高

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上样体积越小
枪头上样、浓度调整时造成的误差不是更大？
我认为一般1-5mg/ml
上样体积5-20ul不错

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:03

请问：
1.内参不是本身存在于样品中的吗？为什么看到有人说什么时候加内参，在哪里买内参什么的？
2.为什么一抗不能标记呢？那样不就省去二抗了？非得标记二抗来显色的？

刚接触WB，问题比较白啊，><

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内参是存在于样品中，加内参？是加内参一抗吧
建议上网搜索一下为什么要加内参

一抗当然能标记啦，有标记的一抗卖啊
有了二抗会对信号起放大作用

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:04

老师您好，你看看我这张膜，我是用考马斯亮蓝染色的。带窄的地方是分子量较大的带，刚过浓缩胶。从这张膜上看我的转膜和电泳有问题没有？
做的内参，结果没有荧光。一抗4度过夜，二抗室温两个小时。可以证明的是二抗和ECL均没有问题。没有荧光可能是什么原因引起的呢？可不可以肯定的说就是一抗引起的呢

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上样量太大啦
试试一抗不同的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:05

老师你好，这是我的WB大概步骤：不同蛋白样品中取出等量蛋白50μg，上样，10%分离胶分离，半干法转移至PVDF膜上，将此膜取下，剪角后在5%脱脂奶粉封闭液中封闭1小时。将一抗按1:600比例稀释，与膜一起4℃孵育过夜。TBST洗涤2次每次10分钟，TBS洗膜一次，10分钟。按1：1000稀释HRP标记的二抗后孵育1-2小时，TBST洗涤2次，每次10分钟，TBS洗膜1次，10分钟。利用增强型化学发光试剂盒（ECL）检测蛋白表达。(蛋白分子量123KD,转膜45分钟)。现在存在以下几点问题：1.曝光时整张膜都是亮的。2.内参曝出两条带. 3.目的蛋白总曝不出来。请问问题都出在哪里？--------急急急！在线等！！谢谢！！

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一抗、二抗浓度太高

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:06

你好，我提胞核和胞浆蛋白，然后根据所测的浓度，每孔15ug上样，跑actin，上面是胞核蛋白，下面是胞浆蛋白，感觉actin在每组表达不一，如胞核蛋白第3、4、5的表达高些，胞浆蛋白第4、5、6的表达高些。

请问是我测的蛋白浓度不准导致的吗？有没有办法调整上样量，使每组的actin表达一致？谢谢！

还有一个问题就是，每次提蛋白的时候，最后高速离心13000转*10分钟，经常发现上清的表面还漂着一层膜样的东西，不知道是什么？谢谢！

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把蛋白浓度调整成一致的啊
上样体积也相同
这样内参就不会有太大的出入了

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:06

版主您好;
最近做western结果出现了几次背景高的情况，TBST洗涤也不管用，膜扔掉又觉得可惜，请教版主，有没有什么好的方法，可以去除高背景？谢谢

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调整过二抗浓度吗？
用的是商品化一抗还是抗血清？细胞培养上清？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:06

老师好，辛苦了，刚刚做western，做了几次，效果都不好，目的蛋白不出，还有杂带，问题一大堆，不知道哪里出了毛病。刚看到说转膜的事情，我的目的蛋白是67kd分子量，转膜15v，160ma以上，半干，90分钟。这个可以吗，会不会蛋白转过或者没转上去呢

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这个转膜条件应该没有问题
转膜结束后用丽春红染色检查一下

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:07

师，您好！请问分子量分别是183kDa和100kDa的两种蛋白，如何分别选择分离胶的浓度，电泳的电压、时间以及转膜的时间和电流（转膜用的是湿转、PVDF膜）？谢谢！

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可以用8%的分离胶
转膜300mA 恒流，湿转，2h-2h30min

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:08

你同学做的很好的话
怎么不参考他的方法呢？
1、网上的配方出入不是很大，基本都可以使用，你看着不同的地方在蛋白酶抑制剂这一块
2、裂解液细胞在冰上操作，孵育20-30min，离心，收集上清
3、超声打破细胞膜、细菌壁等，同时可以打断DNA双链。煮沸的为了使样品变性
如果做非变性电泳不能煮沸
有尿素可以煮沸啊

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谢谢斑竹，最近内参已经做出来了，但是目的蛋白还是没有，我做的蛋白是Bim。不知斑竹有没有做过。

这个蛋白我没做过
你用什么公司抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:08

做的什么蛋白啊？

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我做的是Bim，70KD处的杂带可能跟复用电泳液有关。使用新配电泳液已经无杂带了。
谢谢斑竹！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-5 15:09

我是让公司帮我做的。我怀疑我的结果是假的。请指教。

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作者: qianqin1977 时间: 2013-3-5 15:09

这张是结果。1、3是对照组，2、4是处理组。预计结果是对照组表达强，处理组表达弱。我觉得对照组的阳性结果太强了，而且过于规则，怀疑是造的。胶片还没有拿到。我的目的蛋白是46kd，abcam的一抗。

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作者: DNA 时间: 2013-3-5 15:10

老师您好，请教一个问题，跑western时预电泳是怎么回事，有什么作用呢？

作者: ukonptp 时间: 2013-3-5 15:11

请教，我想用bio-rad的凝胶成像系统来曝光我的目的蛋白条带，不知道具体怎么操作？谢谢

这和用胶片曝光有什么优缺点？

作者: zhenxin 时间: 2013-3-5 15:11

准备做130kDa的蛋白，今天跑了下细胞总蛋白，电泳结束后直接考染，感觉130kDa附近的蛋白量很少，担心做不出来。请教大侠：
1、需要再增加总蛋白上样量吗？第6道上样77ug（BCA蛋白定量，感觉不太准）好像有点拖尾，是不是上样量大造成的？
2、这次的胶是10%的，是不是改用6%的比较好？

[ 本帖最后由 zhenxin 于 2013-3-5 15:13 编辑 ]

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作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-5 15:13

新手，1.请问目的蛋白分子量9.4KDa，应该用多少浓度的胶？
2.我用的是肺组织，我存在-80℃的冰箱里，是否可以直接用其提取蛋白？
3.电转时用多少mA及时间怎么定？

作者: abc816 时间: 2013-3-5 15:15

我做WB一直有杂带,用的milipore的发光液，后来换了碧云天的发光液后明显好的多了，是不是milipore的发光液太敏感了，谢谢！另请问选择发光液有什么讲究，pierece的怎么样？谢谢！！

作者: moonlight45 时间: 2013-3-5 15:15

现在跑western，每次都是内参可见，洗出片子还可以。而目的蛋白背景要么很高洗出黑片，要么是一点发光都看不到，洗出白片，为什么呢？
我做的目的蛋白分子量是80-120之间的，电泳：电压最大，电流30mA，时间80分钟，转膜：电压100.电流最大，时间90分钟。是怎么回事呢？请高手指点

作者: sunnyB 时间: 2013-3-5 15:17

请问老师：
我做的蛋白分子量为41KD,Western blot 结果条带位置在80KD左右?请问这是怎么回事啊？
谢谢！

作者: tie8 时间: 2013-3-5 15:18

请问老师：
我看到你前面解答的问题中，组织保存用锡纸包好后冻存在-80℃的冰箱，我有个问题想问一下，我原来存的标本是用无菌纱布包裹后冻存的，不知是否会影响蛋白的提取，另外这种组织可以在冰箱内存放多少时间，会不会影响蛋白的提取？谢谢，期待你的答复！

作者: standbyme 时间: 2013-3-5 15:20

我做的是 Wista大鼠

想检测 IL-6 和 TNF-α 两种蛋白的表达

两者的分子量分别是 25KD 和 17KD

请问一抗二抗以及内参该如何选择

万分感谢

作者: windy+++ 时间: 2013-3-5 15:22

版主您好,在wb中我遇到了一个很奇怪的问题，我用宝生物的低分子量marker，转膜后只有小条带转过去大分子条带没有了，在空白对照（bl21）中，和大分子量相当的条带能转过去，目的条带也能转过去，开始怀疑是marker出了问题，跑胶考马斯亮蓝染色后marker的条带是全的，转膜条件是400MA，1.5h 和100V,3h 都有这个现象出现。请您指教！

作者: windy+++ 时间: 2013-3-5 15:22

补充一下我的目的条带是 72kd，nc膜，湿转。

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:23

老师您好，请教一个问题，跑western时预电泳是怎么回事，有什么作用呢？

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做WB时一般不做预电泳

在做EMSA的时候有这个
具体作用不太了解

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:24

这张是结果。1、3是对照组，2、4是处理组。预计结果是对照组表达强，处理组表达弱。我觉得对照组的阳性结果太强了，而且过于规则，怀疑是造的。胶片还没有拿到。我的目的蛋白是46kd，abcam的一抗。

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这样不能说明是造假的吧。。。
实验结果与预期有偏差是正常的啊。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:24

请教，我想用bio-rad的凝胶成像系统来曝光我的目的蛋白条带，不知道具体怎么操作？谢谢

这和用胶片曝光有什么优缺点？

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没用过bio-rad的凝胶成像系统

胶片曝光的敏感性高于凝胶成像系统
我喜欢用胶片曝光

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:27

准备做130kDa的蛋白，今天跑了下细胞总蛋白，电泳结束后直接考染，感觉130kDa附近的蛋白量很少，担心做不出来。请教大侠：
1、需要再增加总蛋白上样量吗？第6道上样77ug（BCA蛋白定量，感觉不太准）好像有点拖尾，是不是上样量大造成的？
2、这次的胶是10%的，是不是改用6%的比较好？

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肉眼肯定不能看出蛋白有多少啦

我觉得你的预实验30ug足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:28

新手，1.请问目的蛋白分子量9.4KDa，应该用多少浓度的胶？
2.我用的是肺组织，我存在-80℃的冰箱里，是否可以直接用其提取蛋白？
3.电转时用多少mA及时间怎么定？

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这么大的蛋白我也做的不好

可以直接用来提取蛋白

电转建议用半干

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:29

我做WB一直有杂带,用的milipore的发光液，后来换了碧云天的发光液后明显好的多了，是不是milipore的发光液太敏感了，谢谢！另请问选择发光液有什么讲究，pierece的怎么样？谢谢！！

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建议确定使用一种ECL
不同的ECL对一抗二抗的稀释度都是不一样的

Pierce的ECL分好多种
敏感性均不同

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:30

现在跑western，每次都是内参可见，洗出片子还可以。而目的蛋白背景要么很高洗出黑片，要么是一点发光都看不到，洗出白片，为什么呢？
我做的目的蛋白分子量是80-120之间的，电泳：电压最大，电流30mA，时间80分钟，转膜：电压100.电流最大，时间90分钟。是怎么回事呢？请高手指点

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调整目的蛋白与二抗的稀释度

如果调整多个稀释度不行就要考虑一抗的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:31

请问老师：
我做的蛋白分子量为41KD,Western blot 结果条带位置在80KD左右?请问这是怎么回事啊？
谢谢！

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二聚体？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:31

请问老师：
我看到你前面解答的问题中，组织保存用锡纸包好后冻存在-80℃的冰箱，我有个问题想问一下，我原来存的标本是用无菌纱布包裹后冻存的，不知是否会影响蛋白的提取，另外这种组织可以在冰箱内存放多少时间，会不会影响蛋白的提取？谢谢，期待你的答复！

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对于大部分蛋白来说
在-80保存一年应该没有问题（不能反复冻融）

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:32

我做的是 Wista大鼠

想检测 IL-6 和 TNF-α 两种蛋白的表达

两者的分子量分别是 25KD 和 17KD

请问一抗二抗以及内参该如何选择

万分感谢

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IL-6没做过
TNF-alpha可以选择abcam的

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:33

版主您好,在wb中我遇到了一个很奇怪的问题，我用宝生物的低分子量marker，转膜后只有小条带转过去大分子条带没有了，在空白对照（bl21）中，和大分子量相当的条带能转过去，目的条带也能转过去，开始怀疑是marker出了问题，跑胶考马斯亮蓝染色后marker的条带是全的，转膜条件是400MA，1.5h 和100V,3h 都有这个现象出现。请您指教！

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没有看懂你的意思
转膜后你是染胶还是染膜看大分子量、小分子量？

作者: lgm 时间: 2013-3-5 15:33

老师，我最近做曝出的条带总是呈现位于膜两端的条带比膜中间条带颜色要深的趋势，连内参也是如此，自己觉得应该不是定量的问题，是否是孵育过程有什么问题呢？如何解决？谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-3-5 15:34

提取膜蛋白的目的只是用于western-blot，我提的膜蛋白为45KD的7次跨膜蛋白（取材为脊髓），之前提取总蛋白，跑了好几次没有结果，所以打算提膜蛋白，RIPA量为脊髓重量*4、PMSF按100：1，匀浆后离心机800rpm，4度离心10分钟，所得上清液转入超速离心管。然后100000g，4度离心1小时，弃去上清，取沉淀。不知道这样可不可以，如果可以那沉淀怎么处理？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:35

老师，我最近做曝出的条带总是呈现位于膜两端的条带比膜中间条带颜色要深的趋势，连内参也是如此，自己觉得应该不是定量的问题，是否是孵育过程有什么问题呢？如何解决？谢谢！

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注意加ECL的时候在膜两端与中间一样加匀

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:36

提取膜蛋白的目的只是用于western-blot，我提的膜蛋白为45KD的7次跨膜蛋白（取材为脊髓），之前提取总蛋白，跑了好几次没有结果，所以打算提膜蛋白，RIPA量为脊髓重量*4、PMSF按100：1，匀浆后离心机800rpm，4度离心10分钟，所得上清液转入超速离心管。然后100000g，4度离心1小时，弃去上清，取沉淀。不知道这样可不可以，如果可以那沉淀怎么处理？

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如果做WB的话没有必要单独提取膜蛋白

我用试剂盒提过膜蛋白，RIPA提取的是总蛋白
建议你加大样品的用量，这样才能提取到适量的膜蛋白

作者: mickeylin 时间: 2013-3-5 15:37

版主您好，我是染膜（丽春红）的时候没有打分子量的marker，同样的样品染胶（考马斯亮蓝）的时候可以看到大分子量的marker

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-5 15:38

二聚体？

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谢谢老师回答，我蛋白变性了，还会以二聚体的形式存在？为什么没有单聚体？我在做一遍看看

作者: 131415 时间: 2013-3-5 15:40

请问版主，如果显影后看到有目的带，但是背景很深，这个膜还能复用吗？我的意思是有没有改良的方法洗膜后重新孵抗体？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-5 15:42

请问版主，如果显影后看到有目的带，但是背景很深，这个膜还能复用吗？我的意思是有没有改良的方法洗膜后重新孵抗体？非常感谢！

======================================

可以
用stripping buffer洗膜后重新孵育目的蛋白一抗
减小二抗用量

作者: memory 时间: 2013-3-5 15:43

可以
用stripping buffer洗膜后重新孵育目的蛋白一抗
减小二抗用量

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不好意思，有配方吗？具体怎么用合适？谢谢！

作者: zhezhe 时间: 2013-3-5 15:47

我用的是pierce的BCA蛋白定量试剂盒，请问稀释蛋白样品和标准品的时候该用什么来稀释呢？为什么？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-5 15:48

不好意思，有配方吗？具体怎么用合适？谢谢！

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有配方
你还是买商品化的吧
配方不能告诉你
不好意思

作者: NBA 时间: 2013-3-5 16:02

我用的是pierce的BCA蛋白定量试剂盒，请问稀释蛋白样品和标准品的时候该用什么来稀释呢？为什么？

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可以用生理盐水或者PBS稀释

作者: NBA 时间: 2013-3-5 16:02

以前相同条件跑的条带至少还看得清，最近跑的western实在让我都不忍看了
目的条带130kd的磷酸化enos，和60kd磷酸化的akt
条件：3%的浓缩胶，7.5%的分离胶
75v浓缩胶30min，115v分离胶2h
半干转 0.07A,2：30h ，膜是millipore的0.45mm 的PVDF
牛奶封闭1h
一抗16h，wash3*5min,二抗2h,wash 15*3min
ecl,thermo,普通的没曝出来，用超敏：普通=1：10 曝片8min得到以上结果，
抗体是cell signaling的，应该没问题，请楼主分析一下原因，谢谢。

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超敏的确定就是这样
敏感性太高
会造成很多杂带
如果用超敏的话
需要稀释一抗与二抗

作者: kuohao17 时间: 2013-3-5 16:04

请问版主,电泳缓冲液有不同的配方,请问不同的配方PH最后调的一样吗?PH值对结果影响大吗?我看到的一个配方PH值是8.3,那别的配方不一定是8.3吧?谢谢

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-5 16:04

版主，请问半干转的操作步骤？有什么注意事项吗？新手上路

作者: zwsyrt 时间: 2013-3-5 16:05

您好，我打算做bax\bcl-2\caspase-3的检测，实验动物是家兔，打算做western blot，可是不知道一抗、二抗该如何选择，一抗是选择鼠源的吗？二抗是抗鼠的抗体吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-5 16:06

您好，我打算做bax\bcl-2\caspase-3的检测，实验动物是家兔，打算做western blot，可是不知道一抗、二抗该如何选择，一抗是选择鼠源的吗？二抗是抗鼠的抗体吗？谢谢！

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能用于兔子的抗体很少
有难度

一抗选择鼠源的当然可以
一抗：小鼠
二抗要：抗小鼠

作者: NBA 时间: 2013-3-5 16:09

版主，请问半干转的操作步骤？有什么注意事项吗？新手上路

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注意膜、胶的顺序
膜在电极正侧、胶在负侧

作者: NBA 时间: 2013-3-5 16:12

请问版主,电泳缓冲液有不同的配方,请问不同的配方PH最后调的一样吗?PH值对结果影响大吗?我看到的一个配方PH值是8.3,那别的配方不一定是8.3吧?谢谢

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SDS-PAGE电泳缓冲液配方一般都用
25mM tris
192mM glycine
0.1% SDS
不用调整pH

作者: XYZQ 时间: 2013-3-5 16:14

老师您好，我的目的蛋白一抗1：200稀释的，二抗1：5000可以出现目的条带，但是背景太高，我就把二抗的浓度调低了，背景是干净了，但是带很淡，几乎看不到，怎么回事呢。不是说一抗的浓度和特异性有关，二抗和背景有关吗？我是不是需要将一抗的浓度调低

作者: XYZQ 时间: 2013-3-5 16:15

还有一个问题需要问老师，我买的内参是未带标记的，能不能同时将目的的一抗和内参一抗一起孵育呢

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-5 16:54

请教老师，我打算用RIPA（碧云天）抽提蛋白，据说蛋白变性后更有利于保存，我想问下是否可以抽提蛋白后马上变性，然后用BCA法测蛋白浓度？这样就可以把不同时间点的蛋白一起测浓度，更省时省钱，而比较不用担心蛋白的降解问题。但是这样会不会有影响，还是说必须要在变性前测浓度？谢谢！！！

作者: dog002 时间: 2013-3-5 16:56

用液氮提蛋白时，加了裂解液后就冻住了。是不是应该把组织的粉末刮下来，放到ep管里再加裂解液？

作者: yjf1026 时间: 2013-3-5 16:57

老师您好！请问我做的snail蛋白，分子量26kDa，12%分离胶。用Abcam一抗1：500，二抗1：5000，各两小时，目的条带很弱，背景很脏。请教版主老师，有没有什么好的方法使目的条带清楚，背景干净？

作者: yychen 时间: 2013-3-5 16:58

版主您好：

我在做测脑组织中notch1信号（胞内段），western一直做不出来，请教下转膜的条件和胶的浓度？谢谢！

作者: avi317 时间: 2013-3-5 16:59

请问版主，我做ＷＢ，出来的条带不一样宽是怎么回事？蛋白上样量不一致？谢谢！！

作者: avi317 时间: 2013-3-5 17:05

颏舌肌提取蛋白匀浆，蛋白定量到1mg/ml，用2×SDS上样缓冲液按1：1体积稀释样品，变性后点样，15ul/孔，电泳18小时。转膜，湿转，按0.65mA/cm2，2-2.5小时。用5%脱脂奶粉1：1000稀释一抗，4℃孵育过夜。TBS-T漂洗3次，10min/次。用5%脱脂奶粉1：1000稀释二抗，室温孵育2小时。TBS-T漂洗3次，10min/次。DAB显色2小时。重复数次了，但是效果就是不理想。要么，根本不显色，要么只显个别泳道。请版主帮忙指点一下。谢谢。

作者: u234 时间: 2013-3-5 17:05

上样量大
样品中离子浓度不合适

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请问该如何确定样品中离子浓度？并调到适合的浓度呢？

作者: u234 时间: 2013-3-5 17:08

1，重复用的抗体不能保证是否污染
2，我不建议重复使用抗体
3，延长在4度封闭的时间，减少二抗孵育时间
4，一抗稀释度要变稀
5，用TBST配制的抗体4度一般可以放置一周
6，新配的抗体浓度有些高所以有时不出条带，第二次用的浓度降低了能出条带，从此确定你的一抗浓度太高，建议稀释2~4倍后使用

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为何抗体浓度高了会不出带呢？

作者: INK 时间: 2013-3-5 17:08

请问版主:我的蛋白表达量高时为什么不是条带密度变大,而是条带变长,谢谢!另煮好的蛋白可以用什么稀释,谢谢!!

作者: 831226 时间: 2013-3-5 17:10

最近做westernblot，用的是伯乐的湿转仪，转68左右的蛋白，转到PVDF膜上总是转不上，我是恒压100V，1小时，滤纸用的是买仪器时附带的滤纸，上下各放了一张（因为滤纸比较厚）。转完了用丽春红染色5分钟，再放到自来水上冲却什么条带也没有，请用过伯乐湿转仪的帮忙分析下！！万分感谢

作者: orangecake 时间: 2013-3-5 17:11

最近碰到了一件很郁闷的事情，请大家帮忙看看，怎么解释，下一步有什么办法解决问题。
小妹的课题是研究一个抑癌基因的表达调控及功能。开始的时候用RT-PCR的方法检测了该基因在肿瘤细胞系和正常上皮细胞系中的表达差异，结果显示该基因仅在正常细胞系中表达，在实验室现有的7个肿瘤细胞系中都不表达，当时因为研究的基因表达调控机制是转录水平的，所以就没有再用western的手段进行验证。先上图。
左上方即该基因的表达情况，下方是管家基因。
近来因为要研究该基因的功能，所以构建了该基因的表达载体，并进行了稳定转染。
RT-PCR再次证实了该基因在某细胞中，转染前没有表达，转染后表达显著增高。
可是对此结果进行western验证的时候，恐怖的事情出现了，western显示该基因在转染前既有表达，转染后量也没有显著的增多。我的一抗是多克隆抗体，1：1000的比例做的，说明书上文字部分的蛋白大小是33KD，电泳图是28KD，而我的实验结果不知道为什么在近似的地方出现了两条带，位置和说明书都有出入。大小一个比35大一点，一个比25小一点。两条明显的带之间还有几条分不开的条带，我不知道是在压片的时候动了造成的影子还是确实有条带但是分不开？？？请教高人这怎么解释，如何解决？
眼看还有一个多月实验就要结束了，RT-PCR和western结果却出现了这样颠覆性的差异。以前的RT-PCR我当时重复了很多次，引物比对也没有问题。现在该怎么办啊，有什么合理的解释吗？请大家一定帮帮我啊
上张western的图

图片附件: 87610418.snap.jpg (2013-3-5 17:12, 8.37 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15082

作者: orangecake 时间: 2013-3-5 17:12

我今天刚做了个片子。做得p53.转膜时间是60v 一个小时。一抗1：200，二抗1：3000.显影之后背景很干净，只是泳道颜色深，有非特异性带。昨天做的1;200,二抗1：3500，什么都没有。前天做了一抗1：250二抗1:4000.,还可以看见带，只是背景比较高。有非特异性带。老师帮我想想，我该怎么调浓度呢。做了好长时间都不出结果。谢谢

作者: hyuu 时间: 2013-3-5 17:13

弱弱的问个白痴的问题，为什么做磷酸化蛋白的时候要用总的蛋白做内参？总蛋白的量怎么会在磷酸化的过程中保持不变呢？外界的刺激因素不同，总蛋白的量不是应该也不相同吗？
O(∩_∩)O~
谢谢楼主，新手困惑中。

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:13

老师您好，我的目的蛋白一抗1：200稀释的，二抗1：5000可以出现目的条带，但是背景太高，我就把二抗的浓度调低了，背景是干净了，但是带很淡，几乎看不到，怎么回事呢。不是说一抗的浓度和特异性有关，二抗和背景有关吗？我是不是需要将一抗的浓度调低

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先确定二抗稀释度，不建议经常更换二抗
确定之后再调整一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:14

还有一个问题需要问老师，我买的内参是未带标记的，能不能同时将目的的一抗和内参一抗一起孵育呢

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最好不要一起孵育
会有交叉反应

如果一定要一起孵育的话
可以选用小鼠来源的单抗
且在一起孵育之前要先分开摸好两者的稀释度

或者在目的曝光后，用TBST洗去ＥＣＬ
加内参进行后续ＷＢ

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:15

请教老师，我打算用RIPA（碧云天）抽提蛋白，据说蛋白变性后更有利于保存，我想问下是否可以抽提蛋白后马上变性，然后用BCA法测蛋白浓度？这样就可以把不同时间点的蛋白一起测浓度，更省时省钱，而比较不用担心蛋白的降解问题。但是这样会不会有影响，还是说必须要在变性前测浓度？谢谢！！！

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不建议先变性再测浓度

一般是离心后把上清分装，一份测定浓度，一份冻存，等定量后进行变性，保存

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:17

用液氮提蛋白时，加了裂解液后就冻住了。是不是应该把组织的粉末刮下来，放到ep管里再加裂解液？

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应该把组织的粉末刮下来，放到ep管里再加裂解液
最好能用玻璃匀浆器再次匀浆

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:18

老师您好！请问我做的snail蛋白，分子量26kDa，12%分离胶。用Abcam一抗1：500，二抗1：5000，各两小时，目的条带很弱，背景很脏。请教版主老师，有没有什么好的方法使目的条带清楚，背景干净？

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先确定二抗合适的稀释度
然后试一抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:19

版主您好：

我在做测脑组织中notch1信号（胞内段），western一直做不出来，请教下转膜的条件和胶的浓度？谢谢！

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用的什么抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:19

请问版主，我做ＷＢ，出来的条带不一样宽是怎么回事？蛋白上样量不一致？谢谢！！

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１、蛋白上样量不一致
２、相邻泳道上样体积不一致
３、梳孔大小不一致

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:21

颏舌肌提取蛋白匀浆，蛋白定量到1mg/ml，用2×SDS上样缓冲液按1：1体积稀释样品，变性后点样，15ul/孔，电泳18小时。转膜，湿转，按0.65mA/cm2，2-2.5小时。用5%脱脂奶粉1：1000稀释一抗，4℃孵育过夜。TBS-T漂洗3次，10min/次。用5%脱脂奶粉1：1000稀释二抗，室温孵育2小时。TBS-T漂洗3次，10min/次。DAB显色2小时。重复数次了，但是效果就是不理想。要么，根本不显色，要么只显个别泳道。请版主帮忙指点一下。谢谢。

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先进行SDS-PAGE染胶确定上样量

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:22

请问该如何确定样品中离子浓度？并调到适合的浓度呢？

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裂解液是买的还是自己配制的?
如果是自己配制的浓度不是很清楚吗?

用PBS或者生理盐水调整到合适浓度
具体数值我忘记了
好像是几百个mM吧

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:23

1，重复用的抗体不能保证是否污染
2，我不建议重复使用抗体
3，延长在4度封闭的时间，减少二抗孵育时间
4，一抗稀释度要变稀
5，用TBST配制的抗体4度一般可以放置一周
6，新配的抗体浓度有些高所以有时不出条带，第二次用的浓度降低了能出条带，从此确定你的一抗浓度太高，建议稀释2~4倍后使用

为何抗体浓度高了会不出带呢？

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具体原理请参考<抗体实验技术指南>

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:23

请问版主:我的蛋白表达量高时为什么不是条带密度变大,而是条带变长,谢谢!另煮好的蛋白可以用什么稀释,谢谢!!

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条带左右两边变长?

用1倍的loading进行稀释

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:24

最近碰到了一件很郁闷的事情，请大家帮忙看看，怎么解释，下一步有什么办法解决问题。
小妹的课题是研究一个抑癌基因的表达调控及功能。开始的时候用RT-PCR的方法检测了该基因在肿瘤细胞系和正常上皮细胞系中的表达差异，结果显示该基因仅在正常细胞系中表达，在实验室现有的7个肿瘤细胞系中都不表达，当时因为研究的基因表达调控机制是转录水平的，所以就没有再用western的手段进行验证。先上图。
左上方即该基因的表达情况，下方是管家基因。
近来因为要研究该基因的功能，所以构建了该基因的表达载体，并进行了稳定转染。
RT-PCR再次证实了该基因在某细胞中，转染前没有表达，转染后表达显著增高。
可是对此结果进行western验证的时候，恐怖的事情出现了，western显示该基因在转染前既有表达，转染后量也没有显著的增多。我的一抗是多克隆抗体，1：1000的比例做的，说明书上文字部分的蛋白大小是33KD，电泳图是28KD，而我的实验结果不知道为什么在近似的地方出现了两条带，位置和说明书都有出入。大小一个比35大一点，一个比25小一点。两条明显的带之间还有几条分不开的条带，我不知道是在压片的时候动了造成的影子还是确实有条带但是分不开？？？请教高人这怎么解释，如何解决？
眼看还有一个多月实验就要结束了，RT-PCR和western结果却出现了这样颠覆性的差异。以前的RT-PCR我当时重复了很多次，引物比对也没有问题。现在该怎么办啊，有什么合理的解释吗？请大家一定帮帮我啊
上张western的图

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换一个一抗试试
换不同来源的一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:26

我今天刚做了个片子。做得p53.转膜时间是60v 一个小时。一抗1：200，二抗1：3000.显影之后背景很干净，只是泳道颜色深，有非特异性带。昨天做的1;200,二抗1：3500，什么都没有。前天做了一抗1：250二抗1:4000.,还可以看见带，只是背景比较高。有非特异性带。老师帮我想想，我该怎么调浓度呢。做了好长时间都不出结果。谢谢

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一抗用1:500
二抗用1:5000试试

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:27

弱弱的问个白痴的问题，为什么做磷酸化蛋白的时候要用总的蛋白做内参？总蛋白的量怎么会在磷酸化的过程中保持不变呢？外界的刺激因素不同，总蛋白的量不是应该也不相同吗？
O(∩_∩)O~
谢谢楼主，新手困惑中。

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总蛋白不能说完全不变
是作为一个磷酸化蛋白的参照

简单说就是用非磷酸化(总蛋白)抗体识别的是所有目的蛋白
磷酸化只是这些蛋白中的一部分

具体的一些细节建议你参考抗体制备

作者: youyou99 时间: 2013-3-5 17:27

先确定二抗稀释度，不建议经常更换二抗
确定之后再调整一抗稀释度

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怎么样确定呢，什么样的结果就可以说明该二抗浓度可以呢。还是只是一开始就确定一个二抗的浓度，来调整一抗的浓度

作者: mimili_901 时间: 2013-3-5 17:29

换一个一抗试试
换不同来源的一抗

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版主您好，非常感谢您的回复！
想再麻烦问问你，也是我最疑惑的问题，如果RT-PCR测不到mRNA表达，western会检测到蛋白的表达吗？？更换一抗可以解决不特意的问题，是不是依然不能解释这个情况呢，请您指点，不胜感激！

作者: tie8 时间: 2013-3-5 17:30

您好，请教一个问题，我最近才开始做western，目标蛋白是一个149KDa的膜蛋白，用的1.5mm板，上样量20ul，约100ug蛋白（怕膜蛋白含量低，显不出来），电泳60v-100v，转膜80v2h，转膜前PVDF膜用甲醇浸15s，转膜液平衡。
一开始我的一抗是用TBST稀释的，5%脱脂奶粉封闭（封闭后曾用TBST洗涤），一抗1：200（upstate），4度孵育过夜，二抗1：1000（santa），室温2h，后TBST洗涤2次，每次15min，ECL发光，结果目标蛋白有条带显示，但背景很脏。
后来一抗改用5%脱脂奶粉稀释一抗，封闭后不再用TBST洗涤，直接上一抗，1：200和1：500都做过，4度孵育过夜，其他步骤不变，结果目标蛋白条带无显示，内参（GAPDH）有条带显示。背景依然很脏。
请指点，万分感谢！

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-5 17:30

你好，前段时间在请教了你几个问题，在你的指导下，已经能够做出来了。
现在就是还有个问题请教，摇一抗的时间有没有一个范围。我们实验室的老师说是越长越好，但必须在4度过夜，所以我们都是下午差不多4点做完，然后摇到晚11点实验室关门时才放4度。请问这样会不会对一抗的结合又影响？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:31

版主您好，非常感谢您的回复！
想再麻烦问问你，也是我最疑惑的问题，如果RT-PCR测不到mRNA表达，western会检测到蛋白的表达吗？？更换一抗可以解决不特意的问题，是不是依然不能解释这个情况呢，请您指点，不胜感激！

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RT-PCR引物设计怎样？
能扩增出想要的基因吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:31

您好，请教一个问题，我最近才开始做western，目标蛋白是一个149KDa的膜蛋白，用的1.5mm板，上样量20ul，约100ug蛋白（怕膜蛋白含量低，显不出来），电泳60v-100v，转膜80v2h，转膜前PVDF膜用甲醇浸15s，转膜液平衡。
一开始我的一抗是用TBST稀释的，5%脱脂奶粉封闭（封闭后曾用TBST洗涤），一抗1：200（upstate），4度孵育过夜，二抗1：1000（santa），室温2h，后TBST洗涤2次，每次15min，ECL发光，结果目标蛋白有条带显示，但背景很脏。
后来一抗改用5%脱脂奶粉稀释一抗，封闭后不再用TBST洗涤，直接上一抗，1：200和1：500都做过，4度孵育过夜，其他步骤不变，结果目标蛋白条带无显示，内参（GAPDH）有条带显示。背景依然很脏。
请指点，万分感谢！

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背景脏与洗膜时是否污染等情况有关
还有些一抗就有非特异性背景
建议换BSA试试

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:31

你好，前段时间在请教了你几个问题，在你的指导下，已经能够做出来了。
现在就是还有个问题请教，摇一抗的时间有没有一个范围。我们实验室的老师说是越长越好，但必须在4度过夜，所以我们都是下午差不多4点做完，然后摇到晚11点实验室关门时才放4度。请问这样会不会对一抗的结合又影响？

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当然不是越长越好
你老师说的有一些道理，但不能全面认同
如果4度过夜孵育抗体，建议室温孵育30min后放置在4度过夜
第二天继续RT 孵育 30min，洗膜加二抗

抗原、抗体结合是一种动态平衡过程，请参考有关抗体参考书

作者: 04906 时间: 2013-3-5 17:32

RT-PCR引物设计怎样？
能扩增出想要的基因吗？

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可以扩出想要的条带，引物也用DNAman软件及在NCBI上比对过，同时因为P的不是全长，所以也对产物进行了测序，也是对的。
唉，眼看就要毕业出实验室了，真是令人心焦啊！
感谢楼主！

作者: lixi559 时间: 2013-3-5 17:32

背景脏与洗膜时是否污染等情况有关
还有些一抗就有非特异性背景
建议换BSA试试

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谢谢老师解答。还有个问题，抗体用TBST稀释会不会影响结果？为什么我用TBST稀释一抗时能做出结果，但用牛奶稀释一抗却没有结果出来了呢？
再次感谢~

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-5 17:33

背景脏与洗膜时是否污染等情况有关
还有些一抗就有非特异性背景
建议换BSA试试

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谢谢老师解答。还有个问题，抗体用TBST稀释会不会影响结果？为什么我用TBST稀释一抗时能做出结果，但用牛奶稀释一抗却没有结果出来了呢？
再次感谢~

作者: bamboo16 时间: 2013-3-5 17:34

您好，我进实验室不久，老师让做WB，我最后NC膜用DAB染色试剂盒染出了条带，但是条带非常粗，别人的是一条接一条，我有点像一小块接一小块，请问我有可能是哪个地方出了问题.

作者: NBA 时间: 2013-3-5 17:34

您好，我进实验室不久，老师让做WB，我最后NC膜用DAB染色试剂盒染出了条带，但是条带非常粗，别人的是一条接一条，我有点像一小块接一小块，请问我有可能是哪个地方出了问题.

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减小上样量试试

作者: kuohao17 时间: 2013-3-5 17:35

老师您好，谢谢您最近的指导。这是我今天曝的片子不知道什么原因为什么第一个空和第三个孔会成这样，只有半个。是不是我加ECL不均匀导致的啊。还有我的一抗浓度是1：500.二抗1;5000.,我还需要调整抗体浓度不需要。一抗我用得santa cruz的多克隆抗体

图片附件: 27171087.jpg (2013-3-5 17:35, 4.4 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15083

作者: am10 时间: 2013-3-5 17:35

最近在做小分子量蛋白（26kd)一直都是白版，而作大分子量可以做出来，请问这个分子量转膜条件怎样呢，我用90V电压转30分钟左右出不来，以前出来过，最近总是做不出来。

作者: gogo 时间: 2013-3-5 17:40

最近在做小分子量蛋白（26kd)一直都是白版，而作大分子量可以做出来，请问这个分子量转膜条件怎样呢，我用90V电压转30分钟左右出不来，以前出来过，最近总是做不出来。

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样品是否降解？
抗体、样品冻融没有？

作者: flower-201 时间: 2013-3-5 17:40

，我的目的蛋白为260k,在转膜后（湿转，300ma,3h),会出现纵型条带。这是为什么？
2，我的目的蛋白为核蛋白，用裂解液提取总蛋白分析，总是感觉核内的蛋白提取不好。有没有更好的方法提取核蛋白呢？（看过桨、核蛋白提取液说明，写着并不适合冷冻的组织，而我的恰恰是冷冻组织。）

图片附件: 43787369.jpg (2013-3-5 17:40, 9.06 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15084

作者: orangecake 时间: 2013-3-5 17:41

样品没有问题的，用同一批样本同时跑两个分子量，一大一小，大的可以跑出来，小的就是白板，很奇怪

作者: H2O 时间: 2013-3-5 17:41

请问版主:western blot胶片用多少ＤＰＩ进行扫描较好？存成ＴＩＦ格式好吗？谢谢！！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-5 17:43

版主，我是一个超级菜鸟，做了4次WB，除了第一次有条带，后面都没有，曝光就是白板。我想问一下我应该从哪些地方找原因。我是细胞提的蛋白，用的2*SDS-PAGE loading buffer（师兄教的）。液体也是师兄他们之前配的，蛋白大小60，42，20，转膜时间200mA，1小时10分。
请指教，谢谢！

作者: 8s5g 时间: 2013-3-5 17:43

老师你好，请教一个问题，困扰很久了。我估计是孵抗体的时候边上没有孵到，导致边上的条带老出不来，有什么好方法可以避免这个问题么？谢谢~~

作者: october7 时间: 2013-3-5 17:44

老师你好：
我刚开始准备实验我要测得是分子量200KD的大鼠脑组织的分泌蛋白，我该怎么提蛋白是直接买裂解液匀浆就做还是有其他的要求？还有就是我要提200kd的蛋白应该怎么配胶还有在跑胶和转膜时应该怎么摸条件啊时间，电压，电流？如果我要加内参只有26KD左右那不是要像您说的剪成两块胶分别转膜啊？

作者: ero11 时间: 2013-3-5 17:44

求助：
　　目的蛋白分子量为１６ＫＤ和２３ＫＤ，80/120v恒压电泳，转膜用的是biorad的湿转仪，恒流２００mＡ转膜５０分钟，用的是ＰＶＤＦ膜，转完后可以在膜上看到marker，但是最后目的蛋白条带没有出来。有没有可能是转膜的时间太长，或者转膜条件不合适，目的蛋白转过丢失了？

作者: 04906 时间: 2013-3-5 17:46

我的蛋白大小是：21kd,26kd,34kd,42kd,53kd,55kd。
问题：
1. 是否可以用0.45um PVDF膜转？还是需要用0.22um PVDF膜转21kd和26kd?
2. 我们实验室只能湿转，请问转膜条件该如何选择合适？
3. 用12%的SDS-PAGE是否就可以了?
4. 蛋白封闭的时间选择多少合适，希望给个参考？
谢谢！

作者: wood533 时间: 2013-3-5 17:47

老师好，我现在做足细胞培养，提取蛋白。因为培养肾足细胞是要先铺胶原，促进足细胞足突伸出。提取蛋白后，不知道是不是胶原干扰，我上样量是60微克，可是用考马斯亮蓝染胶发现条带很模糊。湿转膜条件100伏，转膜时间1.5小时，用丽春红染后，蛋白条带很淡。但是我用120微克上样量时，相同的转膜条件，能做出来。现在我怀疑我抽提蛋白有问题。我是在10厘米的大皿里养细胞的，加250微升蛋白裂解液，2.5微升蛋白酶抑制剂。我怀疑以下三个可能有问题1.我加了蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂后，由于加的量少，不能铺满皿底，导致细胞干了2.我在冰上刮下细胞的时间太长3.我加入buffer后。没有混匀就煮了，变性不彻底。请各位牛人支招。谢谢。

作者: kulee 时间: 2013-3-5 17:48

请问各位大侠，我的目的蛋白分子量是180kDa，浓缩胶浓度大概多少比较合适。之前用了5％的效果感觉不是很好，如果3%的或4％的怎么配制呢？

作者: yonger 时间: 2013-3-5 17:49

请问加了上样缓冲液后加热变性时间为15min，对westen有什么大的影响吗？谢谢。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-6 10:32

我目的蛋白约80KD，20mA湿转140分钟，仍然没转上（丽春红染膜无条带，卡马斯染胶有很多条带），但是相应分子量的MAKER却转上的。请教一下：为什么会出现MAKER转上，相应的蛋白却没转上？是否需要继续延长转膜时间？谢谢。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-6 10:32

是200mA，打错了。不好意思。

作者: kuaizige 时间: 2013-3-6 10:32

版主你好，我的膜剪成两半内参和目的分开显的。结果内参那张膜上每个泳道居然有两、三道条带，背景很干净。目的那张不均匀的黑，没有条带。内参GAPDH和目的都是santa的，内参不带HRP，内参和目的用的同一种二抗。内参和目的一抗1：500，二抗1：5000，我想问：
1，内参那张怎么会有多条带呢
2，背景为什么一张干净一张黑呢，洗膜时间和抗体浓度都一样的，
3，我目的21KD，转膜半干转，恒压15V，24分钟和半小时都用过，立春红染膜没明显条带，但marker15KD,25KD有显示，是目的没转上还是转过了呢；内参那张染膜都有条带，不是说分子量越小越容易转上吗，为什么大的转上了，小的却没有呢
谢谢

作者: DNA 时间: 2013-3-6 10:33

1，我的目的蛋白为260k,在转膜后（湿转，300ma,3h),会出现纵型条带。这是为什么？
2，我的目的蛋白为核蛋白，用裂解液提取总蛋白分析，总是感觉核内的蛋白提取不好。有没有更好的方法提取核蛋白呢？（看过桨、核蛋白提取液说明，写着并不适合冷冻的组织，而我的恰恰是冷冻组织。）

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冷冻保存的组织我做过
可以提取核蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:34

请问版主:western blot胶片用多少ＤＰＩ进行扫描较好？存成ＴＩＦ格式好吗？谢谢！！

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分辨率高一些的扫描仪扫描就可以
Tif格式比较大
当然可以

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:36

版主，我是一个超级菜鸟，做了4次WB，除了第一次有条带，后面都没有，曝光就是白板。我想问一下我应该从哪些地方找原因。我是细胞提的蛋白，用的2*SDS-PAGE loading buffer（师兄教的）。液体也是师兄他们之前配的，蛋白大小60，42，20，转膜时间200mA，1小时10分。
请指教，谢谢！

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中间无任何不同步骤？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:36

老师你好，请教一个问题，困扰很久了。我估计是孵抗体的时候边上没有孵到，导致边上的条带老出不来，有什么好方法可以避免这个问题么？谢谢~~

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加大抗体孵育体系

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:42

老师你好：
我刚开始准备实验我要测得是分子量200KD的大鼠脑组织的分泌蛋白，我该怎么提蛋白是直接买裂解液匀浆就做还是有其他的要求？还有就是我要提200kd的蛋白应该怎么配胶还有在跑胶和转膜时应该怎么摸条件啊时间，电压，电流？如果我要加内参只有26KD左右那不是要像您说的剪成两块胶分别转膜啊？
~~~~谢谢你这么久来辛苦的回答我们这些菜鸟的问题！

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1、蛋白名称是什么？查找相关的文献看别人WB做的如何
2、建议用梯度胶，可以解决大小分子量问题

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:44

求助：
　　目的蛋白分子量为１６ＫＤ和２３ＫＤ，80/120v恒压电泳，转膜用的是biorad的湿转仪，恒流２００mＡ转膜５０分钟，用的是ＰＶＤＦ膜，转完后可以在膜上看到marker，但是最后目的蛋白条带没有出来。有没有可能是转膜的时间太长，或者转膜条件不合适，目的蛋白转过丢失了？

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转膜完成后请用丽春红进行转膜情况的确认

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:44

我的蛋白大小是：21kd,26kd,34kd,42kd,53kd,55kd。
问题：
1. 是否可以用0.45um PVDF膜转？还是需要用0.22um PVDF膜转21kd和26kd?
2. 我们实验室只能湿转，请问转膜条件该如何选择合适？
3. 用12%的SDS-PAGE是否就可以了?
4. 蛋白封闭的时间选择多少合适，希望给个参考？
谢谢！

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1、0.45um膜可以
2、湿转 300mA 1h
3、12%可以
4、封闭一般室温30min足够

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:46

老师好，我现在做足细胞培养，提取蛋白。因为培养肾足细胞是要先铺胶原，促进足细胞足突伸出。提取蛋白后，不知道是不是胶原干扰，我上样量是60微克，可是用考马斯亮蓝染胶发现条带很模糊。湿转膜条件100伏，转膜时间1.5小时，用丽春红染后，蛋白条带很淡。但是我用120微克上样量时，相同的转膜条件，能做出来。现在我怀疑我抽提蛋白有问题。我是在10厘米的大皿里养细胞的，加250微升蛋白裂解液，2.5微升蛋白酶抑制剂。我怀疑以下三个可能有问题1.我加了蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂后，由于加的量少，不能铺满皿底，导致细胞干了2.我在冰上刮下细胞的时间太长3.我加入buffer后。没有混匀就煮了，变性不彻底。请各位牛人支招。谢谢。

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胶原没有事先用PBS洗掉啊

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:46

老师，问个为问题啊，做14KD的目标蛋白（BDNF)，GAPDH做内参，用0.22的膜，湿转，大概需要多长时间啊，多大的电流啊，

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这个蛋白我做过

湿转 300mA 30min足够

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:50

请问各位大侠，我的目的蛋白分子量是180kDa，浓缩胶浓度大概多少比较合适。之前用了5％的效果感觉不是很好，如果3%的或4％的怎么配制呢？

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可以用4%

或者用梯度胶
延长电泳时间

作者: NBA 时间: 2013-3-6 10:56

我目的蛋白约80KD，20mA湿转140分钟，仍然没转上（丽春红染膜无条带，卡马斯染胶有很多条带），但是相应分子量的MAKER却转上的。请教一下：为什么会出现MAKER转上，相应的蛋白却没转上？是否需要继续延长转膜时间？谢谢。

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300mA 1h30min

作者: NBA 时间: 2013-3-6 11:04

版主你好，我的膜剪成两半内参和目的分开显的。结果内参那张膜上每个泳道居然有两、三道条带，背景很干净。目的那张不均匀的黑，没有条带。内参GAPDH和目的都是santa的，内参不带HRP，内参和目的用的同一种二抗。内参和目的一抗1：500，二抗1：5000，我想问：
1，内参那张怎么会有多条带呢
2，背景为什么一张干净一张黑呢，洗膜时间和抗体浓度都一样的，
3，我目的21KD，转膜半干转，恒压15V，24分钟和半小时都用过，立春红染膜没明显条带，但marker15KD,25KD有显示，是目的没转上还是转过了呢；内参那张染膜都有条带，不是说分子量越小越容易转上吗，为什么大的转上了，小的却没有呢
谢谢

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转膜时间短了
我对用恒压转膜不了解，一般都是恒流
丽春红染色没有明显条带说明蛋白上样量较少

作者: caihong 时间: 2013-3-6 11:09

这个蛋白我做过

湿转 300mA 30min足够

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呵呵，谢谢老师啊，多嘴一下下，那么转膜液中的甲醇和SDS的比例又是多少呢？

作者: caihong 时间: 2013-3-6 11:09

呵呵，谢谢老师啊，多嘴一下下，那么转膜液中的甲醇和SDS的比例又是多少呢？

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0.01%SDS
甲醇20%

作者: 831226 时间: 2013-3-6 11:10

老师，我做的蛋白主要是表达在膜上的，实验中发现处理后该基因的mRNA水平上调了，但是总蛋白做WB却是下调的，而用流式检测该蛋白膜表面部分时又是上调的，请问这可能是什么原因？

作者: one 时间: 2013-3-6 11:10

老师好，我现在做足细胞培养，提取蛋白。因为培养肾足细胞是要先铺胶原，促进足细胞足突伸出。提取蛋白后，不知道是不是胶原干扰，我上样量是60微克，可是用考马斯亮蓝染胶发现条带很模糊。湿转膜条件100伏，转膜时间1.5小时，用丽春红染后，蛋白条带很淡。但是我用120微克上样量时，相同的转膜条件，能做出来。现在我怀疑我抽提蛋白有问题。我是在10厘米的大皿里养细胞的，加250微升蛋白裂解液，2.5微升蛋白酶抑制剂。我怀疑以下三个可能有问题1.我加了蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂后，由于加的量少，不能铺满皿底，导致细胞干了2.我在冰上刮下细胞的时间太长3.我加入buffer后。没有混匀就煮了，变性不彻底。请各位牛人支招。谢谢。

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胶原没有事先用PBS洗掉啊
老师，我一般是用PBS 洗两遍的

作者: one 时间: 2013-3-6 11:13

老师我转膜时候条带模糊又哪些原因啊？蛋白跑胶用考马斯蓝染过，蛮好的。

作者: one 时间: 2013-3-6 11:13

今天转膜后用丽春红染膜（足够长时间）都没见条带，本来准备放弃了，结果膜晾干了却逐渐出现条带了。实验室一老师也说以前发现过这种情况，具体原因他也解释不清楚。所以想请教一下方版主对此有何高见？

作者: summerxx 时间: 2013-3-6 11:15

老师你好！我想请教一个问题：用5%的TBST脱脂奶粉孵育一抗，今天比平常多孵育了有四个小时，到下午发现奶粉都变成絮状的，一片片，今晚曝光发现没有东西。平常都没有问题的，脱脂奶粉和TBST都是新配的呀，请NBA帮忙看看。不胜感激！

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-6 11:15

您好！我的MAKER最近两次跑电泳时条带挺清晰的，但是转膜后胶上没有条带，膜上只有很微弱的条带，几乎看不清。不知是怎么回事？孵抗体后，内参条带能出来。MARKER加了5ul。

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-6 11:20

以前做实验的时候，湿转100v（电流230~280mA），90min，用立春红染后，效果非常好

现在却发现问题很多：

1. 100v转膜，电流倒是差不多，45min就已经转过头了，垫两张膜就能看到第二张膜上也有蛋白了，而且25kd以下的条带几乎没有，连marker也没了。
2. 同样的配方，以前立春红染1min，结合的很牢了。现在3min也结合不大牢，水里稍微晃两下，浅的带就没颜色了。

注：用的是biorad的mini prot装置，膜是0.45NC，以前和现在都是一样的。

作者: october7 时间: 2013-3-6 11:21

版主您好，问个很菜的问题，如果用weatern检测原代细胞的蛋白含量，每个标本的细胞量是不是一定要相同，结果比较才有意义，也就是说细胞量大标本（如1x107）的会比细胞量小的标本（5x106）的结果大，谢谢，见笑了

作者: IAM007 时间: 2013-3-6 11:25

版主你好，前面看到你很多的精彩解答，给我们这些困惑者莫大的帮助，太感谢你了！
NBA老师，我刚刚开始做WB，向您请教一些小问题
1.我蛋白的上样量是40ug,上样体积有的只有4ul,会不会因为体积太小有影响啊？
2.我的一个目的蛋白开始两次都做出来了，可是后来这两次都没有做出来，上样体积加大了，抗体浓度也加大了，还是没有做出来，郁闷死我了？不知道可能原因是什么啊？难道就降解了？我是蛋白变性后放到-80冰箱的
3.我是组织胞浆蛋白与胞核蛋白分开提取的，蛋白量比较少，裂解液也是自己配取的，不知道自己的提取过程有没有问题
我的提取步骤大概是这样的：
组织PBS洗涤后，加入适量A液，匀浆研磨，冰上膨胀裂解15min，之后震荡，12000r/min,离心10min,所得上清即为胞浆蛋白
加入30ulB液，继续冰上裂解20min,剧烈震荡，15000r/min,离心20min,4°，取上清，即为胞核蛋白

A液：10mM kcl 200ul,10mM Hepes 2ml;0.1mM EDTA 20ul;1.5mM Mgcl,1.2ml;1mM DTT,200UL;0.5mM PMSF,100ul;ddH2O 16.28ml 1%的磷酸酶抑制剂
请版主帮我分析一下，可能是哪些原因啊？谢谢

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-6 11:26

请问各位同仁，NC膜能洗脱然后重新孵育二抗吗？和PVDF膜相比那种更适合于洗脱？谢谢

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-6 11:27

版主你好！我想问个小问题，我做western用的是自己制备的一抗，同时用GAPDH做内参，一起封闭的，但是GAPDH显影还好（挺干净的），而我自己的却有好多杂带（背景很差），是抗体稀释倍数的问题吗？还有以前提细胞中蛋白做western很好过，但现在提组织中的蛋白实验，会不会有区别？
我的步骤是：半干转40mA30min，5%脱脂奶粉封闭1.5小时，一抗孵育1.5小时（自制1:10和1:20稀释都试过），洗膜，二抗孵育50min（1:1000稀释），洗膜，bcip/nbt显影。（一抗倒是反复冻融过会不会有影响呀？）

万分期待版主回答啊！！！谢谢~

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-6 11:27

请教各位高手，加了loading buffer变性后的组织，能否用来蛋白定量？

作者: wood533 时间: 2013-3-6 11:28

您好版主，我要做大鼠脊髓的 bdnf（14kda），nt-3（35kda），ngf（13kda），想请教这么小的蛋白如何能够更好的出结果？因为听说小蛋白不好出。条件上有没有要求呢？这里实验室机器只能设定电压，不能设定电流，多谢

作者: any333 时间: 2013-3-6 11:28

版主您好，最近对处理过的同一蛋白用WB测总蛋白和流式测膜蛋白结果相反，总蛋白下降而膜蛋白上调，该蛋白膜上部分约占总的20%，请问这可能是什么原因？另：目前检测膜蛋白的方法有哪一些？谢谢！

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-6 11:29

我现在在做wb，就做内参actin，可是没做出来。具体步骤如下，大家帮忙分析一下那个地方有问题：
1。 5%浓缩胶 80v 30min
2. 12%分离胶 120 1h-1。5h
3。湿转，120v，1.5h，预染marker转到膜上很清晰漂亮，膜用立春红染后，可看到蛋白条带；胶用考染后，未见条带，说明蛋白转到膜上了吧？
4。室温封闭2h，封闭液配制：20%tween 24ul+0.5g BSA+10mlddH2O，现配现用的，未用完的放4度保存，一周内用完。
5。TBS或PBS洗，10min，3次
6。一抗，4度过夜，actin 1:1000 （稀释好的一抗放在4度保存，用后单独回收）
7。TBS或PBS洗，10min，3次
8。二抗室温2h
9。TBS或PBS洗，10min，3次
10。ecl显色后直接在那个叫xx的仪器下曝光照相。（不用压片的）

结果：第一次有条带，但不清晰，背景深；
第二次什么也没有
是什么原因，actin都没做出来呢？想请教：
1、稀释后的一抗和二抗应该如何保存？
2、为何大家做wb时，要么封闭过夜，要么一抗过夜，我算了时间，如果早上早点开始跑胶的话，室温封闭2h，一抗室温2h，二抗室温2h后，时间上完全可以在晚上曝光，得到结果，而我所认识的人基本都要花一天半的时间做wb，我们不可以缩短时间么？（ps：在实验者时间允许的情况下）
3.用TBS 或PBS洗膜有区别么？

谢谢啦！

作者: october7 时间: 2013-3-6 11:29

请教一下版主，我们最近做WB，样品在下胶中都连成了一条线，在加入上胶时已经把水尽量吸干净了，所以可以排除是水的缘故。我们跑过12%和10%的胶都是如此。想问一下考虑是什么原因造成的。

作者: NBA 时间: 2013-3-6 14:44

老师，我做的蛋白主要是表达在膜上的，实验中发现处理后该基因的mRNA水平上调了，但是总蛋白做WB却是下调的，而用流式检测该蛋白膜表面部分时又是上调的，请问这可能是什么原因？

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做WB时做内参校正了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 14:45

老师好，我现在做足细胞培养，提取蛋白。因为培养肾足细胞是要先铺胶原，促进足细胞足突伸出。提取蛋白后，不知道是不是胶原干扰，我上样量是60微克，可是用考马斯亮蓝染胶发现条带很模糊。湿转膜条件100伏，转膜时间1.5小时，用丽春红染后，蛋白条带很淡。但是我用120微克上样量时，相同的转膜条件，能做出来。现在我怀疑我抽提蛋白有问题。我是在10厘米的大皿里养细胞的，加250微升蛋白裂解液，2.5微升蛋白酶抑制剂。我怀疑以下三个可能有问题1.我加了蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂后，由于加的量少，不能铺满皿底，导致细胞干了2.我在冰上刮下细胞的时间太长3.我加入buffer后。没有混匀就煮了，变性不彻底。请各位牛人支招。谢谢。

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胶原没有事先用PBS洗掉啊
老师，我一般是用PBS 洗两遍的

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1、60ug的上样量染色还模糊的话说明蛋白定量不准确
2、10cm的培养皿加250ul裂解液不多，我一般是10cm培养皿长满加1ml裂解液

作者: NBA 时间: 2013-3-6 14:45

老师我转膜时候条带模糊又哪些原因啊？蛋白跑胶用考马斯蓝染过，蛮好的。

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转膜时温度太高（主要是湿转）
注意降温

作者: NBA 时间: 2013-3-6 14:45

今天转膜后用丽春红染膜（足够长时间）都没见条带，本来准备放弃了，结果膜晾干了却逐渐出现条带了。实验室一老师也说以前发现过这种情况，具体原因他也解释不清楚。所以想请教一下方版主对此有何高见？

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简单
换丽春红
或者有多余泳道的膜用考马斯亮蓝染一下

作者: NBA 时间: 2013-3-6 14:57

你好！我想请教一个问题：用5%的TBST脱脂奶粉孵育一抗，今天比平常多孵育了有四个小时，到下午发现奶粉都变成絮状的，一片片，今晚曝光发现没有东西。平常都没有问题的，脱脂奶粉和TBST都是新配的呀，请fangweibin119帮忙看看。不胜感激！

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室温封闭时间过长
奶粉变质了
在这之前你做这个蛋白结果如何？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:06

您好！我的MAKER最近两次跑电泳时条带挺清晰的，但是转膜后胶上没有条带，膜上只有很微弱的条带，几乎看不清。不知是怎么回事？孵抗体后，内参条带能出来。MARKER加了5ul。

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marker上样量有点少
10ul

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:07

以前做实验的时候，湿转100v（电流230~280mA），90min，用立春红染后，效果非常好

现在却发现问题很多：

1. 100v转膜，电流倒是差不多，45min就已经转过头了，垫两张膜就能看到第二张膜上也有蛋白了，而且25kd以下的条带几乎没有，连marker也没了。
2. 同样的配方，以前立春红染1min，结合的很牢了。现在3min也结合不大牢，水里稍微晃两下，浅的带就没颜色了。

注：用的是biorad的mini prot装置，膜是0.45NC，以前和现在都是一样的。

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1、0.45um的膜，转膜后第二张膜上有条带，很正常
2、丽春红你用什么配方？
3、对于恒压转膜我没有经验，我是用恒流的
4、你的目的蛋白分子量多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:07

版主您好，问个很菜的问题，如果用weatern检测原代细胞的蛋白含量，每个标本的细胞量是不是一定要相同，结果比较才有意义，也就是说细胞量大标本（如1x107）的会比细胞量小的标本（5x106）的结果大，谢谢，见笑了

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不能做到细胞量一致的
最后用内存来校正蛋白上样量就行

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:08

版主你好，前面看到你很多的精彩解答，给我们这些困惑者莫大的帮助，太感谢你了！
NBA老师，我刚刚开始做WB，向您请教一些小问题
1.我蛋白的上样量是40ug,上样体积有的只有4ul,会不会因为体积太小有影响啊？
2.我的一个目的蛋白开始两次都做出来了，可是后来这两次都没有做出来，上样体积加大了，抗体浓度也加大了，还是没有做出来，郁闷死我了？不知道可能原因是什么啊？难道就降解了？我是蛋白变性后放到-80冰箱的
3.我是组织胞浆蛋白与胞核蛋白分开提取的，蛋白量比较少，裂解液也是自己配取的，不知道自己的提取过程有没有问题
我的提取步骤大概是这样的：
组织PBS洗涤后，加入适量A液，匀浆研磨，冰上膨胀裂解15min，之后震荡，12000r/min,离心10min,所得上清即为胞浆蛋白
加入30ulB液，继续冰上裂解20min,剧烈震荡，15000r/min,离心20min,4°，取上清，即为胞核蛋白

A液：10mM kcl 200ul,10mM Hepes 2ml;0.1mM EDTA 20ul;1.5mM Mgcl,1.2ml;1mM DTT,200UL;0.5mM PMSF,100ul;ddH2O 16.28ml 1%的磷酸酶抑制剂
请版主帮我分析一下，可能是哪些原因啊？谢谢

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1、你的蛋白浓度很高了，是不是组织蛋白？蛋白定量用什么方法？
2、蛋白变性后建议分装保存
3、前面两次能做出来，说明蛋白提取应该没有问题（如果做的是同一种蛋白的话）
4、A液、B液标的不清楚啊

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:08

请问各位同仁，NC膜能洗脱然后重新孵育二抗吗？和PVDF膜相比那种更适合于洗脱？谢谢

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都可以
PVDF膜机械强度高一些

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:09

版主你好！我想问个小问题，我做western用的是自己制备的一抗，同时用GAPDH做内参，一起封闭的，但是GAPDH显影还好（挺干净的），而我自己的却有好多杂带（背景很差），是抗体稀释倍数的问题吗？还有以前提细胞中蛋白做western很好过，但现在提组织中的蛋白实验，会不会有区别？
我的步骤是：半干转40mA30min，5%脱脂奶粉封闭1.5小时，一抗孵育1.5小时（自制1:10和1:20稀释都试过），洗膜，二抗孵育50min（1:1000稀释），洗膜，bcip/nbt显影。（一抗倒是反复冻融过会不会有影响呀？）

万分期待版主回答啊！！！谢谢~

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用BSA封闭试试
做几个不同的一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:09

请教各位高手，加了loading buffer变性后的组织，能否用来蛋白定量？

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变性后的组织？
怎么定量？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:10

您好版主，我要做大鼠脊髓的 bdnf（14kda），nt-3（35kda），ngf（13kda），想请教这么小的蛋白如何能够更好的出结果？因为听说小蛋白不好出。条件上有没有要求呢？这里实验室机器只能设定电压，不能设定电流，多谢

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呵呵
BDNF我做过
恒流，半干，1.2A每平方厘米膜面积，转膜30min
15% 分离胶

35K的转膜40-50min

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:11

版主您好，最近对处理过的同一蛋白用WB测总蛋白和流式测膜蛋白结果相反，总蛋白下降而膜蛋白上调，该蛋白膜上部分约占总的20%，请问这可能是什么原因？另：目前检测膜蛋白的方法有哪一些？谢谢！

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WB做内参了？
流式如何校正？

作者: loli 时间: 2013-3-6 15:11

呵呵
BDNF我做过
恒流，半干，1.2A每平方厘米膜面积，转膜30min
15% 分离胶

35K的转膜40-50min

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非常感谢版主给予热心解答，
但是我们没有干转，只有湿转，而且是恒压的
bdnf（14kda），nt-3（35kda），ngf（13kda）
所以想请问：湿转，电压多少？多长时间？
可否用0.45um的膜呢？（因为现在只有0.45）

作者: loli 时间: 2013-3-6 15:12

我现在在做wb，就做内参actin，可是没做出来。具体步骤如下，大家帮忙分析一下那个地方有问题：
1。 5%浓缩胶 80v 30min
2. 12%分离胶 120 1h-1。5h
3。湿转，120v，1.5h，预染marker转到膜上很清晰漂亮，膜用立春红染后，可看到蛋白条带；胶用考染后，未见条带，说明蛋白转到膜上了吧？
4。室温封闭2h，封闭液配制：20%tween 24ul+0.5g BSA+10mlddH2O，现配现用的，未用完的放4度保存，一周内用完。
5。TBS或PBS洗，10min，3次
6。一抗，4度过夜，actin 1:1000 （稀释好的一抗放在4度保存，用后单独回收）
7。TBS或PBS洗，10min，3次
8。二抗室温2h
9。TBS或PBS洗，10min，3次
10。ecl显色后直接在那个叫xx的仪器下曝光照相。（不用压片的）

结果：第一次有条带，但不清晰，背景深；
第二次什么也没有
是什么原因，actin都没做出来呢？想请教：
1、稀释后的一抗和二抗应该如何保存？
2、为何大家做wb时，要么封闭过夜，要么一抗过夜，我算了时间，如果早上早点开始跑胶的话，室温封闭2h，一抗室温2h，二抗室温2h后，时间上完全可以在晚上曝光，得到结果，而我所认识的人基本都要花一天半的时间做wb，我们不可以缩短时间么？（ps：在实验者时间允许的情况下）
3.用TBS 或PBS洗膜有区别么？

谢谢啦！

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1、一抗是那个厂家的？
2、一抗第二次你用回收的？
3、做磷酸化蛋白的时候用TBS
4、目的蛋白一抗孵育过夜效果会好一些

作者: loli 时间: 2013-3-6 15:12

请教一下版主，我们最近做WB，样品在下胶中都连成了一条线，在加入上胶时已经把水尽量吸干净了，所以可以排除是水的缘故。我们跑过12%和10%的胶都是如此。想问一下考虑是什么原因造成的。

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没理解你什么意思
请说的详细点

作者: wood533 时间: 2013-3-6 15:18

非常感谢版主给予热心解答，
但是我们没有干转，只有湿转，而且是恒压的
bdnf（14kda），nt-3（35kda），ngf（13kda）
所以想请问：湿转，电压多少？多长时间？

作者: DONT 时间: 2013-3-6 15:21

版主您好，最近对处理过的同一蛋白用WB测总蛋白和流式测膜蛋白结果相反，总蛋白下降而膜蛋白上调，该蛋白膜上部分约占总的20%，请问这可能是什么原因？另：目前检测膜蛋白的方法有哪一些？谢谢！
fangweibin119 wrote:
WB做内参了？
流式如何校正？

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WB内参是一致的，流式主要是和同一批次未处理的细胞比，用平均荧光强度判断

作者: NBA 时间: 2013-3-6 15:22

版主您好，最近对处理过的同一蛋白用WB测总蛋白和流式测膜蛋白结果相反，总蛋白下降而膜蛋白上调，该蛋白膜上部分约占总的20%，请问这可能是什么原因？另：目前检测膜蛋白的方法有哪一些？谢谢！

WB内参是一致的，流式主要是和同一批次未处理的细胞比，用平均荧光强度判断

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如果用流式来做半定量的话没有校正肯定不行
我刚才也咨询了一下我们这做流式的
不好校正

作者: utt0989 时间: 2013-3-6 15:23

老师，您好！
做western blot有段时间了，现在出现了一个让我非常疑惑的事情：
我的目标条带（80kd）跑得还行，但是内参（GAPDH 37kd）条带却时好时坏，坏的时候如下图，好的时候跟目标条带一样是整齐的。条件基本没变过。

胶是10%的，1.5mm板上样量12ul，电泳80v-150v（有时觉得上样量太大了，压不成一条直线，干脆150v-200v的跑），大概跑60-70分钟，转膜80v2h，封闭5%脱脂牛奶2h，一抗4度过夜，二抗室温1h，ECL发光5min。

请老师指导，谢谢。

图片附件: 64920306.jpg (2013-3-6 15:23, 35.19 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15087

作者: utt0989 时间: 2013-3-6 15:23

接上文：
还有一个目标蛋白分子量是130kd，用的是millipore的多抗，8%的胶，其他条件如上，结果一直是多条带或者无特异蛋白（在130kd附近），如图：
请老师指导：

图片附件: 32579669.jpg (2013-3-6 15:23, 30.07 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15088

作者: abc816 时间: 2013-3-6 15:24

版主，你好，我想咨询一下WB的一些问题，我做WB快一个月了，内参和目的蛋白都显示出来了，但是感觉图不好看，好像不能用在论文里面，特来求助。
图一是我的目的蛋白，一抗在博士德买的，是师姐留下来的，开封已经快一年了。说明书上写的分子量是35kd，用的是北京六一的仪器，湿转，200mA，1h。在两个条带中间的那个不是太清楚的应该是目的蛋白，但是上方和下方多有很多条带，我的一抗是单克隆的，不是多克隆的。我现在不是很清楚我需要注意什么问题，感觉好像在重复失败，很郁闷啊，先谢谢版主了。

图片附件: 12893502.snap.jpg (2013-3-6 15:24, 19.92 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15089

作者: abc816 时间: 2013-3-6 15:25

上学期做western时目的蛋白很深，这次提的东西，所有操作都一样，可是做出来的条带超浅，几乎看不见，可是内参还是差不多深的。不知道什么原因，量加大一倍也没什么效果。大家帮帮忙啊，看看什么原因。我的一批样要一个月才能出一次，不然上个月就白做了

图片附件: 39780662.jpg (2013-3-6 15:25, 6.67 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15090

作者: am10 时间: 2013-3-6 15:25

老师您好，我做的WB，刚开始用一抗1：100，二抗4000，蛋白封闭1小时，一抗过夜，二抗1小时，做出目的蛋白有杂带，之后牛奶封闭过夜后，跑的挺好，但重新提蛋白后，蛋白定量蛋白浓度挺高，20左右，用相同条件WB，目的蛋白出不了，每次都是一片白，或者出一两条带，我用立春红染膜，蛋白基本上都转上去了
用卡玛斯染胶挺好，但我说呢、吗不出条带？？

作者: bring 时间: 2013-3-6 15:27

请问：我想跑个免疫血清的wb,请问我的样品前期要怎么处理？跟普通蛋白样品前期处理一样吗

作者: kuohao17 时间: 2013-3-6 15:56

您好！！我是新手刚刚做了3次western 都没有成功第一次做的时候转膜之后就出现了条带第二次和第三次均是没有目的条带背景混乱分子量是59-62KD 分离胶用12% 积层胶用的5% 细胞蛋白提取定量后没有进行稀释上样量为20ul 转膜为250mv 90min 一抗为1：500 二抗1：800 请问这是什么原因啊谢谢

作者: mimili_901 时间: 2013-3-6 15:58

请问：我最近做P-gp的western，细胞养了20天提取的，结果P-gp淡的看不见，就有几个样的看见一点点，条件和以前实验一样，量甚至上了之前的两倍。内参还是很漂亮的，可是我的目的蛋白怎么回事啊。这样是不是意味着一个月的实验白做了啊，郁闷。希望大家提提建议啊，做P-gp的高人们有没有遇到过类似问题呢

作者: Ao7 时间: 2013-3-6 16:02

您好，我是一个做wb 的新手，很多东西都在摸索中前行，这里有一个很令我困扰的问题，想听一听您的见解。我是用作突触囊泡素(SYP)的一抗进行的实验，又用β-actin作为对照。
我们的目的蛋白(SYP)的分子量为40KD左右，但每次目的条带都不清楚，相反在72KD出现了一条非常清楚的蛋白条带，当时我们猜测可能是与SYP结构相似的蛋白——突触素1。然而，令我非常不解的是我们做β-actin的一抗实验后发现72KD处还是出现了非常清晰的条带。我非常困惑。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-6 16:04

我跑的230kd蛋白，上样量40ug，80V浓缩，160V跑胶，NC膜100V转3个小时，牛奶封闭，一抗4°过夜，二抗半小时，但是问什么转不出来呢，内参很好。请帮我分析一下，谢谢。

作者: greenbee 时间: 2013-3-6 16:05

老师好！有个奇怪的现象想请教一下！
我做的是人的胎盘组织，可能含血比较多，试过用冰预冷的PBS漂洗过再提取，但是提取的蛋白颜色总有些发红，因为胎盘是血窦组织，因此血液很难去除。蛋白提取的方法是按照文献推荐的方法,裂解液配置如下(RIPA: 40 mM TRIS-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X–100, 0.5%sodium deoxycholate, 0.2% SDS, and 1 mM PMSF)containing the protease inhibitor cocktail Complete.均浆后13000r，15min吸上清备WB。做的WB的抗体很多，有膜蛋白的，细胞核蛋白的，还有胞质的，但是很奇怪的是在55KD和25KD左右，总会出现很明显的条带。仅有1-2个抗体有特异的目的条带，不存在类似的55KD和25KD的杂带。一开始自己还以为是抗体的问题，但是为什么这么多抗体都不行呢，现在想是不是组织有什么特别的地方。询问了抗体公司的技术顾问，说是我的组织中含有IgG，在WB的过程中裂解成了IgG重链和IgG轻链，所以最后曝光的时候出现了55KD和25KD的杂带。不知道这样解释是不是合理。还有同样的组织那为什么有的抗体做出来就没有55KD的杂带呢，还有为什么不论二抗是兔还是鼠还是山羊，均会出现55KD的条带呢，难道人血中的IgG这么强大，和小鼠，山羊以及兔的IgG都高度同源？
是不是需要使用特殊的去血细胞的试剂盒？
还望老师予以答疑！不胜感激！

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-6 16:05

请问，OLR-1条带好显吗？我师姐说它本身在细胞里的表达量比较低，所以上样时要加大量。谢谢！

再，想问问，用抗体稀释液5%的和1%的对条带出现有影响吗？

再谢谢！

作者: dog002 时间: 2013-3-6 16:05

您好版主，最近做了三次WB，提的脊髓，裂解液购自博奥森，湿转100v，1小时，分子30多kda，转膜后丽春红染色都只有最起始那里的一个条带，试了三次都如此，而且今天换了样本还是如此，确定不是跑过了，因为放了两张膜，marker可以转上，郁闷至极，盼解

作者: orangecake 时间: 2013-3-6 16:06

做western blot效果不好，可能的原因有那些呢？请指导！

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:06

老师，您好！
做western blot有段时间了，现在出现了一个让我非常疑惑的事情：
我的目标条带（80kd）跑得还行，但是内参（GAPDH 37kd）条带却时好时坏，坏的时候如下图，好的时候跟目标条带一样是整齐的。条件基本没变过。

胶是10%的，1.5mm板上样量12ul，电泳80v-150v（有时觉得上样量太大了，压不成一条直线，干脆150v-200v的跑），大概跑60-70分钟，转膜80v2h，封闭5%脱脂牛奶2h，一抗4度过夜，二抗室温1h，ECL发光5min。

请老师指导，谢谢。

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1、上样量有点大
2、二抗的浓度可以调小一点
3、上面的图片中左边条带变弱了，ECL加的不好

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:07

版主，你好，我想咨询一下WB的一些问题，我做WB快一个月了，内参和目的蛋白都显示出来了，但是感觉图不好看，好像不能用在论文里面，特来求助。
图一是我的目的蛋白，一抗在博士德买的，是师姐留下来的，开封已经快一年了。说明书上写的分子量是35kd，用的是北京六一的仪器，湿转，200mA，1h。在两个条带中间的那个不是太清楚的应该是目的蛋白，但是上方和下方多有很多条带，我的一抗是单克隆的，不是多克隆的。我现在不是很清楚我需要注意什么问题，感觉好像在重复失败，很郁闷啊，先谢谢版主了。

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1、背景这么高肯定发文章看不清楚
2、怎么这么黑？是胶片曝光的吗？
3、调整一下二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:07

上学期做western时目的蛋白很深，这次提的东西，所有操作都一样，可是做出来的条带超浅，几乎看不见，可是内参还是差不多深的。不知道什么原因，量加大一倍也没什么效果。大家帮帮忙啊，看看什么原因。我的一批样要一个月才能出一次，不然上个月就白做了

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注意蛋白保存好啊
不行就放置在液氮中

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:08

老师您好，我做的WB，刚开始用一抗1：100，二抗4000，蛋白封闭1小时，一抗过夜，二抗1小时，做出目的蛋白有杂带，之后牛奶封闭过夜后，跑的挺好，但重新提蛋白后，蛋白定量蛋白浓度挺高，20左右，用相同条件WB，目的蛋白出不了，每次都是一片白，或者出一两条带，我用立春红染膜，蛋白基本上都转上去了
用卡玛斯染胶挺好，但我说呢、吗不出条带？？

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中间没换其它东西？
除了样品

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:13

您好！！我是新手刚刚做了3次western 都没有成功第一次做的时候转膜之后就出现了条带第二次和第三次均是没有目的条带背景混乱分子量是59-62KD 分离胶用12% 积层胶用的5% 细胞蛋白提取定量后没有进行稀释上样量为20ul 转膜为250mv 90min 一抗为1：500 二抗1：800 请问这是什么原因啊谢谢

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如果条件基本一致的应该不会出现这样的现象啊
有没有换什么东西？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:13

请问：我最近做P-gp的western，细胞养了20天提取的，结果P-gp淡的看不见，就有几个样的看见一点点，条件和以前实验一样，量甚至上了之前的两倍。内参还是很漂亮的，可是我的目的蛋白怎么回事啊。这样是不是意味着一个月的实验白做了啊，郁闷。希望大家提提建议啊，做P-gp的高人们有没有遇到过类似问题呢

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一抗活性降低
提高抗体浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:15

您好，我是一个做wb 的新手，很多东西都在摸索中前行，这里有一个很令我困扰的问题，想听一听您的见解。我是用作突触囊泡素(SYP)的一抗进行的实验，又用β-actin作为对照。
我们的目的蛋白(SYP)的分子量为40KD左右，但每次目的条带都不清楚，相反在72KD出现了一条非常清楚的蛋白条带，当时我们猜测可能是与SYP结构相似的蛋白——突触素1。然而，令我非常不解的是我们做β-actin的一抗实验后发现72KD处还是出现了非常清晰的条带。我非常困惑。

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样品或者缓冲液被污染了？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:22

我跑的230kd蛋白，上样量40ug，80V浓缩，160V跑胶，NC膜100V转3个小时，牛奶封闭，一抗4°过夜，二抗半小时，但是问什么转不出来呢，内参很好。请帮我分析一下，谢谢。

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多大分离胶？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:23

老师好！有个奇怪的现象想请教一下！
我做的是人的胎盘组织，可能含血比较多，试过用冰预冷的PBS漂洗过再提取，但是提取的蛋白颜色总有些发红，因为胎盘是血窦组织，因此血液很难去除。蛋白提取的方法是按照文献推荐的方法,裂解液配置如下(RIPA: 40 mM TRIS-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X–100, 0.5%sodium deoxycholate, 0.2% SDS, and 1 mM PMSF)containing the protease inhibitor cocktail Complete.均浆后13000r，15min吸上清备WB。做的WB的抗体很多，有膜蛋白的，细胞核蛋白的，还有胞质的，但是很奇怪的是在55KD和25KD左右，总会出现很明显的条带。仅有1-2个抗体有特异的目的条带，不存在类似的55KD和25KD的杂带。一开始自己还以为是抗体的问题，但是为什么这么多抗体都不行呢，现在想是不是组织有什么特别的地方。询问了抗体公司的技术顾问，说是我的组织中含有IgG，在WB的过程中裂解成了IgG重链和IgG轻链，所以最后曝光的时候出现了55KD和25KD的杂带。不知道这样解释是不是合理。还有同样的组织那为什么有的抗体做出来就没有55KD的杂带呢，还有为什么不论二抗是兔还是鼠还是山羊，均会出现55KD的条带呢，难道人血中的IgG这么强大，和小鼠，山羊以及兔的IgG都高度同源？
是不是需要使用特殊的去血细胞的试剂盒？
还望老师予以答疑！不胜感激！

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一抗、二抗一起作用会出现这样的情况

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:23

请问，OLR-1条带好显吗？我师姐说它本身在细胞里的表达量比较低，所以上样时要加大量。谢谢！

再，想问问，用抗体稀释液5%的和1%的对条带出现有影响吗？

再谢谢！

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什么抗体稀释液？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:24

您好版主，最近做了三次WB，提的脊髓，裂解液购自博奥森，湿转100v，1小时，分子30多kda，转膜后丽春红染色都只有最起始那里的一个条带，试了三次都如此，而且今天换了样本还是如此，确定不是跑过了，因为放了两张膜，marker可以转上，郁闷至极，盼解

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什么意思？
所有样品最后结果只有一个泳道有东西？

作者: 04906 时间: 2013-3-6 16:25

老师好！有个奇怪的现象想请教一下！
我做的是人的胎盘组织，可能含血比较多，试过用冰预冷的PBS漂洗过再提取，但是提取的蛋白颜色总有些发红，因为胎盘是血窦组织，因此血液很难去除。蛋白提取的方法是按照文献推荐的方法,裂解液配置如下(RIPA: 40 mM TRIS-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X–100, 0.5%sodium deoxycholate, 0.2% SDS, and 1 mM PMSF)containing the protease inhibitor cocktail Complete.均浆后13000r，15min吸上清备WB。做的WB的抗体很多，有膜蛋白的，细胞核蛋白的，还有胞质的，但是很奇怪的是在55KD和25KD左右，总会出现很明显的条带。仅有1-2个抗体有特异的目的条带，不存在类似的55KD和25KD的杂带。一开始自己还以为是抗体的问题，但是为什么这么多抗体都不行呢，现在想是不是组织有什么特别的地方。询问了抗体公司的技术顾问，说是我的组织中含有IgG，在WB的过程中裂解成了IgG重链和IgG轻链，所以最后曝光的时候出现了55KD和25KD的杂带。不知道这样解释是不是合理。还有同样的组织那为什么有的抗体做出来就没有55KD的杂带呢，还有为什么不论二抗是兔还是鼠还是山羊，均会出现55KD的条带呢，难道人血中的IgG这么强大，和小鼠，山羊以及兔的IgG都高度同源？
是不是需要使用特殊的去血细胞的试剂盒？
还望老师予以答疑！不胜感激！

一抗、二抗一起作用会出现这样的情况

继续请教老师，能不能具体解释下，一抗二抗一起作用？但是为什么大家的WB没有这样的情况？
遇到这样的情况，该如何解决呢？多谢

作者: plaa 时间: 2013-3-6 16:26

什么意思？
所有样品最后结果只有一个泳道有东西？

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是所有样品只有最近端一个条带，
确保膜没有转过，丽春红也加了甲醇试了，还是就那一个条带，marker全部条带都能转上

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:27

是所有样品只有最近端一个条带，
确保膜没有转过，丽春红也加了甲醇试了，还是就那一个条带，marker全部条带都能转上

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稀释抗体的体系有多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:28

老师好！有个奇怪的现象想请教一下！
我做的是人的胎盘组织，可能含血比较多，试过用冰预冷的PBS漂洗过再提取，但是提取的蛋白颜色总有些发红，因为胎盘是血窦组织，因此血液很难去除。蛋白提取的方法是按照文献推荐的方法,裂解液配置如下(RIPA: 40 mM TRIS-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X–100, 0.5%sodium deoxycholate, 0.2% SDS, and 1 mM PMSF)containing the protease inhibitor cocktail Complete.均浆后13000r，15min吸上清备WB。做的WB的抗体很多，有膜蛋白的，细胞核蛋白的，还有胞质的，但是很奇怪的是在55KD和25KD左右，总会出现很明显的条带。仅有1-2个抗体有特异的目的条带，不存在类似的55KD和25KD的杂带。一开始自己还以为是抗体的问题，但是为什么这么多抗体都不行呢，现在想是不是组织有什么特别的地方。询问了抗体公司的技术顾问，说是我的组织中含有IgG，在WB的过程中裂解成了IgG重链和IgG轻链，所以最后曝光的时候出现了55KD和25KD的杂带。不知道这样解释是不是合理。还有同样的组织那为什么有的抗体做出来就没有55KD的杂带呢，还有为什么不论二抗是兔还是鼠还是山羊，均会出现55KD的条带呢，难道人血中的IgG这么强大，和小鼠，山羊以及兔的IgG都高度同源？
是不是需要使用特殊的去血细胞的试剂盒？
还望老师予以答疑！不胜感激！

一抗、二抗一起作用会出现这样的情况

继续请教老师，能不能具体解释下，一抗二抗一起作用？但是为什么大家的WB没有这样的情况？
遇到这样的情况，该如何解决呢？多谢

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把组织用生理盐水或者PBS清洗干净

作者: PINK 时间: 2013-3-6 16:29

稀释抗体的体系有多少？

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转膜后就染了，还没有加抗体呢

作者: 00无名指00 时间: 2013-3-6 16:30

140KD蛋白，300毫安恒流转130分钟，转膜结束时缓冲液比较热，请问会对最终结果造成什么影响？是不是会使目的条带模糊，蛋白泳道的背景深。我在转膜槽内放了冰袋，还将整个转膜槽埋在冰中，可降温效果还是不满意，有什么好办法吗？可不可以在转膜过程中暂时中断，更换冰袋和预冷的缓冲液？这样会不会影响转膜效果？恳请指导，多谢！

作者: c86v 时间: 2013-3-6 16:31

各位老师好，这是我用目前实验室的条件进行的western结果。
实验条件：
1-普通玻璃板制胶，大约胶厚2-3mm；
2-制胶后在4度冰箱里，在保持湿度的情况下，保存了12小时
3-目的蛋白chop（gadd153）分子量29kd
4-采用0.22um pvdf膜转印。
5-5%脱脂牛奶封闭
6-ECL发光液。
最后出来的结果如下图，请各位老师帮忙分析结果，谢谢。
一抗兔的多抗
二抗羊抗兔辣根过氧化物igG

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:32

140KD蛋白，300毫安恒流转130分钟，转膜结束时缓冲液比较热，请问会对最终结果造成什么影响？是不是会使目的条带模糊，蛋白泳道的背景深。我在转膜槽内放了冰袋，还将整个转膜槽埋在冰中，可降温效果还是不满意，有什么好办法吗？可不可以在转膜过程中暂时中断，更换冰袋和预冷的缓冲液？这样会不会影响转膜效果？恳请指导，多谢！

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湿转是比较热的，没关系
140K蛋白转膜时间可以延长到2h30min
你这个条件也没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:34

各位老师好，这是我用目前实验室的条件进行的western结果。
实验条件：
1-普通玻璃板制胶，大约胶厚2-3mm；
2-制胶后在4度冰箱里，在保持湿度的情况下，保存了12小时
3-目的蛋白chop（gadd153）分子量29kd
4-采用0.22um pvdf膜转印。
5-5%脱脂牛奶封闭
6-ECL发光液。
最后出来的结果如下图，请各位老师帮忙分析结果，谢谢。
一抗兔的多抗
二抗羊抗兔辣根过氧化物igG

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先把SDS-PAGE电泳跑好

作者: yjf1026 时间: 2013-3-6 16:34

您好！！我是新手我的目的蛋白分子量为56KD，western 条件为分离胶用12% 积层胶用的5% 细胞蛋白提取定量后没有进行稀释上样量为20ul 转膜为250mv 90min 一抗为1：1000 二抗1：1000，之前曾经成功检测到分子量为52KD的蛋白，但是这次相同的实验条件下，曝光的结果是膜上所有的条带都看到了，没有特异性条带。
这是怎么回事呢？谢谢！

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-6 16:35

如果条件基本一致的应该不会出现这样的现象啊
有没有换什么东西？
后来做的时候换了东西actin 跑出来了但是背景有点脏今天又跑了一次结果整个膜都曝出来了上面的蛋白条带都曝出来了但是没有条带这是为什么啊

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-6 16:37

这是什么情况啊我明明是想回复的怎么出现这样的框框版主多包涵吧呵呵今天都遇见一些灵异事件了

作者: mimili_901 时间: 2013-3-6 16:37

您好版主，最近做了三次WB，提的脊髓，裂解液购自博奥森，湿转100v，1小时，分子30多kda，转膜后丽春红染色都只有最起始那里的一个条带，试了三次都如此，而且今天换了样本还是如此，确定不是跑过了，因为放了两张膜，marker可以转上，最后曝光时候也没有条带，郁闷至极，盼解

作者: xingyi08 时间: 2013-3-6 16:38

版主你好，小弟刚开始做WB不久，碰到了一个问题，就是目的蛋白的条带上或旁边有竖条的条带（见两张附图），不懂是怎么回事，我在同一张膜上做的内参除了孵育的一抗二抗与目的蛋白不一样外，其他的操作过程都是一摸一样的，内参曝光时从未出现那样的问题，希望帮忙分析下可能原因及解决办法，先谢过啦！
（第一张，左起第四条上）

图片附件: 15642861.jpg (2013-3-6 16:38, 38.29 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15092

作者: xingyi08 时间: 2013-3-6 16:38

(第二张,左起第三条上）

图片附件: 65701673.jpg (2013-3-6 16:38, 10.73 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15093

作者: popo520 时间: 2013-3-6 16:39

例外还有个比较菜的问题想问下版主，我用脱脂奶粉封闭后也用TBST洗了三次，因为感觉脱脂奶粉会不会影响后面一抗的孵育，后面看资料好像没提到要洗，有的还说一抗用封闭液稀释，一抗用脱脂奶粉稀释没问题么？另外准备想尝试下BSA封闭，也是同上面问，封闭后要不要洗膜，还是直接就可以封闭了，甚至一抗用封闭液稀释效果更好？谢谢！

作者: tie8 时间: 2013-3-6 16:39

我刚刚开始做WB，向您请教一些小问题
1.我蛋白的上样量是40ug,上样体积有的只有4ul,会不会因为体积太小有影响啊？
2.我的一个目的蛋白开始两次都做出来了，可是后来这两次都没有做出来，上样体积加大了，抗体浓度也加大了，还是没有做出来，郁闷死我了？不知道可能原因是什么啊？难道就降解了？我是蛋白变性后放到-80冰箱的
3.我是组织胞浆蛋白与胞核蛋白分开提取的，蛋白量比较少，裂解液也是自己配取的，不知道自己的提取过程有没有问题
我的提取步骤大概是这样的：
组织PBS洗涤后，加入适量A液，匀浆研磨，冰上膨胀裂解15min，之后震荡，12000r/min,离心10min,所得上清即为胞浆蛋白
加入30ulB液，继续冰上裂解20min,剧烈震荡，15000r/min,离心20min,4°，取上清，即为胞核蛋白

A液：10mM kcl 200ul,10mM Hepes 2ml;0.1mM EDTA 20ul;1.5mM Mgcl,1.2ml;1mM DTT,200UL;0.5mM PMSF,100ul;ddH2O 16.28ml 1%的磷酸酶抑制剂
请版主帮我分析一下，可能是哪些原因啊？谢谢

1、你的蛋白浓度很高了，是不是组织蛋白？蛋白定量用什么方法？
2、蛋白变性后建议分装保存
3、前面两次能做出来，说明蛋白提取应该没有问题（如果做的是同一种蛋白的话）
4、A液、B液标的不清楚啊
好多天没回来了，上次有事没写完走了，B液：25%甘油 5ml，20mM Hepes液 4ml,400mM Nacl 4ml,1mM EDTA 200ul,1mM DTT 200ul,1mM PMSF 200ul,ddH2O 6.4ml 1%的磷酸酶抑制剂
请方老师指点一下我这样的步骤分别提取组织核蛋白与胞浆蛋白可行吗？还有就是这样提出来的蛋白如果是胞膜蛋白应该在核蛋白里面啊？
我的蛋白定量用的是考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝是自己配置的，测出来的蛋白标准曲线R2值大于0.99
谢谢方老师指点

作者: greenbee 时间: 2013-3-6 16:40

楼主求救，我跑PARP，内参是actin，跑出来后actin能曝出来，而且量很多，ECL加上去1min就发光了，压几秒就可以连成带，按理来说蛋白应该是没问题的，但是PARP却是一片白板，前提是，PARP的一抗是没有问题，因为实验室其他人同一瓶抗体也能曝出很好的条带来。非常感谢。

作者: orangecake 时间: 2013-3-6 16:40

对了，还有个问题就是，我其中的一个目的蛋白，做了6个样本，但只跑出来2个，请教一下楼主有可能是什么原因导致这样的结果啊？
非常感谢

作者: okhaha 时间: 2013-3-6 16:47

先把SDS-PAGE电泳跑好

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老师，您好，我就是不知道怎么跑好，才来问您的呀。我没明白您这句话的意思。请再指点1、2。谢谢。

作者: eric930 时间: 2013-3-6 16:47

您好。我的研究对象是人胚肺细胞，检测bcl-2\bax\c-fos，用照凯基试剂盒提取的总蛋白。但是发现用PBS冲洗后，刮到的细胞就少了，我这个细胞换液时没用过PBS冲洗，那我刮细胞时不用PBS，而后在EP管理冲洗可以吧？另外上样量达到多少才能检测到bcl-2\bax？15%胶？转膜条件？一抗、二抗浓度？压片时间？我买的santar的一抗，中杉分装的santar二抗，GAPDH。我现在能作出GAPDH，但是同一孔下有浅浅的条带，是非特异性条带？这三个目的条带却检测不出来。蛋白浓度1微克每微升。

作者: pencil菲 时间: 2013-3-6 16:49

什么抗体稀释液？

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1ml的5%牛奶封闭液+4ml的TBST(1X)

作者: is2011 时间: 2013-3-6 16:49

1、背景这么高肯定发文章看不清楚
2、怎么这么黑？是胶片曝光的吗？
3、调整一下二抗浓度

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版主，你好，我是碱磷酶显色的，不是胶片曝光，二抗浓度是大了点，我的二抗已经用了一年了，现在是1:2000。还好点，谢谢你了~~

作者: okhaha 时间: 2013-3-6 16:50

版主，您好。本人开始做WB近一个月。始终做不出来条带。膜上白亮亮的。一抗来源是Santan Cruz羊来源的，二抗是中杉的兔抗羊抗体。二抗说明书上英文写的不推荐使用奶粉封闭，推荐使用血清封闭。请问配一抗二抗是否也用兔血清。有没有人用的一抗是羊来源的，用奶粉封闭做出来的。谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:51

您好！！我是新手我的目的蛋白分子量为56KD，western 条件为分离胶用12% 积层胶用的5% 细胞蛋白提取定量后没有进行稀释上样量为20ul 转膜为250mv 90min 一抗为1：1000 二抗1：1000，之前曾经成功检测到分子量为52KD的蛋白，但是这次相同的实验条件下，曝光的结果是膜上所有的条带都看到了，没有特异性条带。
这是怎么回事呢？谢谢！

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和之前检测到的52K蛋白是同一个蛋白？用的同一支抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:53

如果条件基本一致的应该不会出现这样的现象啊
有没有换什么东西？
后来做的时候换了东西actin 跑出来了但是背景有点脏今天又跑了一次结果整个膜都曝出来了上面的蛋白条带都曝出来了但是没有条带这是为什么啊

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问题较多
1、一抗特异性差
2、一抗稀释度不合适
3、二抗浓度不合适

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:54

您好版主，最近做了三次WB，提的脊髓，裂解液购自博奥森，湿转100v，1小时，分子30多kda，转膜后丽春红染色都只有最起始那里的一个条带，试了三次都如此，而且今天换了样本还是如此，确定不是跑过了，因为放了两张膜，marker可以转上，最后曝光时候也没有条带，郁闷至极，盼解

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最起始是什么意思？
第一个泳道？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:55

(第二张,左起第三条上）

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偶尔出现还是这个抗体一直出现？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:56

例外还有个比较菜的问题想问下版主，我用脱脂奶粉封闭后也用TBST洗了三次，因为感觉脱脂奶粉会不会影响后面一抗的孵育，后面看资料好像没提到要洗，有的还说一抗用封闭液稀释，一抗用脱脂奶粉稀释没问题么？另外准备想尝试下BSA封闭，也是同上面问，封闭后要不要洗膜，还是直接就可以封闭了，甚至一抗用封闭液稀释效果更好？谢谢！

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封闭后漂洗一下就行了

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:56

我刚刚开始做WB，向您请教一些小问题
1.我蛋白的上样量是40ug,上样体积有的只有4ul,会不会因为体积太小有影响啊？
2.我的一个目的蛋白开始两次都做出来了，可是后来这两次都没有做出来，上样体积加大了，抗体浓度也加大了，还是没有做出来，郁闷死我了？不知道可能原因是什么啊？难道就降解了？我是蛋白变性后放到-80冰箱的
3.我是组织胞浆蛋白与胞核蛋白分开提取的，蛋白量比较少，裂解液也是自己配取的，不知道自己的提取过程有没有问题
我的提取步骤大概是这样的：
组织PBS洗涤后，加入适量A液，匀浆研磨，冰上膨胀裂解15min，之后震荡，12000r/min,离心10min,所得上清即为胞浆蛋白
加入30ulB液，继续冰上裂解20min,剧烈震荡，15000r/min,离心20min,4°，取上清，即为胞核蛋白

A液：10mM kcl 200ul,10mM Hepes 2ml;0.1mM EDTA 20ul;1.5mM Mgcl,1.2ml;1mM DTT,200UL;0.5mM PMSF,100ul;ddH2O 16.28ml 1%的磷酸酶抑制剂
请版主帮我分析一下，可能是哪些原因啊？谢谢

1、你的蛋白浓度很高了，是不是组织蛋白？蛋白定量用什么方法？
2、蛋白变性后建议分装保存
3、前面两次能做出来，说明蛋白提取应该没有问题（如果做的是同一种蛋白的话）
4、A液、B液标的不清楚啊
好多天没回来了，上次有事没写完走了，B液：25%甘油 5ml，20mM Hepes液 4ml,400mM Nacl 4ml,1mM EDTA 200ul,1mM DTT 200ul,1mM PMSF 200ul,ddH2O 6.4ml 1%的磷酸酶抑制剂
请方老师指点一下我这样的步骤分别提取组织核蛋白与胞浆蛋白可行吗？还有就是这样提出来的蛋白如果是胞膜蛋白应该在核蛋白里面啊？
我的蛋白定量用的是考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝是自己配置的，测出来的蛋白标准曲线R2值大于0.99
谢谢方老师指点

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核蛋白提取试剂基本没问题
胞膜蛋白如果抽提出来的话也应该在胞浆蛋白中

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:57

楼主求救，我跑PARP，内参是actin，跑出来后actin能曝出来，而且量很多，ECL加上去1min就发光了，压几秒就可以连成带，按理来说蛋白应该是没问题的，但是PARP却是一片白板，前提是，PARP的一抗是没有问题，因为实验室其他人同一瓶抗体也能曝出很好的条带来。非常感谢。

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蛋白抽提试剂用的也是相同的？
如果都一样的话问题出现在那我也分析不出来

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:57

老师，您好，我就是不知道怎么跑好，才来问您的呀。我没明白您这句话的意思。请再指点1、2。谢谢。

====================

配好胶，处理好样品

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:58

您好。我的研究对象是人胚肺细胞，检测bcl-2\bax\c-fos，用照凯基试剂盒提取的总蛋白。但是发现用PBS冲洗后，刮到的细胞就少了，我这个细胞换液时没用过PBS冲洗，那我刮细胞时不用PBS，而后在EP管理冲洗可以吧？另外上样量达到多少才能检测到bcl-2\bax？15%胶？转膜条件？一抗、二抗浓度？压片时间？我买的santar的一抗，中杉分装的santar二抗，GAPDH。我现在能作出GAPDH，但是同一孔下有浅浅的条带，是非特异性条带？这三个目的条带却检测不出来。蛋白浓度1微克每微升。

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呵呵
我正在做这几个指标
CST的一抗
蛋白上样量20ug
santa的。。。还分装啊。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-6 16:58

您好。本人开始做WB近一个月。始终做不出来条带。膜上白亮亮的。一抗来源是Santan Cruz羊来源的，二抗是中杉的兔抗羊抗体。二抗说明书上英文写的不推荐使用奶粉封闭，推荐使用血清封闭。请问配一抗二抗是否也用兔血清。有没有人用的一抗是羊来源的，用奶粉封闭做出来的。谢谢。

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BSA封闭即可

作者: bamboo16 时间: 2013-3-6 16:59

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

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不太明白“稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光”是什么意思？RT干燥是什么意思？二抗点在上面，不要洗就去曝光吗？

作者: ROSE李 时间: 2013-3-6 16:59

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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是不是你的细胞根本不表达这个蛋白呢？我养的血管内皮祖细胞，第一次跑这个蛋白就显影了。

作者: glass 时间: 2013-3-6 17:00

我做的分子量23K，26K两种蛋白，剪膜时竟然能够剪开，显影时条带还可以。不是说一般分子量相差6K以上才容易剪吗？我用的是15%的胶

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请问您的转膜条件是什么？恒流还是恒压，多长时间？用什么膜

作者: glass 时间: 2013-3-6 17:02

各位老师好，这是我用目前实验室的条件进行的western结果。
实验条件：
1-普通玻璃板制胶，大约胶厚2-3mm；
2-制胶后在4度冰箱里，在保持湿度的情况下，保存了12小时
3-目的蛋白chop（gadd153）分子量29kd
4-采用0.22um pvdf膜转印。
5-5%脱脂牛奶封闭
6-ECL发光液。
最后出来的结果如下图，请各位老师帮忙分析结果，谢谢。
一抗兔的多抗
二抗羊抗兔辣根过氧化物igG

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您好，请问您的转膜条件是什么啊

作者: glass 时间: 2013-3-6 17:03

老师您好。我现在做的目的条带是25KD 蛋白上样量40微克。上样体积10微升左右。电泳胶是12%。转膜用0.45的NC膜，转膜100伏 1小时。每次转膜后用丽春红染色，发现26KD 以下的条带不清楚。以上的很好。一抗都做到1:100。显影依然什么都没有。由于目的蛋白丰度比较低，请教具体转膜条件。

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:04

不太明白“稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光”是什么意思？RT干燥是什么意思？二抗点在上面，不要洗就去曝光吗？

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RT是室温
不用洗膜

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:04

老师您好。我现在做的目的条带是25KD 蛋白上样量40微克。上样体积10微升左右。电泳胶是12%。转膜用0.45的NC膜，转膜100伏 1小时。每次转膜后用丽春红染色，发现26KD 以下的条带不清楚。以上的很好。一抗都做到1:100。显影依然什么都没有。由于目的蛋白丰度比较低，请教具体转膜条件。

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抗体厂家呢？
什么蛋白？

作者: IAM007 时间: 2013-3-6 17:04

老师好！有个奇怪的现象想请教一下！
我做的是人的胎盘组织，可能含血比较多，试过用冰预冷的PBS漂洗过再提取，但是提取的蛋白颜色总有些发红，因为胎盘是血窦组织，因此血液很难去除。蛋白提取的方法是按照文献推荐的方法,裂解液配置如下(RIPA: 40 mM TRIS-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl,2 mM EDTA, 10% glycerol, 1% Triton X–100, 0.5%sodium deoxycholate, 0.2% SDS, and 1 mM PMSF)containing the protease inhibitor cocktail Complete.均浆后13000r，15min吸上清备WB。做的WB的抗体很多，有膜蛋白的，细胞核蛋白的，还有胞质的，但是很奇怪的是在55KD和25KD左右，总会出现很明显的条带。仅有1-2个抗体有特异的目的条带，不存在类似的55KD和25KD的杂带。一开始自己还以为是抗体的问题，但是为什么这么多抗体都不行呢，现在想是不是组织有什么特别的地方。询问了抗体公司的技术顾问，说是我的组织中含有IgG，在WB的过程中裂解成了IgG重链和IgG轻链，所以最后曝光的时候出现了55KD和25KD的杂带。不知道这样解释是不是合理。还有同样的组织那为什么有的抗体做出来就没有55KD的杂带呢，还有为什么不论二抗是兔还是鼠还是山羊，均会出现55KD的条带呢，难道人血中的IgG这么强大，和小鼠，山羊以及兔的IgG都高度同源？
是不是需要使用特殊的去血细胞的试剂盒？
还望老师予以答疑！不胜感激！

一抗、二抗一起作用会出现这样的情况

继续请教老师，能不能具体解释下，一抗二抗一起作用？但是为什么大家的WB没有这样的情况？
遇到这样的情况，该如何解决呢？多谢

把组织用生理盐水或者PBS清洗干净

老师，您好！想继续请教，其实我已经尝试用PBS清洗了，但是我做的组织是胎盘，本身就是血窦组织，想要完全清洗去血基本不大现实。同时也存在一个蛋白降解的问题。我已经在PBS中加了PMSF。我也问了下，说还有种方法是用highly cross-adsorbed二抗，不过实验室没人用过，也没有查到相应的信息，不知道老师您的意见如何？多谢！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-6 17:07

偶尔出现还是这个抗体一直出现？

==========

经常出现。

作者: ququer787 时间: 2013-3-6 17:07

最起始是什么意思？
第一个泳道？

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是最大的蛋白条带

作者: IAM007 时间: 2013-3-6 17:08

抗体厂家呢？
什么蛋白？

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开始用的Santa的，最近换成invitogen。蛋白名字为sigma receptor1 ，在离体小鼠足细胞中检测。我知道这个丰度应该比较低。

作者: sunnyB 时间: 2013-3-6 17:08

请问楼主如果我的蛋白浓度比较大，想要在变性前把蛋白稀释，用什么稀释比较好呢？PBS吗？还是裂解液？

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-6 17:09

楼主，您好，有几个问题想向您请教一下。
我通过原核表达的方法表达了真菌的一种蛋白A，并对表达出的融合蛋白进行了Western Blot验证，先是用抗His标签单克隆抗体，后来又用了购买的A的抗体，结果均呈阳性。但有几个问题一直困扰着我：
第一，该A抗体是以哺乳动物的A蛋白为抗原制备的（但不知是A的哪个亚型），对我表达的真菌A蛋白有反应能说明什么问题呢？是否能说明我的A蛋白在抗原决定簇处折叠正确还是其它？但Western Blot时将蛋白样煮沸后上的样，说折叠是否不妥，因为此时蛋白已经变性了？
第二，鉴于A抗体同原核表达的真菌A蛋白有反应，我又从真菌体内直接提取总蛋白进行Western。提取时加入了8M的尿素及硫脲等物质，想将所有蛋白均提取出来。但令人奇怪的是，Western总无反应。为什么此抗体能同原核表达的重组蛋白有反应，而对真菌体内的A蛋白无反应呢？
第三，除了His抗体外，我还想对我表达出的融合蛋白做进一步的鉴定，请问还有什么方法可以进行？如果仍想用Western做，请问哪家公司有真菌的蛋白抗体？如果没有，市面上其它的哺乳动物A抗体能否用来进行试验（市面上大多是以哺乳动物的A单位为抗原制备的抗体）？
事情紧急，望不吝赐教。

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-6 17:09

问题较多
1、一抗特异性差
2、一抗稀释度不合适
3、二抗浓度不合适

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现在一抗稀释度为1：1000 二抗为1：2000 抗体为兔来源单抗

作者: u234 时间: 2013-3-6 17:10

版主你好！我想问下，为什么我的B-actin总是不一致呢？我用的是BCA碧云天的试剂盒！请问有什么方法，可以使actin一致。
还请教一个问题，直接用RIPA裂解液裂解，离心后去上去获得的蛋白是总蛋白吗？包括胞浆和胞膜吗？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:15

版主你好！我想问下，为什么我的B-actin总是不一致呢？我用的是BCA碧云天的试剂盒！请问有什么方法，可以使actin一致。
还请教一个问题，直接用RIPA裂解液裂解，离心后去上去获得的蛋白是总蛋白吗？包括胞浆和胞膜吗？
谢谢！

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1、蛋白定量同一样品至少双管对照
2、整个操作要保持一致，我觉得这是平时做实验的习惯，说不清楚
3、包括胞浆、核

作者: fsdd817 时间: 2013-3-6 17:17

老师您好，我是一边看您前面的解答一遍结合我的情况提问题，因此可能问题比较多，也组织的不好，请您见谅！
我最近做睾丸组织bax 21kd bcl-2 26kd蛋白，一直没做出来，请教。
制样时，一半的组织是-80℃保存半年后制样，一半的组织是新鲜组织-80℃保存一个星期后制样。将组织从-80℃拿出，取小块，称重，放入玻璃匀浆器，一般5-8分钟，然后加裂解液。
上海生工RIPA裂解液ii（PL006)，1:5加入，带有蛋白酶抑制剂，但没加PMSF，玻璃匀浆器冰上匀浆20次，冰上放置60min等起裂解。12000g×30min 4℃离心。上清上层有一层白色的物质，好像是油脂，取上清时没管它，吸到了就吸到了。
（注：问题同dxyjy wrote:另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？）
BCA法测蛋白浓度为8-12微克/微升。分光光度计测量。
100微升分装-80℃保存，使用时拿出加上样缓冲液，100℃4min，4℃保存。一般使用4-5次。
上样量10微升。胶的厚度为0.75mm。
我一般用5%浓缩胶，12%分离胶，跑胶。
转膜缓冲液为：tris 3g 甘氨酸 14.5g 甲醇200ml 蒸馏水800ml
bio-rad basic机器。
PVDF膜。0.45孔径。
以下为摸条件时，转膜后胶考染图片。
转膜恒压25V，电流35-43mA。在转移缓冲液中平衡15-30min。由于没有海绵，三明治两边全用滤纸夹。
上排15%胶，从左至右转膜时间0min,40min，40min，60min。
下排12%胶，左至右转膜时间0min,20min，40min，60min。
膜丽春红染色后都有条带。
此后用一直用12%胶，25v左右，55min左右转膜。
3%BSA PBST封闭1h，其中吐温20含量 0.5%。
一抗为博士德兔抗大鼠的多抗稀释比例1：100稀释，（推荐稀释比例1:100-1：400）室温孵育2h，（5月份的室温）
PBST洗膜10min×3次。
博士德进口分装二抗1:2000或1：3000稀释，（推荐稀释比例1:3000-1:6000）
PBST洗膜10min×3次。
ECL曝光1min。吉泰买的thermo ECL。内参和hsp70滴上去10几秒就发光了。
bax无条带，bcl-2二抗1:2000稀释时出现4个条带，1:3000时无条带。图在下面。

用同样步骤，做actin、GAPDH内参，转膜时间加40min，其他相同，内参各做3次，曝光良好。
同样转膜电压调为40v，电流36mA转膜时间90min做HSP70也能做出来。actin、GAPDH，HSP70一抗二抗都来自博士德。
我自己总结认为可能的问题1、样品，可能要做的蛋白含量较低。
2、转膜时间，浏览园子里其他战友类似大小蛋白一般都用80-100v转膜1h，和我的和不一样。是不是由于胶的厚度不同导致的。
3、一抗问题，也许要换好的一抗。
呵呵，现在郁闷得很，希望你能帮我看看可能有什么问题。
谢谢！

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作者: fsdd817 时间: 2013-3-6 17:18

接上面由于不知如何同时传两张图，只好分两次传。
这个是总蛋白的条带，用10%胶跑的，上样从左至右10，8,5微升
接着问：是不是就算总蛋白条带有，有些条带弥散是不是蛋白降解了？这个条带是不是跑的不好，上样量大了是不是也会导致蛋白爆不出来？
谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15095

作者: fsdd817 时间: 2013-3-6 17:19

接着问：For Western blot analysis,200μg of protein was resolved on a 12% SDS polyacrylamide gel at 160V in a Mini-Protean II Cell(Bio-Rad).
睾丸样品200微克的上样量做出如下的图说明目标蛋白的丰度是高还是低？

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作者: fsdd817 时间: 2013-3-6 17:19

这个是我用1:2000二抗时爆出的条带，呵呵不是很好看。内参还有，但左边bcl-2那边都是杂带，看不出目标抗体，右边而bax似乎看见条带发光，但是曝光时就淬灭了。
二抗体为1:3000时就暴不出bax那样的条带了。

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作者: fsdd817 时间: 2013-3-6 17:23

版主你好，今天看了一下午你的帖子，有些疑问：
你的回答1.Bax与Bcl-2我刚做完
骨骼肌来源的
可以用15%的分离胶
最好用0.22um的膜
转膜时间300mA 1h，注意降温

回答2.
再请教您一个问题。我用的是湿式电转。转移buffer 配方是：0.1%SDS，20%甲醇，Tris,Glysine.目的蛋白是17KD。可以推荐一下您认为合适的转膜条件吗？

我选择用湿转 1mm胶
300mA 15~20min
用0.22um膜

回答3
tingzhou123 wrote:
您好 VEGF的分子量是29KD 在胞浆中表达我上次看见的那两个隐约的条带是在26KD和35KD之间所以我觉得可能是目的蛋白我也不确定我的条件是湿转300mA 40min 呵呵想问问前辈做29KD左右分子量的蛋白湿转用什么条件我想用您的经验条件再试试谢谢

300mA 30min

疑问：bax蛋白21kd 和后面的17kd蛋白转膜时间为什么差如此之多？而29kd的蛋白也只转30min？有什么不同的地方吗？是不是要根据实际情况来定？是不是低电压转低分子量的蛋白后面蛋白转到膜上的时候前面蛋白会转出去？

谢谢老师了！

作者: u234 时间: 2013-3-6 17:23

楼主好现在有一个急手的问题。。。。暴出来的胶片居然没有背景。。是怎么回事。。。。有哪些可能的原因。。

作者: u234 时间: 2013-3-6 17:23

老师好刚接触western 问几个问题：1 marker 转到膜上去了但最后荧光时没有看到目的蛋白的荧光是怎么回事，是目的蛋白没转上去吗。2所谓的背景深浅是个什么意思是胶片上的背景。。背景的深浅为什么会对最后的分析结果产生影响

作者: u234 时间: 2013-3-6 17:24

老师关于那个marker 转上去了而目的蛋白没有转上去是不是和上样量有关系我做的是94KD的蛋白。。。是不是上样量要大一些。。。

作者: loli 时间: 2013-3-6 17:25

各位战友，本人也是初做western,做了几周都没有结果。
转膜没有问题，丽春红染色显示有条带。一抗稀释比是1：100-1000，1：400，1：200，都用了，二抗说明书上说1：5000-10000，我用了1：500的时候才把内参做出来。但以后作别的基因二抗的这个稀释比又做不出来了。western不但没有条带连背景都没有，胶片上光光的，什么都没有，不知道这是什么原因呢？急，烦请高手指点！！！

作者: jujuba 时间: 2013-3-6 17:25

最近在跑目的蛋白96kD大小的蛋白，但是每次都是在marker的120kD的位置发现条带
请问——
目的蛋白的位置和marker的位置不一致是怎么回事？
在120kD位置的条带会不会不是我想要的目的蛋白啊？

作者: jujuba 时间: 2013-3-6 17:25

请问一下，如果我提取的蛋白浓度比较高，想要稀释的话，是不是必须在变性前稀释？

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用什么稀释？？PBS还是什么啊？
谢谢您！

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:26

老师您好，我是一边看您前面的解答一遍结合我的情况提问题，因此可能问题比较多，也组织的不好，请您见谅！
我最近做睾丸组织bax 21kd bcl-2 26kd蛋白，一直没做出来，请教。
制样时，一半的组织是-80℃保存半年后制样，一半的组织是新鲜组织-80℃保存一个星期后制样。将组织从-80℃拿出，取小块，称重，放入玻璃匀浆器，一般5-8分钟，然后加裂解液。
上海生工RIPA裂解液ii（PL006)，1:5加入，带有蛋白酶抑制剂，但没加PMSF，玻璃匀浆器冰上匀浆20次，冰上放置60min等起裂解。12000g×30min 4℃离心。上清上层有一层白色的物质，好像是油脂，取上清时没管它，吸到了就吸到了。
（注：问题同dxyjy wrote:另外，蛋白提取时有絮状物，14000rpm*60min或30min都不能沉淀下去。我是35mm的一瓶细胞加1ml RIPA和10ul PMSF，操作严格按说明书进行，提很多次了，都这样，别人也用同一瓶试剂，都没有这种情况，会不会是蛋白的问题导致了WB结果这样呢？）
BCA法测蛋白浓度为8-12微克/微升。分光光度计测量。
100微升分装-80℃保存，使用时拿出加上样缓冲液，100℃4min，4℃保存。一般使用4-5次。
上样量10微升。胶的厚度为0.75mm。
我一般用5%浓缩胶，12%分离胶，跑胶。
转膜缓冲液为：tris 3g 甘氨酸 14.5g 甲醇200ml 蒸馏水800ml
bio-rad basic机器。
PVDF膜。0.45孔径。
以下为摸条件时，转膜后胶考染图片。
转膜恒压25V，电流35-43mA。在转移缓冲液中平衡15-30min。由于没有海绵，三明治两边全用滤纸夹。
上排15%胶，从左至右转膜时间0min,40min，40min，60min。
下排12%胶，左至右转膜时间0min,20min，40min，60min。
膜丽春红染色后都有条带。
此后用一直用12%胶，25v左右，55min左右转膜。
3%BSA PBST封闭1h，其中吐温20含量 0.5%。
一抗为博士德兔抗大鼠的多抗稀释比例1：100稀释，（推荐稀释比例1:100-1：400）室温孵育2h，（5月份的室温）
PBST洗膜10min×3次。
博士德进口分装二抗1:2000或1：3000稀释，（推荐稀释比例1:3000-1:6000）
PBST洗膜10min×3次。
ECL曝光1min。吉泰买的thermo ECL。内参和hsp70滴上去10几秒就发光了。
bax无条带，bcl-2二抗1:2000稀释时出现4个条带，1:3000时无条带。图在下面。

用同样步骤，做actin、GAPDH内参，转膜时间加40min，其他相同，内参各做3次，曝光良好。
同样转膜电压调为40v，电流36mA转膜时间90min做HSP70也能做出来。actin、GAPDH，HSP70一抗二抗都来自博士德。
我自己总结认为可能的问题1、样品，可能要做的蛋白含量较低。
2、转膜时间，浏览园子里其他战友类似大小蛋白一般都用80-100v转膜1h，和我的和不一样。是不是由于胶的厚度不同导致的。
3、一抗问题，也许要换好的一抗。
呵呵，现在郁闷得很，希望你能帮我看看可能有什么问题。
谢谢！

=========================

要说几点
1、先把蛋白SDS-PAGE做好
2、用ECL检测二抗的稀释度
3、最后考虑一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:26

接上面由于不知如何同时传两张图，只好分两次传。
这个是总蛋白的条带，用10%胶跑的，上样从左至右10，8,5微升
接着问：是不是就算总蛋白条带有，有些条带弥散是不是蛋白降解了？这个条带是不是跑的不好，上样量大了是不是也会导致蛋白爆不出来？
谢谢！

=======================

5ul的上样量都已经大了
这几天我在做Bax与BCl-2

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:27

接着问：For Western blot analysis,200μg of protein was resolved on a 12% SDS polyacrylamide gel at 160V in a Mini-Protean II Cell(Bio-Rad).
睾丸样品200微克的上样量做出如下的图说明目标蛋白的丰度是高还是低？

===========================

200ug才这样的效果啊！
已经超出SDS-PAGE的分辨率了

我用20ug做
结果还不错

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:27

这个是我用1:2000二抗时爆出的条带，呵呵不是很好看。内参还有，但左边bcl-2那边都是杂带，看不出目标抗体，右边而bax似乎看见条带发光，但是曝光时就淬灭了。
二抗体为1:3000时就暴不出bax那样的条带了。

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抗体是那一家的？

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:27

最近在跑目的蛋白96kD大小的蛋白，但是每次都是在marker的120kD的位置发现条带
请问——
目的蛋白的位置和marker的位置不一致是怎么回事？
在120kD位置的条带会不会不是我想要的目的蛋白啊？

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请参考抗体说明书
分子量位置有出入是很正常的

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:28

各位战友，本人也是初做western,做了几周都没有结果。
转膜没有问题，丽春红染色显示有条带。一抗稀释比是1：100-1000，1：400，1：200，都用了，二抗说明书上说1：5000-10000，我用了1：500的时候才把内参做出来。但以后作别的基因二抗的这个稀释比又做不出来了。western不但没有条带连背景都没有，胶片上光光的，什么都没有，不知道这是什么原因呢？急，烦请高手指点！！！

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换二抗或者ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:28

老师关于那个marker 转上去了而目的蛋白没有转上去是不是和上样量有关系我做的是94KD的蛋白。。。是不是上样量要大一些。。。

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转膜条件呢

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:28

请问一下，如果我提取的蛋白浓度比较高，想要稀释的话，是不是必须在变性前稀释？

用什么稀释？？PBS还是什么啊？？？
谢谢您！

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变性前稀释
蛋白浓度高不容易降解

作者: KGZ564 时间: 2013-3-6 17:29

请问楼主：
稀释蛋白用什么稀释好啊？？？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:29

QUOTE:

原帖由 KGZ564 于 2013-3-6 17:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问楼主：
稀释蛋白用什么稀释好啊？？？
谢谢

如果知道是什么提取体系
用蛋白抽提试剂稀释
如果不知道什么提取体系用PBS

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:30

1、胶有问题
2、蛋白样品处理的不好

作者: avi317 时间: 2013-3-6 17:30

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-6 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、胶有问题
2、蛋白样品处理的不好

谢谢您的回复
样品每个只有30ug左右，我裂解液按照说明加了200（说明让20ug加100~200ul）。然后用超声处理的，处理的时候每次没有超过10秒，然后放入冰箱，过一段时间再处理的。
灌胶所需液体实验室都在共用，他们做的结果很好，我让他们替我带个样儿，结果染膜的时候他们的蛋白跑的转的很好，各分子量基本都有，但是我的泳道还是只有35以上的蛋白。

作者: KGZ564 时间: 2013-3-6 17:31

非常感谢老师的指导！
我的一抗和二抗都是博士德的。
谢谢！

作者: standbyme 时间: 2013-3-6 17:32

相关疾病：
白血病
请教nba老师:
我要做骨髓液白血病细胞核中的一种460KD大的蛋白,请问该注意什么啊?
最好是有具体的实验步骤,我是刚刚进实验室的.先怎么样保存标本呢?

作者: 831226 时间: 2013-3-6 17:32

请教版主，我要从血液里提取蛋白做western,用什么方法提取蛋白比较好呢

作者: 831226 时间: 2013-3-6 17:33

忘了说，我要提取的是总蛋白，谢谢啊

作者: owanaka 时间: 2013-3-6 17:34

老师是在上海的吗?是在什么公司的呢？哪个公司请了您这样的高手真的很幸运吧！！方不方便短我一个联系方式呢，很想到老师这里来学东东，很想来见识一下高手是怎么样子的？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-6 17:34

版主您好！向您请教一下：最近我的W的电泳时看到marker在70K及以下的条带逐渐弥散，上面的大分子蛋白是好的，请问是胶有问题吗还是什么原因？另外，10%SDS怎样存放好些？不加AP和TEMD胶的配液存多久可以用或是推荐先用现配？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:34

谢谢您的回复
样品每个只有30ug左右，我裂解液按照说明加了200（说明让20ug加100~200ul）。然后用超声处理的，处理的时候每次没有超过10秒，然后放入冰箱，过一段时间再处理的。
灌胶所需液体实验室都在共用，他们做的结果很好，我让他们替我带个样儿，结果染膜的时候他们的蛋白跑的转的很好，各分子量基本都有，但是我的泳道还是只有35以上的蛋白。

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超声10S？
你提取的是细胞蛋白吗？
如果是的话我不建议你用超声

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:35

非常感谢老师的指导！
我的一抗和二抗都是博士德的。
谢谢！

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它家的抗体不好说

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:35

相关疾病：
白血病

==========================================================

我要做骨髓液白血病细胞核中的一种460KD大的蛋白,请问该注意什么啊?
最好是有具体的实验步骤,我是刚刚进实验室的.先怎么样保存标本呢?

======================

取材时可以用液氮保存
取材完成后-80冰箱冻存

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:36

请教版主，我要从血液里提取蛋白做western,用什么方法提取蛋白比较好呢

从血液里面提取什么蛋白做WB？

你的意思是要取红细胞、白细胞之类？

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一般的血液做WB是提取血清后变性蛋白就可以做了

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:36

忘了说，我要提取的是总蛋白，谢谢啊

================

不需要用裂解液
直接取血清就ok

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:37

版主您好！向您请教一下：最近我的W的电泳时看到marker在70K及以下的条带逐渐弥散，上面的大分子蛋白是好的，请问是胶有问题吗还是什么原因？另外，10%SDS怎样存放好些？不加AP和TEMD胶的配液存多久可以用或是推荐先用现配？谢谢！

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pH的关系较大
SDS 室温保存

配液在4度可以放很长时间，注意避光

作者: ukonptp 时间: 2013-3-6 17:39

不需要用裂解液
直接取血清就ok

谢谢老师的回答，具体地说我是要提取人血液标本的蛋白做SOD1的WB，老板只是这样说的，没有其他要求，按你的意思是离心取血清，用PBS稀释一下，加上样缓冲液煮沸就可以做了，是么。。。
不用提取血细胞里的蛋白咯？

作者: greenbee 时间: 2013-3-6 17:41

最近western原来很容易出来的蛋白却都是白板；
一抗，有很多种抗体，但都是白板，一些做免疫荧光试了一下能出来，应该不是一抗的问题
二抗，新买的，也有借别人的，只有actin杂出来带，1分钟就淬灭了
奶粉，伊利的脱脂高钙奶粉，以前用得很好，最近出现问题后看奶粉过期了，换了新的还不行
ECL，pierce的，康为的，借的别人的millipore的效果都一样
测了TBST的PH值，7到8之间
显定液，直接爆了光的一下就显黑，说明都没问题

现在的问题是，出不来条带是什么造成的？哪位高人遇到这种情况过？怎么解决的？要被逼疯了

作者: greenbee 时间: 2013-3-6 17:41

转膜及跑胶应该不成问题，预染的marker转的很漂亮，同样条件原来很容易出来的现在却死都不出来，这是为什么呢？

作者: abc816 时间: 2013-3-6 17:42

老师您好！
最近做WB遇到很多问题，想请老师帮忙解答：
我做小鼠小肠H2AX 17kd和Ku70+ku80，之前用10%的胶，觉得ku70和80的两条带距离太近，H2AX的带又很粗而且连成线，后来改用15%的胶做H2Ax，8%的胶做ku70+ku80。蛋白浓度4ug/ul，上样量8-12ul都试过。电泳60V 30min，100V 45min，转膜用半干转，18V 30min，转ku时也用过20V 45min。一抗都是abcam的，H2Ax 1：1000，ku 1：600（推荐1：300-1000），二抗1：1000，抗体都用1%BSA-TBST稀释。

我的问题是这样的：
1.用8%的胶后ku就没做出来，其他条件都没变，近两次H2Ax也没条带了，丽春红染是有带的，但70、80分子量处一直都不明显。抗体一般会重复用3-4次，可以前用过1个月还能出条带的，大约5cm2大小的膜敷1.5ml抗体。是重复用抗体的原因吗？可以用10%的胶做ku吗？
2.actin曝光出的条带都像方括号一样连在一起，而且中间泳道条带粗，两边细，因为目的蛋白条带也是两边泳道的细，以至于不能确定是真的连actin表达量都低了还是电泳的原因。这和电泳槽电压有关吗？而且开始跑时内槽会缓慢漏液，漏一段时间就停了，我需要中途暂停补加电泳液。条带连线我也怀疑过上样量的问题，但ku蛋白的条带很细，我怕上样少了ku的做不出来，如果不在同一块胶上跑又怕结果不可靠。
3.H2AX有的表达比actin强很多，条带连线，有的很弱，上样量怎么控制呢？
4.转膜条件可以吗？H2AX的膜7.5*3cm大小，ku的7.5*2cm，是不是这样的条件对于ku的效果不太好？
5.在浓缩胶中跑大概10min左右时就会有一些样的溴酚蓝从孔下边的角漏出来，漏到浓缩胶和分离胶的界限为止，速度很快，而且并不沿泳道往正下方漏，而是随意的方向，漏的孔和样也是随机的，但都漏过，随着样进入分离胶后，那些漏出来的溴酚蓝也跟着一起被压入分离胶了。因为目的蛋白是核蛋白，我用的是RIPA裂解液，每次提蛋白时都会有胶状的DNA，我已经尽可能少吸DNA了，但是不能完全避免。这些漏出来的会不会是DNA在作怪呢？浓缩胶我一般会凝3h的，应该能凝好啊
另外附上曝光的图片，第一张是actin的，第二张是ku的，最后是H2AX的，希望老师能帮忙解答！谢谢！

图片附件: 31300220.jpg (2013-3-6 17:42, 6.92 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15099

作者: abc816 时间: 2013-3-6 17:43

不好意思发错了，是这张

图片附件: 60492759.snap.jpg (2013-3-6 17:43, 15.63 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15100

作者: yychen 时间: 2013-3-6 17:44

超声10S？
你提取的是细胞蛋白吗？
如果是的话我不建议你用超声

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不是细胞的，是脊髓的，我大概间断超声3次，每次超声处理10s，间隔5分钟左右进行下一次超声。

作者: wood533 时间: 2013-3-6 17:45

我最近在做P21（WAF1）蛋白，理论上大小应该是21kD，可是我的条带出现在34kD处，而且很特异，做了几次都是如此。请问这是什么原因呢？谢谢~~

作者: qqq111 时间: 2013-3-6 17:45

老师，您好！WB基本做完了，在用Quantity one分析泳道时，显示的信息是“intensity”而不是“Optical Density”，两个含义一样吗？应该怎样解决？请指教，谢谢！

作者: JK.jon 时间: 2013-3-6 17:46

请教NBA版主：我想跑9KD的蛋白做western用什么样的胶比较好，普通的SDS-PAGE 行吗？还是要用专门跑小分子蛋白的胶？

作者: lixi559 时间: 2013-3-6 17:46

楼主你好，再一次麻烦你，我现在觉得我的方法有很大的程度上都是错误的。。。。
以下问题想咨询你一下~~
1.铺完分离胶之后用什么封边呢？我用的异丙醇，待胶凝了之后用滤纸把异丙醇吸干净，不洗，再铺浓缩胶。我想问一下不洗可以么？要不要把异丙醇用去离子水洗洗呢？
2.我做的蛋白有的是胞膜蛋白，有的是胞浆蛋白，裂解的时候需要注意什么呢？具体的操作步骤是怎么样的呢？
3.我做的蛋白分子量是21kd，转膜条件大概应该是什么呢？我用的是150mA，1h，是不是太大了呢？
4.洗脱一抗和二抗的时候是用TBST洗三次么？我看有的资料上写的是TBST洗两遍，第三遍用TBS洗，哪种是对的呢?
5.我用的是DAB显色法，NC膜，请问NC膜可以重复利用么？怎么用stripping洗掉呢？
先谢谢楼主了，我暂时能想到的就只有这些

作者: ero11 时间: 2013-3-6 17:52

版主您好！请问如果分离胶的PH低于8.8会看到marker是怎样的呢？谢谢！

作者: zhenxin 时间: 2013-3-6 17:52

请教一下，用提取组织的细胞外基质中的蛋白用什么方法好？裂解液有什么特殊的吗？

作者: ending 时间: 2013-3-6 17:53

1，请问，90kD大小的蛋白，10%的胶，跑电泳时的电压可选择多少。分离胶合浓缩胶都用180V可不可以？
2，转膜的条件（湿转）？我用180MA3.5小时,最佳的条件是？
谢谢！

作者: www.1 时间: 2013-3-6 17:53

请教高手楼主一个问题，我最近用的一个抗体，蛋白质的分子量是15kDa,做了两次都发现不在15kDa的范围内出现，而是在140kDa，很是迷惑，对应Marker的15kDa处非常干净，希望高手多多指教，真是愁死我了

作者: tuuu2 时间: 2013-3-6 17:53

请教版主：因为western是目的蛋白与内参的半定量比值，那假如我从肝组织中分离某种细胞，如果该细胞的目的蛋白的半定量值与同一肝组织的目的蛋白半定量值相差很大的话，是否可以说该目的蛋白可能还在肝组织的其他细胞上有表达呢？
说的比较啰嗦，谢谢了！

作者: S6044 时间: 2013-3-6 17:54

会不会是蛋白降解了？我最近也遇到这种问题，突然就再也做不出来了，不知道是不是和我蛋白多次在室温融化有关，多多交流啊

作者: 49888 时间: 2013-3-6 17:54

你好，我刚开始接触实验室，懂得很少。
我想问的是：做wb实验时，每个实验组需要有多少条带，才有统计意义。
如果仅仅定性又需要多少呢。
谢谢

作者: 49888 时间: 2013-3-6 17:55

谢谢版主回复
我是因为做wb 一直做不出来
考染和丽春红染都是35以下没有条带
所以怀疑样品蛋白含量低，想做浓缩
我的样品室脊髓，每个只有大概三毫米长，
想请问具体如何浓缩

下边的网址为我做的染膜和胶，刚开始做的不清晰不好看
后来做的清晰的好看一些的结果也和发的差不多，都是35以下没有条带，我做内参（40多）能做出来，目的蛋白35和14，17做不出来。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=17281809&sty=1')

作者: moonlight45 时间: 2013-3-6 17:56

楼主你好,本人最近作western发现电泳时条带不是压成一条线，而是很宽，请您分析一下原因，以前我做好像不是这样的。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:56

谢谢老师的回答，具体地说我是要提取人血液标本的蛋白做SOD1的WB，老板只是这样说的，没有其他要求，按你的意思是离心取血清，用PBS稀释一下，加上样缓冲液煮沸就可以做了，是么。。。
不用提取血细胞里的蛋白咯？

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不用提取血细胞蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-6 17:57

最近western原来很容易出来的蛋白却都是白板；
一抗，有很多种抗体，但都是白板，一些做免疫荧光试了一下能出来，应该不是一抗的问题
二抗，新买的，也有借别人的，只有actin杂出来带，1分钟就淬灭了
奶粉，伊利的脱脂高钙奶粉，以前用得很好，最近出现问题后看奶粉过期了，换了新的还不行
ECL，pierce的，康为的，借的别人的millipore的效果都一样
测了TBST的PH值，7到8之间
显定液，直接爆了光的一下就显黑，说明都没问题

现在的问题是，出不来条带是什么造成的？哪位高人遇到这种情况过？怎么解决的？要被逼疯了

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1、做免疫荧光没有问题并不说明一抗就没有问题，一抗的保存条件是否得当
2、淬灭与ECL，二抗浓度、膜是否污染等有关
3、样品呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:26

转膜及跑胶应该不成问题，预染的marker转的很漂亮，同样条件原来很容易出来的现在却死都不出来，这是为什么呢？

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用丽春红等染色后再确定转膜有没有问题！

在进行WB前先对蛋白电泳后的SDS-PAGE进行染色观察样品

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:27

老师您好！
最近做WB遇到很多问题，想请老师帮忙解答：
我做小鼠小肠H2AX 17kd和Ku70+ku80，之前用10%的胶，觉得ku70和80的两条带距离太近，H2AX的带又很粗而且连成线，后来改用15%的胶做H2Ax，8%的胶做ku70+ku80。蛋白浓度4ug/ul，上样量8-12ul都试过。电泳60V 30min，100V 45min，转膜用半干转，18V 30min，转ku时也用过20V 45min。一抗都是abcam的，H2Ax 1：1000，ku 1：600（推荐1：300-1000），二抗1：1000，抗体都用1%BSA-TBST稀释。

我的问题是这样的：
1.用8%的胶后ku就没做出来，其他条件都没变，近两次H2Ax也没条带了，丽春红染是有带的，但70、80分子量处一直都不明显。抗体一般会重复用3-4次，可以前用过1个月还能出条带的，大约5cm2大小的膜敷1.5ml抗体。是重复用抗体的原因吗？可以用10%的胶做ku吗？
2.actin曝光出的条带都像方括号一样连在一起，而且中间泳道条带粗，两边细，因为目的蛋白条带也是两边泳道的细，以至于不能确定是真的连actin表达量都低了还是电泳的原因。这和电泳槽电压有关吗？而且开始跑时内槽会缓慢漏液，漏一段时间就停了，我需要中途暂停补加电泳液。条带连线我也怀疑过上样量的问题，但ku蛋白的条带很细，我怕上样少了ku的做不出来，如果不在同一块胶上跑又怕结果不可靠。
3.H2AX有的表达比actin强很多，条带连线，有的很弱，上样量怎么控制呢？
4.转膜条件可以吗？H2AX的膜7.5*3cm大小，ku的7.5*2cm，是不是这样的条件对于ku的效果不太好？
5.在浓缩胶中跑大概10min左右时就会有一些样的溴酚蓝从孔下边的角漏出来，漏到浓缩胶和分离胶的界限为止，速度很快，而且并不沿泳道往正下方漏，而是随意的方向，漏的孔和样也是随机的，但都漏过，随着样进入分离胶后，那些漏出来的溴酚蓝也跟着一起被压入分离胶了。因为目的蛋白是核蛋白，我用的是RIPA裂解液，每次提蛋白时都会有胶状的DNA，我已经尽可能少吸DNA了，但是不能完全避免。这些漏出来的会不会是DNA在作怪呢？浓缩胶我一般会凝3h的，应该能凝好啊
另外附上曝光的图片，第一张是actin的，第二张是ku的，最后是H2AX的，希望老师能帮忙解答！谢谢！

==============================================================

1、8%的胶分离70-80效果要好于10%
2、重复3、4次，里面的BSA还没坏？
3、actin像括号是因为上样量太大，另外是转膜后抗体孵育不完全造成两边细
4、上样量控制的看预实验条带啊。。。
5、转膜我没用过恒压

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:27

不是细胞的，是脊髓的，我大概间断超声3次，每次超声处理10s，间隔5分钟左右进行下一次超声。

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提取蛋白一般都不需要用超声

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:28

我最近在做P21（WAF1）蛋白，理论上大小应该是21kD，可是我的条带出现在34kD处，而且很特异，做了几次都是如此。请问这是什么原因呢？谢谢~~

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请看抗体说明书
或者上Abcam网站查看为什么分子量位置有偏差的解释

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:29

老师，您好！WB基本做完了，在用Quantity one分析泳道时，显示的信息是“intensity”而不是“Optical Density”，两个含义一样吗？应该怎样解决？请指教，谢谢！

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呵呵
这个软件我没用过
我用ImageQuant TL读数

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:30

我想跑9KD的蛋白做western用什么样的胶比较好，普通的SDS-PAGE 行吗？还是要用专门跑小分子蛋白的胶？

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建议用Tricine-SDS-PAGE

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:30

楼主你好，再一次麻烦你，我现在觉得我的方法有很大的程度上都是错误的。。。。
以下问题想咨询你一下~~
1.铺完分离胶之后用什么封边呢？我用的异丙醇，待胶凝了之后用滤纸把异丙醇吸干净，不洗，再铺浓缩胶。我想问一下不洗可以么？要不要把异丙醇用去离子水洗洗呢？
2.我做的蛋白有的是胞膜蛋白，有的是胞浆蛋白，裂解的时候需要注意什么呢？具体的操作步骤是怎么样的呢？
3.我做的蛋白分子量是21kd，转膜条件大概应该是什么呢？我用的是150mA，1h，是不是太大了呢？
4.洗脱一抗和二抗的时候是用TBST洗三次么？我看有的资料上写的是TBST洗两遍，第三遍用TBS洗，哪种是对的呢?
5.我用的是DAB显色法，NC膜，请问NC膜可以重复利用么？怎么用stripping洗掉呢？
先谢谢楼主了，我暂时能想到的就只有这些

==========================================================================

1、我用蒸馏水封胶
2、可以用总蛋白抽提试剂进行提取蛋白
3、300mA 30-40min均可
4、用TBST洗，3min，5次。最后一次可以选择TBS，因为Tween 20会使ECL产生一定的背景
5、用Stripping buffer洗掉啊。DAB我没试过stripping，需要具体的东西短信息联系我

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:31

版主您好！请问如果分离胶的PH低于8.8会看到marker是怎样的呢？谢谢！

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哎呦喂
这个我还真没试过
你试下把结果挂上来
大家一起探讨下

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:31

请教一下，用提取组织的细胞外基质中的蛋白用什么方法好？裂解液有什么特殊的吗？

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要看具体是什么蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:31

1，请问，90kD大小的蛋白，10%的胶，跑电泳时的电压可选择多少。分离胶合浓缩胶都用180V可不可以？
2，转膜的条件（湿转）？我用180MA3.5小时,最佳的条件是？
谢谢！

========================================

1、浓缩胶90V，等溴酚蓝进行分离胶界面改用180V
2、湿转：300mA，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:32

请教高手楼主一个问题，我最近用的一个抗体，蛋白质的分子量是15kDa,做了两次都发现不在15kDa的范围内出现，而是在140kDa，很是迷惑，对应Marker的15kDa处非常干净，希望高手多多指教，真是愁死我了

=======================

给公司技术支持打电话撒

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:32

请教版主：因为western是目的蛋白与内参的半定量比值，那假如我从肝组织中分离某种细胞，如果该细胞的目的蛋白的半定量值与同一肝组织的目的蛋白半定量值相差很大的话，是否可以说该目的蛋白可能还在肝组织的其他细胞上有表达呢？
说的比较啰嗦，谢谢了！

==========================

怎么不考虑你自己的误差呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:33

会不会是蛋白降解了？我最近也遇到这种问题，突然就再也做不出来了，不知道是不是和我蛋白多次在室温融化有关，多多交流啊

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说的有点道理

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:34

你好，我刚开始接触实验室，懂得很少。
我想问的是：做wb实验时，每个实验组需要有多少条带，才有统计意义。
如果仅仅定性又需要多少呢。
谢谢

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定性就看你自己了
统计至少n>3

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:34

楼主你好,本人最近作western发现电泳时条带不是压成一条线，而是很宽，请您分析一下原因，以前我做好像不是这样的。谢谢

==============

怎么个宽法？
传图片看看

作者: tuuu2 时间: 2013-3-7 10:36

另外，现在手头有师姐留下的actin，可以将就用来做内参嘛？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-7 10:36

楼主，您好！我准备做ERK、P-ERK1/2 及 IκBα、P-IκBα的实验，请问：
1、这几个的分子量都特别近，42-44-39-40KD等，是不是至少跑2次胶？一块胶先做磷酸化再做非磷酸化？最后再做内参？还是每个都单独跑，还有内参，共跑5次？但是磷酸化或非磷酸化分子量都基本接近，如进行二次洗膜后实验能能确定是后者的抗体吗？
2、这几个蛋白的分离胶浓度是15%还是10%呢？（我在园子里看有的建议8%分离胶）电泳条件？（可以先80V半小时，在120V1小时吗？）转膜条件？(我们实验室看师兄们用的是转膜横流0.24mA 2个小时，时间会不会长了？)
3、内参选用什么合适呢？单独跑一次吗？还是每次都要跑？
4、每次电泳液和转膜液都换新的吗？
5、ERK的42和44 ，是不是不容易跑分开？
6、因为磷酸化蛋白少，上样100微克会不会太多？（我们实验室师兄们甚至上到150微克的蛋白啦）
7、上样根据蛋白浓度调整统一浓度，但上样的总的体积不同，需要用什么把体积也统一吗？还是不需要？
8、我看有的帖子说无干扰也有P-ERK的微量表达?也就是空白对照组也能出现极弱的条带？

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1、我做磷酸化与非磷酸化一般是做两块胶，有很多人用stripping buffer处理后在一张膜上做，也可以试下，先做磷酸化再做非磷酸化最后再做内参
2、可以用12%的分离胶啊，转膜300mA，1h，湿转
3、内参可以用beta-tubulin
4、电泳与转膜都要用新的，如果你用回收的也行。电泳时外槽可以用回收的，内槽必须用新的！转膜的就不必要用回收的吧
5、ERK 42、44容易分开，这几个蛋白很常见，很好做。上个月我做了技术服务就有ERK的蛋白，CST的抗体，效果非常好。
6、我做WB不管是磷酸化蛋白还是非磷酸化蛋白上样量在20-40ug之间，从来没有超过40ug。用BCA定量
7、把蛋白浓度调整成一致啊！上样量与上样体积都能调整成一致。
8、p-ERK无无干扰也有微量表达是对的，你想啊在正常生理状态下如果没有磷酸化蛋白执行功能机体怎么存活？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 10:37

另外，现在手头有师姐留下的actin，可以将就用来做内参嘛？

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可以做内参
但是需要用stripping buffer洗膜

作者: PINK 时间: 2013-3-7 10:38

1、8%的胶分离70-80效果要好于10%
2、重复3、4次，里面的BSA还没坏？
3、actin像括号是因为上样量太大，另外是转膜后抗体孵育不完全造成两边细
4、上样量控制的看预实验条带啊。。。
5、转膜我没用过恒压

===============================================================================================================

谢谢老师的解答，真是恍然大悟，今天换新抗体，加大孵育量试试。另外我转膜用的是bio-rad半干转印仪，电压不超过25V的那款，之前是想用恒流，120mA、200mA都试过，但电压会一直升最后超过25V，就不敢用了。是做三明治出问题了吗？因为恒压转最后电流也会下降。
另外丽春红染条带都很清晰，是不是能确定蛋白没降解？最终没条带就不是蛋白的问题了吧？

作者: 831226 时间: 2013-3-7 10:39

小弟有一不入流的问题请教一下，本人做的是IL-2、IL-10、IFN-r、IL-17、IL-23、MMP-2、MMP-9的WB，我想请教一下，我应该提取总蛋白呢还是别的呢？

作者: am10 时间: 2013-3-7 10:39

您好老师，您忘记回答我的问题了，因为做了很长时间一直这样，非常着急，所以冒昧又贴了一下
现在的问题是
做了很多次
考染和丽春红染都是35以下没有条带
所以怀疑样品蛋白含量低，所以想知道解决办法，是否需要做浓缩
我的样品是大鼠脊髓，每个只有大概三毫米长，两毫米直径
想请问具体如何浓缩

作者: abc816 时间: 2013-3-7 10:39

楼上的你好，我也有过这种经历，大概20以下就染不出来了，后来有一次无意中缩短了转膜时间竟然出来了，你要不换个转膜条件试试

作者: am10 时间: 2013-3-7 10:40

QUOTE:

原帖由 abc816 于 2013-3-7 10:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼上的你好，我也有过这种经历，大概20以下就染不出来了，后来有一次无意中缩短了转膜时间竟然出来了，你要不换个转膜条件试试

谢谢你的指点，我这个主要不是转过了，转过了可能小蛋白没有，然后缩短时间就可以，
我的问题是考染胶也没有的，
就是说电泳后那些条带胶上就没有
怎么转膜呢？
谢谢你啊

作者: abc816 时间: 2013-3-7 10:43

谢谢你的指点，我这个主要不是转过了，转过了可能小蛋白没有，然后缩短时间就可以，
我的问题是考染胶也没有的，
就是说电泳后那些条带胶上就没有
怎么转膜呢？
谢谢你啊

==================================================================

我是把转膜后的胶考染的，如果电泳完直接考染也没有，我也不清楚了，不好意思啊

作者: abc816 时间: 2013-3-7 10:43

谢谢你的指点，我这个主要不是转过了，转过了可能小蛋白没有，然后缩短时间就可以，
我的问题是考染胶也没有的，
就是说电泳后那些条带胶上就没有
怎么转膜呢？
谢谢你啊

=====================

先把你的蛋白电泳跑好！

作者: abc816 时间: 2013-3-7 10:57

谢谢老师的解答，真是恍然大悟，今天换新抗体，加大孵育量试试。另外我转膜用的是bio-rad半干转印仪，电压不超过25V的那款，之前是想用恒流，120mA、200mA都试过，但电压会一直升最后超过25V，就不敢用了。是做三明治出问题了吗？因为恒压转最后电流也会下降。
另外丽春红染条带都很清晰，是不是能确定蛋白没降解？最终没条带就不是蛋白的问题了吧？

=========================

超过25V就不行了？
没事
没有条带：1、目的蛋白降解
2、目的蛋白没有提取出来
3、抗体

作者: DONT 时间: 2013-3-7 11:10

提取膜蛋白的目的只是用于western-blot，我提的膜蛋白为45KD的7次跨膜蛋白（取材为脊髓），之前提取总蛋白，跑了好几次没有结果，所以打算提膜蛋白，RIPA量为脊髓重量*4、PMSF按100：1，匀浆后离心机800rpm，4度离心10分钟，所得上清液转入超速离心管。然后100000g，4度离心1小时，弃去上清，取沉淀。不知道这样可不可以，如果可以那沉淀怎么处理？

如果做WB的话没有必要单独提取膜蛋白

我用试剂盒提过膜蛋白，RIPA提取的是总蛋白
建议你加大样品的用量，这样才能提取到适量的膜蛋白

提取总蛋白效果还是不好，打算提膜蛋白，实验室有高速离心机，有什么好方法吗？谢谢版主！！

作者: memory 时间: 2013-3-7 11:10

如果做WB的话没有必要单独提取膜蛋白

我用试剂盒提过膜蛋白，RIPA提取的是总蛋白
建议你加大样品的用量，这样才能提取到适量的膜蛋白

===========================================================================

提取总蛋白效果还是不好，打算提膜蛋白，实验室有高速离心机，有什么好方法吗？谢谢版主！！

作者: utt0989 时间: 2013-3-7 11:11

LZ您好:
我做WB,内参是43kd,我的目的蛋白是59kd,用的MARKER是彩虹的，在目标蛋白段排列顺序是70kd(红色）下面是55kd和40kd.我在55kd处裁胶。但显影后发现，目标蛋白紧靠55kd(这理论上是这样），但我的内参也紧靠55kd.理论上应该靠近40kd.
我想问的是，为何内参与目的蛋白如此靠近，我用的是10%分离胶，5%浓缩胶。如我不裁胶，一起加一抗可行。正好我的目的蛋白和内参都是鼠源性的。谢谢

作者: okhaha 时间: 2013-3-7 11:11

楼主，最近做WB发现位置不对。本来90kD大小目的蛋白跑到120kD的位置，不知道怎么回事，请教一下。谢谢！

作者: wood533 时间: 2013-3-7 11:13

提取膜蛋白的目的只是用于western-blot，我提的膜蛋白为45KD的7次跨膜蛋白（取材为脊髓），之前提取总蛋白，跑了好几次没有结果，所以打算提膜蛋白，RIPA量为脊髓重量*4、PMSF按100：1，匀浆后离心机800rpm，4度离心10分钟，所得上清液转入超速离心管。然后100000g，4度离心1小时，弃去上清，取沉淀。不知道这样可不可以，如果可以那沉淀怎么处理？

如果做WB的话没有必要单独提取膜蛋白

我用试剂盒提过膜蛋白，RIPA提取的是总蛋白
建议你加大样品的用量，这样才能提取到适量的膜蛋白

提取总蛋白效果还是不好，打算提膜蛋白，实验室有高速离心机，有什么好方法吗？谢谢版主！！

===================================

如果用WB来检测
完全没有必要用膜提取试剂盒来提取蛋白
你做什么蛋白？

作者: wood533 时间: 2013-3-7 11:13

LZ您好:
我做WB,内参是43kd,我的目的蛋白是59kd,用的MARKER是彩虹的，在目标蛋白段排列顺序是70kd(红色）下面是55kd和40kd.我在55kd处裁胶。但显影后发现，目标蛋白紧靠55kd(这理论上是这样），但我的内参也紧靠55kd.理论上应该靠近40kd.
我想问的是，为何内参与目的蛋白如此靠近，我用的是10%分离胶，5%浓缩胶。如我不裁胶，一起加一抗可行。正好我的目的蛋白和内参都是鼠源性的。谢谢

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1、marker有可能不准，不要相信marker一定就准
2、不同胶浓度marker的表观位置是不一样的
3、可以一起加
先做好每个抗体单独的稀释度

作者: wood533 时间: 2013-3-7 11:14

楼主，最近做WB发现位置不对。本来90kD大小目的蛋白跑到120kD的位置，不知道怎么回事，请教一下。谢谢！

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1、marker有可能不准，不要相信marker一定就准
2、不同胶浓度marker的表观位置是不一样的
3、目的蛋白会有修饰等变化，分子量会发生改变

作者: wsll 时间: 2013-3-7 11:14

楼主，你真的很牛啊！
我今天才发现，目的蛋白糖基化后被修饰而改变大小，但是，我怎么去证明被糖基化了呢？目的蛋白是膜蛋白！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 11:20

楼主，你真的很牛啊！
我今天才发现，目的蛋白糖基化后被修饰而改变大小，但是，我怎么去证明被糖基化了呢？目的蛋白是膜蛋白！

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这个我就不太懂了
建议你看看相关蛋白糖基化方面的文献
我记得有一本书好像名称是糖基化蛋白
你可以搜搜看

作者: 66+77 时间: 2013-3-7 11:20

如果用WB来检测
完全没有必要用膜提取试剂盒来提取蛋白
你做什么蛋白？

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大麻素受体

作者: yonger 时间: 2013-3-7 11:24

楼主你好啊：
这里很热闹啊！我是做western blot的新手，已经做了一个月了，前面的蛋白提取、电泳转膜都没问题，我转膜后都用丽春红染色了，转莫很好。我的上样量是40ug，蛋白浓度差不多都是4-6ug/ul。转膜之后5%脱脂奶粉封闭室温1h，一抗是abcam的原装抗体，比例是1:1000（兔多克隆），4度过夜，次日洗膜TBS10分钟*3次，二抗（抗兔）1:6000室温1h，洗膜TBS10分钟*3次，配制发光液，但是整张膜都在发光，也可以看到目的条带在发光，我改怎么调整啊！做了很久了，很苦恼啊！我也怀疑是没洗干净，或封闭不好，但是别的蛋白也是这么做的，没出现这种情况，为此我每次洗膜的时候倒很多TBS，封闭的时候也用很多脱脂奶粉，还是这样啊！
注：抗体没问题，都是新买的

作者: yonger 时间: 2013-3-7 11:25

老师您好：
我在做脑组织膜蛋白，western .一直都没有做出来，之前做细胞系，小肠的全都做出来了，可脑组织的就是做不出来，不知道脑组织膜蛋白提取与其他部位有什么不同，特殊的么？非常感谢!

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-7 11:26

您好，我这段时间一直在做WB，但是一直没有做好，所以想向您请教几个问题，还麻烦您能给予指导：
1，我的目的蛋白在50到65kb之间，我用的胶是12%，跑胶时的电压分别是：浓缩胶100v，分离胶80v，大概一个半小时跑完，我的这一步的问题是：我的蛋白marker跑胶之后，条带很淡，而在别人的电泳装置上，用我的marker，跑的却比较好，不知何故？
2，转膜：我用的半干转，我原来用的电流是35mA，1小时20分钟，现在用的是50mA,50min，一抗稀释比1:5000到10000，我的问题是：转膜时，我本来就很弱的蛋白marker条带，转到膜上更少，最后发光显影时，条带现在很弱。是不是我转膜的时间和电流不够啊，我想问楼主半干转时转膜的时间和电流多少为宜啊？
十分的感谢！

作者: summerxx 时间: 2013-3-7 11:26

高手如云啊！现在也在做WB，遇到很多问题，会经常来向大家请教的，呵呵

作者: ending 时间: 2013-3-7 11:27

老师，你好。请教下。我最近做了很多次。总是效果不好。我把我的条件说下
1.目的蛋白是HIF-a。130kd
2.浓缩胶的浓度为5%，分离胶为8%。胶的厚度为1mm。上样量为30ul
3.浓缩胶时电压120V，分离胶180V.跑到最大的MARKER 170KD到分离胶后我就停了，大约为210min
4.转膜是湿转，膜为PVDF（孔径不太清楚，好像是0.2的）用的BIO-RAD transfer，300mA横流转250min.
5.封闭液为5%的脱脂奶粉，37°封闭2h
6.一抗为SIGMA的，用TBST稀释，1:200. 4°过夜
7.二抗是SIGMA的，用TBST稀释，1:200，37°2个小时
8.显影液为碧云天的ECL。显影时间为1min
9.每次洗涤用TBST 3*10MIN
10.抗体是重复使用的（我老板告诉我，他在美国的实验室一抗可以用3个月、二抗可以用一个月，所以只能重复使用啦）
出现的问题是
1.在MARKER 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线。
2.背景很高，有时候刚好把条带遮住，我相当的郁闷。
3.降低二抗的浓度，有可能显影后没有条带

我想问的问题：
1.为什么 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线？是弥散还是甚么问题？
2.湿转何如知道多少分子量要用多少的电流转多久？
3.湿转是不是很容易使蛋白弥散？
4.如何调整抗体的浓度及比例？
5.对ECL如何使用才能得到好的结果？

麻烦老师帮我解答下。万分感谢！

作者: H2O 时间: 2013-3-7 11:28

老师您好：
我在做脑组织膜蛋白，western .一直都没有做出来，之前做细胞系，小肠的全都做出来了，可脑组织的就是做不出来，不知道脑组织膜蛋白提取与其他部位有什么不同，特殊的么？非常感谢!

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小肠也是组织啊
脑组织蛋白的提取没什么特殊的要求
同小肠组织蛋白提取

作者: H2O 时间: 2013-3-7 11:29

您好，我这段时间一直在做WB，但是一直没有做好，所以想向您请教几个问题，还麻烦您能给予指导：
1，我的目的蛋白在50到65kb之间，我用的胶是12%，跑胶时的电压分别是：浓缩胶100v，分离胶80v，大概一个半小时跑完，我的这一步的问题是：我的蛋白marker跑胶之后，条带很淡，而在别人的电泳装置上，用我的marker，跑的却比较好，不知何故？
2，转膜：我用的半干转，我原来用的电流是35mA，1小时20分钟，现在用的是50mA,50min，一抗稀释比1:5000到10000，我的问题是：转膜时，我本来就很弱的蛋白marker条带，转到膜上更少，最后发光显影时，条带现在很弱。是不是我转膜的时间和电流不够啊，我想问楼主半干转时转膜的时间和电流多少为宜啊？
十分的感谢！

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1、配的胶也一样吗？
2、多大的膜？建议用1.2mA/平方厘米膜面积，恒流。转膜1h30mmin

作者: H2O 时间: 2013-3-7 11:30

老师，你好。请教下。我最近做了很多次。总是效果不好。我把我的条件说下
1.目的蛋白是HIF-a。130kd
2.浓缩胶的浓度为5%，分离胶为8%。胶的厚度为1mm。上样量为30ul
3.浓缩胶时电压120V，分离胶180V.跑到最大的MARKER 170KD到分离胶后我就停了，大约为210min
4.转膜是湿转，膜为PVDF（孔径不太清楚，好像是0.2的）用的BIO-RAD transfer，300mA横流转250min.
5.封闭液为5%的脱脂奶粉，37°封闭2h
6.一抗为SIGMA的，用TBST稀释，1:200. 4°过夜
7.二抗是SIGMA的，用TBST稀释，1:200，37°2个小时
8.显影液为碧云天的ECL。显影时间为1min
9.每次洗涤用TBST 3*10MIN
10.抗体是重复使用的（我老板告诉我，他在美国的实验室一抗可以用3个月、二抗可以用一个月，所以只能重复使用啦）
出现的问题是
1.在MARKER 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线。
2.背景很高，有时候刚好把条带遮住，我相当的郁闷。
3.降低二抗的浓度，有可能显影后没有条带

我想问的问题：
1.为什么 130KD处的那个条带很模糊或者看不到，在75KD左右出现2条带，这两条带很浓密而且每条都连成一条线？是弥散还是甚么问题？
2.湿转何如知道多少分子量要用多少的电流转多久？
3.湿转是不是很容易使蛋白弥散？
4.如何调整抗体的浓度及比例？
5.对ECL如何使用才能得到好的结果？

麻烦老师帮我解答下。万分感谢！

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1、连在一起时蛋白上样量大
2、湿转，1mm厚度胶，恒流，300mA，2h至2h30min
3、不容易弥散
4、稀释抗体用封闭液
5、ECl的使用比较麻烦，你得慢慢摸索。均匀孵育后曝光时间的掌握比较麻烦

作者: wood533 时间: 2013-3-7 11:31

请问下老师。一抗、二抗孵育时间多久最好，一抗我一般都是用4°过夜的，但在室温下孵育6个小时经常没有结果。二抗有的说不超过1小时，有的说不超过2个小时，这个我也不清楚。是不是二抗浓度过高会使背景太高？我看网上说二抗浓度可以用的1：1500以上，但是我用二抗1:500基本上都没条带啦。是我显影有问题还是二抗的问题呢？谢谢老师帮我解答下，万分感谢

作者: NBA 时间: 2013-3-7 11:31

请问下老师。一抗、二抗孵育时间多久最好，一抗我一般都是用4°过夜的，但在室温下孵育6个小时经常没有结果。二抗有的说不超过1小时，有的说不超过2个小时，这个我也不清楚。是不是二抗浓度过高会使背景太高？我看网上说二抗浓度可以用的1：1500以上，但是我用二抗1:500基本上都没条带啦。是我显影有问题还是二抗的问题呢？谢谢老师帮我解答下，万分感谢

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1、一抗请不要在室温孵育6h，4度过夜可以
2、二抗30-40min足够
3、我用的二抗稀释度1:10000-50000，不同的二抗不一样，不要一概而言
不同厂家，不同来源，不同ECL对一抗、二抗稀释度都是不同的

作者: xingyi08 时间: 2013-3-7 11:32

我的图背景很恶心，像月球表面一样，但是我不知道是什么原因造成的，你帮我看看吧，还有条带连在一起是不是上样量太大的引起的，万分感谢。

图片附件: 33137732.jpg (2013-3-7 11:32, 8.86 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15104

作者: am10 时间: 2013-3-7 11:33

请教：本人做了5组片子，都出结果了，每组7例，每张片子都有实验组和对照组标本，共35个标本（人的组织），我想请教一下我的结果用目的蛋白量比上各自内参后的数值，得出来的结果我是不是可以分为实验组和对照组比较统计了？

有位同学告诉我因为每张片子的曝光率不同，他说要每组7个样中选择一例为1，其它的数值和它比较后得出的结果再分为实验组和对照组比较.这样不是每组都有一个1吗？五组有五个1？对吗？
结果可能是：1 0.83 0.57 0.93 1.21 1.02 1.01
1 0.98 1.12 .......
1 0.87 1.00......
1
1
然后统计的时候病例组：5 个1 ，0.83 1.21。。。。。
对照组 0.57 0.93。。。。。。

这样分析对吗?请老师指点一下，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-7 13:21

选择对照组为1

作者: ukonptp 时间: 2013-3-7 13:22

版主，您好！
我看许多人提出用0.1%SDS封闭浓缩胶，这是什么原因，起什么作用?
（我们平时以DDH2O清洗一下浓缩胶，只要是想清洗一下胶的凹槽）

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-7 13:23

请教一下版主,用Western blotting方法检测小鼠细胞中的Bid蛋白的表达情况,选用哪个公司的一抗好?有具体公司的联系方式吗?

作者: 987789 时间: 2013-3-7 13:24

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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版主您好，我现在在做一种细胞外基质糖蛋白versican，买过两种抗体st和ab的，一个是380kd，一个是70kd，试过不同的条件，做的时间也不短了，但是一直没有很好的阳性，偶尔出的话也是很不清楚，一直做得都是组织提的蛋白。
做过360kd的KI67，很容易就转出来了。一直怀疑是抗体的问题，70kd的抗体在09年nature上的文章中用过，结果很好，您能不能给我提点建议呢？比如说在转膜和组织蛋白提取方面，其实我觉得可能这两个环节可能对我的制约很大，蛋白提取我一直都是用的超声破碎组织（4度 30J）。谢谢！

作者: loli 时间: 2013-3-7 13:26

老师，您好！
做western blot有段时间了，现在出现了一个让我非常疑惑的事情，就是我的目的条带非常好，上样40微克，但是内参actin却基本上没有，有的居然还有两条actin条带，我买的是进口的actin，之前做的是actin非常粗但是现在却做不出来，请老师给点建议！谢谢！

图片附件: 75042973.jpg (2013-3-7 13:26, 35.67 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15105

作者: NBA 时间: 2013-3-7 13:29

老师，您好！
做western blot有段时间了，现在出现了一个让我非常疑惑的事情，就是我的目的条带非常好，上样40微克，但是内参actin却基本上没有，有的居然还有两条actin条带，我买的是进口的actin，之前做的是actin非常粗但是现在却做不出来，请老师给点建议！谢谢！

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如果操作没有问题
请考虑抗体
比如保存条件是不是符合厂家要求、能不能识别你的样品种属、冻融了多少次、污染等

作者: NBA 时间: 2013-3-7 13:35

版主您好，我现在在做一种细胞外基质糖蛋白versican，买过两种抗体st和ab的，一个是380kd，一个是70kd，试过不同的条件，做的时间也不短了，但是一直没有很好的阳性，偶尔出的话也是很不清楚，一直做得都是组织提的蛋白。
做过360kd的KI67，很容易就转出来了。一直怀疑是抗体的问题，70kd的抗体在09年nature上的文章中用过，结果很好，您能不能给我提点建议呢？比如说在转膜和组织蛋白提取方面，其实我觉得可能这两个环节可能对我的制约很大，蛋白提取我一直都是用的超声破碎组织（4度 30J）。谢谢！

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蛋白提取我一半不用超声
你是匀浆后超声还是只做超声提蛋白？

作者: lgm 时间: 2013-3-7 14:56

蛋白提取我一半不用超声
你是匀浆后超声还是只做超声提蛋白？

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我是取了肿瘤组织小块之后加裂解液，在裂解液里用小剪刀剪碎，而后再进行的超声破碎。因为我现在用的裂解液是RIPA，感觉裂解能力非常强（提细胞蛋白的话也需要进行超声，因为裂解后的液体都是粘稠的，应该是把核膜也裂解了核酸出来了吧！）。其实我也一直担心超声会不会把我的胞外基质蛋白降解了，搜了一些网上的方法看，大部分都没有用超声的。我提的蛋白做持家倒是没有什么问题，可能丰度太高吧！
最近重复做的WB，电泳用了4-7.5%的SDS-PAGE胶（380kd的蛋白），转膜液中含10%甲醇、0.1%SDS,300mA转了3h，一抗1:500，二抗1:3000，背景还可，就是条带是斑点状断续的。

作者: NBA 时间: 2013-3-7 14:57

我是取了肿瘤组织小块之后加裂解液，在裂解液里用小剪刀剪碎，而后再进行的超声破碎。因为我现在用的裂解液是RIPA，感觉裂解能力非常强（提细胞蛋白的话也需要进行超声，因为裂解后的液体都是粘稠的，应该是把核膜也裂解了核酸出来了吧！）。其实我也一直担心超声会不会把我的胞外基质蛋白降解了，搜了一些网上的方法看，大部分都没有用超声的。我提的蛋白做持家倒是没有什么问题，可能丰度太高吧！
最近重复做的WB，电泳用了4-7.5%的SDS-PAGE胶（380kd的蛋白），转膜液中含10%甲醇、0.1%SDS,300mA转了3h，一抗1:500，二抗1:3000，背景还可，就是条带是斑点状断续的。

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称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-7 15:09

请问版主“灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶.”——0.1%的SDS封胶这是为什么？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:12

请问版主“灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶.”——0.1%的SDS封胶这是为什么？谢谢！

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我没这么做过
也没碰到过这样做的
说的是第一次，不好意思啦

作者: utt0989 时间: 2013-3-7 15:14

称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

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因为超声仪实验室就有，觉得方便就用了，我们这边好多人都用的超声，下次用匀浆试试！
组织量和裂解液的比例，您给提个建议吧！是不是裂解不完全也可以提蛋白，还是最好裂解澄清呢？
您所说的梯度胶是怎么个配法呢？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:27

因为超声仪实验室就有，觉得方便就用了，我们这边好多人都用的超声，下次用匀浆试试！
组织量和裂解液的比例，您给提个建议吧！是不是裂解不完全也可以提蛋白，还是最好裂解澄清呢？
您所说的梯度胶是怎么个配法呢？
谢谢！

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梯度胶的配置参考《蛋白质技术手册》，有详细说明
一般情况组织重量：裂解液体积=1；9，常用
裂解不完全当然可以提取蛋白，只不过蛋白提取的量会少，或者部分不同部位的细胞提取少
离心后才能澄清啊

作者: xingyi08 时间: 2013-3-7 15:27

老师好，我的WB：蛋白A 127kD，蛋白B 37kD,均为核蛋白，我用RIPA提取蛋白。配8%分离胶，上样量50ug，电泳70V,30分钟，之后110V,60分钟。PVDF预先甲醇浸泡30分钟，转膜250mA,120分钟，封闭3小时，剪膜分两块，各自一抗孵育4度15小时，二抗室温1小时，结果37kD的蛋白隐约有条带，127kD的一片空白。

我的问题：
RIPA提取核蛋白可以吗？
这两个蛋白能否在同一条件做，胶浓度？转膜等条件？上述的操作有无明显错误的？
还有我的蛋白marker在红色72kD与绿色10kD之间理论上应该有5条带，而实验只见3条，不知何故？实验新手，请前辈指点，不胜感激！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:28

老师好，我的WB：蛋白A 127kD，蛋白B 37kD,均为核蛋白，我用RIPA提取蛋白。配8%分离胶，上样量50ug，电泳70V,30分钟，之后110V,60分钟。PVDF预先甲醇浸泡30分钟，转膜250mA,120分钟，封闭3小时，剪膜分两块，各自一抗孵育4度15小时，二抗室温1小时，结果37kD的蛋白隐约有条带，127kD的一片空白。

我的问题：
RIPA提取核蛋白可以吗？
这两个蛋白能否在同一条件做，胶浓度？转膜等条件？上述的操作有无明显错误的？
还有我的蛋白marker在红色72kD与绿色10kD之间理论上应该有5条带，而实验只见3条，不知何故？实验新手，请前辈指点，不胜感激！

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1、可以提取核蛋白
2、marker条带是由于8%的胶照成的，厂家卖的marker是有标准浓度的，才能跑出应有的条带
3、分子量跨度有点大，不建议一起做

作者: kuaizige 时间: 2013-3-7 15:30

版主好！我在做OCT4蛋白，但加完底物后如果立刻曝光就有很深的背景，但有条带，如果停上一两分钟就是空白，没有背景也没有条带，觉得是抗体浓度问题，就改变了不同的一抗浓度，效果不大，然后变二抗浓度为1：10000，但改了后就只能曝出空白板了，没有条带连背景也没有了。这是怎么回事呢？？还有，郁闷的是我连内参actin都做不出来，到底是怎么回事呢？？

作者: pencil菲 时间: 2013-3-7 15:31

请教楼主一个问题，我最近在做Western Blot，做的是TGFβ1/Smad信号通路，使用的是大鼠的肾组织，其中有一个目的蛋白是TGFβ1，但是我始终没有做出来，其他蛋白和内参都能做出来，借用别人的TGFβ1抗体还是没有。但是用R&D公司的TGFβ（1，2，3）不是TGFβ1做可以做出条带，位置大概在25KD偏下一点点，但不能确定是不是TGFβ1。我听别人说TGFβ1只能用培养的细胞的培养基做，他说TGFβ1是细胞因子，会分泌到外周，不知道是不是这样？所以我想问下能否用Western Blot做动物组织TGFβ1蛋白表达量的测定。我用的抗体是BIOWORLDE公司的，为Y369（附上抗体说明书）。请楼主帮帮忙。

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-7 15:31

您好！最近开始做westernblot，第一次试提了两种细胞的总蛋白用内参actin练手，暗室发光见很亮的条带，之后提取了实验需要的其他几种细胞总蛋白按照之前的实验条件做，重复了几次一直没有结果，调整个别条件发光时仍然没有见到光。
猜想可能是因为PVDF膜过期的原因，这周在实验室同学推荐的代理公司买了新的PVDF膜（同学用的PVDF膜就是在那儿买的，效果不错的）。前天电泳、转膜（半干转，转膜后用丽春红染膜marker、各泳道蛋白条带清晰可见）、5%奶粉室温封闭1h、4°摇床孵一抗过夜，第二天TBST洗一抗1次2min（之前都是洗3次5min，因为怀疑一抗被洗掉导致没有结果，所以只洗了1次），室温孵二抗2h，TBST洗膜2次、TBS洗膜1次，发光时仍没有一点光，丽春红染膜后整张膜都变成了红色。不明白为什么转膜后染膜明明是有蛋白条带的，怎么经过封闭、抗体孵育后，膜上的蛋白条带一条不剩呢？
请教了师兄建议用我的PVDF膜和同学的PVDF膜同时同条件做一次，昨天转膜后丽春红染两张膜都有条带，今天发光仍然是什么都没有，随后丽春红染两张膜出现了昨天同样的情况，我PVDF膜整张膜都是红色，同学的PVDF膜也一样，清水洗不掉的，可同学就是用这膜做的一直都很好。排除了PVDF膜的质量问题，可究竟是什么原因明明转入PVDF膜的蛋白条带都不见了，真是让人困惑啊~整个WB过程中所用的试剂都是按照标准WB步骤方法配制，应该可以排除试剂的问题，况且我第一次练手时是出了结果的。那还有什么可能原因呢？难道是所提取的蛋白样品有问题，烦请高手帮忙指点，谢谢了~

作者: mimili_901 时间: 2013-3-7 15:35

下面是我转膜后丽春红染膜的照片（减一角的是我的PVDF膜，另一个是同学的PVDF膜）

图片附件: 46972920.jpg (2013-3-7 15:36, 40.96 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15106

作者: mimili_901 时间: 2013-3-7 15:37

这是孵抗体、发光后丽春红染膜的照片：

图片附件: 99093442.jpg (2013-3-7 15:37, 42.29 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15107

作者: yjf1026 时间: 2013-3-7 15:38

做了好多次WB，总是发现曝光往往不尽如人意，我用的是FUJIFILM LAS 4000进行曝光，经常出现虽然有目的条带，但是背景色很浓的情况，不知道是什么原因？？
有人说这个可能和显影液有关，我用的是超敏的，有人建议我用下非超敏的，有人又说和显影液没有关系的？
我每次曝光时也没有对机子进行过任何的设置。。。是不是曝光时间过长了，我是10s每次？
我做出来的条带

图片附件: 29412128.gif (2013-3-7 15:38, 28.85 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15108

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:39

版主好！我在做OCT4蛋白，但加完底物后如果立刻曝光就有很深的背景，但有条带，如果停上一两分钟就是空白，没有背景也没有条带，觉得是抗体浓度问题，就改变了不同的一抗浓度，效果不大，然后变二抗浓度为1：10000，但改了后就只能曝出空白板了，没有条带连背景也没有了。这是怎么回事呢？？还有，郁闷的是我连内参actin都做不出来，到底是怎么回事呢？？

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继续稀释二抗试试
有可能二抗浓度太高，过量消耗底物造成

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:39

请教楼主一个问题，我最近在做Western Blot，做的是TGFβ1/Smad信号通路，使用的是大鼠的肾组织，其中有一个目的蛋白是TGFβ1，但是我始终没有做出来，其他蛋白和内参都能做出来，借用别人的TGFβ1抗体还是没有。但是用R&D公司的TGFβ（1，2，3）不是TGFβ1做可以做出条带，位置大概在25KD偏下一点点，但不能确定是不是TGFβ1。我听别人说TGFβ1只能用培养的细胞的培养基做，他说TGFβ1是细胞因子，会分泌到外周，不知道是不是这样？所以我想问下能否用Western Blot做动物组织TGFβ1蛋白表达量的测定。我用的抗体是BIOWORLDE公司的，为Y369（附上抗体说明书）。请楼主帮帮忙。
谢谢！！！

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分泌型如果培养的细胞能做出来
一般组织都能做出

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:39

您好！最近开始做westernblot，第一次试提了两种细胞的总蛋白用内参actin练手，暗室发光见很亮的条带，之后提取了实验需要的其他几种细胞总蛋白按照之前的实验条件做，重复了几次一直没有结果，调整个别条件发光时仍然没有见到光。
猜想可能是因为PVDF膜过期的原因，这周在实验室同学推荐的代理公司买了新的PVDF膜（同学用的PVDF膜就是在那儿买的，效果不错的）。前天电泳、转膜（半干转，转膜后用丽春红染膜marker、各泳道蛋白条带清晰可见）、5%奶粉室温封闭1h、4°摇床孵一抗过夜，第二天TBST洗一抗1次2min（之前都是洗3次5min，因为怀疑一抗被洗掉导致没有结果，所以只洗了1次），室温孵二抗2h，TBST洗膜2次、TBS洗膜1次，发光时仍没有一点光，丽春红染膜后整张膜都变成了红色。不明白为什么转膜后染膜明明是有蛋白条带的，怎么经过封闭、抗体孵育后，膜上的蛋白条带一条不剩呢？
请教了师兄建议用我的PVDF膜和同学的PVDF膜同时同条件做一次，昨天转膜后丽春红染两张膜都有条带，今天发光仍然是什么都没有，随后丽春红染两张膜出现了昨天同样的情况，我PVDF膜整张膜都是红色，同学的PVDF膜也一样，清水洗不掉的，可同学就是用这膜做的一直都很好。排除了PVDF膜的质量问题，可究竟是什么原因明明转入PVDF膜的蛋白条带都不见了，真是让人困惑啊~整个WB过程中所用的试剂都是按照标准WB步骤方法配制，应该可以排除试剂的问题，况且我第一次练手时是出了结果的。那还有什么可能原因呢？难道是所提取的蛋白样品有问题，烦请高手帮忙指点，谢谢了~

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1、细胞来源相同吗？确定抗体能识别的种属
2、查对一下你用的试剂与你同学用的之间有什么差别

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:39

做了好多次WB，总是发现曝光往往不尽如人意，我用的是FUJIFILM LAS 4000进行曝光，经常出现虽然有目的条带，但是背景色很浓的情况，不知道是什么原因？？
有人说这个可能和显影液有关，我用的是超敏的，有人建议我用下非超敏的，有人又说和显影液没有关系的？
我每次曝光时也没有对机子进行过任何的设置。。。是不是曝光时间过长了，我是10s每次？
我做出来的条带

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减小一抗、二抗浓度

作者: okhaha 时间: 2013-3-7 15:40

老师您好，我做western 快一年了，做小分子的western 都挺好p-akt，akt都很好，但eNOS,iNOS,P-eNOS 一直做不出来，转膜后用丽春红然后不出条带，

作者: kulee 时间: 2013-3-7 15:41

1、细胞来源相同吗？确定抗体能识别的种属
2、查对一下你用的试剂与你同学用的之间有什么差别

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细胞来源相同，都是人的，只是后者施加了干预；和同学的试剂没什么差别。
前天用湿转，内参已经有了结果，只是条带很暗，提高二抗浓度到1:3000，结果好像没什么改善。湿转比半干转能转移更多的蛋白，同学用半干转相同转膜条件、相同内参抗体、相同二抗浓度，他的条带就很亮，这是不是说明我的蛋白有所降解呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:41

老师您好，我做western 快一年了，做小分子的western 都挺好p-akt，akt都很好，但eNOS,iNOS,P-eNOS 一直做不出来，转膜后用丽春红然后不出条带，

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NOS用的是哪个公司的抗体？
用什么提取蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:41

细胞来源相同，都是人的，只是后者施加了干预；和同学的试剂没什么差别。
前天用湿转，内参已经有了结果，只是条带很暗，提高二抗浓度到1:3000，结果好像没什么改善。湿转比半干转能转移更多的蛋白，同学用半干转相同转膜条件、相同内参抗体、相同二抗浓度，他的条带就很亮，这是不是说明我的蛋白有所降解呢？

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换用你同学的样品试试

作者: wood533 时间: 2013-3-7 15:43

丙烯酰胺过期了能不能用？假如过期了，对实验有什么影响？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:44

丙烯酰胺过期了能不能用？假如过期了，对实验有什么影响？谢谢！

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不建议使用
ACR是起分子筛作用的
这个过期了分子筛作用就减弱了

作者: orangecake 时间: 2013-3-7 15:44

显影的时候我们都是先把膜用滤纸吸干，再涂发光剂，保鲜膜覆盖，压片。请问，有更好的方法吗？

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-3-7 15:45

你好，我有两个问题请教一下
1.我的WB重复性很不好，同样的条件，这一次很容易就能做出来，而下一次却怎么也做不出来，这期间试剂、抗体浓度、时间都没有改变，转膜完了立春红染色条带也很好，请问是怎么回事儿呢？

2.我的目的蛋白分子量在200KD左右，我用8%的胶跑电泳，条带出来经常是一个弥散型的，上下很宽，边缘也不清晰，但有几次却显的很好，条带细细的，这是为什么呢？

这个就是显的比较好的条带：

图片附件: 2v8oh9v.jpg (2013-3-7 15:45, 834 Bytes) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15109

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-3-7 15:45

这个是多数情况下的条带：

图片附件: 9zwrc9.jpg (2013-3-7 15:45, 2.82 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15110

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:46

QUOTE:

原帖由 hot_hot_hot 于 2013-3-7 15:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你好，我有两个问题请教一下
1.我的WB重复性很不好，同样的条件，这一次很容易就能做出来，而下一次却怎么也做不出来，这期间试剂、抗体浓度、时间都没有改变，转膜完了立春红染色条带也很好，请问是怎么回事儿呢？

2.我的目的蛋白 ...

电泳完成后染过胶吗？

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-3-7 15:46

没有染过，有什么问题么？

作者: xue258 时间: 2013-3-7 15:47

回答楼上的问题：
1.我们做western的重复性都很好，很稳定，但是我相信只要是实验条件一样的话，应该是经得起重复的。
2.关于跑胶的问题，本实验室的条件是先100伏跑十分钟，然后加大电压到160，一直跑到底。这样做的目的是使sample跑胶时在同一水平。还有就是sample之间蛋白量要严格一致，这点要注意。

作者: zhenxin 时间: 2013-3-7 15:48

称取组织重量后，在冰上把组织剪碎
加入裂解液用电动匀浆器等匀浆，干嘛用超声？？？
如果提取出来的粘稠，可以用DNase I或者超声短暂处理一下
380K蛋白可以用梯度胶做

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版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

作者: 831226 时间: 2013-3-7 15:48

1.我们做western的重复性都很好，很稳定，但是我相信只要是实验条件一样的话，应该是经得起重复的。
2.关于跑胶的问题，本实验室的条件是先100伏跑十分钟，然后加大电压到160，一直跑到底。这样做的目的是使sample跑胶时在同一水平。还有就是sample之间蛋白量要严格一致，这点要注意。

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谢谢你的答复

1.我的WB的条件没有变动过，每次都按一样的条件进行的，而且做的过程中也仔细观察，就是为了防止出现什么意外；
2.我们实验室WB跑胶一直用的是恒流的方法，20mA跑10min左右，然后25mA到底这样子的

作者: 831226 时间: 2013-3-7 15:49

版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

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找到了：
“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

作者: duoduo 时间: 2013-3-7 15:50

您好，请教个问题
我要跑凋亡相关的蛋白，提取细胞蛋白时一定要收集漂浮细胞吗？
原先做时都是去上清，pbs洗后，加裂解液用刮刀刮的

作者: ending 时间: 2013-3-7 15:51

我想请问：
1.可否试着在8%的胶跑两个蛋白：127、37KD?湿转的转膜条件怎样较好？
2、电泳液、电转液一般用几次就要更换？如何判断失效不能用？
3、如何判断一抗是否失效？
4、曝光时，发光液加在PVDF膜上，是否一定要区分膜与凝胶接触的那一面？加完发光液是否要等待几分钟再压片？若压片十分钟后条带很淡，可否再压新片至三十分钟，条带会否浓些？

恳请指教，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:55

版主您好，匀浆的方法又提了蛋白，感觉还行，因为没有配梯度胶的仪器，还是用的4%浓缩胶和7.5%分离胶，但是380kd的versican还是做的不行，曝光要么有时能出带，但是感觉像是在点样孔的位置，因为我的浓缩胶基本上没切，只把竖条切了，怀疑是非特异；要么什么都没有。
曝完光之后，用立春红染了膜，虽然有带，但是好像是在点样孔以及浓缩胶与分离胶的界线处，是不是这些位置经常会出非特异的带呢？谢谢
还有一个小问题：转膜的时候选择稳压或者稳流有什么区别么？在什么情况下选择什么条件呢？谢谢

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1、7.5%的胶marker你跑到什么位置？
2、最好把浓缩胶切掉
3、稳压与稳流都有人采用，我用稳流，取决于实验室及个人的习惯

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:55

您好，请教个问题
我要跑凋亡相关的蛋白，提取细胞蛋白时一定要收集漂浮细胞吗？
原先做时都是去上清，pbs洗后，加裂解液用刮刀刮的

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贴壁还是悬浮细胞？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:56

我想请问：
1.可否试着在8%的胶跑两个蛋白：127、37KD?湿转的转膜条件怎样较好？
2、电泳液、电转液一般用几次就要更换？如何判断失效不能用？
3、如何判断一抗是否失效？
4、曝光时，发光液加在PVDF膜上，是否一定要区分膜与凝胶接触的那一面？加完发光液是否要等待几分钟再压片？若压片十分钟后条带很淡，可否再压新片至三十分钟，条带会否浓些？

恳请指教，谢谢！

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1、这两个蛋白最好分开做，转膜时间不同
2、每次我都是用新的
3、一抗是否失效：A，你的WB操作没问题，B加上阳性对照样品
4、加完ECL需要有一个孵育的过程，时间按照说明书来。压片30min不会比10min要强

作者: qiangren789 时间: 2013-3-7 15:56

我最近跑的wb泳道出现非特异。很奇怪，泳道之间都很干净，也没什么背景，但是，泳道却显现出来了。这是为什么？

作者: plaa 时间: 2013-3-7 15:57

1、7.5%的胶marker你跑到什么位置？
2、最好把浓缩胶切掉
3、稳压与稳流都有人采用，我用稳流，取决于实验室及个人的习惯

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谢谢！
7.5%的胶，marker中70kd的红带跑到下2/3处了。
昨天做了一块5%浓缩胶-10%分离胶，将早先变性后的蛋白加了些DTT又跑了一次电泳。同时又重复做了前面没有做出来的70kd的抗体和出带不稳定的380kd的抗体，切胶转了两块膜，参考站友建议，70kd用160mA 2h，380kd用160mA 3h（这次还是带着浓缩胶了），一抗浓度都提到了1:300，这次比较幸运的是70kd的竟然出了，趋势与实时结果也能对应，有可能是由于抗原抗体结合的不是很好，以前用的抗体浓度低（1:500）做不出来，还有可能是以前转膜的条件不适合，计划明天再重复一次；380kd还是在比较高的浓缩胶的位置有特异的带，非常强的荧光，感觉也是符合趋势，而后用立春红染了膜，大约在荧光的位置确实有非常漂亮的细带，与趋势一致，明天重复。不知道上面的情况是不是我所说的“鬼带”，只是补加了DTT之后好像没有效果，还是我加的DTT量不够？(蛋白变性的时候我一般都是沸水煮8min的,这个条件应该可以吧？)

作者: NBA 时间: 2013-3-7 15:58

我最近跑的wb泳道出现非特异。很奇怪，泳道之间都很干净，也没什么背景，但是，泳道却显现出来了。这是为什么？

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可能是电泳缓冲液污染之类的

作者: yes4 时间: 2013-3-7 15:59

贴壁还是悬浮细胞？

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原来是贴壁的，加药后部分细胞死亡漂起来了

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-7 15:59

您好：我做WB已经快两个月，但一直都没得到理想的结果，十分的纠结：
我做的是磷酸化的蛋白，目的蛋白分子量在6KD，以前是勉强能曝出背景的不知道是什么的条带，现在换了二抗后，直接什么也没有了，实验室的博士说是我的胶有问题以及转膜的问题，不知道《10KD的蛋白应该用什么样浓度的胶，以及转膜的电流应该多大，我现在是一片茫然，还望高手不吝赐教.

作者: DONT 时间: 2013-3-7 16:00

下面是我最近作的一次western：
样品：核蛋白（来源小鼠心肌组织）, 20ug/孔。蛋白是用PIERCE的试剂盒提取的。
待检测的目的蛋白：磷酸化的HDAC4
凝胶：6.0%，80V 20分钟，然后120V 60分钟。
转膜：湿转1.5小时（跑胶和转膜都是用的BioRad系统)
封闭：5% BSA
一抗：Rabbit polyclonal anti- phospho-HDAC4,( cell signalling)1:1500， 4度过夜
二抗：Rabbit IgG secondary antibody - H&L ( abcam ), 1:5000，室温1个半小时

我的问题是：为什么条带中间会出现弯曲？还有，为什么中间几个泳道变得很窄呢？这张还好一点，有几次缩的更厉害。

图片附件: 53564193.snap.jpg (2013-3-7 16:00, 9.54 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15111

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:00

原来是贴壁的，加药后部分细胞死亡漂起来了

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这个问题需要你通过文献来确定
我不是搞凋亡的。。。
促凋亡药物刺激后不同时间点细胞的细胞死亡率不同，到最后你能收集到的细胞就不多了

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:01

您好：我做WB已经快两个月，但一直都没得到理想的结果，十分的纠结：
我做的是磷酸化的蛋白，目的蛋白分子量在6KD，以前是勉强能曝出背景的不知道是什么的条带，现在换了二抗后，直接什么也没有了，实验室的博士说是我的胶有问题以及转膜的问题，不知道《10KD的蛋白应该用什么样浓度的胶，以及转膜的电流应该多大，我现在是一片茫然，还望高手不吝赐教.

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6KD的蛋白不好做
你查查Tris-Tricine系统
换了二抗直接什么都没有那就是二抗的问题（比如不同批次二抗稀释度不同等）

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:02

下面是我最近作的一次western：
样品：核蛋白（来源小鼠心肌组织）, 20ug/孔。蛋白是用PIERCE的试剂盒提取的。
待检测的目的蛋白：磷酸化的HDAC4
凝胶：6.0%，80V 20分钟，然后120V 60分钟。
转膜：湿转1.5小时（跑胶和转膜都是用的BioRad系统)
封闭：5% BSA
一抗：Rabbit polyclonal anti- phospho-HDAC4,( cell signalling)1:1500， 4度过夜
二抗：Rabbit IgG secondary antibody - H&L ( abcam ), 1:5000，室温1个半小时

我的问题是：为什么条带中间会出现弯曲？还有，为什么中间几个泳道变得很窄呢？这张还好一点，有几次缩的更厉害。

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1、一抗的浓度有点高，需要继续稀释，试试1:3000
2、中间条带弯曲基本属于正常现象
3、泳道变窄与相邻泳道间样品蛋白量、体积、离子强度、梳孔好坏等有关
4、延长分离胶聚合时间

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-7 16:03

我是WB新手，想请教下
转膜时衡流300mA，在整个转膜过程中电压不断下降由100多下降到了64V是不是不正常啊？因为老实说不进行降温，所以过程中我没有给电泳槽降温，它很热，是因为温度高电压才下降的吗？

作者: vivian4123 时间: 2013-3-7 16:03

老师好：最近要做WB了。有几个问题想问一下：
1，我想做大鼠脑部黑质部位的表达蛋白的WB,取材的时候必须要精确取黑质部位，再提蛋白吗，还是只要取个大致的位置就行了？
2，WB是不是不能定位呢？怎么样能够既做WB又能定位呢？就是确定某个蛋白是某个特定细胞表达的。

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:04

我是WB新手，想请教下
转膜时衡流300mA，在整个转膜过程中电压不断下降由100多下降到了64V是不是不正常啊？因为老实说不进行降温，所以过程中我没有给电泳槽降温，它很热，是因为温度高电压才下降的吗？

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下降是正常

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:04

老师好：最近要做WB了。有几个问题想问一下：
1，我想做大鼠脑部黑质部位的表达蛋白的WB,取材的时候必须要精确取黑质部位，再提蛋白吗，还是只要取个大致的位置就行了？
2，WB是不是不能定位呢？怎么样能够既做WB又能定位呢？就是确定某个蛋白是某个特定细胞表达的。

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1、精确定位的事情只能由你自己来做啦
2、一般的WB做不到定位及定量，你可以结合IHC
3、有一种WB方法叫：tissue western blot，但是好像也不能定量。只看过文献，没操作过

作者: remenb 时间: 2013-3-7 16:05

楼主好啊：
我最近做的几次WB，目的蛋白条带不是所有样品孔都会发光，一般九个条带只有四五个会亮，把膜做了丽春红染色没问题，同一张膜做了内参也没问题，不知是怎么回事啊！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:06

楼主好啊：
我最近做的几次WB，目的蛋白条带不是所有样品孔都会发光，一般九个条带只有四五个会亮，把膜做了丽春红染色没问题，同一张膜做了内参也没问题，不知是怎么回事啊！

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目的一抗孵育情况如何？孵育体积多大？

作者: TAT 时间: 2013-3-7 16:06

请教专家一下：我最近做了几次western-blotting，同样的样品，同样的操作方式，用的试剂也是一样的配制方法，但是就是结果背景很高，都看不见条带，仔细看还是能看到有目的蛋白条带的，就是背景给覆盖住了。
我的一些实验参数：
1、12%的分离胶，5%的浓缩胶；
2、目的蛋白分子量为10～15kd之间；
3、电泳时，60v恒压跑上胶，90v恒压跑完下胶，转膜时两层海绵+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+两层海绵，320mA，1.5h；
4、用5%BSA封闭了1.5～2h左右，一抗用5%BSA稀释（1：1000），一抗孵育一般是4度16小时左右，二抗是用5%脱脂奶粉稀释（1：5000），RT，1～1.5h
基本上每次都是这样的操作，但是之前都能显示出目的蛋白条带，最近的结果却是背景相当高，在暗室时加ECL发光物后就能看见膜一片光亮的，不知道问题在哪？请教专家们帮忙解决，谢谢啦～

作者: lxh031 时间: 2013-3-7 16:07

专家您好：
我做westernblot, 最后一步是用 GE Amerhsam ECL western blotting 检测液，原来一直是4 度保存，可是上个星期实验室有人把冰箱温度调低了，今天发现显影剂都冻上了，请问这样的话显影剂解冻后还可以再用吗？

谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:07

请教专家一下：我最近做了几次western-blotting，同样的样品，同样的操作方式，用的试剂也是一样的配制方法，但是就是结果背景很高，都看不见条带，仔细看还是能看到有目的蛋白条带的，就是背景给覆盖住了。
我的一些实验参数：
1、12%的分离胶，5%的浓缩胶；
2、目的蛋白分子量为10～15kd之间；
3、电泳时，60v恒压跑上胶，90v恒压跑完下胶，转膜时两层海绵+三层滤纸+胶+膜+三层滤纸+两层海绵，320mA，1.5h；
4、用5%BSA封闭了1.5～2h左右，一抗用5%BSA稀释（1：1000），一抗孵育一般是4度16小时左右，二抗是用5%脱脂奶粉稀释（1：5000），RT，1～1.5h
基本上每次都是这样的操作，但是之前都能显示出目的蛋白条带，最近的结果却是背景相当高，在暗室时加ECL发光物后就能看见膜一片光亮的，不知道问题在哪？请教专家们帮忙解决，谢谢啦～

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稀释二抗至1:10000，1:20000试试
二抗孵育 30-40min
二抗孵育液用BSA

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:08

专家您好：
我做westernblot, 最后一步是用 GE Amerhsam ECL western blotting 检测液，原来一直是4 度保存，可是上个星期实验室有人把冰箱温度调低了，今天发现显影剂都冻上了，请问这样的话显影剂解冻后还可以再用吗？

谢谢！

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应该可以
你做个预实验试试

作者: DNA 时间: 2013-3-7 16:15

老师你好
我每次提的细胞蛋白浓度都很低 0.3-0.5毫克每毫升
我用的是六孔板吸去上清用PBS洗三遍没孔加200微升RIPA和2微升PMSF在冰上三十分钟然后用枪头（因为没有细胞刮刀）刮或不刮我都试过。怎么每次的蛋白浓度都很低呀我的操作有没有问题呀请老师指教谢谢！

作者: 8s5g 时间: 2013-3-7 16:16

有个问题麻烦您给我帮个忙！
原来的wb作的好好的，但是最近几天发现条越来越浅，最后几天根本做不出来了，一抗akt 是cst的（1：1000），beta-actin(1:2000)是康为的,二抗都是康为的。是这样：头几次实验，我加完ecl 5分钟后，暗室发光没有带，然后我把膜放在tbst 里跑了一会，接着又加了ecl 5分钟后，再去暗室发光，就有带了，这是怎么回事。我怀疑是2抗的浓度太高，就少加了2抗（1：8000），结果根本没带。一抗孵育4h ,rt,2抗1小时，封闭半小时！

作者: finger 时间: 2013-3-7 16:17

楼上：
一抗不要再室温孵育这么长时间！
二抗孵育30-40min，康为的二抗请用1:10000稀释
康为的ECL？

作者: finger 时间: 2013-3-7 16:18

老师你好
我每次提的细胞蛋白浓度都很低 0.3-0.5毫克每毫升
我用的是六孔板吸去上清用PBS洗三遍没孔加200微升RIPA和2微升PMSF在冰上三十分钟然后用枪头（因为没有细胞刮刀）刮或不刮我都试过。怎么每次的蛋白浓度都很低呀我的操作有没有问题呀请老师指教谢谢！

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1、提取蛋白前先加PMSF到RIPA中混匀再加入6孔板提取蛋白。PMSF加入RIPA后到加入到6孔板不要超过30min，如果超过30min没开始提取蛋白，请重新加PMSF
2、RIPA加100ul就够了

作者: mamamiya 时间: 2013-3-7 16:18

1、提取蛋白前先加PMSF到RIPA中混匀再加入6孔板提取蛋白。PMSF加入RIPA后到加入到6孔板不要超过30min，如果超过30min没开始提取蛋白，请重新加PMSF
2、RIPA加100ul就够了

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1、我是提前把PMSF加到RIPA中混匀再加入6孔板的。
2、我下次加100ul试试。O(∩_∩)O~

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:19

、我是提前把PMSF加到RIPA中混匀再加入6孔板的。
2、我下次加100ul试试。O(∩_∩)O~

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细胞最好长满90%

作者: avi317 时间: 2013-3-7 16:20

两个目的蛋白，95kD和50kD大小，以前用300mA，但是温度降不下来，而且，发现曝出来的条带两头大，中间很淡，所以想减少电流。分别用200mA 2小时和200mA 1小时可否啊？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:21

QUOTE:

原帖由 avi317 于 2013-3-7 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
两个目的蛋白，95kD和50kD大小，以前用300mA，但是温度降不下来，而且，发现曝出来的条带两头大，中间很淡，所以想减少电流。分别用200mA 2小时和200mA 1小时可否啊？谢谢！ ...

1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-7 16:22

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要号一下嘛？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 16:23

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要号一下嘛？

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可以用冰袋给它降温啊

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-7 18:23

1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要好一些嘛？

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-7 18:24

300mA 2h
北京六一电泳仪，是否太大了？

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-7 18:24

相关疾病：
白血病
大家好，我用RIPA提取白血病细胞总蛋白，蛋白浓度2-3ug/ul,做hTERT(端粒酶逆转录酶 127KD，核蛋白)的WB。分离胶8%，上样量30-60ug，湿转250-300mA,120min.PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗 ab32020 1：1000-750 4度过夜，二抗1：3000-5000 2小时，ECL发光，加了发光液始终不见荧光，曝光时间5-30分钟，做了七八次了，始终没条带。极度郁闷！

我的疑问：
是否换用核蛋白提取试剂提取蛋白会好些？有何推荐吗？
ABCAM 该一抗出了问题？
或者其他步骤可以再改进的？
请指点迷津，不胜感激！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:25

1、可以同时转膜，300mA 2h
2、中间很淡这种情况考虑电泳上样量是不是有点大，抗体孵育是否完全等

但是温度将不下来，转膜液的温度很高。我以前是用300mA1小时20分钟，不是说低电流转膜效果要好一些嘛？

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呵呵
可以试试

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:26

大家好，我用RIPA提取白血病细胞总蛋白，蛋白浓度2-3ug/ul,做hTERT(端粒酶逆转录酶 127KD，核蛋白)的WB。分离胶8%，上样量30-60ug，湿转250-300mA,120min.PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗 ab32020 1：1000-750 4度过夜，二抗1：3000-5000 2小时，ECL发光，加了发光液始终不见荧光，曝光时间5-30分钟，做了七八次了，始终没条带。极度郁闷！

我的疑问：
是否换用核蛋白提取试剂提取蛋白会好些？有何推荐吗？
ABCAM 该一抗出了问题？
或者其他步骤可以再改进的？
请指点迷津，不胜感激！

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ECL是哪的？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:26

00mA 2h
北京六一电泳仪，是否太大了？

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DYY-6C，7C都可以达到400mA

作者: avi317 时间: 2013-3-7 18:27

300mA 2小时会不会转过了啊？
95kD和50kD大小，分别用200mA 2.5小时和200mA 1.5小时可否啊？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:28

QUOTE:

原帖由 avi317 于 2013-3-7 18:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
300mA 2小时会不会转过了啊？
95kD和50kD大小，分别用200mA 2.5小时和200mA 1.5小时可否啊？谢谢！

300mA 2h当然不会转过

作者: avi317 时间: 2013-3-7 18:29

50kD大小的蛋白不能用这样的条件吧？
我转1.5小时，膜上的marker就不清楚了啊？
这是怎么回事？

作者: avi317 时间: 2013-3-7 18:29

请教：杂带很多怎么办呢？封闭2小时，5%牛奶。

作者: yes4 时间: 2013-3-7 18:30

您好，我请教您一个问题，我最近检测磷酸化的ATM(350KD)，应该选用多大的分离胶和浓缩胶，如果带上actin内参该如何配胶。湿转的条件是什么？（我用8%分离胶和5%的浓缩胶，浓缩胶80v，进入分离胶120v直到72kd的marker跑到底大约5h，湿转0.1%sds，10%甲醇，20mA4度过夜，这个条件行吗？）

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:32

请教：杂带很多怎么办呢？封闭2小时，5%牛奶。

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封闭室温30min就行

试用3% BSA

做一抗不同的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:32

50kD大小的蛋白不能用这样的条件吧？
我转1.5小时，膜上的marker就不清楚了啊？
这是怎么回事？

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转缓过热

作者: NBA 时间: 2013-3-7 18:36

您好，我请教您一个问题，我最近检测磷酸化的ATM(350KD)，应该选用多大的分离胶和浓缩胶，如果带上actin内参该如何配胶。湿转的条件是什么？（我用8%分离胶和5%的浓缩胶，浓缩胶80v，进入分离胶120v直到72kd的marker跑到底大约5h，湿转0.1%sds，10%甲醇，20mA4度过夜，这个条件行吗？）

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转膜过夜可以
加20% 甲醇，转膜时降温

也可以试试300mA 3-3.5h

作者: mamamiya 时间: 2013-3-7 18:37

ECL是哪的？

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fang老师，ECL 是普利莱的，应该没问题，因为我的内参荧光是很强的，条带也浓。

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:03

ECL 是普利莱的，应该没问题，因为我的内参荧光是很强的，条带也浓。

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呵呵
很好

那你就调整一抗浓度与上样量及蛋白提取

注意ECL敏感性！

作者: 987789 时间: 2013-3-7 19:04

转膜过夜可以
加20% 甲醇，转膜时降温

也可以试试300mA 3-3.5h

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因为我这里配不了梯度胶，我想问问最好配多大的分离胶和浓缩胶？（不考虑内参的话，我的蛋白350KD）

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:04

因为我这里配不了梯度胶，我想问问最好配多大的分离胶和浓缩胶？（不考虑内参的话，我的蛋白350KD）

=======================

可以用7.5或者8%分离胶
浓缩胶4%

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-7 19:05

谢谢您的指教.
下面是我今天刚做的一张westernblot,
样品:小鼠心肌
上样量:15ug/孔,封闭:5%BSA
一抗:1:1500
二抗:1:10000
不知道为什么,到数第二个孔会突然缺了呢?
很是郁闷啊,又得重做一遍.

作者: wood533 时间: 2013-3-7 19:06

下面是我今天刚做的一张westernblot,
样品:小鼠心肌
上样量:15ug/孔,封闭:5%BSA
一抗:1:1500
二抗:1:10000
不知道为什么,到数第二个孔会突然缺了呢?
很是郁闷啊,又得重做一遍.

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1、一抗还可以继续稀释1:3000
2、转膜可能那个地方没转好
3、一抗孵育体系的体积最好能大些，比如5ml，要充分均匀覆盖膜

作者: wood533 时间: 2013-3-7 19:07

您好，做WB一段时间了，今天做出来的条带竟然是连成一条直线的，理应空白的地方反而浓聚得很厉害，但是内参GAPDH却是正常的，条带间也是分隔开的，而且目标蛋白的形态也发生了变化。有人说是因为漏胶的原因，但是如果是这个原因为什么内参却没有出现这个问题。
我的上样量为40ug，应该也不算太多吧，以前同样的标准进行都没有什么太大的问题。。。
我现在是相当地困惑啊！！谢谢指导了哦

上面是内参，下面是目标蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:07

QUOTE:

原帖由 wood533 于 2013-3-7 19:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

您好，做WB一段时间了，今天做出来的条带竟然是连成一条直线的，理应空白的地方反而浓聚得很厉害，但是内参GAPDH却是正常的，条带间也是分隔开的，而且目标蛋白的形态也发生了变化。有人说是因为漏胶的原因，但是如果是这个原因为 ...

1、漏胶的概念是啥？
2、我怀疑你的样品有沉淀
3、是组织样品还是细胞样品？蛋白浓度多少？

作者: bamboo16 时间: 2013-3-7 19:08

1、漏胶的概念是啥？
2、我怀疑你的样品有沉淀
3、是组织样品还是细胞样品？蛋白浓度多少？

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有人说是不是制胶过程胶没有完全凝固，然后在跑电泳的时候就出现异常，但我个人觉得这种可能性不高的说。。。
是组织样品，上样的蛋白浓度是40ug，上样量为12ul
样品有沉淀会出现这种情况？为什么在理应空白的地方出现异常的浓聚啊？
那我需要怎么处理？在使用前再次进行离心？（我组织提取后的离心条件 4度下13000转/分，10min）
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:08

组织样品用什么裂解液？
我感觉是沉淀的可能性较大
吸取上清的时候不能带上沉淀或者悬浮在最上面一层的东西

作者: glass 时间: 2013-3-7 19:09

我用的RIPA/PMSF以100:1添加
吸取上清时我也比较注意了，可能还是有点沉淀带上了，但我用的蛋白标本有时会重复使用，这次用的标本我以前也是用来跑过WB的，也并没有出现这种情况。。。
那我以后用之前再离心一下取上清，这个操作应该没有什么问题吧？
我提取蛋白时用的13000转/分，10min是不是可以在适当增加点时间？
不甚感激啊

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-7 19:09

你好，我最近做磷酸化蛋白，结果背景很黑，如何处理？谢谢！

作者: dog002 时间: 2013-3-7 19:16

楼主：想请教一个问题，关于一抗和二抗浓度调整的问题，我是这样理解的：如果压片后除了目的条带以外，还有杂带，此时需要降低一抗浓度；如果背景比较重的话，比如说整个膜发光，此时需要降低二抗浓度。不知我这样理解对不对

作者: dog002 时间: 2013-3-7 19:16

我用的RIPA/PMSF以100:1添加
吸取上清时我也比较注意了，可能还是有点沉淀带上了，但我用的蛋白标本有时会重复使用，这次用的标本我以前也是用来跑过WB的，也并没有出现这种情况。。。
那我以后用之前再离心一下取上清，这个操作应该没有什么问题吧？
我提取蛋白时用的13000转/分，10min是不是可以在适当增加点时间？
不甚感激啊

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1、离心20min
2、第一次取出上清后，进行第二次离心，10min，再取上清
3、蛋白标本是指什么？提取后的蛋白还是组织、细胞？

作者: dog002 时间: 2013-3-7 19:16

你好，我最近做磷酸化蛋白，结果背景很黑，如何处理？谢谢！

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BSA封闭及稀释抗体？

作者: dog002 时间: 2013-3-7 19:17

楼主：想请教一个问题，关于一抗和二抗浓度调整的问题，我是这样理解的：如果压片后除了目的条带以外，还有杂带，此时需要降低一抗浓度；如果背景比较重的话，比如说整个膜发光，此时需要降低二抗浓度。不知我这样理解对不对

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可以这么理解
有时候一抗也会带来背景
比如一抗是抗血清还没有做过纯化的

作者: fox_79 时间: 2013-3-7 19:17

最近在做海马的BDNF和NGF，用的是millipore的抗体，分子量分别是18和32，我用的15的胶，做了两次，NGF出来了，但是很难看，BDNF一直就没有看到条带，Maker是很清楚的，具体条件是：电泳恒压70V，PVDF膜电转1.5 h，5%BSA 4度封闭过夜，一抗（1:500）37度2h，TBS-T洗膜10 min，三次，二抗（羊抗兔生物素标记，1:1000）37度，30min，洗膜，三抗（卵白素标记，1:1000），洗膜，曝片。请高手指点

作者: fox_79 时间: 2013-3-7 19:18

这是NGF的

图片附件: 82757926.jpg (2013-3-7 19:18, 9.81 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15112

作者: yes4 时间: 2013-3-7 19:19

今特前来请教：
我最近做western blot，做了几次结果都没有出来
目的蛋白分子量为140KD，
分别做了8%和10%浓度的凝胶电泳，电泳液配方参照分子生物学试验指南，跑胶时间80V半小时+100V 2小时。转膜湿转，200mA恒流三小时。TBST液10分钟洗1次，5%牛奶液封闭1小时，TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释一抗1：1000，冰箱孵育过夜。
第2天TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释二抗1：5000，后续曝光、显影、定影。

这几次beta-actin有表达，但是目的蛋白没有表达，阳性对照组也没有目的蛋白的表达。一般X片都很干净，没有什么痕迹。补充，转膜的时候有时可以看到maker的颜色，有时候看不到。

请版主帮我分析看看，哪些条件做些调整，非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:19

最近在做海马的BDNF和NGF，用的是millipore的抗体，分子量分别是18和32，我用的15的胶，做了两次，NGF出来了，但是很难看，BDNF一直就没有看到条带，Maker是很清楚的，具体条件是：电泳恒压70V，PVDF膜电转1.5 h，5%BSA 4度封闭过夜，一抗（1:500）37度2h，TBS-T洗膜10 min，三次，二抗（羊抗兔生物素标记，1:1000）37度，30min，洗膜，三抗（卵白素标记，1:1000），洗膜，曝片。请高手指点

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没做过三抗的WB
三抗用卵白素标记最后用什么检测？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:20

今特前来请教：
我最近做western blot，做了几次结果都没有出来
目的蛋白分子量为140KD，
分别做了8%和10%浓度的凝胶电泳，电泳液配方参照分子生物学试验指南，跑胶时间80V半小时+100V 2小时。转膜湿转，200mA恒流三小时。TBST液10分钟洗1次，5%牛奶液封闭1小时，TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释一抗1：1000，冰箱孵育过夜。
第2天TBST液5分钟洗3次，分别做了2次，2.5%和5%的牛奶稀释二抗1：5000，后续曝光、显影、定影。

这几次beta-actin有表达，但是目的蛋白没有表达，阳性对照组也没有目的蛋白的表达。一般X片都很干净，没有什么痕迹。补充，转膜的时候有时可以看到maker的颜色，有时候看不到。

请版主帮我分析看看，哪些条件做些调整，非常感谢！

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什么蛋白？
一抗哪个公司的？货号？
ECL是那得？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-7 19:20

ECL检测，用的是康为的发光液

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:21

加大二抗稀释度试试

作者: any333 时间: 2013-3-7 19:21

楼主，最近我做WB时发光淬灭的很快，而且各带的淬灭速度还不一致（我是用BCA标定蛋白，各孔上样量应该是一致的），这是怎么回事，你遇到过这种情况吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 19:22

QUOTE:

原帖由 any333 于 2013-3-7 19:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，最近我做WB时发光淬灭的很快，而且各带的淬灭速度还不一致（我是用BCA标定蛋白，各孔上样量应该是一致的），这是怎么回事，你遇到过这种情况吗？ ...

所有的封闭液及抗体稀释液重配，且现用现配

作者: www.1 时间: 2013-3-7 19:22

55kD和43KD大小的蛋白转膜条件？
目前用200mA转1小时，但是，每次Marker都模糊甚至看不见了！
谢谢！

作者: Ao7 时间: 2013-3-7 19:23

相关疾病：
糖尿病
我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组，分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置，二抗抗小鼠是1:5000配置，按说我的一抗已经浓度很高了，而且转膜2小时后，丽春红染色显示转上膜了，然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜，第二天TBST洗3次，每次10分钟，加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次，每次10分钟，去曝片，结果，内参条带很浓，目的什么都没有，居然是一片空白

不知道是为什么……

作者: jujuba 时间: 2013-3-7 20:07

相关疾病：
糖尿病

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我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组，分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置，二抗抗小鼠是1:5000配置，按说我的一抗已经浓度很高了，而且转膜2小时后，丽春红染色显示转上膜了，然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜，第二天TBST洗3次，每次10分钟，加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次，每次10分钟，去曝片，结果，内参条带很浓，目的什么都没有，居然是一片空白

不知道是为什么……

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换抗体稀释液配方；

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:09

在线求助：55kD和43KD大小的蛋白转膜条件？
目前用200mA转1小时，但是，每次Marker都模糊甚至看不见了！
谢谢！

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200mA恒流，1h30min足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:10

我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组，分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置，二抗抗小鼠是1:5000配置，按说我的一抗已经浓度很高了，而且转膜2小时后，丽春红染色显示转上膜了，然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜，第二天TBST洗3次，每次10分钟，加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次，每次10分钟，去曝片，结果，内参条带很浓，目的什么都没有，居然是一片空白

不知道是为什么……

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什么公司的一抗？用1:100？
上样量多少？分子量是47吗？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-7 20:11

55kD和43KD大小的蛋白转膜条件？
目前用200mA转1小时，但是，每次Marker都模糊甚至看不见了！
谢谢！

200mA恒流，1h30min足够了

方老师，这个条件会不会有点过了？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-7 20:12

内参的问题和目的蛋白应该是一样的吧。中央发白的区域是不是蛋白和一抗二抗所在的区域，是不是过多的酶把底物消耗完的缘故？
还有个问题，压片的时候要把PVDF膜放到两层塑料膜间，而我合上塑料膜的时候，发现一些本来发光的区域不发光了，是不是合上薄膜时ECL流动到了别的地方？怎么样操作才能保证压片时的效果和从ECL中取出时的效果一样？
今天把一抗，二抗的稀释度都翻了一番，变成1：1000，1：4000。试了santa 的ECL，结果还是一样。
RT干燥是routin 干燥？怎么操作？

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似乎是荧光淬灭，可能抗体浓度过大或者有金属污染

作者: wood533 时间: 2013-3-7 20:13

老师，我今天第1次做western blotting，以前从没做过。
问个菜鸟级别的问题。
在制作悬浮淋巴细胞的蛋白样本时。
我们已经测得3个管的细胞数：
control组（无药物)：2.5×10＾7.
A浓度药物组： 2.2×10＾7.
B浓度药物组: 1.8×10＾7.
这时我们另外用Tris Glycine SDS Sample Buffer（2×）+ 蒸馏水配制裂解缓冲液，放在另3个小管中。
control组（无药物)：Tris Glycine SDS Sample Buffer（2×）250ul+ 蒸馏水 250ul（共500ul)
A浓度药物组： Tris Glycine SDS Sample Buffer（2×）220ul+ 蒸馏水 220ul（共440ul).
B浓度药物组: Tris Glycine SDS Sample Buffer（2×）180ul+ 蒸馏水 180ul（共360ul).
一个小问题，裂解缓冲液加多少量合适。
我看到文献都是加一样多的裂解缓冲液，那我是按照细胞多少加的，比如control组500ul；
A浓度药物组共440ul，B浓度药物组360ul.
可以嘛？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:13

一般按照1×10的7次细胞加入1ml裂解液
依据不同细胞大小加的裂解液量可以从500ul-1ml

作者: TAT 时间: 2013-3-7 20:15

相关疾病：
糖尿病
云之小雅 wrote:
我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组，分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置，二抗抗小鼠是1:5000配置，按说我的一抗已经浓度很高了，而且转膜2小时后，丽春红染色显示转上膜了，然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜，第二天TBST洗3次，每次10分钟，加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次，每次10分钟，去曝片，结果，内参条带很浓，目的什么都没有，居然是一片空白

不知道是为什么……

什么公司的一抗？用1:100？
上样量多少？分子量是47吗？

一抗是1:100用脱脂牛奶配的封闭液稀释配置的
上样量是20微升，分子量是P47
内参很清楚，目的什么都没有。我拿的是师姐提取的细胞做的，她也做不出来，说可能是提取细胞的方法就是做不出来P47，我用的是肾脏系膜细胞，应该p47表达的很高。

作者: yjf1026 时间: 2013-3-7 20:16

请教—有谁知道quantity one 最后用哪个结果比较？是Adj.Vol这个值还是Density这个值？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:18

相关疾病：
糖尿病

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我想请教一下
我做的糖尿病系膜细胞提取的蛋白
分成4组，分别作内参和目的

目的是p47一抗1:100配置，二抗抗小鼠是1:5000配置，按说我的一抗已经浓度很高了，而且转膜2小时后，丽春红染色显示转上膜了，然后一抗摇床上均匀孵育1小时4°过夜，第二天TBST洗3次，每次10分钟，加2抗孵育1小时后TBST同样洗3次，每次10分钟，去曝片，结果，内参条带很浓，目的什么都没有，居然是一片空白

不知道是为什么……

什么公司的一抗？用1:100？
上样量多少？分子量是47吗？

一抗是1:100用脱脂牛奶配的封闭液稀释配置的
上样量是20微升，分子量是P47
内参很清楚，目的什么都没有。我拿的是师姐提取的细胞做的，她也做不出来，说可能是提取细胞的方法就是做不出来P47，我用的是肾脏系膜细胞，应该p47表达的很高。

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考虑下一抗
你的一抗是哪个公司的？货号呢？

作者: jujuba 时间: 2013-3-7 20:19

请教—有谁知道quantity one 最后用哪个结果比较？是Adj.Vol这个值还是Density这个值？
谢谢！

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我替版主回答，都不对。
因为你既然定量最好对数据进行统计优化，所以需要高斯建模。
你最后的读值应该是比较“Gauss Model Trace”

PS：版主，你觉得有米有必要在我的《WB指南》后面加Quantity One定量部分，最准确的定量方法（含高斯建模）；我觉得到现在为止很多人还停留在简单、粗糙的“等高线定量方法”

作者: 969 时间: 2013-3-7 20:20

其实，我觉得用PS做的效果也不错。
请问，以上两位用什么统计WB?
谢谢！

作者: 969 时间: 2013-3-7 20:20

请教—有谁知道quantity one 最后用哪个结果比较？是Adj.Vol这个值还是Density这个值？
谢谢！

我替版主回答，都不对。
因为你既然定量最好对数据进行统计优化，所以需要高斯建模。
你最后的读值应该是比较“Gauss Model Trace”

PS：版主，你觉得有米有必要在我的《WB指南》后面加Quantity One定量部分，最准确的定量方法（含高斯建模）；我觉得到现在为止很多人还停留在简单、粗糙的“等高线定量方法”

Bandscan这个软件怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:21

我替版主回答，都不对。
因为你既然定量最好对数据进行统计优化，所以需要高斯建模。
你最后的读值应该是比较“Gauss Model Trace”

PS：版主，你觉得有米有必要在我的《WB指南》后面加Quantity One定量部分，最准确的定量方法（含高斯建模）；我觉得到现在为止很多人还停留在简单、粗糙的“等高线定量方法”

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呵呵
学习中
这个不懂
给大家讲讲哈
我读取胶片的数据用ImageQuant TL这个软件

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:21

其实，我觉得用PS做的效果也不错。
请问，以上两位用什么统计WB?
谢谢！

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ImageQuant TL 软件读数

作者: ero11 时间: 2013-3-7 20:22

这是我最近又做的一次western, 条件如下
样品：核蛋白（同样来源小鼠心肌组织）, 40ug/孔。蛋白是用PIERCE的试剂盒提取的。
待检测的目的蛋白：HDAC4
凝胶：6.0%，80V 20分钟，然后140V 60分钟。
转膜：湿转1.5小时（跑胶和转膜都是用的BioRad系统)
封闭：5% BSA
一抗：Mouse monoclonal anti-HDAC4,( cell signalling)1:1500， 4度过夜
二抗：Rabbit IgG secondary antibody - H&L ( abcam ), 1:5000，室温1个半小时

有几个问题：第一，在上面大概150KD的地方，有很强的粗条带，不知道是什么原因，或者有什么方法可以除去？
第二，为什么条带会出现两头粗中间弱的情况呢？看着就像棉签棒一样，郁闷。

[ 本帖最后由 ero11 于 2013-3-7 20:24 编辑 ]

图片附件: 63570720.snap.jpg (2013-3-7 20:24, 12.76 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15113

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15114

作者: yes4 时间: 2013-3-7 20:25

楼主您好，有个问题请教您。
原来做western的时候都很正常，最近新配置了分离胶12%的，这时重新配置了1.5Mtris-hcl pH8.8，可是结果跑出来的条带比平时做的偏下很多，我想也许是ph计不准（用了很久了，至少2年都没换过），重新测试了ph是8.2。不知道分离胶的ph过高或过低会不会使条带偏离正常位置。还有就是aps好像是受潮了，没新的，就把浓度有10%调到16%了，这有何影响。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:27

这是我最近又做的一次western, 条件如下
样品：核蛋白（同样来源小鼠心肌组织）, 40ug/孔。蛋白是用PIERCE的试剂盒提取的。
待检测的目的蛋白：HDAC4
凝胶：6.0%，80V 20分钟，然后140V 60分钟。
转膜：湿转1.5小时（跑胶和转膜都是用的BioRad系统)
封闭：5% BSA
一抗：Mouse monoclonal anti-HDAC4,( cell signalling)1:1500， 4度过夜
二抗：Rabbit IgG secondary antibody - H&L ( abcam ), 1:5000，室温1个半小时

有几个问题：第一，在上面大概150KD的地方，有很强的粗条带，不知道是什么原因，或者有什么方法可以除去？
第二，为什么条带会出现两头粗中间弱的情况呢？看着就像棉签棒一样，郁闷。

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一抗是小鼠单抗
二抗是兔？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:28

原来做western的时候都很正常，最近新配置了分离胶12%的，这时重新配置了1.5Mtris-hcl pH8.8，可是结果跑出来的条带比平时做的偏下很多，我想也许是ph计不准（用了很久了，至少2年都没换过），重新测试了ph是8.2。不知道分离胶的ph过高或过低会不会使条带偏离正常位置。还有就是aps好像是受潮了，没新的，就把浓度有10%调到16%了，这有何影响。谢谢

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APS很重要，从新买点撒，又不贵
pH对条带的影响较大

作者: 831226 时间: 2013-3-7 20:30

一抗是小鼠单抗
二抗是兔？

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二抗是 Rabbit polyclonal to Mouse IgG-H&L(HRP), abcam.

有问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:30

二抗是 Rabbit polyclonal to Mouse IgG-H&L(HRP), abcam.

有问题吗？

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没问题
一抗只做过1:1500这个一个稀释度？
如果是，先试下1:3000,1:5000稀释

作者: one 时间: 2013-3-7 20:31

请教您个问题。昨天我重新配置了12%的分离胶，其中更换的东西有1.5M tris-hcl，这次我用的是新的aps，别的没变化，但是刚刚跑胶非常快，是正常时间的一半，结果溴酚蓝带早就跑没了，但是marker的位置还算正常，不得其解，急求赐教。谢谢

作者: is2011 时间: 2013-3-7 20:32

我一新手我的蛋白分子量是90 加样蛋白量5微升配1：2的sample buffer 电泳积层胶是半个小时100伏分离胶一个小时120伏转膜100伏 3小时完成后考马斯染胶基本蛋白也转膜开始用5%milk封闭一抗推荐1：500 我梯度做了几次后选择了1：4000 5%BSA稀释过夜二抗国产 1 ：1000 TTBS稀释最后显影条带似乎可以看到但背景灰黑考虑封闭不够就第二次改用5%BSA 封闭再曝光条带都基本看不到了是不是封闭过度了下面应该怎么做啊

作者: 04906 时间: 2013-3-7 20:32

请问一下，我的蛋白是12.9KD，采用15%的分离胶合适吗？因为我之前采用了12%分离胶，发现电泳时速度比较慢，而且采用的marker上层条带之间比较窄，marker 采用的是适合4-20%的Tris-HCL GEL,分离的蛋白是10,15,20,25,50,75,100,250。

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:33

请教您个问题。昨天我重新配置了12%的分离胶，其中更换的东西有1.5M tris-hcl，这次我用的是新的aps，别的没变化，但是刚刚跑胶非常快，是正常时间的一半，结果溴酚蓝带早就跑没了，但是marker的位置还算正常，不得其解，急求赐教。谢谢

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电泳完成后染胶看结果

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:35

我一新手我的蛋白分子量是90 加样蛋白量5微升配1：2的sample buffer 电泳积层胶是半个小时100伏分离胶一个小时120伏转膜100伏 3小时完成后考马斯染胶基本蛋白也转膜开始用5%milk封闭一抗推荐1：500 我梯度做了几次后选择了1：4000 5%BSA稀释过夜二抗国产 1 ：1000 TTBS稀释最后显影条带似乎可以看到但背景灰黑考虑封闭不够就第二次改用5%BSA 封闭再曝光条带都基本看不到了是不是封闭过度了下面应该怎么做啊

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封闭多长时间？
二抗只做过一个稀释度？
ECL是哪个公司的？

作者: ROSE李 时间: 2013-3-7 20:36

前半个月WB试验还好，最近半个月老是不出东西，调整过去调整过来，搞的现在连WB胶都配不好了，。情况如下：希望大家能够给点意见。
电泳蛋白80微克，80v，至看见marker红线（72kD），然后调至100v，电泳时间大约1.5h。附图。
电转用250v，3h，三层夹心，滤纸上下各只铺了一层，湿转，NC膜，0.45微米。目的分子量150kd。转后丽春红染膜，（附图），考马染电转过的胶条仍发现有两孔少许蛋白未转至膜上。
TBS洗涤后，10%脱脂奶粉封闭2h，室温，28度。TBST洗涤，10minx3次。加一抗1：1500以5%奶粉稀释抗体.（抗体2009-12-19到我手上，刚开始使用效果很好，达到1：5000。保存于-70度，分装使用）。二抗使用皮尔斯二抗，1：2000，5%奶粉稀释抗体。显影结果如图，显影未看见条带。

[ 本帖最后由 ROSE李于 2013-3-7 20:37 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15115

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:38

半个月WB试验还好，最近半个月老是不出东西，调整过去调整过来，搞的现在连WB胶都配不好了，。情况如下：希望大家能够给点意见。
电泳蛋白80微克，80v，至看见marker红线（72kD），然后调至100v，电泳时间大约1.5h。附图。
电转用250v，3h，三层夹心，滤纸上下各只铺了一层，湿转，NC膜，0.45微米。目的分子量150kd。转后丽春红染膜，（附图），考马染电转过的胶条仍发现有两孔少许蛋白未转至膜上。
TBS洗涤后，10%脱脂奶粉封闭2h，室温，28度。TBST洗涤，10minx3次。加一抗1：1500以5%奶粉稀释抗体.（抗体2009-12-19到我手上，刚开始使用效果很好，达到1：5000。保存于-70度，分装使用）。二抗使用皮尔斯二抗，1：2000，5%奶粉稀释抗体。显影结果如图，显影未看见条带。

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1、胶配不好与APS、TEMED、环境温度有关
2、什么蛋白？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-7 20:39

没问题
一抗只做过1:1500这个一个稀释度？
如果是，先试下1:3000,1:5000稀释

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做过1:3000的稀释，条带就很淡。
还有，为什么会出现两头很粗的情况呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:39

做过1:3000的稀释，条带就很淡。
还有，为什么会出现两头很粗的情况呢？

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从你提供图片的条带来看我认为你的电泳有点问题
样品变性后是不是有点沉淀？

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-7 20:40

我做的是p-PERK，170kDa,一抗是cell signal公司的，我湿转分别用了350mA2h,400mA2h,400mA2.5h,400mA3h,400mA3.5h,100v2h,封闭分别用了5%脱脂奶粉、5%BSA，一抗、二抗孵育用脱脂奶粉，都没出结果。怎么办？指点我一下吧，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:41

我做的是p-PERK，170kDa,一抗是cell signal公司的，我湿转分别用了350mA2h,400mA2h,400mA2.5h,400mA3h,400mA3.5h,100v2h,封闭分别用了5%脱脂奶粉、5%BSA，一抗、二抗孵育用脱脂奶粉，都没出结果。怎么办？指点我一下吧，谢谢

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1、蛋白提取的时候你是怎么处理的？比如蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF
2、上样量多少？
3、用BSA

作者: eric930 时间: 2013-3-7 20:41

请问一下我提取完蛋白后直接PCR上95℃变性五分钟，但是没有加上样缓冲液，该怎么办？之前这样变性的蛋白在上样的时候加入上样缓冲液，混匀上样，跑出来的结果（erk1/2）也还可以。现在才发现他们都是加入了上样缓冲液后才进行蛋白变性的。接下来我要做p-erk，不知道这样能出结果么，结果可信么？非常感谢期待您的回答

作者: remenb 时间: 2013-3-7 20:43

我做得western的条带时好时坏，有时候能做出来比较规矩的一个棒状的条带，但有的时候条带形状非常不规则，蝌蚪型，哑铃型的，从中间断裂开的，只有半条的，上突下凹的什么都有，请教一下是什么原因，该注意些什么步骤以避免这种情况？

我感觉不太像是电泳问题，因为使用的预染的marker，在SDS-PAGE的阶段条带还是比较整齐的，转膜缓冲液通常只重复用一次

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我觉得不是啊，我也出现这种情况，我的胶用考玛斯亮蓝染过后，也是出现条带中间少，两边多的情况，不知道问题出在哪里

作者: NBA 时间: 2013-3-7 20:43

样品中有沉淀
电泳时电压太高
胶没有凝好
样品中盐离子浓度过高（一般超过300mM）
都可能会出现两头粗、中间窄的情况

作者: xyw5 时间: 2013-3-7 20:44

我用同一条件，前面都做的很好，背景也很干净。突然有一天，就不出条带了，一片空白，连背景都没有……后来重复作了几遍，用原来做过肯定能出条带的样本，借用别的实验室的抗体，新的buffer都试过了，还是什么都没有……后来在有一次做actin的时候，发现1min曝光有很浅的条带（终于有东西了，虽然比以前浅很多），但是之后曝光5min，30min确什么都没有了！detection reagent应该没问题，因为别人也在用都很好，我的抗体浓度：一抗1：1000或者3：5000，二抗 1：5000（我觉得不高……因为前几次都成功了……而且2h的时候还有信号……），我用的ECL,GE的，试剂，膜基本都是GE的。

请高手帮忙！我的心都碎了！

作者: is2011 时间: 2013-3-8 17:14

请问，灌胶的时候，有时分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有大气泡，有时又不会，用的都是同样的玻板，厚板是bio-rad的，薄板是国产的，会不会是两者不配套，还是因为玻板和胶垫之间有空隙，空气进入里面。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:15

我用同一条件，前面都做的很好，背景也很干净。突然有一天，就不出条带了，一片空白，连背景都没有……后来重复作了几遍，用原来做过肯定能出条带的样本，借用别的实验室的抗体，新的buffer都试过了，还是什么都没有……后来在有一次做actin的时候，发现1min曝光有很浅的条带（终于有东西了，虽然比以前浅很多），但是之后曝光5min，30min确什么都没有了！detection reagent应该没问题，因为别人也在用都很好，我的抗体浓度：一抗1：1000或者3：5000，二抗 1：5000（我觉得不高……因为前几次都成功了……而且2h的时候还有信号……），我用的ECL,GE的，试剂，膜基本都是GE的。

请高手帮忙！我的心都碎了！

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把样品跑个电泳，染胶
像TBST or PBST这些缓冲液的pH要注意

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:15

请问，灌胶的时候，有时分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有大气泡，有时又不会，用的都是同样的玻板，厚板是bio-rad的，薄板是国产的，会不会是两者不配套，还是因为玻板和胶垫之间有空隙，空气进入里面。谢谢

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不会
从玻璃板两边往里面加胶

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-8 17:16

请教楼主：最近电泳还是跑的非常快，，约为正常时间的3分之一，结果都没有清晰的条带。电压电流都没问题。不知道什么因素能导致跑胶快呢？我能想到的就是胶的浓度以及tris的ph值，失败了几次了，望赐教。

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:16

改变胶浓度了？

作者: moonlight45 时间: 2013-3-8 17:17

改变胶浓度了？

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由12%提高到13%了，别的就是重配了1.5Mtris。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:18

由12%提高到13%了，别的就是重配了1.5Mtris。谢谢

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检查你的胶浓度计算方法

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-8 17:19

小弟近日做一种分子量较大的蛋白（包含280/120KD 2个片段），文献提示为非还原变性，上样量为80ug，我尝试了6%及8%的胶，电转(湿转)60V 2.5h，快速封闭液0.5h，1抗(1:300)4度过夜，2抗(1:2000)1h。做了好几次都没有任何条带，而内参显示挺好的。不知各位大侠能否指导下，是否存在什么错误或不足？？？
PS：此外我用的Fermatas SM1841蛋白maker，在10孔1.5mm厚度加样20ul了，电泳后胶上显示挺好，但转膜后条带非常淡，很多还看不出来，这是为何啊？？？
非常感谢！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-8 17:19

我是口腔医学研究生，我最近在做口腔牙槽骨缺损的模型，但是因为骨组织太硬不好检测圣生长因子，不知有什么办法可以像检测体液一样检测骨组织中的生长因子（比如BMP-2，骨桥蛋白，骨钙素等），万分感谢，谢谢！！

作者: lxh031 时间: 2013-3-8 17:20

求教--目的蛋白曝光时连成一条线，可能是怎样的原因？
已将二抗降低浓度，效果不佳！

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-8 17:38

RT 30min~1h
封闭完之后用缓冲液冲洗干净
然后加抗体
屡试不爽

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一抗是用封闭液配的,为啥还要洗呢?

作者: wmp1234 时间: 2013-3-8 17:38

小弟近日做一种分子量较大的蛋白（包含280/120KD 2个片段），文献提示为非还原变性，上样量为80ug，我尝试了6%及8%的胶，电转(湿转)60V 2.5h，快速封闭液0.5h，1抗(1:300)4度过夜，2抗(1:2000)1h。做了好几次都没有任何条带，而内参显示挺好的。不知各位大侠能否指导下，是否存在什么错误或不足？？？
PS：此外我用的Fermatas SM1841蛋白maker，在10孔1.5mm厚度加样20ul了，电泳后胶上显示挺好，但转膜后条带非常淡，很多还看不出来，这是为何啊？？？
非常感谢！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-8 17:39

最近做了个抗血清的检测，50KD蛋白，电转(湿转)35V 3.5h，封闭液2，1抗(1:500)2h，2抗(1:20000)2h。阴性对照基本没有显色，阳性有好些条带。怎么会这样？麻烦解惑下，谢谢

阴性：BL21菌液阳性：pET-gene-BL21诱导菌液

图片附件: 60919497.jpg (2013-3-8 17:39, 26.1 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15120

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:43

小弟近日做一种分子量较大的蛋白（包含280/120KD 2个片段），文献提示为非还原变性，上样量为80ug，我尝试了6%及8%的胶，电转(湿转)60V 2.5h，快速封闭液0.5h，1抗(1:300)4度过夜，2抗(1:2000)1h。做了好几次都没有任何条带，而内参显示挺好的。不知各位大侠能否指导下，是否存在什么错误或不足？？？
PS：此外我用的Fermatas SM1841蛋白maker，在10孔1.5mm厚度加样20ul了，电泳后胶上显示挺好，但转膜后条带非常淡，很多还看不出来，这是为何啊？？？
非常感谢！

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你也用的文章中的条件？
抗体说明书也是检测非还原变性条件下的目的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:43

求教--目的蛋白曝光时连成一条线，可能是怎样的原因？
已将二抗降低浓度，效果不佳！

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减低上样量

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:44

一抗是用封闭液配的,为啥还要洗呢?

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不洗当然也可以
有些时候孵育后的一抗要回收
洗洗会好一些

作者: NBA 时间: 2013-3-8 17:44

最近做了个抗血清的检测，50KD蛋白，电转(湿转)35V 3.5h，封闭液2，1抗(1:500)2h，2抗(1:20000)2h。阴性对照基本没有显色，阳性有好些条带。怎么会这样？麻烦解惑下，谢谢

阴性：BL21菌液阳性：pET-gene-BL21诱导菌液

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一抗调整至1:1000，1:2000等试试

作者: moonlight45 时间: 2013-3-8 17:46

我最近做Notch1蛋白，分子量125kDa，上样60ug，电泳条件：80V 30min，120V 50min；转膜条件：恒流400mA 2h；5%脱脂奶粉室温封闭1h；Epitomics一抗(1：250）4°C孵育过夜，推荐1：1500.CST二抗1：3000室温孵育1h。北京普利莱的ECl发光液。
这个一抗效价并不是很好，但后面有做出来过。最近几次同样条件再做就出不来了。怀疑是转膜的问题，因为Maker在胶上还挺明显，但为什么转到膜上就很淡很淡了。再者，提取的蛋白样品会不会有问题啊？

作者: tianmei001 时间: 2013-3-8 17:47

楼上的，预染Marker狠容易扩散的。你可以在相同的转膜条件下换成彩色Marker比较一下！

作者: yonger 时间: 2013-3-8 17:47

楼上的，预染Marker狠容易扩散的。你可以在相同的转膜条件下换成彩色Marker比较一下！

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我用的就是fermentas的sm0671

作者: 831226 时间: 2013-3-9 08:59

彩色marker也是预染的
两者有什么区别？
只不过是标记的染料不同而已
Epitomics的抗体基本上还是可以的
转膜用300mA 2h就够了
你是不是同一批蛋白样品反复冻融了之后上样的？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 08:59

楼上：
蛋白样品反复冻融很容易降解是不是？
可是我就冻融过一两次而已，应该还是不至于吧。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:00

冻融一两次没问题
蛋白在进行WB进行过电泳后的染胶吗？

作者: yychen 时间: 2013-3-9 09:00

我最近做wb，有十几天了，不管怎么做，胶片都是白纸一张，我把整个体系都检查了一遍，所有的试剂全都是新的，膜用丽春红染后，能看到蛋白条带，很明显，清水洗去丽春红，封闭1h，4度一抗过夜，TBST洗膜三次，每次8min，二抗反应4h-6h，TBST洗膜三次，每次8min，
ECL反应5min，看不到荧光，胶片最后就是白纸一张，连actin也是这样。请问楼主，这是为什么啊？我出错在哪里啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:00

QUOTE:

原帖由 yychen 于 2013-3-9 09:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我最近做wb，有十几天了，不管怎么做，胶片都是白纸一张，我把整个体系都检查了一遍，所有的试剂全都是新的，膜用丽春红染后，能看到蛋白条带，很明显，清水洗去丽春红，封闭1h，4度一抗过夜，TBST洗膜三次，每次8min，二抗反应4h-6h，TBST洗膜三 ...

1、封闭30min足够
2、洗膜3min乘以5-6次
3、把TBST等涉及到pH的缓冲液好好检查一下
4、以前有结果，现在没结果？
5、二抗反应不要超过1h

作者: JK.jon 时间: 2013-3-9 09:01

请问，分离胶凝后会在胶和玻璃板之间有小气泡，且都在板的两侧，胶中没有气泡。碰到过好几回这样的，板都洗的很干净，也不是同一块板，年前做的时候还没这样呢，就最近老这样，请问到底是怎么回事,怎么才能避免啊，谢谢了

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如果你用的是六一的板子的话，可能是由于你制胶的时候板子压的太紧了，以至于你拆胶条的时候板稍微被撑开了一点，，下回你注意下这个问题看是不是。我以前也有多相似的经历。

作者: u234 时间: 2013-3-9 09:01

碰到一个难题，电泳过程中蛋白跑的很慢，marke也只分开到55kd，并且在溴酚蓝处感觉胶有点厚（就是比其他地方的胶看起来厚些），在加样槽底部会看到有白色颗粒，以为是压分离胶水未吸干和胶未凌好，后来都吸干水，配好胶在室温放了50min才放入4度保存，第二天用。可结果还是一样。以前跑的很好，现在就只重配了tris。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:02

QUOTE:

原帖由 u234 于 2013-3-9 09:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

碰到一个难题，电泳过程中蛋白跑的很慢，marke也只分开到55kd，并且在溴酚蓝处感觉胶有点厚（就是比其他地方的胶看起来厚些），在加样槽底部会看到有白色颗粒，以为是压分离胶水未吸干和胶未凌好，后来都吸干水，配好胶在室温放了50mi ...

1、重新检查tris的pH值
2、样品是不是有沉淀？变性后离过心吗？

作者: fsdd817 时间: 2013-3-9 09:04

样品变性后没有离心，明天试试把样品离心后再跑。就是提好的样品放在-20度保存怎么又沉淀？是什么原因？电泳时溴酚蓝处胶怎么感觉变厚了，什么原因？以前没看见过、谢了

作者: duoduo 时间: 2013-3-9 09:04

冻融一两次没问题
蛋白在进行WB进行过电泳后的染胶吗？

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昨天又做了，条带出来了，就是有点淡。

作者: bamboo16 时间: 2013-3-9 09:05

我是做western blot的新手，有几个问题想请教，望不吝赐教，先谢谢了！
1、我做的是动物组织的蛋白，分子量160kd左右，上样量为200ug，先用的10齿梳子，100v恒压电泳，2小时，基本就跑到底了，后来换了15齿的梳子，2小时只跑了一大半，请问，我是应该仍然只跑2个小时，还是要一直让它跑到底呢？
2、我用的是10%的胶跑的，效果还可以，内参分子量是40kd左右，用奥德赛直接扫的膜，很清晰，因为我还要做其他的蛋白，有的只有35kd，有的有70kd,请问我仍然用10%的胶可以么（因为想到40kd和35kd差不了多少，而且用丽春红染的，70多的位置也有很清晰的条带）？如果可以的话，请问电泳和转膜的时间应该怎样调整呢？（160的那个蛋白275mA恒流1小时，湿转，效果还行）
3、请问电泳缓冲液和转膜缓冲液有严格的pH值的要求么？
4、请问溴酚蓝的饱和溶液一般是百分之几啊？
先谢过了！

作者: vivian4123 时间: 2013-3-9 09:05

楼主，您好！
我是新手，有很多问题请教：
1、做的是凋亡的蛋白，电泳条件是：80v十几分钟，等到分离胶的时候换成120v的电压，等溴酚蓝跑出的时候停止电泳。转膜条件是：80v恒压50min左右，Birored的仪器，PVDF膜。
2、一抗是1：1000孵育的，2h ，二抗也是1：1000的，1h ，封闭是5%的脱脂奶粉4度过夜封闭的。
3、我做WB的时候杂带很多，条带还挺粗的。就是没有目的条带，请问是什么原因？
这些条件都是实验室的师姐师兄给的，他们做的好像还可以，请问一下有什么问题？急救……

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:05

样品变性后没有离心，明天试试把样品离心后再跑。就是提好的样品放在-20度保存怎么又沉淀？是什么原因？电泳时溴酚蓝处胶怎么感觉变厚了，什么原因？以前没看见过、谢了

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变性的时候蛋白浓度有多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:06

我是做western blot的新手，有几个问题想请教，望不吝赐教，先谢谢了！
1、我做的是动物组织的蛋白，分子量160kd左右，上样量为200ug，先用的10齿梳子，100v恒压电泳，2小时，基本就跑到底了，后来换了15齿的梳子，2小时只跑了一大半，请问，我是应该仍然只跑2个小时，还是要一直让它跑到底呢？
2、我用的是10%的胶跑的，效果还可以，内参分子量是40kd左右，用奥德赛直接扫的膜，很清晰，因为我还要做其他的蛋白，有的只有35kd，有的有70kd,请问我仍然用10%的胶可以么（因为想到40kd和35kd差不了多少，而且用丽春红染的，70多的位置也有很清晰的条带）？如果可以的话，请问电泳和转膜的时间应该怎样调整呢？（160的那个蛋白275mA恒流1小时，湿转，效果还行）
3、请问电泳缓冲液和转膜缓冲液有严格的pH值的要求么？
4、请问溴酚蓝的饱和溶液一般是百分之几啊？
先谢过了！

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1、200ug上样真够大的！
2、电泳时以溴酚蓝或者marker为准
3、35K的蛋白可以用stripping buffer洗掉后再杂交内参
4、电泳缓冲液与转移缓冲液不用调整pH
5、不知道多少饱和，不过1%的就已经不能全溶了

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:06

楼主，您好！
我是新手，有很多问题请教：
1、做的是凋亡的蛋白，电泳条件是：80v十几分钟，等到分离胶的时候换成120v的电压，等溴酚蓝跑出的时候停止电泳。转膜条件是：80v恒压50min左右，Birored的仪器，PVDF膜。
2、一抗是1：1000孵育的，2h ，二抗也是1：1000的，1h ，封闭是5%的脱脂奶粉4度过夜封闭的。
3、我做WB的时候杂带很多，条带还挺粗的。就是没有目的条带，请问是什么原因？
这些条件都是实验室的师姐师兄给的，他们做的好像还可以，请问一下有什么问题？急救……

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1、蛋白名称？分子量？
2、减少上样量
3、太笼统，我怎么说啊？

作者: 04906 时间: 2013-3-9 09:06

变性的时候蛋白浓度有多少？

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浓度时8ug/ul-10ug/ul,

作者: ero11 时间: 2013-3-9 09:07

我的蛋白是Bcl-2/bax的……

作者: fsdd817 时间: 2013-3-9 09:07

你好，我想做纤维蛋白原跑电泳，分子量是340kd，我的问题是，这样品是冻干粉，纯的纤维蛋白原，那我样品应该怎么样处理，是不是把样溶解后，也得和上样缓冲液煮沸变性，样品和上样缓冲液的比例呢？

作者: mimili_901 时间: 2013-3-9 09:07

浓度时8ug/ul-10ug/ul,

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请把蛋白浓度调整至2-4mg/ml后变性

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:08

你好，我想做纤维蛋白原跑电泳，分子量是340kd，我的问题是，这样品是冻干粉，纯的纤维蛋白原，那我样品应该怎么样处理，是不是把样溶解后，也得和上样缓冲液煮沸变性，样品和上样缓冲液的比例呢？

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一般没有特殊情况说明的情况下是溶解后加样品缓冲液变性
比例需要通过蛋白浓度来确定

你查查这个蛋白的背景资料（或者说明书），看是否需要变性

作者: u234 时间: 2013-3-9 09:08

请把蛋白浓度调整至2-4mg/ml后变性

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蛋白已经变性了，怎么再调整浓度，可以再加裂解液吗？该如何操作？

作者: flower-201 时间: 2013-3-9 09:09

你好！我抽提的是跨膜蛋白（跨膜3次），我如果用总蛋白抽提试剂盒，那所抽提的蛋白可以用么？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 09:10

首先，谢谢版主！
纤维蛋白原跑电泳，分子量是340kd，我想跑完后考染色，考察他的分子量。能不能推荐一下，我浓缩胶、分离胶用多大的，还有电泳的条件，我以前做过细胞中的蛋白WB，一般都是80、120v（5%、12%）,分子量这么大，还用这个行么？
另外，还有一问题，这次采购买回来的十二烷基硫酸钠是粉针状的，商标写的是十二烷基硫酸钠（粉针），科密欧的，以前用的是细粉，我用不用换货呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 09:10

还是纤维蛋白原的问题，我的蛋白是工厂自己提出来的，制成了冻干粉，灌装。样品和上样缓冲液的比例问题，这蛋白是纯的，浓度要多少就可以是多少，我挺迷糊的，也不知道该上样多少ug能跑好（考染色后条带好），也不知道该加多少比例缓冲液。你看这样，我打算上样蛋白总量是20ug,然后纤维蛋白原溶成4mg/ml,取5ul的样，加上5ul的上样缓冲液，这样行否？

作者: www.1 时间: 2013-3-9 09:13

请教：最近做了2次western，结果都是没有明显的斑点，而且整个片子呈白色，但是目标条带位置也发白，个人感觉这两个结果有些矛盾，与以往不同的有两个，一是配胶的tris溶液新配的，也许ph不准；而是洗膜用的是厂家赠送的tbs，不是原来的tbst溶液。别的都差不多，请问楼主有可能是以上的原因造成片子及斑点处发白吗？谢谢

作者: is2011 时间: 2013-3-9 09:13

请问GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin内参在细胞损伤及药物干预的情况下会发生变化吗？谢谢！

作者: is2011 时间: 2013-3-9 09:14

请问高手，为什么有时候我做的western总是想“M”型的带呢，就像下面的图示。很奇怪一样的手法偶尔就有，但是大部分时间是没有的，请指教，谢谢！！

图片附件: 44827484.jpg (2013-3-9 09:14, 4.33 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15121

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:14

蛋白已经变性了，怎么再调整浓度，可以再加裂解液吗？该如何操作？

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不好意思
这种没尝试过
你可以尝试一下
把结果挂上来

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:15

你好！我抽提的是跨膜蛋白（跨膜3次），我如果用总蛋白抽提试剂盒，那所抽提的蛋白可以用么？

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如果做WB完全可以
不知道你用什么牌子的裂解液提取的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:15

我的蛋白是Bcl-2/bax的……

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那个公司的一抗及ECL？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:15

首先，谢谢版主！
纤维蛋白原跑电泳，分子量是340kd，我想跑完后考染色，考察他的分子量。能不能推荐一下，我浓缩胶、分离胶用多大的，还有电泳的条件，我以前做过细胞中的蛋白WB，一般都是80、120v（5%、12%）,分子量这么大，还用这个行么？
另外，还有一问题，这次采购买回来的十二烷基硫酸钠是粉针状的，商标写的是十二烷基硫酸钠（粉针），科密欧的，以前用的是细粉，我用不用换货呢？

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用7.5%或者8%
最好用4-12%梯度胶

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:16

还是纤维蛋白原的问题，我的蛋白是工厂自己提出来的，制成了冻干粉，灌装。样品和上样缓冲液的比例问题，这蛋白是纯的，浓度要多少就可以是多少，我挺迷糊的，也不知道该上样多少ug能跑好（考染色后条带好），也不知道该加多少比例缓冲液。你看这样，我打算上样蛋白总量是20ug,然后纤维蛋白原溶成4mg/ml,取5ul的样，加上5ul的上样缓冲液，这样行否？

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纯蛋白的话上样量0.1-0.5ug足够啦

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:16

请问GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin内参在细胞损伤及药物干预的情况下会发生变化吗？谢谢！

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你觉得呢？
哪有绝对不变的东西呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:16

请问高手，为什么有时候我做的western总是想“M”型的带呢，就像下面的图示。很奇怪一样的手法偶尔就有，但是大部分时间是没有的，请指教，谢谢！！

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检查过胶底部的气泡吗？

作者: gogo 时间: 2013-3-9 09:17

我有两个相差1kD的目的蛋白（假设为a,b），二抗均为抗羊，先杂a再杂b的话，b的条带很弱但是a的条带还很强，先杂b再杂a则a的条带会很弱，二抗会累积而且很难洗掉，我试着增加一抗浓度，降低二抗浓度，结果好一些但仍然不够理想。用洗膜液洗了之后，残留的抗体是没了但是蛋白好像也被洗掉了。请问版主如何解决。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:17

我有两个相差1kD的目的蛋白（假设为a,b），二抗均为抗羊，先杂a再杂b的话，b的条带很弱但是a的条带还很强，先杂b再杂a则a的条带会很弱，二抗会累积而且很难洗掉，我试着增加一抗浓度，降低二抗浓度，结果好一些但仍然不够理想。用洗膜液洗了之后，残留的抗体是没了但是蛋白好像也被洗掉了。请问版主如何解决。

=====================================================================

1、样品充足，跑两次胶
2、stripping buffer会洗掉一部分抗原，但是如果是等比例往下洗的话结果是可以接受的

作者: gogo 时间: 2013-3-9 09:18

1、样品充足，跑两次胶
2、stripping buffer会洗掉一部分抗原，但是如果是等比例往下洗的话结果是可以接受的

==========================================================================

看样子只能重新跑胶了，我洗过两张膜，第二次时间减半了，结果蛋白还是没了，显影看不到带。

作者: kulee 时间: 2013-3-9 09:18

向您请教
做western用ECL发光，前两次曝光A条带信号很强，B条带信号偏弱，换第三张底片延长曝光时间，B条带消失了，A条带也变弱，重新洗膜后加重新加反应液，也看不到条带。为什么？如何处理？
谢谢！

作者: moonlight45 时间: 2013-3-9 09:19

你好，
1.我的目的蛋白是110kd左右的，但是出来的条带是在170kd上面点（marker的最大指示条带是170kd，10%的胶），是什么情况?二聚体么，该怎么解决？

2.
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态 ?? 凝胶条件 ??上样buffer ?? 电泳buffer
Reduced - Denatured ?? 还原，变性 ??含β-巯基乙醇或DTT，含SDS ?? 含SDS
Reduced - Native ?? 还原，不变性 ??含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS ?? 不含SDS
Oxidized - Denatured ??不还原，变性 ??不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS ?? 含SDS
Oxidized - Native ?? 不还原，不变性 ??不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS ?? 不含SDS

以上是我在一个资料上看到的，待测蛋白状态?这个是怎么查的？和是上样buffer决定的么？

作者: yes4 时间: 2013-3-9 09:20

尊敬的前辈：
您好！我是刚做WB的小白，我的目的蛋白是53kd，但曝光结果在目的蛋白（目的蛋白已曝出）上面还有一条较细的条带，请问前辈这里面有什么问题？（我的一抗说明书上的条带只有一条），非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:20

看样子只能重新跑胶了，我洗过两张膜，第二次时间减半了，结果蛋白还是没了，显影看不到带。

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再stripping之前条带的第一目的蛋白条带如何呢？
stripping后的效果不至于像你这样的情况

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:20

你好，
1.我的目的蛋白是110kd左右的，但是出来的条带是在170kd上面点（marker的最大指示条带是170kd，10%的胶），是什么情况?二聚体么，该怎么解决？

2.
根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态 ?? 凝胶条件 ??上样buffer ?? 电泳buffer
Reduced - Denatured ?? 还原，变性 ??含β-巯基乙醇或DTT，含SDS ?? 含SDS
Reduced - Native ?? 还原，不变性 ??含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS ?? 不含SDS
Oxidized - Denatured ??不还原，变性 ??不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS ?? 含SDS
Oxidized - Native ?? 不还原，不变性 ??不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS ?? 不含SDS

以上是我在一个资料上看到的，待测蛋白状态?这个是怎么查的？和是上样buffer决定的么？

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1、不同胶浓度中，marker指示的位置会有所不同
2、ruduced含有b-ME或者DTT
Denatured含有SDS
反之则不含

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:21

尊敬的前辈：
您好！我是刚做WB的小白，我的目的蛋白是53kd，但曝光结果在目的蛋白（目的蛋白已曝出）上面还有一条较细的条带，请问前辈这里面有什么问题？（我的一抗说明书上的条带只有一条），非常感谢！

===============

稀释一下一抗

作者: gogo 时间: 2013-3-9 09:21

再stripping之前条带的第一目的蛋白条带如何呢？
stripping后的效果不至于像你这样的情况

===========================================================================================

stripping之前条带比较弱，stripping之后更加弱，且几乎不见，但是用丽春红染液染色还能看到比较红的条带，很奇怪。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:22

stripping之前条带比较弱，stripping之后更加弱，且几乎不见，但是用丽春红染液染色还能看到比较红的条带，很奇怪。

==========================

stripping之后条带变弱很正常
所以要选择先做弱的
再做强的

你stripping前做同一个蛋白？

作者: H2O 时间: 2013-3-9 09:22

想问问有哪位高手做过结缔组织的WB，取材匀浆有什么要注意的地方吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:23

想问问有哪位高手做过结缔组织的WB，取材匀浆有什么要注意的地方吗？

=============

什么组织？
什么蛋白？

作者: zwsyrt 时间: 2013-3-9 09:24

足底组织，蛋白是神经营养因子的前体

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:24

足底组织

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皮肤吗？

作者: flower-201 时间: 2013-3-9 09:25

皮肤吗？

===================

是的，包括部分真皮层

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:25

QUOTE:

原帖由 flower-201 于 2013-3-9 09:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
皮肤吗？

===================

是的，包括部分真皮层

做过
没什么问题

作者: flower-201 时间: 2013-3-9 09:26 标题: 回复 #3057 NBA 的帖子

我想问的是，取材跟取肌组织，神经组织有区别吗？取材定位及所取组织大小有什么特别的要求吧？谢谢···

作者: gogo 时间: 2013-3-9 09:27

stripping之后条带变弱很正常
所以要选择先做弱的
再做强的

你stripping前做同一个蛋白？

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是的，原来很强的带，stripping之后带也很弱了

作者: gemei0115 时间: 2013-3-9 09:27

老师您好，我是新手，想咨询您几个问题，我做的蛋白28KD，应该有多大浓度的分离胶呢？12%的还是15%的较为合适呢？还有就是在转膜条件是什么呢？我现在是200mA,1小时，marker都能转过去，但不知道蛋白是不是全转过去了

作者: flower-201 时间: 2013-3-9 09:27

hxg2119 wrote:
老师您好，我是新手，想咨询您几个问题，我做的蛋白28KD，应该有多大浓度的分离胶呢？12%的还是15%的较为合适呢？还有就是在转膜条件是什么呢？我现在是200mA,1小时，marker都能转过去，但不知道蛋白是不是全转过去了

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这个我倒是知道，12%或者15%都可以，12%我认为好一点，另外转膜45分钟左右即可，小分子量就这个要很注意
这里有个攻略，可以看看，比较全

作者: wood533 时间: 2013-3-9 09:28

版主你好，请问提取膜蛋白做WB用什么试剂比较好，万分感谢！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 09:28

请教老师，我们用的封闭牛奶过期了，09年2月产，12月保质期，今年9月刚开始用，怎么也做不出来，牛奶是不是主要原因？
电泳后染胶可以看到条带，转膜后丽春红染不出色，但是mark都转过去了，再染胶看不到条带了，不知道膜上到底有没有蛋白，会不会转过了

作者: nut6694 时间: 2013-3-9 09:28

您好，最近做WB条带都很淡，不知道和什么原因有关呢？下面这张图，左侧上面是不同浓度，下面是不同时间的，一条颜色就很淡。

图片附件: 15799630.snap.jpg (2013-3-9 09:29, 18.03 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15122

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:29

我想问的是，取材跟取肌组织，神经组织有区别吗？取材定位及所取组织大小有什么特别的要求吧？谢谢···

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定位看你的参考文献吧
取材于保存都是差不多

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:29

是的，原来很强的带，stripping之后带也很弱了

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stripping buffer有问题？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:30

版主你好，请问提取膜蛋白做WB用什么试剂比较好，能否邮箱联系。我的邮箱是万分感谢！

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做膜蛋白的WB可以用提取总蛋白的方法
我的邮箱在我的个人资料中有
如果想提高浓度的膜蛋白，可以试试用胞浆、胞核抽提试剂盒

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:31

请教老师，我们用的封闭牛奶过期了，09年2月产，12月保质期，今年9月刚开始用，怎么也做不出来，牛奶是不是主要原因？
电泳后染胶可以看到条带，转膜后丽春红染不出色，但是mark都转过去了，再染胶看不到条带了，不知道膜上到底有没有蛋白，会不会转过了

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1、为什么要用过期奶粉？想不通
2、膜也可能过期了或者处理方法不对

作者: xyw5 时间: 2013-3-9 09:31

我想请问下各位前辈一个问题，我的目的蛋白是重组在了有红色荧光蛋白的载体上的，那么我在说WESTERN BLOT的时候我的目的蛋白的大小还是它原先的大小，还是我应该把红色荧光蛋白的大小也加上，才是最终的大小啊？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:32

QUOTE:

原帖由 xyw5 于 2013-3-9 09:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我想请问下各位前辈一个问题，我的目的蛋白是重组在了有红色荧光蛋白的载体上的，那么我在说WESTERN BLOT的时候我的目的蛋白的大小还是它原先的大小，还是我应该把红色荧光蛋白的大小也加上，才是最终的大小啊？谢谢 ...

要加上荧光蛋白

作者: summerxx 时间: 2013-3-9 09:32

想请教一下，检测细胞培养液中蛋白，最后显出的带型很宽

培养液是10%FBS，是不是浓度太高有影响？或者是浓缩胶不够？我用的是12%SDS-PAGE，转膜250mA 2hours，上样量30ul，蛋白总浓度大概40-50ug

谢谢指点

作者: qhyu 时间: 2013-3-9 09:33

呃怎么图片没有了，重新发个，今天的结果依然很郁闷，同样的蛋白，上面的那张膜是不同浓度处理的下面的是不同时间的，上样量和操作都一样，就是不知道问题在哪？为什么上面的那张膜几乎什么都没有？用的是ECL发光试剂盒显影。

图片附件: 91565182.jpg (2013-3-9 09:33, 15.17 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15123

作者: qhyu 时间: 2013-3-9 09:33

还有啊，每次我都用脱脂奶室温封闭两小时，洗膜也都是用TBST，为什么杂带还是这么多，背景黑乎乎的，一抗和二抗都是1:1000，做ACTIN背景挺干净的，二抗是抗兔的。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:34

想请教一下，检测细胞培养液中蛋白，最后显出的带型很宽

培养液是10%FBS，是不是浓度太高有影响？或者是浓缩胶不够？我用的是12%SDS-PAGE，转膜250mA 2hours，上样量30ul，蛋白总浓度大概40-50ug

谢谢指点

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太宽的话一般与上样量大有关

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:36

还有啊，每次我都用脱脂奶室温封闭两小时，洗膜也都是用TBST，为什么杂带还是这么多，背景黑乎乎的，一抗和二抗都是1:1000，做ACTIN背景挺干净的，二抗是抗兔的。

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杂带与你封闭关系不是很大
室温封闭30min足够
目的蛋白的一抗做几个不同的稀释度

作者: 子衿青青 时间: 2013-3-9 09:36

SDS-PAGE电泳后面染色再脱色，同样可以检测目的蛋白，为什么一般都做western-blot，而不做SDS-page呢？
望各位专家指点。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:37

SDS-PAGE电泳后面染色再脱色，同样可以检测目的蛋白，为什么一般都做western-blot，而不做SDS-page呢？
望各位专家指点。

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SDS-PAGE染色后你能确定目的蛋白吗？

作者: 131415 时间: 2013-3-9 09:37

想请教NBA老师：我刚做westernblotting ，由于有师兄的带领，程序还比较熟悉。只是很郁闷的是，我做了三次，目的蛋白都是黑带，而内参都是白带。
我的目的蛋白比较大，有180kd，内参是B-actin为43kd，电转3h，3%BSA封闭2小时，一抗1:1000过夜，二抗1:5000 2小时，洗膜后ECL显影，目的蛋白整条带发荧光，内参什么都看不到，曝光后就是目的蛋白黑带，粗黑，很吓人，而内参白带。急死我也！
很是郁闷，想请问老师.我的目的蛋白出现黑带，内参白带的最可能原因是？？？？？
此外，出现黑带和白带有哪些原因造成。非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:38

QUOTE:

原帖由 131415 于 2013-3-9 09:37 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

想请教NBA老师：我刚做westernblotting ，由于有师兄的带领，程序还比较熟悉。只是很郁闷的是，我做了三次，目的蛋白都是黑带，而内参都是白带。
我的目的蛋白比较大，有180kd，内参是B-actin为43kd，电转3h，3%BSA封闭2小时，一抗1:1000 ...

1、蛋白上样量太大
2、二抗浓度太高

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-9 09:41

请教版主，1为什么显示出泳道而别人则没有泳道
2电泳起始端应该没有蛋白显示，为什么会出现，杂带为什么会出现

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-9 09:41

你好。楼主，本人刚做WB不久，碰到很多问题，希望楼主多多指教
1.我做的是32Kd的蛋白，转膜是250ma转40min，丽春红染色上面没有条带，请问楼主到底是什么原因那？
2.每次电泳时（恒压条件下）电流都很小，80v的条件下才20mA，请问楼主时什么原因那？
3.每次提蛋白（样品为组织）都是在冰上操作，没有在液氮条件下，请问转不上膜是不是与蛋白没提取出来有关？
谢谢楼主，焦急的在线等！！！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:42

QUOTE:

原帖由 taoshengyijiu 于 2013-3-9 09:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好。楼主，本人刚做WB不久，碰到很多问题，希望楼主多多指教
1.我做的是32Kd的蛋白，转膜是250ma转40min，丽春红染色上面没有条带，请问楼主到底是什么原因那？
2.每次电泳时（恒压条件下）电流都很小，80v的条件下才20mA，请问楼主时什 ...

在进行WB钱请先对蛋白进行SDS-PAGE后的染色

作者: 987789 时间: 2013-3-9 09:43

请问一下，跑胶时nonreducing condition和reducing condition有什么区别？谢谢

作者: 小野花 时间: 2013-3-9 09:43

您好，请教！

我本打算做SDS-PAGE，检测的指标是纤维蛋白原，分子量是340kd，可是现在的问题是，我买的Marker是GE公司的，（冻干粉、从66－669kd，五个条带）看说明书后才发现，这个Marker只适用于native electrophoresis，您在9月初的时候也回贴建议我用4-12%梯度胶，GE的说明书跑出的条带也是用的梯度胶。

请问这个梯度胶怎么配，用什么特殊的溶剂么，一点不懂，还有说明书写的是用上样缓冲液稀释Marker，上样缓冲液怎么配，以前的5×SDS不能用了吧，很是郁闷，这些试剂让我准备的乱套了！主要是我做的这个实验是想要判断分子量的变化，没有Marker还不行。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:44

请问一下，跑胶时nonreducing condition和reducing condition有什么区别？谢谢

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1、胶没有什么区别
2、non reducing：样品缓冲液中不能含有还原剂，如DTT，beta-巯基乙醇
反之应该含有

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:44

您好，请教！

我本打算做SDS-PAGE，检测的指标是纤维蛋白原，分子量是340kd，可是现在的问题是，我买的Marker是GE公司的，（冻干粉、从66－669kd，五个条带）看说明书后才发现，这个Marker只适用于native electrophoresis，您在9月初的时候也回贴建议我用4-12%梯度胶，GE的说明书跑出的条带也是用的梯度胶。

请问这个梯度胶怎么配，用什么特殊的溶剂么，一点不懂，还有说明书写的是用上样缓冲液稀释Marker，上样缓冲液怎么配，以前的5×SDS不能用了吧，很是郁闷，这些试剂让我准备的乱套了！主要是我做的这个实验是想要判断分子量的变化，没有Marker还不行。

版主如果有native electrophoresis方面的资料，能帮我发一下么huihui4595@sina.com非常感谢！

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native是不能含有DTT等还原剂及 SDS的
梯度胶可以参看《蛋白质技术手册》

作者: xingyi08 时间: 2013-3-9 09:45

非常感谢楼主上次回答我的问题，按照你的指示，我行考马斯亮蓝染色发现天带还是很清晰，我在想是不是转膜时出了问题，我做的是32Kd的蛋白质，转膜时用的是恒流250mA，转40min，你觉得这个条件有问题没有，如果楼主有更好的方法，希望指示！！！
焦急的在线等~~~

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:45

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2013-3-9 09:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢楼主上次回答我的问题，按照你的指示，我行考马斯亮蓝染色发现天带还是很清晰，我在想是不是转膜时出了问题，我做的是32Kd的蛋白质，转膜时用的是恒流250mA，转40min，你觉得这个条件有问题没有，如果楼主有更好的方法，希望 ...

你的这个转膜条件没问题

作者: xingyi08 时间: 2013-3-9 09:46

请问如果目的蛋白的分子量非常小，大概4 Kd，配胶和转膜有什么要求？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:46

不好意思
这么小的蛋白（多肽）没有经验

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 09:54

非常感谢楼主对我问题的解答，我还想问下，non reducing的上样缓冲液怎么配?要是不加DTT，beta-巯基乙醇，那缓冲液的总体积不是改变了吗？还是另有其他的配方?谢谢楼主

作者: 2541 时间: 2013-3-9 09:55

纯的核蛋白，不含胞浆蛋白的，用什么来做内参比较好，ACTIN不行吧？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:55

非常感谢楼主对我问题的解答，我还想问下，non reducing的上样缓冲液怎么配?要是不加DTT，beta-巯基乙醇，那缓冲液的总体积不是改变了吗？还是另有其他的配方?谢谢楼主

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总体积用蒸馏水补足

作者: NBA 时间: 2013-3-9 09:55

纯的核蛋白，不含胞浆蛋白的，用什么来做内参比较好，ACTIN不行吧？

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用核蛋白内参
参考文献及Abcam上有资料
呵呵

作者: #问号# 时间: 2013-3-9 09:56

请问版主，转膜后如果没有时间做下一步（2-3天后才有时间），能将膜放在PBS里泡着吗？还是放在封闭液里封闭？封闭太久会不会overblot？

作者: #问号# 时间: 2013-3-9 09:56

还有一个问题，提取完蛋白样品，一般怎样存放？是在-80度存放，还是95度变性后-80度存放？-80和-20度能存放多久？比较敏感的蛋白是不是最好尽快跑胶转膜？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:22

请问版主，转膜后如果没有时间做下一步（2-3天后才有时间），能将膜放在PBS里泡着吗？还是放在封闭液里封闭？封闭太久会不会overblot？

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封闭后，吸取封闭液，-20度冻存

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:23

还有一个问题，提取完蛋白样品，一般怎样存放？是在-80度存放，还是95度变性后-80度存放？-80和-20度能存放多久？比较敏感的蛋白是不是最好尽快跑胶转膜？谢谢！

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有-80当然是-80好
尽快检测最好

作者: standbyme 时间: 2013-3-9 10:24

问个目的蛋白选择的问题：
做差异蛋白质组学方面的研究，目前用质谱鉴定出了一些蛋白，下一步准备选取部分蛋白质进行验证，我想请教一下：在进行WB和real-time PCR时，哪些目的蛋白可以进行验证，需要满足一些什么条件？(我做的标本是大鼠脊髓)

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:24

问个目的蛋白选择的问题：
做差异蛋白质组学方面的研究，目前用质谱鉴定出了一些蛋白，下一步准备选取部分蛋白质进行验证，我想请教一下：在进行WB和real-time PCR时，哪些目的蛋白可以进行验证，需要满足一些什么条件？(我做的标本是大鼠脊髓)

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这个问题挺有难度的
选择有意义的差异蛋白
有经费就多验证几个

作者: glass 时间: 2013-3-9 10:25

请教楼主，您认为转模时恒压好还是恒流好？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:25

请教楼主，您认为转模时恒压好还是恒流好？

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依据个人及实验室习惯
我用的是恒流

作者: vvmmoy 时间: 2013-3-9 10:26

这个问题挺有难度的
选择有意义的差异蛋白
有经费就多验证几个

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谢谢版主，请问每个质谱给出的蛋白都有相应的抗体吗，都能进行WB和real-time PCR吗？有什么方法可以查是否有该抗体吗，谢谢？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:26

谢谢版主，请问每个质谱给出的蛋白都有相应的抗体吗，都能进行WB和real-time PCR吗？有什么方法可以查是否有该抗体吗，谢谢？

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应该是大部分都有商业化的抗体

作者: vvmmoy 时间: 2013-3-9 10:27

应该是大部分都有商业化的抗体

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谢谢版主！昨天试了下，去abcam等网站搜了下，
的确大部分有抗体，但是与质谱给出的蛋白质还是有一些差异的，
比如说质谱给出的是一个蛋白质的一部分结构，比如说蛋白质的某亚基，但是网站上查询时只有该蛋白质的完整抗体。我想请教一下，在这种情况下可以用完整的蛋白质抗体来检测，从而进行验证吗？

作者: bring 时间: 2013-3-9 10:27

楼主，你好！
我想再请教你一个问题，我们实验一共有五个组，每组都有六只SD大鼠。那我做WB时，每组是不是只取一只大鼠的样本！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:28

谢谢版主！昨天试了下，去abcam等网站搜了下，
的确大部分有抗体，但是与质谱给出的蛋白质还是有一些差异的，
比如说质谱给出的是一个蛋白质的一部分结构，比如说蛋白质的某亚基，但是网站上查询时只有该蛋白质的完整抗体。我想请教一下，在这种情况下可以用完整的蛋白质抗体来检测，从而进行验证吗？

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最好是能找到与你的质谱结果相匹配的抗体
你还可以上Novus，Abnova等找找
抗体公司很多啦

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:28

楼主，你好！
我想再请教你一个问题，我们实验一共有五个组，每组都有六只SD大鼠。那我做WB时，每组是不是只取一只大鼠的样本！

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要做统计处理吗？

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-9 10:28

楼主，你好！
我想再请教你一个问题，我们实验一共有五个组，每组都有六只SD大鼠。那我做WB时，每组是不是只取一只大鼠的样本！

要做统计处理吗？
做不做统计处理差别在那里那，望楼主指教，不胜感激

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:29

QUOTE:

原帖由 cwcwcww 于 2013-3-9 10:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主，你好！
我想再请教你一个问题，我们实验一共有五个组，每组都有六只SD大鼠。那我做WB时，每组是不是只取一只大鼠的样本！

要做统计处理吗？
做不做统计处理差别在那里那，望楼主指教，不胜感激 ...

做统计必须具备足够的样本量

作者: tianmei001 时间: 2013-3-9 10:29

非常感谢并敬佩楼主有问必答，并且答复的很快的精神！
楼主还有一个问题想请教你。我今天跑的条带，有一条带在膜的一边（准确的说，像一滴墨滴一样），并且转膜时此处的膜没有对这胶（剪得膜长的原因），还有此处本来是MARKER的位置，有蓝色的残留痕迹在此处，我在想是差点就转过去啦，还是MARKER蓝色痕迹造成的，我想下次调整转膜时间，32KD的蛋白质，我想下次250mA转35min，你个人觉得是什么问题那？？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:29

非常感谢并敬佩楼主有问必答，并且答复的很快的精神！
楼主还有一个问题想请教你。我今天跑的条带，有一条带在膜的一边（准确的说，像一滴墨滴一样），并且转膜时此处的膜没有对这胶（剪得膜长的原因），还有此处本来是MARKER的位置，有蓝色的残留痕迹在此处，我在想是差点就转过去啦，还是MARKER蓝色痕迹造成的，我想下次调整转膜时间，32KD的蛋白质，我想下次250mA转35min，你个人觉得是什么问题那？？

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转膜条件可以

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:30

我也是和你一样，我是压得片子，30分钟也什么都没有。。郁闷

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:37

请问你现在曝出来啦嘛~我和你用的一个牌子的抗体。。。

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:38

我在用考马斯亮蓝染色测定蛋白浓度时，将样品稀释为不同倍数进行测定，吸光度值都在标准曲线的范围之内，但是根据各个稀释度计算原浓度时，得出的原浓度是不同的，这是为什么？抓狂啊！……

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:38

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原帖由 windy+++ 于 2013-3-9 10:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我在用考马斯亮蓝染色测定蛋白浓度时，将样品稀释为不同倍数进行测定，吸光度值都在标准曲线的范围之内，但是根据各个稀释度计算原浓度时，得出的原浓度是不同的，这是为什么？抓狂啊！…… ...

每个稀释度的误差不同
还有不同稀释度中影响bradford的试剂浓度不一致
不能做线性比较

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:39

QUOTE:

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每个稀释度的误差不同
还有不同稀释度中影响bradford的试剂浓度不一致
不能做线性比较

那请问楼主，我该用什么标准来选择其中的某个值呢？谢谢~

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:39

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那请问楼主，我该用什么标准来选择其中的某个值呢？谢谢~

OD值在0.5-1.0之间的

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:40

请问楼主：marker是蓝色的，相应pv膜被染蓝，ECL下会显色吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 10:40

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原帖由 windy+++ 于 2013-3-9 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问楼主：marker是蓝色的，相应pv膜被染蓝，ECL下会显色吗？

ECL能不能显色要看marker的原材料（蛋白）是什么

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 10:44

老师，你好。今天我跑内参，加了四个样本，结果只出现一条带，其他组没出现，你认为是什么原因那

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 10:45

楼主，你好！我用同一个样品使用nonreducing condition和reducing condition跑胶，跑出来后曝光，出来的条带不一样，请问这是什么原因啊？谢谢

作者: mimili_901 时间: 2013-3-9 10:45

版主好，1.我做b-actin，150mA湿转，多长时间比较合适？
2.没有变性的蛋白在-20冰箱可以放多久？
3.我想用GAPDH做内参，可不可以在同一张膜上面直接做，具体如何操作？

作者: KGZ564 时间: 2013-3-9 10:46

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）

作者: KGZ564 时间: 2013-3-9 10:46

另外：已经提完的蛋白液里会不会还有没裂解出来的核蛋白，能不能再提一次？

作者: wood533 时间: 2013-3-9 10:47

我现在做的是52KD的蛋白，用10%是胶时，片子出来的结果是条带很松散，且不黑很浅，加大上样量背景又很少，若降低一抗浓度，又变得很浅。同时用12%的胶时，条带很细，也黑了。但是转膜后染胶，10%的可以完全转过去，12%的就会有很多没转过去，我的转膜条件是100V80-90分钟。我做了很多次都是这样，我觉得这样会很影响实验结果，现在都不知道该怎么再做下去了，麻烦老师帮忙给指导一下，谢谢！

作者: vcve 时间: 2013-3-9 11:02

老师您好，问个非技术问题。半个月前做过一次WB，当现在想做的时候发现凝胶贮液都变成胶状凝固的了，半个月前配胶时没有大的失误，不敢肯定是不是因为一些不记得的小失误如配胶时未更换枪头，但是配胶时所用的大枪头只用在凝胶贮液，缓冲液，DW上，所以不知道怎么就会变成这样了。凝胶贮液是刚买不久的。。。。。。望老师解答，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:03

老师，你好。今天我跑内参，加了四个样本，结果只出现一条带，其他组没出现，你认为是什么原因那

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转膜后进行丽春红染色等步骤检测了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:03

楼主，你好！我用同一个样品使用nonreducing condition和reducing condition跑胶，跑出来后曝光，出来的条带不一样，请问这是什么原因啊？谢谢

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什么蛋白？
reducing会打断二硫键，如果你的蛋白存在有二硫键的话，跑出来的分子量不一样是对的

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:03

版主好，1.我做b-actin，150mA湿转，多长时间比较合适？
2.没有变性的蛋白在-20冰箱可以放多久？
3.我想用GAPDH做内参，可不可以在同一张膜上面直接做，具体如何操作？

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1、300mA 40min
2、可以放置几个月吧
3、可以做，方法有好几种，需要通过目的蛋白来确定。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:04

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）

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1、能裂解出一部分核蛋白
2、考染不能说明某一蛋白的问题，如果能说明的话就不需要做WB检测了。考染能看看蛋白提取与定量情况
3、上样量多少？ECL是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:04

另外：已经提完的蛋白液里会不会还有没裂解出来的核蛋白，能不能再提一次？

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剩下的是细胞碎片，建议用新样品提取

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:04

我现在做的是52KD的蛋白，用10%是胶时，片子出来的结果是条带很松散，且不黑很浅，加大上样量背景又很少，若降低一抗浓度，又变得很浅。同时用12%的胶时，条带很细，也黑了。但是转膜后染胶，10%的可以完全转过去，12%的就会有很多没转过去，我的转膜条件是100V80-90分钟。我做了很多次都是这样，我觉得这样会很影响实验结果，现在都不知道该怎么再做下去了，麻烦老师帮忙给指导一下，谢谢！

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配胶的一些缓冲液可能有问题
膜是新买的吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:05

老师您好，问个非技术问题。半个月前做过一次WB，当现在想做的时候发现凝胶贮液都变成胶状凝固的了，半个月前配胶时没有大的失误，不敢肯定是不是因为一些不记得的小失误如配胶时未更换枪头，但是配胶时所用的大枪头只用在凝胶贮液，缓冲液，DW上，所以不知道怎么就会变成这样了。凝胶贮液是刚买不久的。。。。。。望老师解答，谢谢

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储液不能用了就换了吧

作者: 2541 时间: 2013-3-9 11:05

配胶的一些缓冲液可能有问题
膜是新买的吗？

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膜是新买的。我今天试试延长凝胶时间，加大上样量，看结果如何。
我用同样的胶做的别的蛋白就很好，而且我们实验室的其他人也用的一样的配胶溶液都很正常。
另外还有一个问题要问您，我做的43KD的蛋白条带也有些弥散，有时候就像两个条带似地。
前段时间做的不这样的，现在不知道该怎么处理了，再麻烦老师知道一下。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 11:06

什么蛋白？
reducing会打断二硫键，如果你的蛋白存在有二硫键的话，跑出来的分子量不一样是对的

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我做的是血清，我直接把血清拿来做的，没有去除里面的任何成分。我的蛋白是CFH

作者: wood533 时间: 2013-3-9 11:07

楼主您好：几个问题请教
1，用碧云天RIPA裂解液（强），加PMSF裂解大鼠脑组织（未加其它蛋白酶抑制剂），测蛋白浓度后-70保存，核蛋白能否裂解出来？（按照说明书操作）
2，WB跑胶后，考马斯亮蓝染胶，目标蛋白附近有条带，但是未见明显趋势（应该有趋势），也未必就能说把核蛋白裂解出来了吧
3，今天跑胶，内参跑出来了，目标蛋白一点也没显影，一抗是Abcam的。

现在就怀疑蛋白裂解有问题，我的裂解液还应加入什么才能更好的裂解核蛋白呢？？（该裂解液说明书上写核蛋白裂解效果很好，蛋白酶抑制剂也有的）

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1、能裂解出一部分核蛋白
2、考染不能说明某一蛋白的问题，如果能说明的话就不需要做WB检测了。考染能看看蛋白提取与定量情况
3、上样量多少？ECL是什么？

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上样量是20ug，16ug蛋白加4ug上样缓冲液（总蛋白浓度大约调为1ug/ul），现在怀疑上样量太少，最近打算提高上样量40ug，80ug，100ug分别跑电泳试试情况，另外一抗浓度也适当提高一点看看。
ECL是DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:07

上样量是20ug，16ug蛋白加4ug上样缓冲液（总蛋白浓度大约调为1ug/ul），现在怀疑上样量太少，最近打算提高上样量40ug，80ug，100ug分别跑电泳试试情况，另外一抗浓度也适当提高一点看看。
ECL是DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒

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1、WB不需要那么高的上样量，我一般上样量不会超过40ug，BCA法蛋白定量
2、ECL是DAB辣根。。。。？
表述有误。
用DAB敏感性差，能做出结果来的可能性不大

作者: utt0989 时间: 2013-3-9 11:08

能给个WB细胞裂解液的配方吗？我们实验室现在缺DTT，可不可以用没有DTT的配方，或是用其他东西代替？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:08

细胞裂解液不需要用DTT

作者: tianmei001 时间: 2013-3-9 11:09

我是做Western的新手，想问一下，我转膜完后，用丽春红染色，一个条带也看不出来，请问这是转膜没转上吗？谢谢！
注：80V稳压电泳，约100min，350mA湿转2.5h。
因为刚开始做，不太清楚，辛苦版主啦

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:09

QUOTE:

原帖由 tianmei001 于 2013-3-9 11:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是做Western的新手，想问一下，我转膜完后，用丽春红染色，一个条带也看不出来，请问这是转膜没转上吗？谢谢！
注：80V稳压电泳，约100min，350mA湿转2.5h。
因为刚开始做，不太清楚，辛苦版主啦 ...

1、蛋白电泳染胶了吗？首先确保有蛋白
2、转膜后染胶了吗？
3、用预染marker没有？如果用了在膜上有没有呢？
别是电极放反了

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 11:10

楼主你好！接着请教你问题：如果丽春红染色后，直接封闭，附抗体可以不，丽春红对其影响大不，谢谢指教！！！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 11:10

楼主，你好。我想问下，血清做western blot需要怎么处理啊？稀释一般用什么啊？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:11

楼主你好！接着请教你问题：如果丽春红染色后，直接封闭，附抗体可以不，丽春红对其影响大不，谢谢指教！！！

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丽春红没有影响
可以直接封闭

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:11

楼主，你好。我想问下，血清做western blot需要怎么处理啊？稀释一般用什么啊？谢谢

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蛋白浓度调整至2-4mg/ml
不要太高
可以用PBS稀释

作者: mickeylin 时间: 2013-3-9 11:12

O--------Occludin
V--------VEGF
B------beta-action
一抗是santa的，The VEGF was suggested 1:350,occluding was 1:100
大家看看主要原因是啥？40ug/孔小鼠视网膜提取的蛋白，5%的脱脂奶粉室温封闭2小时，二抗也是室温2小时洗膜10min × 4

VEGF、Occludin一点条带都没内参还可以

图片附件: 61375713.jpg (2013-3-9 11:12, 6.51 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15124

作者: damingxia0904 时间: 2013-3-9 11:12

最近想做western 对western还不是很了解弱弱的问一下如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:13

最近想做western 对western还不是很了解弱弱的问一下如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢

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冻存的细胞可以做

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 11:13

楼主，接着想教你WB问题，我每次转膜都是转两张膜（在两个黑匣子里），用一个电转仪电转，每次照相都是一张膜显示，请问楼主这是什么原因那？？

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 11:13

还有个问题接着问哈楼主，上样的时候根据蛋白的浓度，计算上样体积从而使蛋白的量一致，我是这样做的，还有上样相同的体积，蛋白量不一样，然后根据浓度计算从而标准化，这两者那一种更好一点，楼主的经验是什么，谢谢！！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 11:14

亲爱的战友们：我现在遇到一个奇怪的事情，麻烦楼主与战友们给我一些启示。
我现在做一个分子量17的蛋白，曝光后的结果是背景一片漆黑，在目的条带处包括MARKER的目的条带处是亮的。就是说结果和本来预想的恰恰相反！！！而且目的条带的形状很好，扁椭圆形，不同标本还可见粗细的不同，这种粗细的差异和预想一致！
我有些崩溃了！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 11:15

接上，我的BETA曝的效果挺好的。同时电泳，同时转膜，同时曝光。

作者: ffooll 时间: 2013-3-9 11:15

您好！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测蛋白的p-NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？我是不是可以这么理解：NF-KB的活性可以通过活化的p65来反映，而p65只有活化后才能进入核内。换句话说，也就是p65的磷酸化水平可以反映核内p65的水平。那么是不是全蛋白中磷酸化的p65水平跟核蛋白中总的p65水平相一致？那么是不是可以用p-p65抗体测全蛋白中磷酸化的p65来反应NF-KB活化程度，而不一定要用普通的p65抗体测定核蛋白中p65的量？是不是这样？另外，我如果只想看下药物对NF-KB有没有影响的话是不是只要看干预组与对照组全蛋白中NF-KBp65的水平，而没必要一定要测核蛋白或者磷酸化p65的水平？请您指点！！谢谢！！！

作者: INK 时间: 2013-3-9 11:16

楼主您好，我刚开始做wb，现在我遇到个问题就是我的目的蛋白是17，35KD的，内参是43KD,如果不洗的话，怎么在一块胶上同时检测，谢谢！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 11:16

老师你好！有几个问题。
1.我今天跑了个GADPH（内参）。一个正常样本和四个不同时间感染的鼠肝脏组织来源的蛋白样本，跑了五个泳道。显影出来仅有正常组出现GD条带，而且又细又浅，其余四组影子也没有，请问会是什么原因啊！
整个操作在冰上进行，应该不会是蛋白降解。转膜条件是350mA 150min，有没有问题啊？
转膜完后胶染色，无条带。
2.还想问一下，转膜用的滤纸一般多长时间换一次？
3.天气凉了以后，用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭需不需要提高温度，增加封闭效率？
辛苦啦！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 11:17

楼主您好，我刚开始做wb，现在我遇到个问题就是我的目的蛋白是17，35KD的，内参是43KD,如果不洗的话，怎么在一块胶上同时检测，谢谢！

你的意思是这三个蛋白在同一块膜上检测吧。
这三个蛋白的分子量离得不是很近17,35,43kd，我觉得，可以在电泳中加上预染marker,转膜后，或者在封闭后，将这三个蛋白按marker上所显示蛋白质的分子量，将其剪成三块膜，分别孵不同的一抗，剪得时候要看好，以免碰到这三个蛋白条带。仅供参考！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:18

最近想做western 对western还不是很了解弱弱的问一下如果用细胞做western是不是必须是活细胞啊？培养好后在冰箱冻存的细胞能不能做啊？谢谢

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冻存的细胞与组织都可以

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:20

还有个问题接着问哈楼主，上样的时候根据蛋白的浓度，计算上样体积从而使蛋白的量一致，我是这样做的，还有上样相同的体积，蛋白量不一样，然后根据浓度计算从而标准化，这两者那一种更好一点，楼主的经验是什么，谢谢！！

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相同体积
相同的总蛋白量

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:21

亲爱的战友们：我现在遇到一个奇怪的事情，麻烦楼主与战友们给我一些启示。
我现在做一个分子量17的蛋白，曝光后的结果是背景一片漆黑，在目的条带处包括MARKER的目的条带处是亮的。就是说结果和本来预想的恰恰相反！！！而且目的条带的形状很好，扁椭圆形，不同标本还可见粗细的不同，这种粗细的差异和预想一致！
我有些崩溃了！

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调整二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:21

您好！我最近打算做药物对肾脏疾病NF-KB信号通路的干预作用，想用Western Blot测定NF-KB p65活性。一些国外的文献NF-KB p65活性测定采用的是普通的抗体，也有文献采用的是磷酸化的抗体，所以很不理解。园子的朋友说p65活化后入核，所以测核内普通的NF-KB p65活性与测蛋白的p-NF-KB p65活性意义是一样的，我想知道是不是这样？我是不是可以这么理解：NF-KB的活性可以通过活化的p65来反映，而p65只有活化后才能进入核内。换句话说，也就是p65的磷酸化水平可以反映核内p65的水平。那么是不是全蛋白中磷酸化的p65水平跟核蛋白中总的p65水平相一致？那么是不是可以用p-p65抗体测全蛋白中磷酸化的p65来反应NF-KB活化程度，而不一定要用普通的p65抗体测定核蛋白中p65的量？是不是这样？另外，我如果只想看下药物对NF-KB有没有影响的话是不是只要看干预组与对照组全蛋白中NF-KBp65的水平，而没必要一定要测核蛋白或者磷酸化p65的水平？请您指点！！谢谢！！！

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有没有必要测我不懂
如果要测活性需要检测总蛋白与磷酸化蛋白两种形式

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:22

楼主您好，我刚开始做wb，现在我遇到个问题就是我的目的蛋白是17，35KD的，内参是43KD,如果不洗的话，怎么在一块胶上同时检测，谢谢！

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同时检测有一定的难度
如果选择小鼠单抗可以在分别摸好稀释度的条件下，可以一起做

作者: NBA 时间: 2013-3-9 11:23

老师你好！有几个问题。
1.我今天跑了个GADPH（内参）。一个正常样本和四个不同时间感染的鼠肝脏组织来源的蛋白样本，跑了五个泳道。显影出来仅有正常组出现GD条带，而且又细又浅，其余四组影子也没有，请问会是什么原因啊！
整个操作在冰上进行，应该不会是蛋白降解。转膜条件是350mA 150min，有没有问题啊？
转膜完后胶染色，无条带。
2.还想问一下，转膜用的滤纸一般多长时间换一次？
3.天气凉了以后，用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭需不需要提高温度，增加封闭效率？
辛苦啦！

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1、先把你的样品跑电泳后染胶
2、转膜把膜染一下

作者: DDD 时间: 2013-3-9 11:23

楼主你好！
最近作ＷＢ出现了一些问题，同样的蛋白样本，同样的条件，上一次条带出来了，下一次就什么都没有了，抗体都是新的，唯一变换的只有电泳液和转膜液，我的转膜条件是内参（37ｋＤａ）３００ｍＡ恒流转１ｈ，出来之后连marker都看不见了，显影后的结果是一张膜出来了，另一张膜没有出来，按理说之前内参随便做都会出来的。搞不懂到底哪里出了问题了。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-9 11:24

调整二抗浓度

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老师的意思是怎么调整？稀释二抗的浓度？您以前也看到别人出现过这种情况么？原理是什么呢，为什么会出现这样的结果。我做的别的因子如果二抗浓度高了只见一片漆黑，看不到亮带。只有这个因子背景黑而目的条带处却是亮的。

作者: yjf1026 时间: 2013-3-9 11:27

老师你好！有几个问题。
1.我今天跑了个GADPH（内参）。一个正常样本和四个不同时间感染的鼠肝脏组织来源的蛋白样本，跑了五个泳道。显影出来仅有正常组出现GD条带，而且又细又浅，其余四组影子也没有，请问会是什么原因啊！
整个操作在冰上进行，应该不会是蛋白降解。转膜条件是350mA 150min，有没有问题啊？
转膜完后胶染色，无条带。
2.还想问一下，转膜用的滤纸一般多长时间换一次？
3.天气凉了以后，用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭需不需要提高温度，增加封闭效率？
辛苦啦！

丁香园版主建议：
1、先把你的样品跑电泳后染胶
2、转膜把膜染一下

我转完膜以后，膜进行丽春红染色，仅看到五个泳道，GD条带未见；胶进行考马斯亮蓝染色，脱色后，在反射光下，无条带，这应该可以说明转膜是没有问题的吧。谢谢版主，我下次试着把样品跑电泳后胶染一下，看一下到底问题出在哪。

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 11:27

调整二抗浓度

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老师的意思是怎么调整？稀释二抗的浓度？您以前也看到别人出现过这种情况么？原理是什么呢，为什么会出现这样的结果。我做的别的因子如果二抗浓度高了只见一片漆黑，看不到亮带。只有这个因子背景黑而目的条带处却是亮的。

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 11:27

我的意思可能你们没看明白，发个图片吧，敬候老师指教！

图片附件: 77397610.snap.jpg (2013-3-9 11:27, 15.24 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15125

作者: lixi559 时间: 2013-3-9 11:28

我的意思可能你们没看明白，发个图片吧，敬候老师指教！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:19

老师的意思是怎么调整？稀释二抗的浓度？您以前也看到别人出现过这种情况么？原理是什么呢，为什么会出现这样的结果。我做的别的因子如果二抗浓度高了只见一片漆黑，看不到亮带。只有这个因子背景黑而目的条带处却是亮的。

二抗浓度太高会产生背景
稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:21

我的意思可能你们没看明白，发个图片吧，敬候老师指教！

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稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:22

还要麻烦楼主，问几个小问题，漂洗后，附一抗前膜一不小心掉至桌面上，然后我漂洗了大约一刻钟，结果除了背景遭污染，还有可能造成什么后果，桌面看起来是干净的那种？？还有楼主，漂洗时间过长会不会对蛋白有影响，谢谢

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你知道桌子上有什么东西吗？
试剂可大部分都是透明的
另外漂洗时间长了抗体会与抗原解离

作者: 49888 时间: 2013-3-9 14:22

楼主好，继续向您请教：
1，大鼠脑组织，处死之后迅速取脑，大脑分两半，称重大约0.2g，分别加入2000ul碧云天RIPA裂解液（强），（之前裂解液按要求加入PMSF），剪碎，超声裂解，裂解几秒，拿出，再超声，（期间放在冰盒上，操作也在冰上）。孵育半小时，4度离心机10000g10分钟，取上清，测蛋白浓度10mg/ml,蛋白一直放入-70冰箱。

2，目的蛋白为Rb蛋白，分子量105kd左右，定位在核内。

3，一抗是abcam的，二抗是碧云天的，发光是碧云天ECL。

4，上样量曾经上过16ug，40ug，80ug，100ug，一抗最高浓度了1：200，4度过夜。之前封闭5%脱脂奶粉1.5小时。

5，5%浓缩胶，10%分离胶，电泳80v，100v，彩色MARKER跑的很齐，曾经考染胶，有大量蛋白条带，但不确定是什么蛋白。湿转膜250mA，2小时，0.45NC膜，膜上MARKER转的很清晰，没用丽春红染过。

6，内参actin，做出来了，P21也做出来了，p21也是核内的蛋白。Rb，p21，actin在同一张胶切的。

请楼主分析Rb白板原因
补充：我看abcam一抗里有叠氮钠，但是在后面会洗掉的吧，不会影响HRP的二抗了吧，洗膜TBST 4X10分钟。

作者: 49888 时间: 2013-3-9 14:24

打算再做一次wb，实验条件更改如下：
1，用-70冰箱里的新蛋白，之前做的是半月之前从-70拿出放在-20度里的。

2，继续用100ug上样量，怀疑核内Rb裂解出来的比较少？

3，是否用一抗1：100试试。

4，丽春红染膜看看条带。

5，封闭浓度适当降低，封闭时间减少。

6，一抗室温1小时后再放入4度冰箱过夜。

作者: remenb 时间: 2013-3-9 14:25

楼主您好，请问目的蛋白和内参的分子量一样行不？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:30

楼主好，继续向您请教：
1，大鼠脑组织，处死之后迅速取脑，大脑分两半，称重大约0.2g，分别加入2000ul碧云天RIPA裂解液（强），（之前裂解液按要求加入PMSF），剪碎，超声裂解，裂解几秒，拿出，再超声，（期间放在冰盒上，操作也在冰上）。孵育半小时，4度离心机10000g10分钟，取上清，测蛋白浓度10mg/ml,蛋白一直放入-70冰箱。

2，目的蛋白为Rb蛋白，分子量105kd左右，定位在核内。

3，一抗是abcam的，二抗是碧云天的，发光是碧云天ECL。

4，上样量曾经上过16ug，40ug，80ug，100ug，一抗最高浓度了1：200，4度过夜。之前封闭5%脱脂奶粉1.5小时。

5，5%浓缩胶，10%分离胶，电泳80v，100v，彩色MARKER跑的很齐，曾经考染胶，有大量蛋白条带，但不确定是什么蛋白。湿转膜250mA，2小时，0.45NC膜，膜上MARKER转的很清晰，没用丽春红染过。

6，内参actin，做出来了，P21也做出来了，p21也是核内的蛋白。Rb，p21，actin在同一张胶切的。

请楼主分析Rb白板原因
补充：我看abcam一抗里有叠氮钠，但是在后面会洗掉的吧，不会影响HRP的二抗了吧，洗膜TBST 4X10分钟。

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按你的描述，操作没问题
现在怀疑ECL敏感性低

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:32

楼主您好，请问目的蛋白和内参的分子量一样行不？

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可以
但是建议最好错开

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:34

打算再做一次wb，实验条件更改如下：
1，用-70冰箱里的新蛋白，之前做的是半月之前从-70拿出放在-20度里的。

2，继续用100ug上样量，怀疑核内Rb裂解出来的比较少？

3，是否用一抗1：100试试。

4，丽春红染膜看看条带。

5，封闭浓度适当降低，封闭时间减少。

6，一抗室温1小时后再放入4度冰箱过夜。

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1、一抗建议稀释度多少？
2、一抗室温30min后4度过夜
3、换用BSA
4、建议丽春红染膜
5、100ug的上样量太大，不过可以试试（一般的WB不会超过40ug）

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 14:35

请教版主，考马斯亮蓝染色的脱色液中甲醇占多少比例比较合适？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:36

请教版主，考马斯亮蓝染色的脱色液中甲醇占多少比例比较合适？谢谢！

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多一点，少一点都没关系

作者: yonger 时间: 2013-3-9 14:38

请教老师，我最近做目的蛋白用两张膜，总是一张膜有条带，另外一张什么都没有，就是电泳的时候跑两块胶，用一个电转槽转两张一张膜有（正反面没问题），后来换成两个电转槽每个转一张膜，也是一张膜有，做丽春红染色总是一张膜上没蛋白，同样的条件下，为什么一张膜有，另外一张膜没有呀，电泳，电转的条件一样，电泳液，电转液也一样，其他条件几乎一样，实在搞不明白，就连封闭，洗膜都是在同一个培养皿内，楼主分析估计是什么原因那，苦恼了几天啦，谢谢！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 14:40

楼主好，继续向您请教：
1，大鼠脑组织，处死之后迅速取脑，大脑分两半，称重大约0.2g，分别加入2000ul碧云天RIPA裂解液（强），（之前裂解液按要求加入PMSF），剪碎，超声裂解，裂解几秒，拿出，再超声，（期间放在冰盒上，操作也在冰上）。孵育半小时，4度离心机10000g10分钟，取上清，测蛋白浓度10mg/ml,蛋白一直放入-70冰箱。

2，目的蛋白为Rb蛋白，分子量105kd左右，定位在核内。

3，一抗是abcam的，二抗是碧云天的，发光是碧云天ECL。

4，上样量曾经上过16ug，40ug，80ug，100ug，一抗最高浓度了1：200，4度过夜。之前封闭5%脱脂奶粉1.5小时。

5，5%浓缩胶，10%分离胶，电泳80v，100v，彩色MARKER跑的很齐，曾经考染胶，有大量蛋白条带，但不确定是什么蛋白。湿转膜250mA，2小时，0.45NC膜，膜上MARKER转的很清晰，没用丽春红染过。

6，内参actin，做出来了，P21也做出来了，p21也是核内的蛋白。Rb，p21，actin在同一张胶切的。

请楼主分析Rb白板原因
补充：我看abcam一抗里有叠氮钠，但是在后面会洗掉的吧，不会影响HRP的二抗了吧，洗膜TBST 4X10分钟。

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按你的描述，操作没问题
现在怀疑ECL敏感性低

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为什么P21和内参做出来了，ECL敏感性不够吗？有什么依据吗？和Rb蛋白分子量有关？
不过已经出来的这两个条带确实不怎么黑，也是时浓时淡。

作者: wood533 时间: 2013-3-9 14:41

请教老师，我最近做目的蛋白用两张膜，总是一张膜有条带，另外一张什么都没有，就是电泳的时候跑两块胶，用一个电转槽转两张一张膜有（正反面没问题），后来换成两个电转槽每个转一张膜，也是一张膜有，做丽春红染色总是一张膜上没蛋白，同样的条件下，为什么一张膜有，另外一张膜没有呀，电泳，电转的条件一样，电泳液，电转液也一样，其他条件几乎一样，实在搞不明白，就连封闭，洗膜都是在同一个培养皿内，楼主分析估计是什么原因那，苦恼了几天啦，谢谢！

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样品也相同？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:41

请楼主分析Rb白板原因
补充：我看abcam一抗里有叠氮钠，但是在后面会洗掉的吧，不会影响HRP的二抗了吧，洗膜TBST 4X10分钟。

为什么P21和内参做出来了，ECL敏感性不够吗？有什么依据吗？和Rb蛋白分子量有关？
不过已经出来的这两个条带确实不怎么黑，也是时浓时淡。

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呵呵
实验经验

作者: avi317 时间: 2013-3-9 14:42

请问western blot条带拖尾，模糊是什么原因？
我的目的条带是130kda，8%的分离胶，以前做过一次，结果挺好的，条带很清晰，但是最近几次结果都不好，条带弥散，附件是结果图片，请问是胶的问题还是样品的问题?

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 14:42

请教楼主老师：
最近想做一下蛋白点杂交实验，可是我发现把蛋白点到膜上的时候，蛋白溶液是弥散开的，并不能成为一点或者画成线，这样曝光出来根本和背景分不开，怎么保证蛋白局限于膜上一点呢？PVDF膜甲醇激活，转膜液浸湿后，彻底干燥？不是说膜尽量不要干燥吗？

菜鸟问题，还请解答。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:42

请问western blot条带拖尾，模糊是什么原因？
我的目的条带是130kda，8%的分离胶，以前做过一次，结果挺好的，条带很清晰，但是最近几次结果都不好，条带弥散，附件是结果图片，请问是胶的问题还是样品的问题?

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样品冻融过多次？
中间换过什么试剂？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:43

请教楼主老师：
最近想做一下蛋白点杂交实验，可是我发现把蛋白点到膜上的时候，蛋白溶液是弥散开的，并不能成为一点或者画成线，这样曝光出来根本和背景分不开，怎么保证蛋白局限于膜上一点呢？PVDF膜甲醇激活，转膜液浸湿后，彻底干燥？不是说膜尽量不要干燥吗？

菜鸟问题，还请解答。

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请用NC膜

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-9 14:44

前辈您好：请教您两问题，我配的8%的胶，蛋白分子量为100，50-57，18kD，转膜时我把胶切成两段，以35为界，18KD的转两小时，100及50-57转三小时，恒流300mA,湿转，NC膜，不知可否？刚才转完了，瞅了一眼，因为35以下的胶条很小了，所以不好固定，变形了，歪歪扭扭的，不知道有什么更好的方法？还有一问题280KD蛋白我用的6%的胶，上述条件需要转多久，4小时可以吗？（4°）谢谢~

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:44

QUOTE:

原帖由 BOSS2011 于 2013-3-9 14:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
前辈您好：请教您两问题，我配的8%的胶，蛋白分子量为100，50-57，18kD，转膜时我把胶切成两段，以35为界，18KD的转两小时，100及50-57转三小时，恒流300mA,湿转，NC膜，不知可否？刚才转完了，瞅了一眼，因为35以下的胶条很小了，所以不好固定，变形了 ...

用0.22um的膜一起转
不用切胶

作者: DONT 时间: 2013-3-9 14:45

我想请教楼主一个问题
最近我做K562细胞内γ珠蛋白的检测，但是一直未有结果出来，不知为何，我做的条件：15的胶，转膜250mA，3h。可以清晰的看到Marker的最后一条10kd的条带在NC膜上，目的蛋白：γ珠蛋白的大小事18kd。最后加完ECL混合液，根本没有荧光显示，曝光也没有任何条带显示，不知道是什么原因。

作者: yonger 时间: 2013-3-9 14:46

用0.22um的膜一起转
不用切胶

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再请问前辈一下，我用的就是0.22um的膜，如果一起转3小时，300mA，分子量为18KD的目的蛋白会不会转过头啊？

作者: zzzz 时间: 2013-3-9 14:47

老师你好，我提的蛋白做出了目的蛋白，但是今天没有做出内参（贝塔-action），丽春红染膜膜上有蛋白，重新附了二抗仍然没有显影，请问老师1.是我蛋白没提取好吗？？？2.我放二抗的冰箱电源线前几天遭拔了一次（可能别人无疑碰掉的），你认为我二抗（我做二抗+ECL发光剂，暗室下看得到荧光，是不是说明二抗基本上没问题？？？）会不会受影响？？？3.老师认为下一步怎么做（贝塔-action没问题，因为我前几次提的蛋白都做出来过），谢谢指教，不胜感激！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:48

我想请教楼主一个问题
最近我做K562细胞内γ珠蛋白的检测，但是一直未有结果出来，不知为何，我做的条件：15的胶，转膜250mA，3h。可以清晰的看到Marker的最后一条10kd的条带在NC膜上，目的蛋白：γ珠蛋白的大小事18kd。最后加完ECL混合液，根本没有荧光显示，曝光也没有任何条带显示，不知道是什么原因。

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用0.22um的膜
转膜250mA 20-30min
1、电泳后先染胶，确保有合适量的蛋白
2、丽春红染色验证转膜效率
3、抗体做不同的稀释度
4、验证二抗与ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:49

再请问前辈一下，我用的就是0.22um的膜，如果一起转3小时，300mA，分子量为18KD的目的蛋白会不会转过头啊？

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18K的转膜时间确实有点长
你不能分开做吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 14:50

老师你好，我提的蛋白做出了目的蛋白，但是今天没有做出内参（贝塔-action），丽春红染膜膜上有蛋白，重新附了二抗仍然没有显影，请问老师1.是我蛋白没提取好吗？？？2.我放二抗的冰箱电源线前几天遭拔了一次（可能别人无疑碰掉的），你认为我二抗（我做二抗+ECL发光剂，暗室下看得到荧光，是不是说明二抗基本上没问题？？？）会不会受影响？？？3.老师认为下一步怎么做（贝塔-action没问题，因为我前几次提的蛋白都做出来过），谢谢指教，不胜感激！！！！！！

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用回收的beta-actin抗体？
把蛋白或者抗体的名字拼写正确！

作者: okhaha 时间: 2013-3-9 14:51

不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？

作者: abc816 时间: 2013-3-9 14:52

您好！想请教一下哪能合成硫酸基团修饰的五肽，两个Y磺化，据说合成上比较复杂，不知哪个公司能做？

作者: vera+ 时间: 2013-3-9 14:53

18K的转膜时间确实有点长
你不能分开做吗？

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样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~

作者: wood533 时间: 2013-3-9 14:54

样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~

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我做100kDa的300mA转2个小时就足够了，其它的一个小时就可以了~

作者: wood533 时间: 2013-3-9 14:54

楼主，今天跑胶的时候浓缩还是可以的，可是一到分离胶染料就开始扩散了，为什么？会不会是丙烯酰胺的问题呢？

作者: loli 时间: 2013-3-9 14:55

楼主，你好，接着请教，如果二抗+ECL发光剂发出荧光，是否可证明二抗与ECL发光剂都没有问题

作者: 831226 时间: 2013-3-9 14:56

不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

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样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？

作者: 831226 时间: 2013-3-9 14:57

样品不够多，想节省一点的，昨天结果出来了，18kD 转2小时，300mA的条带不清楚，是不是转过了呀？如图，下面不清楚有点歪斜的是18KD的蛋白条带，前辈我想下次一张膜做四种抗体100，75，57，18kD，用8%的胶，100，75KD转三小时300mA，57，18KD转1小时300mA，这个条件可以不？谢谢~

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不可以
用梯度胶做吧

作者: 831226 时间: 2013-3-9 14:57

楼主，你好，接着请教，如果二抗+ECL发光剂发出荧光，是否可证明二抗与ECL发光剂都没有问题

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不能
ECL有些有自发荧光
可以把二抗做几个不同的稀释度点到NC膜，待干燥后加ECL
查找我早前的帖子，有说明

作者: ending 时间: 2013-3-9 14:58

不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？

染胶了的，胶上有条带

作者: mimili_901 时间: 2013-3-9 14:58

请教几个问题：
大鼠脊髓组织，有两个目的蛋白，可恨和内参分子量相差比较近（稍微大一点点）
1.分子量和内参相差不多，有什么好办法吗？
2.目的蛋白抗体为兔多抗，一抗孵化时可以一起孵吗，目的蛋白可以和内参一起孵吗？
3.一抗选择小鼠的可以吗（小鼠和大鼠有没有交叉反应？），如果选择小鼠的单抗目的蛋白和内参可以一起孵化吗？
先谢谢了吖

作者: xue258 时间: 2013-3-9 14:59

版主，您好！我跑了一块胶，并且转完膜，打算先孵我的目的蛋白一抗二抗，然后显影；之后再孵GD的一抗二抗，显影。我的问题是在第一次显影结束后，PVDF膜仅用1×TBST洗涤3×5min，就孵GD的一抗，可以吗？需不需要再用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭？或者用甘氨酸进行洗涤？
麻烦版主啦！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:01

不是用的回收的beta-action抗体，beta-action抗体是新买的，前几次都做得出来过（用的不是同一次提的蛋白），我是用的1：10000的稀释倍数（说明书上推荐的），用5ml稀释0.5ul beta-action一抗，就在混匀器上混了大约半分钟，我也在想是不是beta-action没有混匀充分，因为混在一起的时间我个人觉得有点短，--所以今天洗膜后重新附了beta-action一抗--，同实验室的说我蛋白没提好，我觉得不像，这次是我蛋白提的最好的一次，浓度都可以，染膜后条带很清楚，有beta-action蛋白的可能性个人觉得很大，老师，你觉得我分析的对吗？？？

样品跑过电泳，考马斯亮蓝染胶吗？

染胶了的，胶上有条带

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那就的考虑一下缓冲液了

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:01

请教几个问题：
大鼠脊髓组织，有两个目的蛋白，可恨和内参分子量相差比较近（稍微大一点点）
1.分子量和内参相差不多，有什么好办法吗？
2.目的蛋白抗体为兔多抗，一抗孵化时可以一起孵吗，目的蛋白可以和内参一起孵吗？
3.一抗选择小鼠的可以吗（小鼠和大鼠有没有交叉反应？），如果选择小鼠的单抗目的蛋白和内参可以一起孵化吗？
先谢谢了吖

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1、多大分子量？内参有好几种，beta-actin 43K，beta-tubulin 55K，GAPDH 37K
2、兔多抗不能一起孵育
3、一抗可以选择小鼠单抗啊。单抗可以一起孵育，但是要事先摸索好单个抗体的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:02

版主，您好！我跑了一块胶，并且转完膜，打算先孵我的目的蛋白一抗二抗，然后显影；之后再孵GD的一抗二抗，显影。我的问题是在第一次显影结束后，PVDF膜仅用1×TBST洗涤3×5min，就孵GD的一抗，可以吗？需不需要再用5%脱脂牛奶进行蛋白封闭？或者用甘氨酸进行洗涤？
麻烦版主啦！

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1、用TBST洗膜后，直接可以加一抗
2、如果用stripping buffer处理后，需要从封闭开始

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-9 15:02

最近转膜遇到难题，请老师帮忙解决。具体转膜过程是，nc膜，在dd水中浸泡2h以上，用的是bio-rad mini湿转仪，60v恒压转2h，转膜后丽春红染色，膜上什么也没有，marker也没有，将胶用考马斯亮蓝染色，只在胶的上部见到大的蛋白，其余部分空白，操作过程也仔细检查了正负极问题，滤纸是否接触问题。转膜液也是自己新配的，但是没有提前预冷，这个问题很严重吗。前几次用干转法转膜成功过几次，后面就再也转不出来了，怀疑滤纸接触导致短路，烧坏仪器，于是换的湿转。请老师解答，谢谢

作者: plaa 时间: 2013-3-9 15:03

磷酸化与否，做westernblot有什么特殊要求吗，谢谢楼主

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:03

蛋白提取的时候加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF
封闭及抗体孵育用BSA-TBST

作者: windy+++ 时间: 2013-3-9 15:05

楼主，您好。
最近做WB，蛋白分子量87KD，第一次曝光，条带位置差不多正确；第二次，条带位置下降一些；第三次，替代位置基本到膜的最下方了。这种情况是不是蛋白降解了？
感谢楼主

作者: ukonptp 时间: 2013-3-9 15:06

你好，我做western做了很长时间，前段时间是做的分子量43的，一抗santa，1：300，室温1h和四度过夜都做过，一二抗都是用tbst洗8min 3次，一开始总是黑膜，整张膜都发光，但actin却每次都没问题，后来做了几次，就好了，也不知道什么原因。
现在我做分子量为220kd的蛋白，5%分离胶，转膜80v，3h20min，5%牛奶封闭1h，一抗santa 1：300，室温1h，四度过夜，二抗一直用的1：500，室温1h，又是膜一片黑，做了三次，黑了两次，每次actin都没问题，而且我觉得三次没什么不一样，电泳电转液牛奶每次都新配，抗体不重复使用。
都已经做的对自己没信心了，希望能指点下。

作者: loli 时间: 2013-3-9 15:06

不好意思，传错了啦，刚刚的附件太大了，下面是两张膜，出来的那个是actin，黑膜的是目的基因

图片附件: 33496018.snap.jpg (2013-3-9 15:07, 17.78 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15126

作者: loli 时间: 2013-3-9 15:07

actin

图片附件: 73803449.snap.jpg (2013-3-9 15:07, 9.83 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15127

作者: loli 时间: 2013-3-9 15:08

我的电泳缓冲液是反复使用的，请问最多是否合适，如果可以最多能用几次？电泳液反复使用会有什么后果？

作者: gogo 时间: 2013-3-9 15:09

请教楼主。如果跑胶时，目测溴芬兰不是直的，而是一条斜线，那么胶上的蛋白会不会受影响？？？个人觉得条带应该是直的，麻烦楼主分析下，谢谢

作者: youyou99 时间: 2013-3-9 15:09

您好，我的问题是我的Actin很好，可是我的目的蛋白检测不到，我的目的基因上连接FLAG，FLAG只有8个氨基酸。我用的是sigma的抗体。一抗稀释比例在四月份是1:500做的比较好，虽然有杂带目的条带也出来了，但是现在一直没有结果，就是空白。目的蛋白大小20KD，12%的分离胶转膜是250mA 1h。丽春红染膜以后小条带看的不清楚，我想知道我的转膜条件是不是不合适？还有只有8个氨基酸结合不牢固吧，我应该注意什么？先谢谢您！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:10

你好，我做western做了很长时间，前段时间是做的分子量43的，一抗santa，1：300，室温1h和四度过夜都做过，一二抗都是用tbst洗8min 3次，一开始总是黑膜，整张膜都发光，但actin却每次都没问题，后来做了几次，就好了，也不知道什么原因。
现在我做分子量为220kd的蛋白，5%分离胶，转膜80v，3h20min，5%牛奶封闭1h，一抗santa 1：300，室温1h，四度过夜，二抗一直用的1：500，室温1h，又是膜一片黑，做了三次，黑了两次，每次actin都没问题，而且我觉得三次没什么不一样，电泳电转液牛奶每次都新配，抗体不重复使用。
都已经做的对自己没信心了，希望能指点下。

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目的是什么蛋白？
二抗与beta-actin用的相同？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:11

我的电泳缓冲液是反复使用的，请问最多是否合适，如果可以最多能用几次？电泳液反复使用会有什么后果？

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第一次跑电泳内槽的可以回收用
外槽的不建议回收使用

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:13

请教楼主。如果跑胶时，目测溴芬兰不是直的，而是一条斜线，那么胶上的蛋白会不会受影响？？？个人觉得条带应该是直的，麻烦楼主分析下，谢谢

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对小分子量的影响大一些
转膜后染膜来具体确定

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:14

您好，我的问题是我的Actin很好，可是我的目的蛋白检测不到，我的目的基因上连接FLAG，FLAG只有8个氨基酸。我用的是sigma的抗体。一抗稀释比例在四月份是1:500做的比较好，虽然有杂带目的条带也出来了，但是现在一直没有结果，就是空白。目的蛋白大小20KD，12%的分离胶转膜是250mA 1h。丽春红染膜以后小条带看的不清楚，我想知道我的转膜条件是不是不合适？还有只有8个氨基酸结合不牢固吧，我应该注意什么？先谢谢您！

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你的Flag意思是把Flag作为标签的一个融合蛋白吧？
转膜30min就够了

作者: ffooll 时间: 2013-3-9 15:14

首先谢谢楼主的回复。我正在做，准备看看。还有一个问题，就是在做FLAG作为标签检测20KD目的基因的过程中，一抗4度过夜，摇晃一夜，有没可能一抗掉了，FLAG总8个氨基酸会结合不牢固？所以会没有条带，检测到白板？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:15

首先谢谢楼主的回复。我正在做，准备看看。还有一个问题，就是在做FLAG作为标签检测20KD目的基因的过程中，一抗4度过夜，摇晃一夜，有没可能一抗掉了，FLAG总8个氨基酸会结合不牢固？所以会没有条带，检测到白板？

检测到白板的原因很多
不能一概而论
需要一步一步排除

作者: 987789 时间: 2013-3-9 15:16

楼主老师好，我又来了。我的WB一直是白板，楼主曾经怀疑是ECL敏感性低，于是我换了新的ECL，结果还是白板，因为二抗是碧云天新定的，所以一开始没怀疑二抗有问题，但是我换用别人的二抗之后，竟然发现出来影了，但是背景有点高。

图片附件: 29776515.jpg (2013-3-9 15:17, 16.69 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15128

作者: 987789 时间: 2013-3-9 15:19

目的蛋白应该在膜的最中间位置，但是在膜的最下面有两条带，难道是降解了？两条带上方隐约有一个淡淡的条带。这次一抗1：200.二抗：1：2000.封闭5%脱脂奶粉1.5小时，洗膜4*
10分钟。

我下次准备调整条件如下：
1，一抗，1:400,二抗1：2000
2，目的蛋白貌似很淡，是否再次加大上样量？因为是总蛋白，目的蛋白是核蛋白，含量比较低。
3，延长封闭时间2小时，延长洗膜时间。

望指教。谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-3-9 15:19

从组织提的蛋白TRPV1，分子量95kd，上样量40-80ug，120mv电泳，200mA 80分钟湿转，5%脱脂奶粉+TBST室温封闭2小时，Abcam一抗 1：300 1：500 1：1000 1：2000 1：3000TBST稀释（推荐1：300-1：3000）4°C孵过夜，国产二抗1：7000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）室温1+小时。都是TBST洗膜3*10min。
发光剂是ThermoECL 。一抗浓度几乎都是试了试，每次都是整张膜都发光，曝光黑乎乎一片，没有条带。另外一59kd的蛋白，也是Abcam抗体，效果很好
最近换了santa抗体一抗1：100 1：200 1：300 1：500（推荐1：100-1：1000），二抗1：5000，正好相反，膜丝毫不见发光，压片后什么都没有
稍后上图，快折磨疯掉了，老板经常催，期待版主指条路！

作者: bring 时间: 2013-3-9 15:20

western blot为什么要用甲醇处理NC膜

作者: kulee 时间: 2013-3-9 15:21

版主，您好！
最近想配个一抗二抗洗脱液，想问版主讨个配方。
谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-9 15:22

LZ你好，请问下30-50KD的蛋白的湿转条件

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:22

楼主老师好，我又来了。我的WB一直是白板，楼主曾经怀疑是ECL敏感性低，于是我换了新的ECL，结果还是白板，因为二抗是碧云天新定的，所以一开始没怀疑二抗有问题，但是我换用别人的二抗之后，竟然发现出来影了，但是背景有点高。

见图：两张是同一张膜，不同的对比度。

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膜剪的有点小
国内现在很多二抗已经做的不成样子了
建议你买可靠的试剂
这张图上的二抗稀释度再调整一下，多洗下膜

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:23

western blot为什么要用甲醇处理NC膜

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活化，让膜带上正电

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:24

版主，您好！
最近想配个一抗二抗洗脱液，想问版主讨个配方。
谢谢！

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呵呵
这个配方是我自己研发的
不好意思，不能给你哈
如果你想用点我可以送你点

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:24

LZ你好，请问下30-50KD的蛋白的湿转条件

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300mA 恒流或者100V恒压，40min

作者: wood533 时间: 2013-3-9 15:25

版主你好，谢谢您一直以来耐心的解答，我又有一个小问题，聚丙烯酰胺凝胶，怎么制成干胶，看资料说用干油，玻璃纸，玻璃纸总打褶，弄不好，望赐教！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:26

版主你好，谢谢您一直以来耐心的解答，我又有一个小问题，聚丙烯酰胺凝胶，怎么制成干胶，看资料说用干油，玻璃纸，玻璃纸总打褶，弄不好，望赐教！

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用玻璃纸我做过
其它方法没做过
用玻璃纸：把胶放在玻璃板上，均匀覆盖玻璃纸，不能有气泡，胶上可以加一些水。覆盖好后，等它自己慢慢干燥

作者: kuaizige 时间: 2013-3-9 15:27

版主好
请教问题：
提取的蛋白质浓度过高或者过低怎么办？一般采取什么浓缩或者稀释的方法吖？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:27

版主好
请教问题：
提取的蛋白质浓度过高或者过低怎么办？一般采取什么浓缩或者稀释的方法吖？谢谢

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这个真没试过
高的话可以用裂解液来调整
低的话就不知道怎么处理了

作者: 3648755 时间: 2013-3-9 15:28

版主好：我最近做western半干转160mA40min转整张膜的时候效率还可以，基本都转过去了，转一半胶那么大的膜同样的条件发现转的效率不高，只能转上大概一半？请问是什么原因呢，谢谢
ps：我的就是biorad那样的小胶版，0.75mm，我的蛋白30Kd

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:28

版主好：我最近做western半干转160mA40min转整张膜的时候效率还可以，基本都转过去了，转一半胶那么大的膜同样的条件发现转的效率不高，只能转上大概一半？请问是什么原因呢，谢谢
ps：我的就是biorad那样的小胶版，0.75mm，我的蛋白30Kd

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半干，恒流，1.2mA/平方厘米膜面积
30K转膜30min足够

作者: caihong 时间: 2013-3-9 15:29

楼主您好！

最近做WB用TMB显色
（这是我用的配方：
buffer:0.1M 柠檬酸+0.2M Na2HPO4 pH5.0-5.4
TMB：2mg/ml溶于无水乙醇或者DMSO
H2O2: 30%

工作液：0.5ml TMB+ 9.5ml buffer+ 1ul H2O2
），
约10min后，目标条带出现黄色.不是出现蓝色吗？然后我用水漂洗结果条带消失。再显色就出不来了，请问原因是什么？
HRP最为灵敏的显色液是什么？哪个公司的比较好？
我的蛋白是70K左右，湿转条件你推荐是多少V多少时间？

作者: ending 时间: 2013-3-9 15:29

楼主你好！
我最近做wb一直跑不出目的条带，请您指点。
我的条件：
1.从细胞提取的蛋白质
2.目的蛋白分子量是33kD
3.电泳条件为：80v→100v
4.转膜条件为：250mA，1h
5.封闭用的5％脱脂牛奶，1h
6.一抗用的Bioscience的多抗，浓度为1：500（说明书推荐为1：500-1：1000）
4度孵育过夜
7.二抗孵育1h，浓度为1：5000（说明书推荐为1：5000-1：10000）
现象：
1.用我自己的样本可以跑出内参条带（内参用的GAPDH）但跑不出目的条带
2.用同学转好的膜（同学从组织提取做的其他蛋白，）孵育我的一抗，可以跑出目的条带。
请问我的问题出在哪里？
谢谢！

作者: XYZQ 时间: 2013-3-9 15:30

您好！我最近配胶老是出现问题，一个是浓缩胶浓缩的比较厉害，经常是一个泳道都缩没有了，其次是一旦进入分离胶，marker就往边上歪(浓缩胶里是很正常的），这是我配胶问题？

作者: XYZQ 时间: 2013-3-9 15:31

您好！我最近在提蛋白做Western blot，我是用碧云天裂解液裂解肿瘤组织（-80°放置一个月吧），然后再加入PMSF，冰上研磨10分钟，倒入EP管中，超声波振荡15s，13000rpm，4°离心15min，然后就发现EP管上面有白色的东西，非常粘稠，请问一下这个是蛋白吗？
再次，上样的体积是20ul，电泳完之后采用考马斯亮蓝染色。染出结果很差，每次条带都很细，基本看不到，即使我把体积加大，也还是没有什么变化啊，这个是什么原因呢？还请版主解决我的困惑，非常感谢。

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:31

第一个“不高兴和没头脑”的战友：你的条带很像我做过的一次，最后原因是，用PVDF膜，转膜前没有在甲醇液里浸泡，这对转膜，加一、二都有影响

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:32

一般用专用的提取蛋白试剂，提出的蛋白浓度不会高或低的太多，若是这样，可以用双蒸水稀释一下

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:34

你的目的蛋白分子量是33kD，转膜条件应该为150-180mA,30-40分钟，（按0.8-3.0mA/cm2），封闭时间最好长点，我一般室温3-4小时，一抗4度过夜，二抗2-3小时（室温）

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:35

可能是配胶玻璃架插入电泳槽是，两边胶皮垫没卡紧，漏电泳液，或配胶玻璃间有缝隙，应该涂少许凡士林，

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:39

你的目的蛋白分子量是33kD，转膜条件应该为150-180mA,30-40分钟，（按0.8-3.0mA/cm2），封闭时间最好长点，我一般室温3-4小时，一抗4度过夜，二抗2-3小时（室温）

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你好，谢谢你的回复，不过为什么我同学用250mA的可以跑出我的目的条带呀？

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:45

楼主您好！

最近做WB用TMB显色
（这是我用的配方：
buffer:0.1M 柠檬酸+0.2M Na2HPO4 pH5.0-5.4
TMB：2mg/ml溶于无水乙醇或者DMSO
H2O2: 30%

工作液：0.5ml TMB+ 9.5ml buffer+ 1ul H2O2
），
约10min后，目标条带出现黄色.不是出现蓝色吗？然后我用水漂洗结果条带消失。再显色就出不来了，请问原因是什么？
HRP最为灵敏的显色液是什么？哪个公司的比较好？
我的蛋白是70K左右，湿转条件你推荐是多少V多少时间？

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你这个配方不是沉淀型TMB的配方
怎么能把条带留在膜上啊？
需要用沉淀型的TMB

作者: ending 时间: 2013-3-9 15:47

建议：1.新配电泳液，转膜液，2.分子量较大，建议做6%(最佳分离浓度)的SDS胶，电泳时间80v浓缩胶， 120v分离胶,转膜基本可以，3.洗膜时间延长，一抗洗45分钟，3次，每次15分钟，二抗洗1小时，20分钟一次，洗三次，4.根据亮度调整曝光时间，胶片是用柯达的。我做的是125KD的，背景很亮。

作者: 831226 时间: 2013-3-9 15:47

转膜250mA时间30分钟左右，也可以转上，但效率比转膜条件150-180mA,30-40分钟，理论上差点，因为你的蛋白分子量小，只有33KD

作者: wmp1234 时间: 2013-3-9 15:50

相关疾病：
肿瘤

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可能是配胶玻璃架插入电泳槽是，两边胶皮垫没卡紧，漏电泳液，或配胶玻璃间有缝隙，应该涂少许凡士林，

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是的，确实是这样，感谢。我现在在提取肿瘤组织蛋白，无论是怎么提取，始终没有发现蛋白，很是郁闷啊！

[ 本帖最后由 wmp1234 于 2013-3-9 15:52 编辑 ]

图片附件: 46440584.snap.jpg (2013-3-9 15:52, 22.62 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15129

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-9 15:54

LZ你好，我最近做western遇到一个问题，转完膜之后，预染MARK在膜上看不到，胶上也没有。
我的一块，染了胶，发现还有条带，说明转膜不成功。
帮同学做的一块，染了胶，没有条带，他后续做了一抗二抗ECL等工作，阳性对照是有的。
我要检测的蛋白是30-50KD，转膜时间90min,恒流300mA。同学检测的是20左右。
我想问一下，是不是因为我的膜比同学的膜小很多，面积不同，造成不能用同一电流条件做呢？
昨天又做了一次，因为我只有5个孔道，带MARK，为了不浪费膜，只取了25-75kd区段，所以膜也剪得很小。转膜条件 300mA 100min。染了转过的胶，有一些若有似无的条带。我还有必要做下去么？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:54

QUOTE:

原帖由 xueyouzhang 于 2013-3-9 15:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

LZ你好，我最近做western遇到一个问题，转完膜之后，预染MARK在膜上看不到，胶上也没有。
我的一块，染了胶，发现还有条带，说明转膜不成功。
帮同学做的一块，染了胶，没有条带，他后续做了一抗二抗ECL等工作，阳性对照是有的。
我要检测 ...

电极放反？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-9 15:55

电极放反？

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没有啊。有没有别的解释？

作者: applebook=213 时间: 2013-3-9 15:57

楼主，你好，我最近做wb，一个18kd的，终于出来结果了，之前用的是0.45的nc膜，现在换了0.2的pvdf膜，就做出来了，但是有个问题，我跑出来的条带像山字形，很奇怪的，之前怀疑是电泳内槽有点漏液，然后电压有点大，后来把板放好不漏了，电压也降低了，但是跑出来的条带还是山字形的，很是奇怪，不知何解，我的条件：电泳80v过浓缩胶后100v大约140min所需蛋白条带跑到胶中间停止。转膜是100v1h。

作者: kuohao17 时间: 2013-3-9 15:58

请问楼主 60-90K蛋白湿转恒压条件？

还有HIS-TAG抗体是不是只对HHHHHH有特异性，还是对所有长度HIS都有反应？

作者: 66+77 时间: 2013-3-9 15:59

没有啊。有没有别的解释？

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和你同学用的是相同的膜吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 15:59

楼主，你好，我最近做wb，一个18kd的，终于出来结果了，之前用的是0.45的nc膜，现在换了0.2的pvdf膜，就做出来了，但是有个问题，我跑出来的条带像山字形，很奇怪的，之前怀疑是电泳内槽有点漏液，然后电压有点大，后来把板放好不漏了，电压也降低了，但是跑出来的条带还是山字形的，很是奇怪，不知何解，我的条件：电泳80v过浓缩胶后100v大约140min所需蛋白条带跑到胶中间停止。转膜是100v1h。

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电泳的时候溴酚蓝别跑到底
另外用12%的胶试试

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:00

请问楼主 60-90K蛋白湿转恒压条件？

还有HIS-TAG抗体是不是只对HHHHHH有特异性，还是对所有长度HIS都有反应？

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100V，恒压，60min

依据抗体的特性，多抗与单抗等都有区别

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-9 16:00

和你同学用的是相同的膜吗？

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是啊，我和我同学用的是相同的膜啊。昨天再做了一次，这次看到MARKER了。
再问一个问题，一块膜可以加几次一抗和二抗？

作者: duoduo 时间: 2013-3-9 16:01

版主你好！我的蛋白分子量为44-46 和56 用pvdfm孔径为0.45um还是0.22um为好？要转膜多长时间电压为多大？期待你的解答谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:02

是啊，我和我同学用的是相同的膜啊。昨天再做了一次，这次看到MARKER了。
再问一个问题，一块膜可以加几次一抗和二抗？

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需要看你的目的蛋白了
理论上很多次

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:03

版主你好！我的蛋白分子量为44-46 和56 用pvdfm孔径为0.45um还是0.22um为好？要转膜多长时间电压为多大？期待你的解答谢谢！

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0.45um
湿转：300mA 恒流或者100V 恒压，60min
半干：1.2mA/平方厘米膜面积，恒流 60min

作者: 3N4G 时间: 2013-3-9 16:03

你好，楼主，我最近做western blot β-actin内参总是不太顺利，同样一张膜上，目的条带却出的非常好，原来同样的体系下，也可以顺利的做出目的条带和内参条带，但是最近，内参出来了也缺少条带，我用10孔的胶，除去mark应该是显出来九个内参，但是每次不是最后一个孔道上没有条带，就是中间一个孔道上没有条带，不清楚是什么原因，我用的是ecl显色剂，每次都是均匀的加在膜上，静止1分钟左右才用保鲜膜包上在暗合中压片，一抗1:500,用的是santa cruz公司的，，二抗1:1000. 楼主有解决的方法吗？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:03

你好，楼主，我最近做western blot β-actin内参总是不太顺利，同样一张膜上，目的条带却出的非常好，原来同样的体系下，也可以顺利的做出目的条带和内参条带，但是最近，内参出来了也缺少条带，我用10孔的胶，除去mark应该是显出来九个内参，但是每次不是最后一个孔道上没有条带，就是中间一个孔道上没有条带，不清楚是什么原因，我用的是ecl显色剂，每次都是均匀的加在膜上，静止1分钟左右才用保鲜膜包上在暗合中压片，一抗1:500,用的是santa cruz公司的，，二抗1:1000. 楼主有解决的方法吗？谢谢

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转膜后丽春红染过吗？
条带有没有缺失？

作者: qiangren789 时间: 2013-3-9 16:04

0.45um
湿转：300mA 恒流或者100V 恒压，60min
半干：1.2mA/平方厘米膜面积，恒流 60min

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半干转博乐转膜仪器，是恒压的需要转多长时间多大电压？
昨天我用是22v 55分钟然后把转膜后的这块胶考马斯亮蓝染胶洗胶，可胶上怎么还有条带呢？（不太显）是不是没有转上呢？
9月份做过一次用PVDF膜孔径为0.22um，23v 56分钟也行考马斯亮蓝染胶，胶上没有条带，这又是不是转过了？还是我的目的蛋白没有转上？

作者: qiangren789 时间: 2013-3-9 16:05

转膜后丽春红染过吗？
条带有没有缺失？

没有用丽春红染色，但是我的目的蛋白全都出来了，没有缺失的条带，内参和目的是在同一张膜上做的。我把图上传了，麻烦您给看看吧，图中的S是标准品，除了mark还有标准品之外，应该有8条内参条带，但现在显示1、5没有内参，目的蛋白全都显出来了，是不是可以排除转膜的原因啊，这是什么原因呢，先谢谢楼主了

图片附件: 32662644.snap.jpg (2013-3-9 16:05, 36.25 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15130

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:06

半干转博乐转膜仪器，是恒压的需要转多长时间多大电压？
昨天我用是22v 55分钟然后把转膜后的这块胶考马斯亮蓝染胶洗胶，可胶上怎么还有条带呢？（不太显）是不是没有转上呢？
9月份做过一次用PVDF膜孔径为0.22um，23v 56分钟也行考马斯亮蓝染胶，胶上没有条带，这又是不是转过了？还是我的目的蛋白没有转上？

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半干恒压没转过
不好意思
在转膜前确保SDS-PAGE电泳时有蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:07

转膜后丽春红染过吗？
条带有没有缺失？

没有用丽春红染色，但是我的目的蛋白全都出来了，没有缺失的条带，内参和目的是在同一张膜上做的。我把图上传了，麻烦您给看看吧，图中的S是标准品，除了mark还有标准品之外，应该有8条内参条带，但现在显示1、5没有内参，目的蛋白全都显出来了，是不是可以排除转膜的原因啊，这是什么原因呢，先谢谢楼主了

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有点意思
你用哪种内参？
试了别的内参没有？

作者: xue258 时间: 2013-3-9 16:07

请楼主指点，我做细胞色素C的WB，用15%的胶，上样量为70ug
电泳：浓缩80V 45min，分离100V 150min；
转膜：0.22的膜，湿转 250MA，1h；丽春红染色有条带，
封闭 5%脱脂奶粉 3h ；
一抗：Santa，5%BSA稀释 1:1000 4度过夜
二抗：博士德，TBST稀释 1:3000 室温1.5h
洗膜TBST 6次*10min
背景很高（如图）

后来改进了，上样量也试过50ug、80ug
一抗、二抗稀释液都改为牛奶了后背景没了、目的条带也没了。干干净净的。
~~o(>_<o ~~

将一抗稀释液改成牛奶，二抗稀释液用tbst，结果背景也高

将一抗稀释液改成BSA,二抗稀释液用牛奶，也有背景，但是二抗浓度低点（1:5000）的那个背景干净点，但是条带也淡了很多，基本不合格~~o(>_<o ~~

做了十多次，这张图还是效果较好的，其他根本不能见人，都要疯掉了
请楼主指点

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-9 16:08

有点意思
你用哪种内参？
试了别的内参没有？

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内参一抗我用的是santa 的beita-actin 1;500稀释，二抗是博奥森的，1；1000.一抗四度孵育过夜，二抗37度1个小时。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:09

有点意思
你用哪种内参？
试了别的内参没有？

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内参一抗我用的是santa 的beita-actin 1;500稀释，二抗是博奥森的，1；1000.一抗四度孵育过夜，二抗37度1个小时
存在有和无的情况就搞不太明白
如果是强弱的话可以用别的内参试试

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:09

不好意思，第一次传图，传错了

上面那个下载要上面丁当，下面这个应该不要

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先把二抗浓度调成合适的

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-9 16:10

再来请问lz，膜可以保存多久？因为我的一个一抗出了问题，得换。我师姐说可以用保鲜膜封起来放在-20°。但是一抗得要俩个星期才能到货。这样的话，俩个星期以后还可以用么？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:11

再来请问lz，膜可以保存多久？因为我的一个一抗出了问题，得换。我师姐说可以用保鲜膜封起来放在-20°。但是一抗得要俩个星期才能到货。这样的话，俩个星期以后还可以用么？

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封闭后在-20度保存几个月

作者: nn255 时间: 2013-3-9 16:13

我测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？

作者: nn255 时间: 2013-3-9 16:15

我的意思是我做不出来的主要原因在哪儿？是不是主要是跟分子量小有关系。有什么好的方法？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-9 16:15

我测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？谢谢在线等待

建议换个15%或者浓度更大点的胶试试。或者梯度胶也可以，膜用的是多大的？0.2的比较好。

作者: 3N4G 时间: 2013-3-9 16:16

为什么我做的蛋白印迹实验,蛋白70kD,一抗1:250,二抗1:3000；都要重复孵育两次才能出来条带呢？？？SOS

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:17

测蛋白分子量7kD，12%分离胶，santa山羊来源一抗1:200,1:500，二抗1:2000，转膜用NC膜，内参GAPDH做出来还不错，但是目的蛋白什么都没有，一片洁白。有老师建议用梯度胶配分离胶，膜换成PVDF膜，说截留分子量会更小些。请教fangweibin119老师，您能给我比较详细的建议和protocol吗？谢谢在线等待

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小于12K以下的蛋白我没经验，不好意思

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:21

我的意思是我做不出来的主要原因在哪儿？是不是主要是跟分子量小有关系。有什么好的方法？

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试试tricine胶系统
用0.22um孔径的膜，NC或PVDF都可以

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:22

为什么我做的蛋白印迹实验,蛋白70kD,一抗1:250,二抗1:3000；都要重复孵育两次才能出来条带呢？？？SOS

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这个。。。。
一抗孵育不完全？

作者: am10 时间: 2013-3-9 16:22

LZ好，我又遇到问题了。
检测一蛋白的背景很高很高，只有一次看到目的条带，别的时候，就算新跑的胶新转的膜，也是一样的结果---加了发光液之后约1min，没有荧光，但压了10分钟后打开，看到一大片的荧光。
一抗是santa的。二抗是抗兔的，protein tech group进口分装的。
每次封闭都是4°过夜，一抗俩个小时，中间PBST洗4次，每次15min，二抗一个小时，洗4次，每次15min。昨天以为是我洗膜没有洗干净，刚好也等同学一起去显影，二抗多洗了一个小时。加了发光液之后没有见到荧光，我还以为是没有问题了。放心压片。压了30min后，打开又看到一片发光的……
但是同时孵的另一种一抗，同样的二抗，同样的洗法，检验出来了，条带很清晰很漂亮。这是为什么呢？

作者: duoduo 时间: 2013-3-9 16:23

怪异
我用ECL发光，膜上都看到HRP作用后的棕色的带子了，但是发光却发不出来，快疯掉了，不知道是什么原因，谢谢

作者: 小荷尖尖 时间: 2013-3-9 16:25

我最近刚开始做western-blot，遇到一问题：
接通电源，设定恒压60伏，按输出后键后机器出现嗡名声后自动停止输出。检查一下
1：正负极没接反，
2：内槽电泳液高于矮板边缘距上边缘0.5厘米(基本满了),外槽略少（基本是电泳槽三分之一深度）
问题出在什么地方呢？请老师帮忙解决，谢谢！！！

作者: 3648755 时间: 2013-3-9 16:25

楼主，我最近做磷酸化的蛋白，曝光会出现多个条带，其中有一条和目的条带离得很近，有点难区分，目的条带下有两条表达特别高的条带，重复两次都是类似的情况，这是怎么回事啊

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:26

LZ好，我又遇到问题了。
检测一蛋白的背景很高很高，只有一次看到目的条带，别的时候，就算新跑的胶新转的膜，也是一样的结果---加了发光液之后约1min，没有荧光，但压了10分钟后打开，看到一大片的荧光。
一抗是santa的。二抗是抗兔的，protein tech group进口分装的。
每次封闭都是4°过夜，一抗俩个小时，中间PBST洗4次，每次15min，二抗一个小时，洗4次，每次15min。昨天以为是我洗膜没有洗干净，刚好也等同学一起去显影，二抗多洗了一个小时。加了发光液之后没有见到荧光，我还以为是没有问题了。放心压片。压了30min后，打开又看到一片发光的……
但是同时孵的另一种一抗，同样的二抗，同样的洗法，检验出来了，条带很清晰很漂亮。这是为什么呢？

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一抗的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:31

怪异
我用ECL发光，膜上都看到HRP作用后的棕色的带子了，但是发光却发不出来，快疯掉了，不知道是什么原因，谢谢

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二抗浓度太高
曝不出来正常
降低二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:33

我最近刚开始做western-blot，遇到一问题：
接通电源，设定恒压60伏，按输出后键后机器出现嗡名声后自动停止输出。检查一下
1：正负极没接反，
2：内槽电泳液高于矮板边缘距上边缘0.5厘米(基本满了),外槽略少（基本是电泳槽三分之一深度）
问题出在什么地方呢？请老师帮忙解决，谢谢！！！

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仪器的问题找找厂家咨询吧

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:34

楼主，我最近做磷酸化的蛋白，曝光会出现多个条带，其中有一条和目的条带离得很近，有点难区分，目的条带下有两条表达特别高的条带，重复两次都是类似的情况，这是怎么回事啊

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1、先调整一抗稀释度
2、杂带正常

作者: 911 时间: 2013-3-9 16:35

楼主你好，我是新手，最近做了两次WB背景都很糟糕，不知道是什么原因，您能帮我分析一下吗，万分感谢。我的目的蛋白是150kDa，分离胶8%，电泳200V，50min，转膜没有加SDS，bio-rad 湿转，200V 1.5h，PVDF 膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗、二抗都是室温孵育1h，检测方式是加了ECL反应后，直接在bio-rad的成像系统里曝光5~10min，拍的照片。

图片附件: 15787223.snap.jpg (2013-3-9 16:35, 24.68 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15131

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:36

楼主你好，我是新手，最近做了两次WB背景都很糟糕，不知道是什么原因，您能帮我分析一下吗，万分感谢。我的目的蛋白是150kDa，分离胶8%，电泳200V，50min，转膜没有加SDS，bio-rad 湿转，200V 1.5h，PVDF 膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h，一抗、二抗都是室温孵育1h，检测方式是加了ECL反应后，直接在bio-rad的成像系统里曝光5~10min，拍的照片。

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一抗名称及厂家
二抗稀释度
ECL厂家

作者: newway 时间: 2013-3-9 16:37

我想问下就是电泳缓冲液可以重复使用一次不？二抗用到1;1000会不会浓度过高谢谢

作者: DONT 时间: 2013-3-9 16:37

请教斑竹几个问题：
1，刚测蛋白浓度，结果actin很不整齐，再测一遍，还不齐，上样很小心地，不知道问题出在哪？
2，有个82kD的蛋白，用1:400santa抗体，湿转，100v恒压，1:55,5%分离胶，10%浓缩胶，5%牛奶封闭1h，结果在目的分子量附近有多个条带，距离很近，分不出来哪个是想要的，

图片附件: 14243941.jpg (2013-3-9 16:37, 12.25 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15132

作者: DONT 时间: 2013-3-9 16:38

这个膜上下缘分别是95和72的marker,目的条带是82，谢谢斑竹

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:38

我想问下就是电泳缓冲液可以重复使用一次不？二抗用到1;1000会不会浓度过高谢谢

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可以重复用，但是内槽不能重复用
二抗的稀释度每个厂家都不一样
需要通过自己的实验来确定

作者: 49888 时间: 2013-3-9 16:39

紧急求助版主：
我要做WB，我的目的蛋白分别是20kD，21kD，42kD 分子量，
（一）我该选择多少的分离胶和浓缩胶的浓度？
（二）GAPDH、beta-Actin、beta-tubulin 我该选择那个作为我的内参蛋白？
（三）我该选用哪种孔径的PVDF膜，是0.22的还是0.45的呢？
谢谢版主！不胜感激!

作者: 49888 时间: 2013-3-9 16:39

版主：你好！我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，分质量在20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以的话，内参选什么比较好？
3、可不可以同时检测几种抗体？
期待回复！谢谢！

作者: 49888 时间: 2013-3-9 16:39

版主：你好！
我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，一个40KD上下，一个20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以做的话，选什么内参比较好？
3、可不可以同时检测这两种目标抗体？
期待回复，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:40

紧急求助版主：
我要做WB，我的目的蛋白分别是20kD，21kD，42kD 分子量，
（一）我该选择多少的分离胶和浓缩胶的浓度？
（二）GAPDH、beta-Actin、beta-tubulin 我该选择那个作为我的内参蛋白？
（三）我该选用哪种孔径的PVDF膜，是0.22的还是0.45的呢？
谢谢版主！不胜感激!

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1、12%分离胶，5%浓缩胶
2、beta-tubulin
3、0.45的就可以

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:40

版主：你好！我是新手，想请教一下有关人血清做WB的相关问题。
1、我想测人血清中的抗体，分质量在20KD上下，用WB做的话效果怎么样？
2、如果可以的话，内参选什么比较好？
3、可不可以同时检测几种抗体？
期待回复！谢谢！

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问题讲的不详细
是检测人血清中的抗体，分子量又为20K是什么意思呢？
是不是指20K的抗原？
内参可以选择GAPDH
不能同时检测，需要有先后

作者: lixi559 时间: 2013-3-9 16:41

之前问过没有人回答，希望楼主能帮助一下啊，先谢谢了
肠道组织5-HT受体表达，选用B-actin做的内参。我是先表达5-HT受体，然后用0.2M NaOH 洗掉抗体，重新上的B-actin，条件为一抗1：1000过夜，二抗HRP1：5000，10000，20000 和40000一个小时，抗体没问题。但是仅1：5000和1：10000二抗时采集的ECL信号成团状且很弱，而其它两个稀释点无任何条带，请问这可能是什么原因啊？见图。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:41

之前问过没有人回答，希望楼主能帮助一下啊，先谢谢了
肠道组织5-HT受体表达，选用B-actin做的内参。我是先表达5-HT受体，然后用0.2M NaOH 洗掉抗体，重新上的B-actin，条件为一抗1：1000过夜，二抗HRP1：5000，10000，20000 和40000一个小时，抗体没问题。但是仅1：5000和1：10000二抗时采集的ECL信号成团状且很弱，而其它两个稀释点无任何条带，请问这可能是什么原因啊？见图。

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先确保你的内参结果很好再做别的

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-9 16:42

请教下斑竹，做大脑和心肌细胞的TLR4，位置分别为170KDa和95KDa。抗体说明书上说的是110KDa，大小隔这么多是否正常？我们也用了巨噬细胞做了阳性对照，结果什么条带都没有。一抗是CST的，浓度1：500（推荐浓度1：1000）。至于实验体系应该不会有问题，其他大小一样的蛋白都能出来，所以请教下是我们的样品有问题，还是抗体问题？需不需要提膜蛋白来做？谢谢

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 16:42

老师好，想请教一个问题：
有这种说法2×Loading buffer中先不加β-巯基乙醇，在提蛋白的时候单独加；而5×Loading 中可以先就将β-巯基乙醇加入，提蛋白的时候直接加上样缓冲液就行？请问老师，这是什么原因啊？谢谢！

作者: lxh031 时间: 2013-3-9 16:43

楼主您好，我想请教一下我在wb中碰到的问题：
首先是关于蛋白的提取，大鼠肝脏组织，从-80度中拿出后置于冰盒中，然后每100毫克组织加500微升的蛋白裂解液（包括蛋白酶抑制剂，用的是fermentas的），然后在手握式电动组织细胞匀浆器匀浆至无肉眼可见组织，裂解10min以上，然后16,000g离心15分钟，取上清，保存在-80度冰箱。等做wb时，从-80度冰箱取出蛋白，置于冰盒上，10ul蛋白加入3.3ul的上样缓冲液（因为蛋白在冰盒中解冻较慢，所以我有手捏着EP管帮助解冻）。然后将其置于PCR仪中 95度，5min，取出，问题来了，等我上样的时候发现EP管理有沉淀物（提了2次蛋白都这样T。T），我用微量进样器上样的，所以不能很好的吸取EP管中的蛋白（沉淀物会堵住针孔）。因为是新手，不知道问题出在哪里，尽量写的详细，希望楼主帮忙指点迷津。
第二，条带拖尾巴。等我跑完WB，压完胶片，喜中掺忧。喜是因为有条带，对了下maker，应该是目的蛋白条带，忧是因为条带很不明朗，后面拖着长长的尾巴，做了2次都这样。以下是WB过程的大致条件：上样的时候，可以明显的看到，上的蛋白样品有沉淀物。蛋白47kd，浓缩胶80v，80min，分离胶120v，90min。350mA转膜90min，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗用5%脱脂奶粉TBST 1：300配，4度过夜，TBST 10min每次，3次，二抗也用5%脱脂奶粉TBST1;10000配，室温孵育2h。TBST10min每次3次后 ECL 显色，曝光压片。

作者: yes4 时间: 2013-3-9 16:44

有个问题急需请问下老师您，
做western blot曝光后膜上有很多条非特异性条带，连可视maker最亮的那条带也曝出来了，我在一张膜上跑两份样品，同时转膜脱脂奶粉封闭，洗后切开膜分别孵育action,caspase3的一抗，结果曝光的两张膜在同一个泳道上有很多条带，就好像是跑胶染色后的效果一样。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:45

请教下斑竹，做大脑和心肌细胞的TLR4，位置分别为170KDa和95KDa。抗体说明书上说的是110KDa，大小隔这么多是否正常？我们也用了巨噬细胞做了阳性对照，结果什么条带都没有。一抗是CST的，浓度1：500（推荐浓度1：1000）。至于实验体系应该不会有问题，其他大小一样的蛋白都能出来，所以请教下是我们的样品有问题，还是抗体问题？需不需要提膜蛋白来做？谢谢！

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1、做WB不需要单独提取膜蛋白来检测
2、分子量有差别是个大问题，每个厂家抗体都不同。需要大家进一步研究确定。
3、TLR4，CST抗体说明书中写的是转染后细胞的检测，没有说能否检测内源性蛋白，因此检测不到在情理之中。
4、如果你想投诉，希望也不大
5、可以换一抗试试，选择抗体时要注意看说明书写的是检测内源性还是转染后的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:46

老师好，想请教一个问题：
有这种说法2×Loading buffer中先不加β-巯基乙醇，在提蛋白的时候单独加；而5×Loading 中可以先就将β-巯基乙醇加入，提蛋白的时候直接加上样缓冲液就行？请问老师，这是什么原因啊？谢谢！

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2×与5×loading都可以在变性处理蛋白的时候加beta-ME
有些蛋白提取的过程中需要加beta-ME或者DTT，是蛋白提取的需要

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:46

楼主您好，我想请教一下我在wb中碰到的问题：
首先是关于蛋白的提取，大鼠肝脏组织，从-80度中拿出后置于冰盒中，然后每100毫克组织加500微升的蛋白裂解液（包括蛋白酶抑制剂，用的是fermentas的），然后在手握式电动组织细胞匀浆器匀浆至无肉眼可见组织，裂解10min以上，然后16,000g离心15分钟，取上清，保存在-80度冰箱。等做wb时，从-80度冰箱取出蛋白，置于冰盒上，10ul蛋白加入3.3ul的上样缓冲液（因为蛋白在冰盒中解冻较慢，所以我有手捏着EP管帮助解冻）。然后将其置于PCR仪中 95度，5min，取出，问题来了，等我上样的时候发现EP管理有沉淀物（提了2次蛋白都这样T。T），我用微量进样器上样的，所以不能很好的吸取EP管中的蛋白（沉淀物会堵住针孔）。因为是新手，不知道问题出在哪里，尽量写的详细，希望楼主帮忙指点迷津。
第二，条带拖尾巴。等我跑完WB，压完胶片，喜中掺忧。喜是因为有条带，对了下maker，应该是目的蛋白条带，忧是因为条带很不明朗，后面拖着长长的尾巴，做了2次都这样。以下是WB过程的大致条件：上样的时候，可以明显的看到，上的蛋白样品有沉淀物。蛋白47kd，浓缩胶80v，80min，分离胶120v，90min。350mA转膜90min，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗用5%脱脂奶粉TBST 1：300配，4度过夜，TBST 10min每次，3次，二抗也用5%脱脂奶粉TBST1;10000配，室温孵育2h。TBST10min每次3次后 ECL 显色，曝光压片。

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1、蛋白定量了吗？
2、拖尾与沉淀有关，沉淀是因为蛋白变性过程中蛋白浓度太高

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:47

有个问题急需请问下老师您，
做western blot曝光后膜上有很多条非特异性条带，连可视maker最亮的那条带也曝出来了，我在一张膜上跑两份样品，同时转膜脱脂奶粉封闭，洗后切开膜分别孵育action,caspase3的一抗，结果曝光的两张膜在同一个泳道上有很多条带，就好像是跑胶染色后的效果一样。

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把一抗做几个不同稀释度

作者: yes4 时间: 2013-3-9 16:48

我确实没定过量。今天，我去定量，如果浓度很高，我稀释了在跑一次。

作者: DDD 时间: 2013-3-9 16:48

1、做WB不需要单独提取膜蛋白来检测
2、分子量有差别是个大问题，每个厂家抗体都不同。需要大家进一步研究确定。
3、TLR4，CST抗体说明书中写的是转染后细胞的检测，没有说能否检测内源性蛋白，因此检测不到在情理之中。
4、如果你想投诉，希望也不大
5、可以换一抗试试，选择抗体时要注意看说明书写的是检测内源性还是转染后的蛋白。

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是的，也是刚刚才注意到只能检测转染的蛋白

作者: wmp1234 时间: 2013-3-9 16:50

请问，如果加药使细胞发生凋亡，其抗凋亡蛋白的表达一定会减少吗？还是有可能不受影响的？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-9 16:51

请问，如果加药使细胞发生凋亡，其抗凋亡蛋白的表达一定会减少吗？还是有可能不受影响的？

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这个不太清楚
用实验来说明吧

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 16:52

老师您好！
请教一个问题：我要跑一个68KDa的蛋白，打算用两张PVDF膜叠在一起转两张膜，条件是稳流350mA、2.5h。想问一下，这样的条件能够保证两张膜上都有我的目的蛋白和内参GD吗？
谢谢老师！

作者: mamamiya 时间: 2013-3-9 16:53

请教一下：
1. 在样品处理上，对cell 样品来说RIPA buffer liysis 和sonicate lysis 有什么区别嘛？
2.看了以前的帖子，发现和我处理样品不一样。我是在cell pellet 中直接加2X SDS loading buffer，然后sonicate，然后boiling 5－10m，没有离心（我看前面的帖子是离心取上清，上样），直接上样。请问我得方法行吗？
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定？
先谢了！
期待回复

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:54

请教一下：
1. 在样品处理上，对cell 样品来说RIPA buffer liysis 和sonicate lysis 有什么区别嘛？
2.看了以前的帖子，发现和我处理样品不一样。我是在cell pellet 中直接加2X SDS loading buffer，然后sonicate，然后boiling 5－10m，没有离心（我看前面的帖子是离心取上清，上样），直接上样。请问我得方法行吗？
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定？
先谢了！
期待回复

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1、我一般不做超声处理，直接用裂解液
2、如果加loading进行煮沸的话，不需要超声。但是一定要离心，不然会有拖尾

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:56

第3个问题：
3.凝聚胶的浓度百分比有什么因素决定？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 16:58

由目的蛋白分子量
一般选择3-5%

作者: ROSE李 时间: 2013-3-9 16:59

没明白你的意思

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我的意思是，通常转膜时，装置顺序依次是负极，海绵，滤纸，胶，PVDF膜，滤纸，海绵，正极。我现在想的是可不可以用两张PVDF膜重叠在一起，用一块胶转出两张膜。条件是：稳流350mA，2.5h。目的分子68KDa，和内参GD。老师，你觉得这样做可以吗？谢谢答复！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:00

我的意思是，通常转膜时，装置顺序依次是负极，海绵，滤纸，胶，PVDF膜，滤纸，海绵，正极。我现在想的是可不可以用两张PVDF膜重叠在一起，用一块胶转出两张膜。条件是：稳流350mA，2.5h。目的分子68KDa，和内参GD。老师，你觉得这样做可以吗？谢谢答复！

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这样不可以吧
可以用一张膜转好，通过marker在同一张膜上确定两者的分子量

作者: yes4 时间: 2013-3-9 17:01

请问我看到很多文献做western blot检测细胞上清液中某个蛋白质的量，文章并没有说要把上清液浓缩。
但是我觉得上清液中蛋白质那么低，怎么做，是不是别人做了浓缩没有说而已。例如下面的文章，就是
Extracellular TNFR1 Release Requires the Calcium-dependent Formation of a Nucleobindin 2-ARTS-1 Complex
期待您的回答，因为我也打算在上清液中做western blot。

作者: yes4 时间: 2013-3-9 17:01

请问我看到有的文章说用western 检测细胞上清液中某个蛋白质的分泌。但是细胞培养上清液的蛋白质的含量很低，都是纳克级别的，怎么检测，但是文章也没有说要把上清液浓缩，请问那些文章真的没有浓缩上清液吗。？我也要做上清液检测western blot，
例如文章
Extracellular TNFR1 Release Requires the Calcium-dependent Formation of a Nucleobindin 2-ARTS-1 Complex*

作者: yes4 时间: 2013-3-9 17:02

请问我看到有的文章说用western 检测细胞上清液中某个蛋白质的分泌。但是细胞培养上清液的蛋白质的含量很低，都是纳克级别的，怎么检测，但是文章也没有说要把上清液浓缩，请问那些文章真的没有浓缩上清液吗。？我也要做上清液检测western blot，
例如文章
Extracellular TNFR1 Release Requires the Calcium-dependent Formation of a Nucleobindin 2-ARTS-1 Complex*

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下载文献看了
没有说检测上清液中分泌的蛋白呢

作者: Ao7 时间: 2013-3-9 17:03

楼主我做的是170KD的蛋白，用5%的浓缩胶，8%的分离胶，40V半小时80V传至结束，后用PVDF膜60V转3个小时，转膜时间是不是有点长了？？多谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:03

楼主我做的是170KD的蛋白，用5%的浓缩胶，8%的分离胶，40V半小时80V传至结束，后用PVDF膜60V转3个小时，转膜时间是不是有点长了？？多谢

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湿转吗?
湿转可以用100V，2h30min

作者: kulee 时间: 2013-3-9 17:04

是湿转，多谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-9 17:05

转膜后用立春红染色蛋白转上然后再用这张膜进行封闭加一抗二抗可以吗？有没有什么影响？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:05

转膜后用立春红染色蛋白转上然后再用这张膜进行封闭加一抗二抗可以吗？有没有什么影响？

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可以
没有影响

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-9 17:06

可以
没有影响

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刚曝光结束，在暗室呆55分钟多，离开暗室时膜上荧光条带还在亮着就是曝的背景高二抗浓度是1：9000，太高了！得调到两万

作者: qqq111 时间: 2013-3-9 17:06

我最近显影很郁闷，试验组没条带，反而显出Marker 。不知道是为什么？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-9 17:08

刚曝光结束，在暗室呆55分钟多，离开暗室时膜上荧光条带还在亮着就是曝的背景高二抗浓度是1：9000，太高了！得调到两万

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恩
需要调整二抗
确定合适二抗的浓度之后再做一抗的不同稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:15

我最近显影很郁闷，试验组没条带，反而显出Marker 。不知道是为什么？

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marker有条带很正常
因为marker中有些会带标签蛋白。。。。
还有抗体制备的时候抗原中有些也带标签蛋白。。。。
so

作者: am10 时间: 2013-3-9 17:17

恩
需要调整二抗
确定合适二抗的浓度之后再做一抗的不同稀释度

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昨天下午重新洗膜加一抗，4°过夜，今上午TBST洗膜加二抗，1：20000，二抗室温下孵育3个小时，TBST洗膜8次x6分钟，暗室曝光荧光条带持续2分钟左右未等压胶片荧光全部吹灭，这又是什么原因呢？

作者: am10 时间: 2013-3-9 17:17

恩
需要调整二抗
确定合适二抗的浓度之后再做一抗的不同稀释度

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一抗是abCaM公司的二抗中山金桥

作者: any333 时间: 2013-3-9 17:18

麻烦版主帮我看一下，我跑的蛋白分子量是340kd,1是我要的目的蛋白么，还是2是目的蛋白，没跑下来，3是浓缩胶分离胶交界处。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15133

作者: mickeylin 时间: 2013-3-9 17:19

麻烦版主帮我看一下，我跑的蛋白分子量是340kd,1是我要的目的蛋白么，还是2是目的蛋白，没跑下来，3是浓缩胶分离胶交界处。

作者: lgm 时间: 2013-3-9 17:20

我想请教下我要做的是膜蛋白 22kd
1.组织提蛋白第一次用的是2D裂解液第二次用的是western及IP裂解液和ripa，跑page出来条带好像2D裂解液比较好，2D裂解液是不是对膜蛋白的提取比较好？有没有必要用膜蛋白提取试剂盒？
2.12% 分离胶 5% 浓缩胶 60v 30min，120v 65min，薄滤纸 22mm膜，半干转 10v 45 分钟和10 25分钟、12v 30分钟都试过伊利脱脂奶粉封闭2h 一抗invitrogen 1:250(推荐1:200-300，但说明书上没有说在肺组织得到过验证能做WB）4度过夜；TBST 洗膜10min *3；二抗 1:10000 抗小鼠 1h； TBST 洗膜10min *3 开始上样量20ug 30ug都是内参能发出来目的发不出来；后来增加到40ug 50ug都看到的是可疑目的跳带附近的不清晰条带请问是什么地方可能出现问题？

作者: lixi559 时间: 2013-3-9 17:21

请教各位战友：
之前做western有个指标已经做出了条带，位置显示正确，背景清晰，没有杂带。最近重复实验，同一指标同种蛋白，同种实验条件，却发现目的蛋白的位置变化了，分子量变大了10-20KD，背景不清晰，而且出现了一条淡淡的杂带，就在原先目的带的位置。这两次实验中改变的条件有：
1、之前提蛋白后都是立即测蛋白浓度，原液加loading buffer变性后放-80度，用时取出；这一次是没能提蛋白后立即测浓度，而是原液用双蒸水稀释二十倍后，放置-80度隔了一天又取出测的浓度。
2、之前配置的抗体用了近两个月，所以最近两次都是新配置的抗体，但都是从同一支抗体内吸出配置的。
3、TBST在室温下放置了10天左右，且脱脂牛奶封闭液、抗体和洗膜都是用的这些TBST.
我实在是想不出出现目的条带变化的原因是什么，希望见多识广的各位战友能帮我找找原因，谢谢各位了！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:22

昨天下午重新洗膜加一抗，4°过夜，今上午TBST洗膜加二抗，1：20000，二抗室温下孵育3个小时，TBST洗膜8次x6分钟，暗室曝光荧光条带持续2分钟左右未等压胶片荧光全部吹灭，这又是什么原因呢？

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稀释二抗用的缓冲液是新配的吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:22

麻烦版主帮我看一下，我跑的蛋白分子量是340kd,1是我要的目的蛋白么，还是2是目的蛋白，没跑下来，3是浓缩胶分离胶交界处。

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我觉得1是目的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:23

最近在做WB时，电泳时候，我的MARK和上样的样品的条带不是在同一水平线上，MARK的条带要高于样品的条带，我是把mark加在槽的最左边的，所以左边的mark条带要高些，右边的样品条带要低一些，请问是怎么回事呢，该如何改进呢，谢谢。

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没法改进
是由于marker的缓冲液与你样品缓冲液体系不一致造成的

作者: 831226 时间: 2013-3-9 17:24

我想请教下我要做的是膜蛋白 22kd
1.组织提蛋白第一次用的是2D裂解液第二次用的是western及IP裂解液和ripa，跑page出来条带好像2D裂解液比较好，2D裂解液是不是对膜蛋白的提取比较好？有没有必要用膜蛋白提取试剂盒？
2.12% 分离胶 5% 浓缩胶 60v 30min，120v 65min，薄滤纸 22mm膜，半干转 10v 45 分钟和10 25分钟、12v 30分钟都试过伊利脱脂奶粉封闭2h 一抗invitrogen 1:250(推荐1:200-300，但说明书上没有说在肺组织得到过验证能做WB）4度过夜；TBST 洗膜10min *3；二抗 1:10000 抗小鼠 1h； TBST 洗膜10min *3 开始上样量20ug 30ug都是内参能发出来目的发不出来；后来增加到40ug 50ug都看到的是可疑目的跳带附近的不清晰条带请问是什么地方可能出现问题？

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1、做WB检测不需要提取膜蛋白试剂盒
2、目的蛋白是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:25

请教各位战友：
之前做western有个指标已经做出了条带，位置显示正确，背景清晰，没有杂带。最近重复实验，同一指标同种蛋白，同种实验条件，却发现目的蛋白的位置变化了，分子量变大了10-20KD，背景不清晰，而且出现了一条淡淡的杂带，就在原先目的带的位置。这两次实验中改变的条件有：
1、之前提蛋白后都是立即测蛋白浓度，原液加loading buffer变性后放-80度，用时取出；这一次是没能提蛋白后立即测浓度，而是原液用双蒸水稀释二十倍后，放置-80度隔了一天又取出测的浓度。
2、之前配置的抗体用了近两个月，所以最近两次都是新配置的抗体，但都是从同一支抗体内吸出配置的。
3、TBST在室温下放置了10天左右，且脱脂牛奶封闭液、抗体和洗膜都是用的这些TBST.
我实在是想不出出现目的条带变化的原因是什么，希望见多识广的各位战友能帮我找找原因，谢谢各位了！

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1、样品缓冲液中用的是2-ME还是DTT？
2、两次用的是同一管marker？
3、分离胶浓度一致？

作者: DDD 时间: 2013-3-9 17:26

1、做WB检测不需要提取膜蛋白试剂盒
2、目的蛋白是什么？

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我的目的蛋白是claudin-4 大鼠组织

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:27

我的目的蛋白是claudin-4 大鼠组织

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不需要用试剂盒提取膜蛋白来进行WB

作者: 101010 时间: 2013-3-9 17:27

请教版主，我要做一个果蝇体内表达量很低的一个蛋白的western，抗体是自己制备的，表达片段打的兔多抗（elisa检测效价>6万）。本来western的蛋白是果蝇匀浆RIPA裂解液，这里干扰的杂蛋白肯定很多。加之又多抗，所以显影不是白片，就是黑片。这次我的抗体用proteinG纯化。不知道纯化的抗体需不需要透析，还是在稀释的情况下，高浓度的glycine的影响很小。若要损失好多啊？特异性未检测出的情况下，能用IP的方式纯化抗原吗？（总感觉有些悖论的样子）。不知道自己制备的一抗稀释倍数的限定范围。望指教！

作者: 3648755 时间: 2013-3-9 17:29

老师，你好，我做的是98KD的蛋白，上样量是14ul,电转80v 120v,转膜250mA 160分钟，2%PBS脱脂牛奶封闭二小时，1%PBST脱脂牛奶配的一抗（abcam公司的，1：250）二抗用的博奥森（1：3000）但是条带有时有时没有，出现条带的时候也有背景。请老师帮我分析一下

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:31

请教版主，我要做一个果蝇体内表达量很低的一个蛋白的western，抗体是自己制备的，表达片段打的兔多抗（elisa检测效价>6万）。本来western的蛋白是果蝇匀浆RIPA裂解液，这里干扰的杂蛋白肯定很多。加之又多抗，所以显影不是白片，就是黑片。这次我的抗体用proteinG纯化。不知道纯化的抗体需不需要透析，还是在稀释的情况下，高浓度的glycine的影响很小。若要损失好多啊？特异性未检测出的情况下，能用IP的方式纯化抗原吗？（总感觉有些悖论的样子）。不知道自己制备的一抗稀释倍数的限定范围。望指教！

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IP的方式可以纯化抗原，但是产量很小
另外进行IP的抗体特异性也要高，还有一种情况：IP下来的蛋白与别的蛋白之间是不是有相互作用？
这一点需要考虑

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:31

老师，你好，我做的是98KD的蛋白，上样量是14ul,电转80v 120v,转膜250mA 160分钟，2%PBS脱脂牛奶封闭二小时，1%PBST脱脂牛奶配的一抗（abcam公司的，1：250）二抗用的博奥森（1：3000）但是条带有时有时没有，出现条带的时候也有背景。请老师帮我分析一下

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1、博奥森的二抗现在可以达到1:3000的稀释度了？真是难得！
2、条带时有时无与封闭液、稀释液、二抗有关系
现用现配

作者: xue258 时间: 2013-3-9 17:32

求组方方大大，做出来的条带成这个样子了。帮我看看~~会是甚么原因呢

[ 本帖最后由 xue258 于 2013-3-9 17:34 编辑 ]

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作者: tuuu2 时间: 2013-3-9 17:35

大侠，我准备做一个分子量是170KD的WB，用actin做内参，marker用10-170KD的合适否？？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:35

大侠，我准备做一个分子量是170KD的WB，用actin做内参，marker用10-170KD的合适否？？谢谢

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可以
内参还可以选用beta-tubulin

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-9 17:36

版主，我做了个全细胞蛋白的western，发现交叉反应严重，应该并不是由一抗引起的，背景很干净，就是出现了非目的条带。这个应该是二抗引起的吧。做了一个不加一抗，只加二抗的，证实了确实是由二抗引起的。想问下如何消除二抗引起的交叉反应？
一抗二抗浓度均是稀释10000倍，3%bsa+0.05%的吐温封闭及稀释抗体。是否用5%脱脂奶粉+0.05%吐温封闭，用1%脱脂奶粉+0.05%吐温稀释抗体会减少二抗的交叉反应？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-9 17:37

请各位战友帮忙分析一下这种结果的原因是什么，谢谢

图片附件: 48128692.jpg (2013-3-9 17:37, 32.14 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15135

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:38

版主，我做了个全细胞蛋白的western，发现交叉反应严重，应该并不是由一抗引起的，背景很干净，就是出现了非目的条带。这个应该是二抗引起的吧。做了一个不加一抗，只加二抗的，证实了确实是由二抗引起的。想问下如何消除二抗引起的交叉反应？
一抗二抗浓度均是稀释10000倍，3%bsa+0.05%的吐温封闭及稀释抗体。是否用5%脱脂奶粉+0.05%吐温封闭，用1%脱脂奶粉+0.05%吐温稀释抗体会减少二抗的交叉反应？

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继续稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:39

请各位战友帮忙分析一下这种结果的原因是什么，谢谢

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电泳跑的不太好
先把胶跑好吧

作者: 2541 时间: 2013-3-9 17:40

电泳跑的不太好
先把胶跑好吧

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楼主你好，谢谢回复。胶没跑好是什么原因呢？浓缩胶80V跑了30min，8%分离胶120v跑了1个小时，怎么改善呢？再次感谢！

作者: 3648755 时间: 2013-3-9 17:41

楼主请问，0.22um PVDF膜的背景易模糊有什么办法？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:41

楼主请问，0.22um PVDF膜的背景易模糊有什么办法？非常感谢！

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1、多洗膜
2、改变封闭方法
3、0.22的膜比0.45的容易有背景

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:42

楼主请问，0.22um PVDF膜的背景易模糊有什么办法？非常感谢！

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1、多洗膜
2、改变封闭方法
3、0.22的膜比0.45的容易有背景

作者: okhaha 时间: 2013-3-9 17:42

楼主你好！
我最近几次显色，有的膜加显色液后看着荧光条带很清晰，
但是压片后荧光完全消失，重新显色无效。
用的是santa的beta-catenin，mouse一抗。
显色液用的是碧云天的ECL plus
显色用的是塑料培养皿，是重复利用的，这个有影响么？

非常感谢

作者: wu11998866 时间: 2013-3-9 17:43

老师你好，我最近了几次WB，遇到以下问题，烦请帮忙分析一下：
一抗购于Abcam，大小130KD;内参actin 43KD。分离胶10%，浓缩胶5%；上样量25ul，电泳90V、120V；半干转（20V或40mA）：一抗 45与90分钟均使用过，actin 30分钟；一抗浓度 1：700（为说明书推荐浓度），actin 1：1000，二抗 1：5000；曝光时，加ECL后，一抗从未发现过有荧光，actin荧光条带很强，但几秒后迅速熄灭，根本来不及压片。（目的蛋白是目前已经公认的表达比较确切的蛋白，在细胞中应该表达）
自己分析：1.一抗质量问题？（较小）2.转膜条件和时间的问题，估计没转上。如果这样的话，烦请提供一个合适的转膜条件和时间。3.二抗浓度还较高？以至于荧光迅速熄灭。
还请老师在帮忙分析一下导致结果失败的上述原因及其他原因的可能性，我好赶紧优化实验步骤，顺利完成实验

作者: avi317 时间: 2013-3-9 17:49

请问楼主，我从A549细胞中提取的蛋白做β-actin内参，条带出现复层现象，即所谓的“三明治”夹层现象，请问原因，及解决方法。我的蛋白上样量为40ug，一抗二抗均1：10000稀释。
谢谢！

作者: S6044 时间: 2013-3-9 17:49

1、多洗膜
2、改变封闭方法
3、0.22的膜比0.45的容易有背景

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请问改用什么方法较好，我是用gelatin封闭的，

作者: S6044 时间: 2013-3-9 17:50

二抗可以用PBS稀释不同的浓度点在NC膜上，每个点1ul
然后用ECL孵育，后续同曝光过程
这样可以看出二抗的效价

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可以用TBST稀释后点在PVDF膜上吗？PVDF是否要用甲醇活化？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:51

楼主你好！
我最近几次显色，有的膜加显色液后看着荧光条带很清晰，
但是压片后荧光完全消失，重新显色无效。
用的是santa的beta-catenin，mouse一抗。
显色液用的是碧云天的ECL plus
显色用的是塑料培养皿，是重复利用的，这个有影响么？

非常感谢

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二抗浓度有点高
降低二抗浓度吧

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:51

老师你好，我最近了几次WB，遇到以下问题，烦请帮忙分析一下：
一抗购于Abcam，大小130KD;内参actin 43KD。分离胶10%，浓缩胶5%；上样量25ul，电泳90V、120V；半干转（20V或40mA）：一抗 45与90分钟均使用过，actin 30分钟；一抗浓度 1：700（为说明书推荐浓度），actin 1：1000，二抗 1：5000；曝光时，加ECL后，一抗从未发现过有荧光，actin荧光条带很强，但几秒后迅速熄灭，根本来不及压片。（目的蛋白是目前已经公认的表达比较确切的蛋白，在细胞中应该表达）
自己分析：1.一抗质量问题？（较小）2.转膜条件和时间的问题，估计没转上。如果这样的话，烦请提供一个合适的转膜条件和时间。3.二抗浓度还较高？以至于荧光迅速熄灭。
还请老师在帮忙分析一下导致结果失败的上述原因及其他原因的可能性，我好赶紧优化实验步骤，顺利完成实验

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1、淬灭：降低二抗浓度
2、一抗建议4度孵育过夜

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:51

楼主，我做western显影时，荧光很快就没了，就是开始能看到，不到一分钟就没了，压片也压不出了。我用的是ECL显色，用的是Thermo的进口试剂。
以前做过一次没出现这种情况，荧光10分钟后还有。这次就不对了，而且这次荧光不强，应该不是结合二抗太多把底物都消耗了。以前也遇到过荧光很强的，但也能坚持4到5分钟。
不知什么原因，希望楼主解答一下。

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thermo的什么ecl？

作者: fei1226com 时间: 2013-3-9 17:55

thermo的什么ecl？

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就是发光试剂是SuperSignal West Dura。这个是Thermo Fisher Scientific公司生产的吧，ecl不是化学发光试剂的意思吗？
刚接触这些，有些名词还不太懂，见谅。

作者: utt0989 时间: 2013-3-9 17:56

请问楼主，我从A549细胞中提取的蛋白做β-actin内参，条带出现复层现象，即所谓的“三明治”夹层现象，请问原因，及解决方法。我的蛋白上样量为40ug，一抗二抗均1：10000稀释。
谢谢！

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上样量太大

作者: duoduo 时间: 2013-3-9 17:56

楼主你好，我在做分子量220kd的蛋白，用的是5%的分离胶，老板说8%的胶跑不出来，80v恒压转150min。原来8%的胶actin还没问题，现在actin都很不好，转30min总是有的有，有的没有，转的时间长了就什么都没有了目的条带就更不用说了，我想问下5%的胶是不是比较容易转过啊，并且条带很散，很宽的感觉，谢谢

作者: tie8 时间: 2013-3-9 17:57

就是发光试剂是SuperSignal West Dura。这个是Thermo Fisher Scientific公司生产的吧，ecl不是化学发光试剂的意思吗？
刚接触这些，有些名词还不太懂，见谅。

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你用的是Pierce的产品，
因为现在Pierce被Thermo兼并了，所以你不知道这个是Pierce的。
虽然并了，但是包装的外观好像还是没变的。
可能好多人还不知道

作者: yes4 时间: 2013-3-9 17:57

你用的是Pierce的产品，
因为现在Pierce被Thermo兼并了，所以你不知道这个是Pierce的。
虽然并了，但是包装的外观好像还是没变的。
可能好多人还不知道

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哦，我刚开始接触实验，很多还是不了解。貌似你也有荧光消失的很快的问题。我也有，不过这次做没有了，可能有那个步骤把膜给污染了。

作者: applebook=213 时间: 2013-3-9 17:58

二抗浓度有点高
降低二抗浓度吧

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谢谢楼主！
我试一下，我用的1：1000，二抗是碧云天的。
下次试试。

1。另外问个很傻的问题，显色后洗脱液洗膜后是不是没希望再重新杂交原来的一抗？

2。我用santa的MBP、GFAP等神经系列的一抗，使用推荐的一抗比 1：200，二抗1：1000，显色后整张膜都是亮的，压片后胶片是一片黑。稀释一抗到1：1000也没用。为什么呢？

作者: mamamiya 时间: 2013-3-9 17:58

1、淬灭：降低二抗浓度
2、一抗建议4度孵育过夜

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谢谢老师的分析！
一抗我一直是4度孵育过夜，请老师再帮我分析一下转膜的条件和时间，半干转是否以电流为准，电流（或电压）多大合适？时间多长合适？我总感觉每次膜转的都不太好。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:59

楼主你好，我在做分子量220kd的蛋白，用的是5%的分离胶，老板说8%的胶跑不出来，80v恒压转150min。原来8%的胶actin还没问题，现在actin都很不好，转30min总是有的有，有的没有，转的时间长了就什么都没有了目的条带就更不用说了，我想问下5%的胶是不是比较容易转过啊，并且条带很散，很宽的感觉，谢谢

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5%的胶actin肯定会不好
可以用8%，内参选择beta-tubulin，55K
转膜，恒压100V,3h,湿转
目的蛋白是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-9 17:59

谢谢楼主！
我试一下，我用的1：1000，二抗是碧云天的。
下次试试。

1。另外问个很傻的问题，显色后洗脱液洗膜后是不是没希望再重新杂交原来的一抗？

2。我用santa的MBP、GFAP等神经系列的一抗，使用推荐的一抗比 1：200，二抗1：1000，显色后整张膜都是亮的，压片后胶片是一片黑。稀释一抗到1：1000也没用。为什么呢？

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1、stripping后，从封闭开始，可以重新杂交原来的一抗
2、封闭可能不太好，另外羊多抗也比较容易出现这种问题

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-9 17:59

向往拉普兰德，稳流350mA，2.5h。目的分子68KDa，和内参GD 很容易把它们转过的，两个膜放在一起理论上是可以的，但很容易出问题。你调整下转膜条件。

作者: wsll 时间: 2013-3-9 18:00

你好老师，最近一段时间有同事做WB又碰到一个问题：
每次显影时，膜上看着条带很亮很好，就是片子什么也压不出来，30妙、1、2、5、8、10分钟都试过，均失败！压完片条带还是亮的。很让人郁闷，不知怎么回事，该怎么解决？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-9 18:00

你好老师，最近一段时间有同事做WB又碰到一个问题：
每次显影时，膜上看着条带很亮很好，就是片子什么也压不出来，30妙、1、2、5、8、10分钟都试过，均失败！压完片条带还是亮的。很让人郁闷，不知怎么回事，该怎么解决？
谢谢

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1、胶片过期
2、显影液质量不好

作者: wsll 时间: 2013-3-9 18:00

请教楼主一个问题：18KD的蛋白做WB时有什么需要注意的地方，比如说胶的浓度，电泳的时间，转膜的条件（恒流、时间OR恒压、时间），一抗二抗的稀释度、封闭的时间。谢谢楼主解答。

作者: NBA 时间: 2013-3-9 18:01

请教楼主一个问题：18KD的蛋白做WB时有什么需要注意的地方，比如说胶的浓度，电泳的时间，转膜的条件（恒流、时间OR恒压、时间），一抗二抗的稀释度、封闭的时间。谢谢楼主解答。

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可以用12%的分离胶，但是溴酚蓝跑的不要太接近胶底部
转膜恒流 300ma 20min0.22um 膜
一抗及二抗需要看说明书

作者: lixi559 时间: 2013-3-11 11:04

老师好，我是新手，请教几个问题:封闭液是不是最好和一抗、二抗稀释液是同一种？BSA和脱脂奶粉有什么区别？
我我的目的蛋白是78KD的，WB条件是：分离胶12%，浓缩胶5%，电泳80V 40min，140V 80min，半干转 10V 100min，5%脱脂奶粉 37度封闭1h，目的蛋白一抗是cell signaling的多抗，1：500稀释的，二抗是1：1000稀释，显色后会看到很多杂带，78KD处没看到清晰的带，但是actin带很清新，请问我应该怎么改进？应该注意哪些条件？

作者: lixi559 时间: 2013-3-13 12:44

楼主你好，我现在要做ampk，62kd 请问胶选多大浓度合适，一般文献上说是10%的，楼主意见如何呢？我还想同时再做一个33kd的蛋白，但是胶的浓度不同，如果我想两个同时电泳，配多大浓度的胶合适呢？这样是否容易出结果呢？多谢楼主的回复

作者: lixi559 时间: 2013-3-13 12:45

嘿嘿，还有问题问楼主呢
1.62kd和33kd转膜条件恒流下多少ma，多大电压，时间多久，（0.22um的膜）楼主如果做过相关大小的蛋白的话，期待你的回答啊
2。看到有帖子说可以同时压两张pvdf膜，如果这样压的话有没可能蛋白转膜不均匀呢？怎样好些呢？
新手做WB，请老师多指教

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:45

老师好，我是新手，请教几个问题:封闭液是不是最好和一抗、二抗稀释液是同一种？BSA和脱脂奶粉有什么区别？
我我的目的蛋白是78KD的，WB条件是：分离胶12%，浓缩胶5%，电泳80V 40min，140V 80min，半干转 10V 100min，5%脱脂奶粉 37度封闭1h，目的蛋白一抗是cell signaling的多抗，1：500稀释的，二抗是1：1000稀释，显色后会看到很多杂带，78KD处没看到清晰的带，但是actin带很清新，请问我应该怎么改进？应该注意哪些条件？

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把一抗稀释度加大一点

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:47

楼主你好，我现在要做ampk，62kd 请问胶选多大浓度合适，一般文献上说是10%的，楼主意见如何呢？我还想同时再做一个33kd的蛋白，但是胶的浓度不同，如果我想两个同时电泳，配多大浓度的胶合适呢？这样是否容易出结果呢？多谢楼主的回复

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12%的胶可以

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:47

嘿嘿，还有问题问楼主呢
1.62kd和33kd转膜条件恒流下多少ma，多大电压，时间多久，（0.22um的膜）楼主如果做过相关大小的蛋白的话，期待你的回答啊
2。看到有帖子说可以同时压两张pvdf膜，如果这样压的话有没可能蛋白转膜不均匀呢？怎样好些呢？
新手做WB，请老师多指教

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1、一张PVDF就行，用0.45um的，如果有0.22um的膜也可以用
2、AMPK都做烂了，湿转：300mA 恒流 60min

作者: kuaizige 时间: 2013-3-13 12:48

灌完浓缩胶插完梳子后，浓缩胶上沿与玻璃上沿持平，但是一段时间后，浓缩胶明显萎缩，请问这是怎么回事？

作者: zhenxin 时间: 2013-3-13 12:49

楼主，您好！！我最近在做肾组织磷酸化NF-KB和磷酸化P-38的蛋白表达，用的是CST公司的抗体，提取的是组织全蛋白（未用核蛋白提取试剂盒），100ug未见条带，上样200ug时，压片15min后，曝光发现条带位置不对。说明书上NF-KB的位置在65KD，而我做出来在55KD左右；说明书上说P38为43KD，但是提供的图片其位置在40KD左右，而我做出来位置在35KD左右。想请教楼主是什么原因？
谢谢！！

作者: wu11998866 时间: 2013-3-13 12:49

老师好，我发现周围很多人用的转膜液配方不一样，主要有2种，请问老师这两种转膜液有什么不同的转膜条件吗？老师用的哪种？

转膜液1：甘氨酸 14.4g，
Trisbase 3g，
SDS 0.1g，
Milli-H2O 800ml
用前加甲醇 200ml PH 8.3

转膜液2：甘氨酸（MW75.07） 2.9g
Tris（MW121.14） 5.8g
SDS 0.37g
甲醇 200ml
蒸馏水至 1000ml

另外，我是组织提的总蛋白，测蛋白浓度约为10mg/ml，上样量大约有100微克了，考马斯亮蓝上方有条带，下面条带很少，几乎没有。

用第2种转膜液，16KD蛋白，80V转50分钟，0.22膜。42KD内参，80V，90分钟， 0.45膜。丽春红染膜啥也没有，但是MARKER转的很清楚，最后曝光，内参有条带，P16是白板，曾经借用别人半干转，P16丽春红染出来过，曝光条带也出来了。

现在我怀疑转膜有问题：1，只要转完膜丽春红能染出来，就能出条带。
2，组织蛋白上样量这么大（100微克），即使目的蛋白含量少，丽春红也应该能染出其它总蛋白啊。
3，转完膜，MARKER总是转的很好，转完膜后胶考染是空白的。
4，三明治制作，夹子夹的很紧，也赶走气泡了。

请问老师，P16,以及p21这样的小蛋白，如何转膜效率高些。42kdD 内参为啥丽春红也染不出呢？丽春红是好用的。

非常感谢

作者: zhenxin 时间: 2013-3-13 12:50

楼主你好，我要做的蛋白分子量59KD，我用10%的分离胶和200V的电压，之后用150A的恒流50分钟转膜（NC膜）一抗浓度为1：200（说明书为1：250--1：500）4度过夜，二抗浓度为1：2000，37度一小时。曝光20分钟出现很淡的条带，actin的条带很好。接着又做了几次同样条件的，一点儿条带也没有了，内参都挺好的。请LZ给点建议吧，谢谢了！

作者: zhenxin 时间: 2013-3-13 12:50

看看抗体说明书

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有很多抗体的说明书上的图就是有及条带并存的

如果说明书上有几条带说明什么问题呢？谢谢

作者: mimili_901 时间: 2013-3-13 12:52

求助各位师兄师姐：
我做的17、19KD的west，转膜出来条带很清楚，可是曝光后白板一张，再染一下丽春红以前的条带都没了，同时做的P-ERK,P-MEK染丽春红后条带都很清楚。怎么办啊

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:53

楼主，您好！！我最近在做肾组织磷酸化NF-KB和磷酸化P-38的蛋白表达，用的是CST公司的抗体，提取的是组织全蛋白（未用核蛋白提取试剂盒），100ug未见条带，上样200ug时，压片15min后，曝光发现条带位置不对。说明书上NF-KB的位置在65KD，而我做出来在55KD左右；说明书上说P38为43KD，但是提供的图片其位置在40KD左右，而我做出来位置在35KD左右。想请教楼主是什么原因？
谢谢！！

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1、CST 的nf-kb p65我用过它家的几个不同货号，效果都不怎么样。推荐你用Bioworld的
2、p65在55K，p38在35K，位置都下移，说明你用的marker分子量表观位置有偏差。
3、如果条带特异，这两个蛋白都没问题
4、不同分离胶、缓冲液都会对marker表观位置造成影响

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:54

楼主你好，我要做的蛋白分子量59KD，我用10%的分离胶和200V的电压，之后用150A的恒流50分钟转膜（NC膜）一抗浓度为1：200（说明书为1：250--1：500）4度过夜，二抗浓度为1：2000，37度一小时。曝光20分钟出现很淡的条带，actin的条带很好。接着又做了几次同样条件的，一点儿条带也没有了，内参都挺好的。请LZ给点建议吧，谢谢了！

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actin需要曝光20min才出现，说明系统有问题
先调整系统

作者: NBA 时间: 2013-3-13 12:55

楼主你好，我要做的蛋白分子量59KD，我用10%的分离胶和200V的电压，之后用150A的恒流50分钟转膜（NC膜）一抗浓度为1：200（说明书为1：250--1：500）4度过夜，二抗浓度为1：2000，37度一小时。曝光20分钟出现很淡的条带，actin的条带很好。接着又做了几次同样条件的，一点儿条带也没有了，内参都挺好的。请LZ给点建议吧，谢谢了！

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actin需要曝光20min才出现，说明系统有问题
先调整系统

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:00

求助各位师兄师姐：
我做的17、19KD的west，转膜出来条带很清楚，可是曝光后白板一张，再染一下丽春红以前的条带都没了，同时做的P-ERK,P-MEK染丽春红后条带都很清楚。怎么办啊

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封闭步骤后的膜用丽春红染色是染不出来的

作者: IAM007 时间: 2013-3-13 15:01

actin需要曝光20min才出现，说明系统有问题
先调整系统

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actin30秒就出了，是目的蛋白20分钟才出很淡的条带。

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:02

actin30秒就出了，是目的蛋白20分钟才出很淡的条带。

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目的蛋白是什么？

作者: zranqi_1 时间: 2013-3-13 15:03

相关疾病：
肿瘤
问个问题：我在做肿瘤组织的WB的时候，在同一张膜上，有1-2个样本的目的蛋白表达量非常高，比内参高很多，而其他样本则表达量比较低，那么结果就是这些高表达的组织曝光到一定程度其他低表达的组织就可能曝光不出来了，如附件图所示。这种情况下有什么比较好的办法解决吗？大家有做组织WB的经验吗？不要说是把高表达的组织剔除，因为我如果做10来个指标，不可能高表达的都是这2个组织。还有，我在想如果把上样量降低到10-20mg不知道可行不可行？望高手指点，谢谢。

作者: mamamiya 时间: 2013-3-13 15:04

先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

good luck

请问:怎样才算最合适的稀释度？最亮还是中亮？同学教我，将适量的A/B混合液混合后，加入待验证的二抗，然后在暗室里观察是否有荧光，前提：A/B是好的，结果有荧光，那是否就能说明二抗是好的，我在想，HRP仅仅是二抗上耦联的一个基团，这个基团有活性是否能代表二抗的抗体活性，还有，20天前配的二抗，今天拿出来如上验证，结果有荧光，但不是太亮，那这样的话，该抗体还能用否？
先谢谢楼主！

作者: hustwb 时间: 2013-3-13 15:04

最近开始做血浆蛋白的WB，想请教几个问题：

1 有合适的内参选择么？一般内参都是选择的管家蛋白，但血浆中似乎没有这样的蛋白。楼主之前的回复说可以选择GAPDH ，但该蛋白似乎是组织源性，在血浆中表达特点与组织中一样？

不知能否告诉理由或者有没有相关的文献依据？

2 如过没有合适的内参选择，除了上样量上相等，操作上尽量小心，还需要注意一些什么因素。以减少对相对定量结果的影响？

3 血浆蛋白由于存在高丰度蛋白的影响，特别是白，球两种蛋白，那上样量如何恰当选择？

4 另外对于血浆高分子蛋白 170+KD，biorad湿转，转膜参数，100--140V 2--3H 是否合适？

谢谢楼主！

作者: yjf1026 时间: 2013-3-13 15:05

这边有哪位提取过核蛋白的？我最近在提取核蛋白，但是结果一直不稳定，希望找位前辈交流一下。

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:06

相关疾病：
肿瘤

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问个问题：我在做肿瘤组织的WB的时候，在同一张膜上，有1-2个样本的目的蛋白表达量非常高，比内参高很多，而其他样本则表达量比较低，那么结果就是这些高表达的组织曝光到一定程度其他低表达的组织就可能曝光不出来了，如附件图所示。这种情况下有什么比较好的办法解决吗？大家有做组织WB的经验吗？不要说是把高表达的组织剔除，因为我如果做10来个指标，不可能高表达的都是这2个组织。还有，我在想如果把上样量降低到10-20mg不知道可行不可行？望高手指点，谢谢。

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如果真是表达差异造成的
没法调整

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:07

先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

good luck

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请问:怎样才算最合适的稀释度？最亮还是中亮？同学教我，将适量的A/B混合液混合后，加入待验证的二抗，然后在暗室里观察是否有荧光，前提：A/B是好的，结果有荧光，那是否就能说明二抗是好的，我在想，HRP仅仅是二抗上耦联的一个基团，这个基团有活性是否能代表二抗的抗体活性，还有，20天前配的二抗，今天拿出来如上验证，结果有荧光，但不是太亮，那这样的话，该抗体还能用否？
先谢谢楼主！

二抗还是现用现配吧

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:07

这边有哪位提取过核蛋白的？我最近在提取核蛋白，但是结果一直不稳定，希望找位前辈交流一下。

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一定要提取核蛋白来进行核定位蛋白的WB检测吗？
还是可以用总蛋白来检测？

作者: KGZ564 时间: 2013-3-13 15:08

请教版主，温度对显影有影响吗？用ECL显影。
谢谢！

作者: lxh031 时间: 2013-3-13 15:08

请教版主：
我的WB是这样的，我做两个蛋白，一个是16KD，WB结果显示条带很模糊，弥散，当时电泳的时候Marker显示10kD的很模糊，弥散了，17KD还可以。后来又调整了一下胶中Tris的浓度和缓冲液的浓度（分子克隆上分离胶中tris的浓度时1.5M,碧云天厂家提供的是1.0M;电泳缓冲液中，分子克隆提供的1L的tris-glycine配方中需要甘氨酸为18.8克，还有其他的一种配方是甘氨酸14.4克），调整之后，我用的1M的tris(ph8.8)配得分离胶，电泳缓冲液用的是14.4的甘氨酸，12%的胶，结果Marker中的10kd没有弥散，但是电压控制的不是很好，34-26-17kd的没有分开，转膜杂交之后显示目的带很清楚，一条线的。
然后我有用这个经验去做一个12KD的蛋白，15%的胶，但是10KD的Marker一进分离胶就弥散了；最后也没有杂出目的带。（这个抗体是没问题的，在GST-目的蛋白原核表达中已经显示出目的带），但是真核表达一直都没做出来。转膜条件是半干转，恒流，0.6mA/CM2，15min,这个转膜条件在那个16KD的也做得很好。
现在我自己考虑是问题还是在电泳上，总是在高浓度的胶中，那个10kd的Marker不清楚；而且我觉得总是那个和目的蛋白分子量相近的Marker跑清楚了，然后的杂交带才清楚，锐利。小分子的蛋白如果电泳中就弥散了，可能在以后的转膜和杂交中也不容易做出来。
问题是，我现在该怎么调整呢，非得用那个tris-tricine-sds电泳吗，，请求版主帮助呀

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-13 15:12

如果真是表达差异造成的
没法调整

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那组织蛋白的WB怎么做的？那么多文献人家做的指标的表达都是那么均一的？如果真是这样，我只能是笑而不语。

作者: yychen 时间: 2013-3-13 15:14

老师，想请教一下，我的转膜液和电泳液在四度过夜后就会变浑浊，低温转膜两个半小时，转膜液也变浑浊了！请问是什么原因！谢谢

作者: yychen 时间: 2013-3-13 15:15

老师，想请教一下，我的转膜液和电泳液在四度过夜后就会变浑浊，低温转膜两个半小时，转膜液也变浑浊了！请问是什么原因！谢谢，有什么办法改善吗？对我的实验流程有影响吗？谢谢

作者: qhyu 时间: 2013-3-13 15:15

你好，老师，我做的是肝癌细胞，蛋白分子量62，自从实验室换成ＮＣ膜后，就做不出来了
仪器是六一仪器厂的，NC膜转膜液配方：甘氨酸2.9g Tris5.8g SDS0.37g 定容至800，加200ml甲醇
长*宽*2 转4个小时，问题出在哪呢

作者: kuaizige 时间: 2013-3-13 15:39

楼主，您好，看了前面的帖子发现，marker在不同的条件下位置不一样，那相应样品的蛋白位置会有变化吗，就是依据marker还能不能准确指示蛋白分子量，我的marker是 95、70、49、40、30、25、16，内参为43，我每次都只会留下49和40之间的胶转膜，那假如“43”的那一条“漂移”了，那岂不是要被我剪掉了？

作者: kuaizige 时间: 2013-3-13 15:39

大师，呵呵还有个问题，我想着剪一小块PVDF，全浸入待测一抗里，漂洗3次，再全进入二抗里作用40min，漂洗3次，ECL发光，检测一抗有没有问题，这可行吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:40

楼主，您好，看了前面的帖子发现，marker在不同的条件下位置不一样，那相应样品的蛋白位置会有变化吗，就是依据marker还能不能准确指示蛋白分子量，我的marker是 95、70、49、40、30、25、16，内参为43，我每次都只会留下49和40之间的胶转膜，那假如“43”的那一条“漂移”了，那岂不是要被我剪掉了？

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这么窄的距离容易被剪掉

作者: gemei0115 时间: 2013-3-13 15:42

我刚开始做实验，构建了一个目的序列的载体（真核和原核都构建了），我师姐说让我转到真核细胞里表达蛋白，然后做western blot看蛋白大小，但是我觉得真核细胞本身有蛋白，会干扰结果吧，可以转大肠杆菌里表达了蛋白，然后WB么？有人做过么？如果能做需要注意些什么呢？谢谢。。。

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-13 15:42

您好，我这里有个棘手的问题，我跑170kd左右的蛋白，用4%的浓缩胶，90v跑15min。分离胶是6%，120v跑90分钟。转膜一块胶用200mA，转2h。转膜后，膜上marker有5条条带（正常的话应该有7条，估计有两条跑过了，但是溴酚蓝的条带还在，所以感到意外，这是问题之一，请问原因是什么？）。

膜用丽春红染色，上面有清楚的条带，胶用考马斯亮蓝染色，没有条带，说明都转过去了。用5%milk/TBST 室温block 1h，TBST 3x5min洗三次，一抗1:1000稀释在5%milk/TBST中，4C°过夜，TBST 3x5min洗三次二抗1:5000稀释在5%milk/TBST中，室温1h。最后竟然得到的是白板。连actin也没有，阳性对照液没有，做过多次结果都一样，测试过二抗，显色液，胶片都没有问题，一抗换过多次，不会有问题。TBST的PH值是7.4左右。所以我不知道原因会出在哪里，我是新手，不知道原因出在哪里，最可能的原因是什么？哭死，刚开始的时候还可以做出来，条带很清楚。第二次就很淡了，现在什么也没有，样品是培养细胞的裂解液，加ripa后，直接-20°C保存，开始没有分装，反复冻融了两到三次，后面就分装了。不会这么快就全部降解了吧，再说，用别人的阳性对照也没有做出来呀。请大侠指点迷津！

作者: yjf1026 时间: 2013-3-13 15:43

应该是可以的
我做过ECL发光后的膜
冻在-20度几个月了
拿出来重新用ECL孵育后照样能曝出条带

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拿出来后直接就加ECL吗？还要不要一抗二抗孵育？

作者: yjf1026 时间: 2013-3-13 15:44

您好，我这里有个棘手的问题，我跑170kd左右的蛋白，用4%的浓缩胶，90v跑15min。分离胶是6%，120v跑90分钟。转膜一块胶用200mA，转2h。转膜后，膜上marker有5条条带（正常的话应该有7条，估计有两条跑过了，但是溴酚蓝的条带还在，所以感到意外，这是问题之一，请问原因是什么？）。

膜用丽春红染色，上面有清楚的条带，胶用考马斯亮蓝染色，没有条带，说明都转过去了。用5%milk/TBST 室温block 1h，TBST 3x5min洗三次，一抗1:1000稀释在5%milk/TBST中，4C°过夜，TBST 3x5min洗三次二抗1:5000稀释在5%milk/TBST中，室温1h。最后竟然得到的是白板。连actin也没有，阳性对照液没有，做过多次结果都一样，测试过二抗，显色液，胶片都没有问题，一抗换过多次，不会有问题。TBST的PH值是7.4左右。所以我不知道原因会出在哪里，我是新手，不知道原因出在哪里，最可能的原因是什么？哭死，刚开始的时候还可以做出来，条带很清楚。第二次就很淡了，现在什么也没有，样品是培养细胞的裂解液，加ripa后，直接-20°C保存，开始没有分装，反复冻融了两到三次，后面就分装了。不会这么快就全部降解了吧，再说，用别人的阳性对照也没有做出来呀。请大侠指点迷津！

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我深有同感，觉得都很正确，就是做不出来内参，开始还可以，后来就是不行！

作者: one 时间: 2013-3-13 15:44

请问54k,和72k的湿转条件，谢谢。

作者: 831226 时间: 2013-3-13 15:45

请问细胞外基质比如胶原一等western的做法与胞内蛋白有什么差异？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:55

请问54k,和72k的湿转条件，谢谢。

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300mA 1h

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:55

请问细胞外基质比如胶原一等western的做法与胞内蛋白有什么差异？

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collagen等？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:56

您好，我这里有个棘手的问题，我跑170kd左右的蛋白，用4%的浓缩胶，90v跑15min。分离胶是6%，120v跑90分钟。转膜一块胶用200mA，转2h。转膜后，膜上marker有5条条带（正常的话应该有7条，估计有两条跑过了，但是溴酚蓝的条带还在，所以感到意外，这是问题之一，请问原因是什么？）。

膜用丽春红染色，上面有清楚的条带，胶用考马斯亮蓝染色，没有条带，说明都转过去了。用5%milk/TBST 室温block 1h，TBST 3x5min洗三次，一抗1:1000稀释在5%milk/TBST中，4C°过夜，TBST 3x5min洗三次二抗1:5000稀释在5%milk/TBST中，室温1h。最后竟然得到的是白板。连actin也没有，阳性对照液没有，做过多次结果都一样，测试过二抗，显色液，胶片都没有问题，一抗换过多次，不会有问题。TBST的PH值是7.4左右。所以我不知道原因会出在哪里，我是新手，不知道原因出在哪里，最可能的原因是什么？哭死，刚开始的时候还可以做出来，条带很清楚。第二次就很淡了，现在什么也没有，样品是培养细胞的裂解液，加ripa后，直接-20°C保存，开始没有分装，反复冻融了两到三次，后面就分装了。不会这么快就全部降解了吧，再说，用别人的阳性对照也没有做出来呀。请大侠指点迷津！

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1、marker变成5条带正常，因为6%的胶不能让小分子量marker分离
2、什么蛋白？
3、阳性对照都没有那就说明系统存在很大问题

作者: ritou1985 时间: 2013-3-13 15:57

1、marker变成5条带正常，因为6%的胶不能让小分子量marker分离
2、什么蛋白？
3、阳性对照都没有那就说明系统存在很大问题

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蛋白是膜蛋白，今天做了一次二抗孵育后，有两块膜，一块用TBST随便冲洗了一下，大约几分钟。最后去显影，有深背景，但也有条带。另外一个认真洗了近半个小时，结果跟前面的一样，什么也没有，非常的干净。然道是被洗掉了不成？另外有个细节问题，前一个加显影液的时候，膜上的TBST残液用纸洗过，所以应该比较少，后一次也就是爆白板的这次，没有吸，估计残液比较多，会是这些残液影响的吗？

作者: ritou1985 时间: 2013-3-13 15:57

1、marker变成5条带正常，因为6%的胶不能让小分子量marker分离
2、什么蛋白？
3、阳性对照都没有那就说明系统存在很大问题

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这次试验有一个条带，是我想要的特异条带，但是actin没有出来，actin没有出来会不会是胶浓度稀跑出去了，或者转膜的时候，转过头了。actin要单独转吗，另外我想请问一下，系统最可能出现的问题是在哪一步呢？还是什么溶液有问题呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 15:59

另外，还问一个很弱智的问题，洗的时候可以用摇床摇吗，我还怀疑，二抗被我摇下来了。有没有这种可能性？

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会变弱
完全洗掉的可能性小

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-13 15:59

老师您好！我刚开始做WB不久，想请教一下：
我的目的蛋白是69-105KD，内参是43KD，我用的8%的分离胶，半干转，内参转27分钟，目的转32分钟，目的几乎每次都能出来，但是内参始终出不来，没有条带，这是怎么回事啊？

作者: wood533 时间: 2013-3-13 16:01

老师您好！我刚开始做WB不久，想请教一下：
我的目的蛋白是69-105KD，内参是43KD，我用的8%的分离胶，半干转，内参转27分钟，目的转32分钟，目的几乎每次都能出来，但是内参始终出不来，没有条带，这是怎么回事啊？

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溴酚蓝跑到什么地方了？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-13 16:01

你好，请问WB中电泳缓冲液能重复使用吗，电转液呢？要能重复使用，大概能重复多少次？谢谢！

作者: one 时间: 2013-3-13 16:04

您好！我想请问您一个问题：我要检测的蛋白的分子量在100KD左右，在转膜时，使用100V的恒电压，时间为100min，但是Marker在凝胶上还会残留高分子量的蛋白部分。请问我需要怎么做？

作者: wood533 时间: 2013-3-13 16:09

您好！我想请问您一个问题：我要检测的蛋白的分子量在100KD左右，在转膜时，使用100V的恒电压，时间为100min，但是Marker在凝胶上还会残留高分子量的蛋白部分。请问我需要怎么做？

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湿转吗？

作者: 831226 时间: 2013-3-13 16:14

我现在要做精氨酸，谷氨酸，脯氨酸对子宫内膜细胞mTOR表达的影响，对照组是无氨基酸处理，要比较不同处理间的差异。每个处理我做了六个样品，如果六个样都点样的话，跟本不能在同一张胶上跑啊，胶孔最多的是10个孔。另外有个疑问，就是我看那些发表的文章，western怎么都是一个处理一条带呢？请赐教啊！
感谢了！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-13 16:15

老师，我想问下，我今天曝光的目的和内参，膜都是亮的，稍等一会压出的片子，目的和内参的地方是白的，其余地方全黑，是我二抗比例高的原因吗？谢谢

作者: owanaka 时间: 2013-3-13 16:15

做了两个月的小鼠C57的肝质膜蛋白Western blot ,线粒体条带非常漂亮，但Na+k+ATPase酶（采用的半干法一个小时转膜，就是做不出来或者背景很黑（抗体1:10000或1:5000；二抗抗鼠：1:2000.实在想不出原因？请教各位高手：是不是Na+k+ATPase酶特别难做出来，怎么才能做好？怎样才能做出？有什么经验？请大家多指点啊。实验做不出，精神都崩溃了，时间就这样过去了？请大家与版主提建议啊？

作者: 987789 时间: 2013-3-13 16:18

一定要提取核蛋白来进行核定位蛋白的WB检测吗？
还是可以用总蛋白来检测？

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也可以用总蛋白来检测，但是里面一定要含有核蛋白，我主要是检测核蛋白的表达。总蛋白一般只含有膜蛋白以及胞浆蛋白，应该几乎没有核蛋白吧？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:19

我现在要做精氨酸，谷氨酸，脯氨酸对子宫内膜细胞mTOR表达的影响，对照组是无氨基酸处理，要比较不同处理间的差异。每个处理我做了六个样品，如果六个样都点样的话，跟本不能在同一张胶上跑啊，胶孔最多的是10个孔。另外有个疑问，就是我看那些发表的文章，western怎么都是一个处理一条带呢？请赐教啊！
感谢了！

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可以这么设计
marker、无、精氨酸、谷氨酸、脯氨酸、无、精氨酸、谷氨酸、脯氨酸、buffer
western当然是一个处理一个条带
选择好的图在论文中
要不然做统计的那么多图怎么放呢/

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:19

老师，我想问下，我今天曝光的目的和内参，膜都是亮的，稍等一会压出的片子，目的和内参的地方是白的，其余地方全黑，是我二抗比例高的原因吗？谢谢

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降低上样量
稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:19

做了两个月的小鼠C57的肝质膜蛋白Western blot ,线粒体条带非常漂亮，但Na+k+ATPase酶（采用的半干法一个小时转膜，就是做不出来或者背景很黑（抗体1:10000或1:5000；二抗抗鼠：1:2000.实在想不出原因？请教各位高手：是不是Na+k+ATPase酶特别难做出来，怎么才能做好？怎样才能做出？有什么经验？请大家多指点啊。实验做不出，精神都崩溃了，时间就这样过去了？请大家与版主提建议啊？

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抗体是哪里的？

作者: PINK 时间: 2013-3-13 16:20

老师你好，我现在想做分子量在400多KD的蛋白的含量测定，想请教一下做大分子量蛋白的条件，胶浓度，时间等。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:20

可以选择5-15%的梯度胶

作者: 8princess8 时间: 2013-3-13 16:22

可以选择5-15%的梯度胶

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这种梯度胶可以直接用于分大分子量的蛋白，还是需要先将蛋白裂解为亚基？谢谢老师。

作者: eric930 时间: 2013-3-13 16:23

转完膜后，用立春红染色，有条带，加完一、二抗后，由于条带暗，所以用一抗过夜了，效果还行，但两个星期后重复实验，一抗过夜后，效果不好了，就连背景也很暗，应该怎么解决？

作者: 49888 时间: 2013-3-13 16:25

请问定位在内质网腔内，与内质网内膜相连的蛋白如何提取呢？我用RIPA buffer裂解细胞，然后14，,000cpm离心取上清，能得到吗？谢谢了

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-13 16:26

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量90kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果发现有两个问题：
1、8%胶的磷酸化蛋白两侧marker也会显影，而10%胶却很干净，一抗跟marker蛋白结合好像说不通。
2、总目的蛋白爆出n条带，而跟磷酸化蛋白相比，我怀疑最黑的那条可能还不是目的蛋白。因为磷酸化蛋白条带的背景是往上走，而总蛋白的杂带是往下走，两者的分子量不太一致。总蛋白的一抗是CST的兔单克隆抗体，说明书建议用5%脱脂奶粉稀释，1：1000，封闭我用的也是5%脱脂奶粉。是不是一抗浓度应该降低？

求高手解答，谢谢！

[ 本帖最后由 yapuyapu 于 2013-3-13 16:41 编辑 ]

图片附件: 49415577.snap.jpg (2013-3-13 16:41, 19.96 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15162

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:42

转完膜后，用立春红染色，有条带，加完一、二抗后，由于条带暗，所以用一抗过夜了，效果还行，但两个星期后重复实验，一抗过夜后，效果不好了，就连背景也很暗，应该怎么解决？

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考虑下样品及缓冲液问题

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:42

请问定位在内质网腔内，与内质网内膜相连的蛋白如何提取呢？我用RIPA buffer裂解细胞，然后14，,000cpm离心取上清，能得到吗？谢谢了

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可以用质量好的RIPA来裂解细胞
能得到内质网内膜蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:43

QUOTE:

原帖由 yapuyapu 于 2013-3-13 16:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

图片由下往上分别是内参GAPDH、磷酸化目的蛋白（分子量90kDa左右）、总目的蛋白；左侧是8%分离胶，右边是10%分离胶，两张膜孵育的抗体、条件基本一样。
我是先孵育磷酸化蛋白然后洗脱掉再孵育总蛋白的，结果发现有两个问题：
1、8 ...

1、CST的抗体怎么推荐用5%脱脂奶粉呢？应该是BSA，你再看看说明书
2、CST的抗体有很多也不好用
3、总蛋白把抗体稀释度加大至1:2000,1:4000试试
4、你的WB做的还不错

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-13 16:43

1、CST的抗体怎么推荐用5%脱脂奶粉呢？应该是BSA，你再看看说明书
2、CST的抗体有很多也不好用
3、总蛋白把抗体稀释度加大至1:2000,1:4000试试
4、你的WB做的还不错

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谢谢楼主！

没错，说明书是建议用5%的脱脂奶粉稀释的。本来还想着掺杂5%BSA来稀释一抗的，但还是先从稀释一抗着手。
昨天将膜洗脱后，从中间剪成两半，分别孵育1:2000和1:3000两个浓度，结果看来改善很多了，如下图。对于1:2000居然比1:3000淡，估计是配制一抗时或二抗出问题（二抗也是分开孵的）。

图片附件: 93569845.snap.jpg (2013-3-13 16:43, 41.67 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15163

作者: 131415 时间: 2013-3-13 16:44

老师您好，我做western快两个月了，连内参都不出，请您帮我看看有什么问题
1，蛋白是一瓶细胞加300微升蛋白裂解液 RIPA裂解液(强），没有测浓度，因为紫外光度仪坏了。10微升加2.5的5乘蛋白loading煮沸后上样
2,10%分离胶，5%浓缩胶，80V跑浓缩胶，120V跑分离胶至溴酚蓝到底
3，半干转BIO的100毫安恒流1小时，丽春红染膜在最下面能看到清晰地一条带，往上就是很模糊了，感觉应该是转上了，（转完的胶考染能看到部分大分子的条带）。
4,5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（3年前的，最近没人用过）1；1000孵育1小时，TBST洗膜3*15min，2抗1；2000孵育2小时，TBST洗膜3*15min
5，暗室里加1毫升ECL混合液（康为世纪），关灯大约5分钟后可见大半个膜的地方都发出淡淡的荧光，用枪吸取ECL液体，保鲜膜包起来放入暗合，压片3分钟，什么都没有
请您帮我看看整个步骤问题到底出在哪，多谢了

作者: 131415 时间: 2013-3-13 16:44

都说内参是最好出的，我却怎么做都不出啊，郁闷

作者: 831226 时间: 2013-3-13 16:45

我是新手我要做的是小分子膜蛋白想请教几个问题：
1. 分子量22kd 试过很多转膜条件（半干转10v 30分 12v30分 10v45分等）和上样量都只见内参没有目的条带怎么样的转膜条件比较适合小分子量蛋白？
2. 组织提膜蛋白需要注意的嘛？裂解液（2D裂解液）太强会不会破坏膜蛋白？

做了一个多月了还是没条带刚换了一个抗体还没做帮帮我吧~~~谢谢了

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:46

老师您好，我做western快两个月了，连内参都不出，请您帮我看看有什么问题
1，蛋白是一瓶细胞加300微升蛋白裂解液 RIPA裂解液(强），没有测浓度，因为紫外光度仪坏了。10微升加2.5的5乘蛋白loading煮沸后上样
2,10%分离胶，5%浓缩胶，80V跑浓缩胶，120V跑分离胶至溴酚蓝到底
3，半干转BIO的100毫安恒流1小时，丽春红染膜在最下面能看到清晰地一条带，往上就是很模糊了，感觉应该是转上了，（转完的胶考染能看到部分大分子的条带）。
4,5%脱脂奶粉封闭过夜，一抗（3年前的，最近没人用过）1；1000孵育1小时，TBST洗膜3*15min，2抗1；2000孵育2小时，TBST洗膜3*15min
5，暗室里加1毫升ECL混合液（康为世纪），关灯大约5分钟后可见大半个膜的地方都发出淡淡的荧光，用枪吸取ECL液体，保鲜膜包起来放入暗合，压片3分钟，什么都没有
请您帮我看看整个步骤问题到底出在哪，多谢了

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1、把丽春红染色结果扫描后发到我邮箱，邮箱在我的个人信息中有
2、一抗是哪个公司的？做过稀释度的梯度吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:46

我是新手我要做的是小分子膜蛋白想请教几个问题：
1. 分子量22kd 试过很多转膜条件（半干转10v 30分 12v30分 10v45分等）和上样量都只见内参没有目的条带怎么样的转膜条件比较适合小分子量蛋白？
2. 组织提膜蛋白需要注意的嘛？裂解液（2D裂解液）太强会不会破坏膜蛋白？

做了一个多月了还是没条带刚换了一个抗体还没做帮帮我吧~~~谢谢了

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半干我常用电流
1.2mA/平方厘米膜面积，时间 22K的话 30min
会使膜蛋白变性，用2D的裂解液提取的蛋白及你想那个WB是没问题的

作者: PCR 时间: 2013-3-13 16:47

1、把丽春红染色结果扫描后发到我邮箱，邮箱在我的个人信息中有
2、一抗是哪个公司的？做过稀释度的梯度吗？

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1，请问丽春红染色用什么扫描啊，凝胶成像吗，我就是染完看一下就脱色接着往下做了
2，内参抗体是SANTA的，还没做梯度，因为曝光什么都没有，稀释度是按师兄以前做的比例做的

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:47

1，请问丽春红染色用什么扫描啊，凝胶成像吗，我就是染完看一下就脱色接着往下做了
2，内参抗体是SANTA的，还没做梯度，因为曝光什么都没有，稀释度是按师兄以前做的比例做的

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1、抗体买回来多久了？
2、丽春红染色后，脱色至清晰，用扫描仪扫描后保存为Jpeg格式文件

作者: PCR 时间: 2013-3-13 16:48

1、抗体买回来多久了？
2、丽春红染色后，脱色至清晰，用扫描仪扫描后保存为Jpeg格式文件

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呵呵，没有扫描仪
抗体是三年前的，一直分装放在-20保存的

作者: 831226 时间: 2013-3-13 16:48

半干我常用电流
1.2mA/平方厘米膜面积，时间 22K的话 30min
会使膜蛋白变性，用2D的裂解液提取的蛋白及你想那个WB是没问题的

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我今天第一次尝试用15%分离胶只跑了2/3小分子的marker 分的很开了而大分子聚在一起
22kd分子量用12%好还是15%好呢？

作者: 831226 时间: 2013-3-13 16:49

小分子蛋白的话有没有人必要用湿转？

作者: u234 时间: 2013-3-13 16:50

我今天第一次尝试用15%分离胶只跑了2/3小分子的marker 分的很开了而大分子聚在一起
22kd分子量用12%好还是15%好呢？

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我觉得12%的胶就可以...成功做出过17KD的蛋白.

不过其实论效果的话,trisine胶的效果会更好一些...

作者: H2O 时间: 2013-3-13 16:55

我觉得12%的胶就可以...成功做出过17KD的蛋白.

不过其实论效果的话,trisine胶的效果会更好一些...

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17kd的请问你的转膜条件是什么？

trisine胶？它的配方是什么？我们这里都用SDS-PAGE好像

作者: NBA 时间: 2013-3-13 16:57

呵呵，没有扫描仪
抗体是三年前的，一直分装放在-20保存的

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借你同学新买抗体或者买个小包装抗体来进行预实验
内参抗体试用如果需要的话可以站内信息联系我

作者: ukonptp 时间: 2013-3-13 17:06

借你同学新买抗体或者买个小包装抗体来进行预实验
内参抗体试用如果需要的话可以站内信息联系我

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谢谢您，我借点别人的吧，您看我的整个步骤有没有什么问题，为什么整个膜发光呢

作者: qhyu 时间: 2013-3-13 17:07

您好，我是一个新手，第四次做western。最近一次的结果有的有目的条带有的没有，同样的样品做另一个蛋白就都有条带。我非常肯定样品中都含有这两种蛋白。

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我想问一下啊楼主是我一抗浓度不够的原因吗？那些地方需要改进
谢谢

作者: qhyu 时间: 2013-3-13 17:08

是不是因为我在转膜的时候同一个电泳槽中转两块膜而导致转膜效率不一致？
谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:10

谢谢您，我借点别人的吧，您看我的整个步骤有没有什么问题，为什么整个膜发光呢

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整张膜是ECL引起的

作者: 04906 时间: 2013-3-13 17:11

还想请教您一个问题，关于抗体孵育
我之前是一张7乘5大小的膜加5毫升抗体稀释液在塑封袋里孵育，师兄说用500微升就可以，这样太浪费抗体，请问您对这个问题的看法：
另外膜用1抗孵育，在4度能放多久，2-3天应该没问题吧
不好意思，这么多问题，因为是纯新手

作者: wmp1234 时间: 2013-3-13 17:13

半干我常用电流
1.2mA/平方厘米膜面积，时间 22K的话 30min
会使膜蛋白变性，用2D的裂解液提取的蛋白及你想那个WB是没问题的

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我想问下你是用一个体系转膜的嘛？
我用1：2：7=10X电转液：甲醇：dd水

作者: loli 时间: 2013-3-13 17:14

你好！我想问一下，为什么我的内参蛋白（GAPDH）只有在stripping后才能出来
我的条件：湿转：60v，60min，millipore 0.22um孔径
洗膜TBST，10min，三次
封闭（5%脱脂奶粉，TBST稀释）1小时
洗膜TBST，10min，三次

一抗封闭4度过夜（0.5%的封闭液稀释）
洗膜TBST，10min，三次
二抗1小时（0.5%的封闭液稀释）
洗膜TBST，10min，三次

显影ECL
第一次白板，用抗体洗脱液洗脱后，重新重复封闭及以后的过程，才能有内参
困惑很久，盼解答，谢谢！

作者: qumm1985 时间: 2013-3-13 17:19

您好，重新贴一下，我不太会贴图，不知道这次会不会成功。上面的条带是目的条带，下面的一排是目的条带样本对应的tublin。

图片附件: 41343205.snap.jpg (2013-3-13 17:20, 12.79 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15164

作者: plaa 时间: 2013-3-13 17:21

17kd的请问你的转膜条件是什么？

trisine胶？它的配方是什么？我们这里都用SDS-PAGE好像

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哦，打错个字母，应该是tricine。

TRICINE –SDS-PAGE
Tricine-SDS-PAGE胶的配方：（分离范围是5 KD--45 KD。若分离5KD以内蛋白，把AB-3换成AB-6即可,范围3KD-35KD。）
（约2.5ml）4%分离胶 10%积层胶 (约4.67ml)
ddH2O 1.486 mL 2 mL
AB-3 0.167 mL 1 mL
Gel-Buffer(3*) 0.83 mL 1 mL
甘油 — 0.67 mL
10%AP 12.5uL 25 uL
TEMED 1.3 uL 2. 5 uL

3*Gel-Buffer 配方：(100mL量)
Tris 36.4g
SDS 0.3 g
pH 8.45 with HCL
h2o make up to 100ml
难溶，可以60°C水浴促进溶解。

AB-3 (100mL量) AB-6(100mL量)
丙烯 48 g 丙烯 46.5 g
双叉丙烯酰胺 1.5 g 双叉丙烯酰胺 3 g
h2o make up to 100ml
注意：丙烯溶解后会使溶液体积增大，故只要用约80mL水溶解即可，完全溶解后再定容。通风橱内操作，注意保护自己！

外槽电泳液（+极）（Anode Buffer）10*: 500ml量
Tris 121.9g
pH 8.9 with HCL
h2o make up to 500ml

内槽电泳液（-极）（Cathode Buffer）10*:100mL体积
Tris-Base 12.11 g
Tricine 17.92 g
SDS 1g
pH 约8.250 (不用调)
h2o make up to 100ml
（般电泳槽内槽一次只要150mL液体，而外槽需要400-500mL液体。）

2*Sample Loading buffer : 5ml
甘油 1ml
B-巯基乙醇 0.5ml
0.4g SDS
0.5 M/L PH6.8 Tris 1ml
h2o make up to 5ml 加入少许溴酚蓝至红棕色

跑小分子蛋白是不错的选择。转膜一般100V，1小时就可以，膜是PVDF，0.22的。我们实验验也有30V，过夜的，说是害怕蛋白从膜上又转到滤纸上了，不知道有没有道理。但反正结果是可以用的。

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:22

还想请教您一个问题，关于抗体孵育
我之前是一张7乘5大小的膜加5毫升抗体稀释液在塑封袋里孵育，师兄说用500微升就可以，这样太浪费抗体，请问您对这个问题的看法：
另外膜用1抗孵育，在4度能放多久，2-3天应该没问题吧
不好意思，这么多问题，因为是纯新手

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1、这么大的膜500ul有点少，容易孵育不完全，5ml有点多，可以选择2-3ml
2、2-3天有点长，为什么要孵育这么长时间？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:23

我想问下你是用一个体系转膜的嘛？
我用1：2：7=10X电转液：甲醇：dd水

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半干、湿转都有
你的稀释方法基本可以

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:23

你好！我想问一下，为什么我的内参蛋白（GAPDH）只有在stripping后才能出来
我的条件：湿转：60v，60min，millipore 0.22um孔径
洗膜TBST，10min，三次
封闭（5%脱脂奶粉，TBST稀释）1小时
洗膜TBST，10min，三次

一抗封闭4度过夜（0.5%的封闭液稀释）
洗膜TBST，10min，三次
二抗1小时（0.5%的封闭液稀释）
洗膜TBST，10min，三次

显影ECL
第一次白板，用抗体洗脱液洗脱后，重新重复封闭及以后的过程，才能有内参
困惑很久，盼解答，谢谢！

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只做了一次还是重复过很多次？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:25

您好，重新贴一下，我不太会贴图，不知道这次会不会成功。上面的条带是目的条带，下面的一排是目的条带样本对应的tublin。

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转膜完成后丽春红染色了吗/

作者: memory 时间: 2013-3-13 17:25

问一个非技术问题，预染marker哪家的好呢

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:27

问一个非技术问题，预染marker哪家的好呢

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进口的：fermentas（Thermo），Bio-Rad等等都不错
性价比高：Fermentas（Thermo）

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-13 17:28

老师你好：做了快两个月的WB 可一点起色都没有。我的指标是IRE1 ,P-JNK，内参均为gapdh.说说我的步骤：8%分离胶，5%浓缩胶。上样是50ug，15ul,70V,120V,转膜液是10%，且加了0.37gSDS。两指标均用此转膜液，P-JNK及GAPDH转45分钟后，暂停伯乐电泳仪，将其取出，再继续转膜45分钟后取出IRE1的膜，结果两者的maker均看不见。立春红染膜后，有时候有条带，有时候无。5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗10*3min,santa的IRE1一抗1:500稀释，santa的gapdh1:500稀释，cell signaling的p-jnk 1:2000稀释（均采用碧云天的一抗稀释液，以便抗体再利用），4度摇床过夜，次日约孵育20小时候，TBST洗10*3min,二抗1:5000（建议是1:5000-1:100000）室温1h,TBST洗10*3min,ECL发光曝光，机器曝光。结果：IRE1有么是白板，要么是黑的只有整个条形膜形状，内参有时候有，但条带不全，P-JNK开始几次还可以，后来也组的不好了。我的问题：1，此两指标是否要用不同的分离胶？大分子8%，小分子10%？
2，转膜液是否各自一份，大分子应该加SDS且甲醇浓度10%？小分子不加SDS，甲醇20%？
3，我的转膜时间是否可以？但结果总是不稳定，大多数是maker不清楚。
4,像我这种情况应该采取哪种条件的转变？
谢谢！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-13 17:29

IRE1分子量约120 ，P-JNK分子量46/54

作者: 8princess8 时间: 2013-3-13 17:30

进口的：fermentas（Thermo），Bio-Rad等等都不错
性价比高：Fermentas（Thermo）

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Fermentas的有点贵啊呵呵，国产的有什么好的可以推荐吗

作者: 3N4G 时间: 2013-3-13 17:32

请教老师，转膜出来上面一片缺失的白色是什么原因造成的？我做的时候有有小心把气泡赶走，请教了师姐，师姐说这种边缘模糊的不像是气泡，气泡边缘比较清晰，反而有点像是转膜的板上的圆孔印记，同时做了两张，另外一张缺失的白色少点，但是那张缺失的白色部分形状比较想转膜板上的圆孔印记，不知道是什么原因，请老师帮忙分析一下。

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:33

请教老师，转膜出来上面一片缺失的白色是什么原因造成的？我做的时候有有小心把气泡赶走，请教了师姐，师姐说这种边缘模糊的不像是气泡，气泡边缘比较清晰，反而有点像是转膜的板上的圆孔印记，同时做了两张，另外一张缺失的白色少点，但是那张缺失的白色部分形状比较想转膜板上的圆孔印记，不知道是什么原因，请老师帮忙分析一下。

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湿转还是半干转？

作者: 3N4G 时间: 2013-3-13 17:33

湿转还是半干转？

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是湿转

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:37

是湿转

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是不是缓冲液有点少？
一个槽子中转两块吗？
另一块如何呢？

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-3-13 17:38

1.PVDF膜用TBST洗完在加ECL之前需不需要晾干，如果有残留液体会不会影响ECL的效价呢

2.加ECL之后究竟多长时间曝光，有人说马上就可以去暗室曝光，也有人说要等到看到条带荧光，请问是不是一定要看到荧光呢

3.曝光后的片子是放到显影液里就行还是要不停摇晃啊，我用镊子夹着摇晃片子上总是有镊子的划痕

谢谢

作者: yychen 时间: 2013-3-13 17:39

是不是缓冲液有点少？
一个槽子中转两块吗？
另一块如何呢？

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同时做了两张，另外一张缺失的白色少点，但是那张缺失的白色部分形状比较像转膜板上的圆孔印记，不知道是什么原因，请老师帮忙分析一下。

作者: wmp1234 时间: 2013-3-13 17:40

1.PVDF膜用TBST洗完在加ECL之前需不需要晾干，如果有残留液体会不会影响ECL的效价呢

2.加ECL之后究竟多长时间曝光，有人说马上就可以去暗室曝光，也有人说要等到看到条带荧光，请问是不是一定要看到荧光呢

3.曝光后的片子是放到显影液里就行还是要不停摇晃啊，我用镊子夹着摇晃片子上总是有镊子的划痕

谢谢

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1、不需要晾干
2、不同公司ECL孵育时间是不同的
3、可以摇晃，用镊子夹的时候要夹胶片的角

作者: wmp1234 时间: 2013-3-13 17:41

同时做了两张，另外一张缺失的白色少点，但是那张缺失的白色部分形状比较像转膜板上的圆孔印记，不知道是什么原因，请老师帮忙分析一下。

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我没碰到过这样的问题
看看膜是不是过期

作者: 00无名指00 时间: 2013-3-13 17:42

我的样品制备好之后，第一次跑电泳之后GAPDH一抗，发光出来，片子上黑的丽春红染的也比较红。但在-70冰箱冻了之后，再跑电泳转膜发光，丽春红染的红的，胶片上反而不那么黑（GAPDH一抗）。如图所示，都是一一对应的。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15165

作者: 831226 时间: 2013-3-13 17:43

我将X基因分别构建在Invitrogen的pcDNA3.1，还有一个是带Myc标签的，两个载体。

蛋白30kd（分泌蛋白），买的伯乐的胶，配12%的，跑得很开了。伯乐的膜，孔径0.2um转膜350mA，90min(也试过40V，8h，差不
多)。转膜液配方：14.4g Glycine，3g Tris，200ml甲醇。室温用5%脱脂牛奶PBST封闭1h。
一抗(特异抗体购自R&D的和Myc标签抗体购自Invitrogen)6h，洗4*10min；二抗(Santa)3h，洗4*10min。
现在的问题是：
1. 需要很大的上样量（>100ug，用伯乐的染液Bradford测的），少了带出不来
2. 只有表达量很高（瞬转蛋白）的时候才能出带（但效果很好，带很清晰）
3. 试过一抗孵育室温2h，带出不来
4. 都说带标签的western会比较好做，但我做的效果甚至不如特异抗体
5. 好像大家做β-actin的时候一抗室温一个小时，压片的时候5秒钟之内就有很强的带，而我的一般需约1min
怀疑过HRP显色底物，但和别人的比较过，虽然我们的出来没背景带稍弱，但用他们的试了下，有背景也没带。

请问楼主：问题在哪里？该如何改进，才能提高体系的灵敏度啊？

作者: 987789 时间: 2013-3-13 17:44

请问老师几个比较业余的问题吧，做过PTEN蛋白和NF-KB蛋白的吗？是不是都属于磷酸化蛋白，都不太好出啊？谢谢

作者: mickeylin 时间: 2013-3-13 17:44

请教楼主，我跑western转膜后用ponceau S染色，有的泳道条带发生内缩，条带不实。请问可能是什么原因造成的？跑胶用的Invitrogen NuPAGE System，100V电压，压平后换200V，为提高上样量，用的自己制备的10*loading buffer。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15166

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:47

请问老师几个比较业余的问题吧，做过PTEN蛋白和NF-KB蛋白的吗？是不是都属于磷酸化蛋白，都不太好出啊？谢谢

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1、这两个蛋白做过，很好做，呵呵
2、有磷酸化形式，看你是不是要检测磷酸化形式了，呵呵

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:48

QUOTE:

原帖由 mickeylin 于 2013-3-13 17:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教楼主，我跑western转膜后用ponceau S染色，有的泳道条带发生内缩，条带不实。请问可能是什么原因造成的？跑胶用的Invitrogen NuPAGE System，100V电压，压平后换200V，为提高上样量，用的自己制备的10*loading buffer。
...

样品中沉淀太多，离心后上样

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:49

我将X基因分别构建在Invitrogen的pcDNA3.1，还有一个是带Myc标签的，两个载体。

蛋白30kd（分泌蛋白），买的伯乐的胶，配12%的，跑得很开了。伯乐的膜，孔径0.2um转膜350mA，90min(也试过40V，8h，差不
多)。转膜液配方：14.4g Glycine，3g Tris，200ml甲醇。室温用5%脱脂牛奶PBST封闭1h。
一抗(特异抗体购自R&D的和Myc标签抗体购自Invitrogen)6h，洗4*10min；二抗(Santa)3h，洗4*10min。
现在的问题是：
1. 需要很大的上样量（>100ug，用伯乐的染液Bradford测的），少了带出不来
2. 只有表达量很高（瞬转蛋白）的时候才能出带（但效果很好，带很清晰）
3. 试过一抗孵育室温2h，带出不来
4. 都说带标签的western会比较好做，但我做的效果甚至不如特异抗体
5. 好像大家做β-actin的时候一抗室温一个小时，压片的时候5秒钟之内就有很强的带，而我的一般需约1min
怀疑过HRP显色底物，但和别人的比较过，虽然我们的出来没背景带稍弱，但用他们的试了下，有背景也没带。

请问楼主：问题在哪里？该如何改进，才能提高体系的灵敏度啊？

==============================================================================================================

1、100ug蛋白上样量有点大了，一般WB检测时10-20ug总蛋白
2、一抗最好孵育过夜
3、有可能标签抗体不好，或者转染没成功？这几天我在做真核转染的标签IP，效果还不错。如果需要，我可以给你点阳性对照样品（真核或者原核）及想对应的抗体做个对照
4、你的二抗与ECL用的是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-13 17:49

417695062 wrote:
我的样品制备好之后，第一次跑电泳之后GAPDH一抗，发光出来，片子上黑的丽春红染的也比较红。但在-70冰箱冻了之后，再跑电泳转膜发光，丽春红染的红的，胶片上反而不那么黑（GAPDH一抗）。如图所示，都是一一对应的。

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样品降解？

作者: wood533 时间: 2013-3-14 12:09

样品降解

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如果样品讲解的话一般是因为什么原因呢？样品降解了有什么特征？谢谢啦~

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-14 12:12

我将X基因分别构建在Invitrogen的pcDNA3.1，还有一个是带Myc标签的，两个载体。

蛋白30kd（分泌蛋白），买的伯乐的胶，配12%的，跑得很开了。伯乐的膜，孔径0.2um转膜350mA，90min(也试过40V，8h，差不
多)。转膜液配方：14.4g Glycine，3g Tris，200ml甲醇。室温用5%脱脂牛奶PBST封闭1h。
一抗(特异抗体购自R&D的和Myc标签抗体购自Invitrogen)6h，洗4*10min；二抗(Santa)3h，洗4*10min。
现在的问题是：
1. 需要很大的上样量（>100ug，用伯乐的染液Bradford测的），少了带出不来
2. 只有表达量很高（瞬转蛋白）的时候才能出带（但效果很好，带很清晰）
3. 试过一抗孵育室温2h，带出不来
4. 都说带标签的western会比较好做，但我做的效果甚至不如特异抗体
5. 好像大家做β-actin的时候一抗室温一个小时，压片的时候5秒钟之内就有很强的带，而我的一般需约1min
怀疑过HRP显色底物，但和别人的比较过，虽然我们的出来没背景带稍弱，但用他们的试了下，有背景也没带。

请问楼主：问题在哪里？该如何改进，才能提高体系的灵敏度啊？

fangweibin119 wrote:
1、100ug蛋白上样量有点大了，一般WB检测时10-20ug总蛋白
2、一抗最好孵育过夜
3、有可能标签抗体不好，或者转染没成功？这几天我在做真核转染的标签IP，效果还不错。如果需要，我可以给你点阳性对照样品（真核或者原核）及想对应的抗体做个对照
4、你的二抗与ECL用的是哪里的？

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谢谢你好意，不过我的阳性对照能做的出来，就是需要大量的样品和长时间的抗体孵育，所以我怀疑wb系统的某个或某几个因素导致灵敏度太低。如何能在更少上样量（如30ug），抗体孵育时间更短的情况下把目的条带做出来？这就是我想要解决的。
我的二抗是santa c.的，有驴抗羊，和羊抗鼠的。 ECL是伯乐的。

作者: wsll 时间: 2013-3-14 12:13

请问250kd的蛋白，转膜条件是什么？湿转和干转是什么概念？我用的是1Xtansfer buffer，然后胶完全泡在BUFFER里面转膜，是不是湿转？谢谢~

作者: wsll 时间: 2013-3-14 12:13

我不想转膜过夜。。

作者: abc816 时间: 2013-3-14 12:14

我没碰到过这样的问题
看看膜是不是过期

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谢谢老师的回答。师姐说她以前也碰到过几次做出这种结果的情况，也不知道什么原因，后来又没有出现过了。

作者: NBA 时间: 2013-3-14 12:15

请问250kd的蛋白，转膜条件是什么？湿转和干转是什么概念？我用的是1Xtansfer buffer，然后胶完全泡在BUFFER里面转膜，是不是湿转？谢谢~

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湿转
300mA 恒流
2h30min足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-14 12:15

如果样品讲解的话一般是因为什么原因呢？样品降解了有什么特征？谢谢啦~

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如果是用WB的话
会出现多条带（与未降解样品对照，需要有对照做对比）

作者: NBA 时间: 2013-3-14 12:15

谢谢你好意，不过我的阳性对照能做的出来，就是需要大量的样品和长时间的抗体孵育，所以我怀疑wb系统的某个或某几个因素导致灵敏度太低。如何能在更少上样量（如30ug），抗体孵育时间更短的情况下把目的条带做出来？这就是我想要解决的。

我的二抗是santa c.的，有驴抗羊，和羊抗鼠的。 ECL是伯乐的。

===============================

一抗稀释度多少？可以改变一下试试
另外一抗是否孵育过夜？

作者: abc816 时间: 2013-3-14 12:16

湿转
300mA 恒流
2h30min足够了

=================================================================================================

谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？

作者: NBA 时间: 2013-3-14 12:17

QUOTE:

原帖由 abc816 于 2013-3-14 12:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
湿转
300mA 恒流
2h30min足够了

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谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的 ...

7.5%或者8%就可以

作者: xue258 时间: 2013-3-14 12:17

您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-15 10:07

300mA 恒流
2h30min足够了

==================================================================================================

谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:08

谢谢您的回复。还想请问，250KD，和150KD两个蛋白在同一张膜上做，6%的胶和7.5%的胶或者其他什么浓度的胶比较好？

==================

7.5%或者8%就可以

作者: 987789 时间: 2013-3-15 10:08

您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！

作者: 831226 时间: 2013-3-15 10:11

一抗稀释度多少？可以改变一下试试
另外一抗是否孵育过夜？

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一抗1:2000和1:1000都试过，孵育时间很长，室温6小时，也试过4度过夜。再试试1:500的看

作者: 831226 时间: 2013-3-15 10:12

您好，我是新手，请教一些问题！

1，我现在正做目标蛋白，显影时加发光剂能发亮，但是将胶片放入显影夜时胶片就变成了黑色，看不到条带。但是暗夹里的目标蛋白一直在亮，没有淬灭。现了好几次胶片都是黑板，这是怎么回事呢？

2，做内参时，也是在显影液中随着条带的出现胶片就逐渐变黑，将胶片放入定影液也没什么作用，作出的背景特别黑。只有几个胶片背景不黑，这是怎么回事。也红外线有关系吗，还是胶片或显影液的问题。但是以前师兄师姐做事条件相同也没有这样的情况？

3，定影液的作用是什么，能让背景变淡吗，怎么每次把胶片放入时条带都会变粗呢？

谢谢啊！！

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胶片过期或者已经全被曝光了

作者: 831226 时间: 2013-3-15 10:14

一抗1:2000和1:1000都试过，孵育时间很长，室温6小时，也试过4度过夜。再试试1:500的看

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室温不能孵育这么长时间

长时间孵育要在4度

作者: 04906 时间: 2013-3-15 10:14

室温封闭两小时，一二抗1比1000的稀释，一抗过夜，二抗两小时，

===========================================================================================================

不懂为什么会是这样的图？

同一张膜，为什么有两条带？第二张杂带比较浅了，但都是可以看的到的。还有第二张为什么成黑色的了，是因为在显影液里的时间长了吗？感觉从显影液里拿出来后就是黑色的了。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15173

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:15

室温封闭两小时，一二抗1比1000的稀释，一抗过夜，二抗两小时，

不懂为什么会是这样的图？

同一张膜，为什么有两条带？第二张杂带比较浅了，但都是可以看的到的。还有第二张为什么成黑色的了，是因为在显影液里的时间长了吗？感觉从显影液里拿出来后就是黑色的了。

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1、胶片可能曝光了

2、调整一抗稀释度，用1:2000,1:4000试试

作者: xingyi08 时间: 2013-3-15 10:16

细胞总蛋白抽提后，用BCA法测得总蛋白浓度只有0.18 ug/ul,后续WB还能能不能做啊，有什么方法可以浓缩吗？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-15 10:17

曝光怎么会是黑色的呢？我的是有大部分黑色的了

作者: IAM007 时间: 2013-3-15 10:18

您好，老师我想请假一些问题。

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最近我做出的条带都连在一块，一开始上样量是20微克，我感觉可能太大了，逐渐减做过一次12微克的还是连在一块，最近我就将上样量减到10微克，条带很细还是连在一块。我用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶。如果是胶的问题我应怎么改变呢，配方是什么样的啊，谢谢啊

作者: IAM007 时间: 2013-3-15 10:23

请高手指点啊！！
老师好，我最近做内参胶片上的条带总是连在一块，一开始以为是上样量过大，我现在上样量为10微克，出来的条带很细，但还是连在一块。是不是胶出了问题啊。我现在用的是10%的分离胶和5%的浓缩胶。如果是胶的问题应怎么改变啊，麻烦说些配方啊？谢谢啊！！

我是自己配的胶。10%分离胶：（双板）蒸馏水4.0 ml，30%AcrBic3.3 ml，1.5mol/l Tris.Hcl(PH8.8) 2.5 ml, 10%SDS 0.1 ml, 10%APS 0.1 ml, TEMED 4 ul。。 5%浓缩胶：（双板）蒸馏水2.8 ml, 30%AcrBic 0.66 ml, 1.0 mol/l Tris.Hcl （PH6.8) 0.50 ml , 10%SDS 0.04 ml, 10%APS 0.04 ml, TEMED 4 ul。
谢谢啊！

作者: 49888 时间: 2013-3-15 10:24

细胞总蛋白抽提后，用BCA法测得总蛋白浓度只有0.18 ug/ul,后续WB还能能不能做啊，有什么方法可以浓缩吗？

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没试过浓缩的方法

这个浓度有点低，能检测到部分蛋白

作者: hold住 时间: 2013-3-15 10:26

我去年9月做的western,目的蛋白survivin,16.5KD,用ECL，在Las-4000 Luminescent image analyzer上显影观察的，目的蛋白显影非常好。当时沒做内参，观察完后放4度冰箱，PBST浸泡中。现时隔7月，重新把这个膜取出来，stripping buffer洗20分钟后，在以同法PBST洗涤，β－actin 一抗孵育，PBST洗涤，二抗孵育，洗涤，之后同法ECL后在Las-4000 Luminescent image analyzer上显影观察，发现什么东西也没有。
是膜防止时间太长，还是β－actin 一抗及二抗有问题，或是什么原因。
我不知道怎么办，现在写论文要用，难道重新做。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:28

膜上蛋白本身的问题比较大

作者: duoduo 时间: 2013-3-15 10:29

楼主，你好，我最近做Western，要用没做过的抗羊二抗，不知道要用多大的稀释倍数，说明书上是写的稀释1000倍，我想问下能再加大稀释倍数吗？1：3000可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:29

楼主，你好，我最近做Western，要用没做过的抗羊二抗，不知道要用多大的稀释倍数，说明书上是写的稀释1000倍，我想问下能再加大稀释倍数吗？1：3000可以吗？

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做预实验看看

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 10:32

请教老师，我是WB新手，最近做了几次预实验，结果如下图，两张图都是同样的样本，一个杂带很明显但条带蛮漂亮的（左图，粗的是目的条带），一个杂带比较淡，但背景很深且条带貌似不怎么好(右图)。两张图除上样量不同外，其余条件均一样，请老师指点下一步该何去何从？还有哪张图比较好点儿？实在困惑不已啊~~~先谢了。

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作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 10:33

还有，两次内参(actin)都没有出来，搞不清为什么

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:35

QUOTE:

原帖由 66小飞侠 于 2013-3-15 10:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教老师，我是WB新手，最近做了几次预实验，结果如下图，两张图都是同样的样本，一个杂带很明显但条带蛮漂亮的（左图，粗的是目的条带），一个杂带比较淡，但背景很深且条带貌似不怎么好(右图)。两张图除上样量不同外，其余条件均一样，请 ...

结果差别还是挺大的

一抗两张用的是相同条件吗？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 10:36

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-15 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

结果差别还是挺大的

一抗两张用的是相同条件吗？

是的，两张除上样量不同外（右图上样量小些），其余条件都一样。

我还在摸索条件中，遇到这样的结果是在不知何去何从……

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:36

QUOTE:

原帖由 66小飞侠 于 2013-3-15 10:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是的，两张除上样量不同外（右图上样量小些），其余条件都一样。

我还在摸索条件中，遇到这样的结果是在不知何去何从……

建议多做几遍

把条件弄熟悉了

作者: hold住 时间: 2013-3-15 10:37

最近做小鼠肺组织的MAPK中的JNK,裂解用的是碧云天的western以及IP细胞裂解液，临用前加的PMSF，用玻璃匀浆器进行匀浆，上样量是60微克，一抗用的是Bioworld Technology的JNK1/2/3 (T178) pAb，一抗二抗用的是脱脂奶粉，以前可以做出来，现在却做不出来了，不知道问题出在了哪？请问楼主在做这些时需要注意什么？还有就是用的PMSF曾经在室温放过一个小时，在四度也放过一天吧，会对裂解有影响吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:38

QUOTE:

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最近做小鼠肺组织的MAPK中的JNK,裂解用的是碧云天的western以及IP细胞裂解液，临用前加的PMSF，用玻璃匀浆器进行匀浆，上样量是60微克，一抗用的是Bioworld Technology的JNK1/2/3 (T178) pAb，一抗二抗用的是脱脂奶粉，以前可以 ...

PMSF不是主要问题

抗体买回来保存多久了？

现在内参能做出来吗？

作者: hold住 时间: 2013-3-15 10:39

谢谢楼主的回答，抗体买回来三四个月吧，一直零下二十度冻存，内参没有做过呢。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:40

谢谢楼主的回答，抗体买回来三四个月吧，一直零下二十度冻存，内参没有做过呢。

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新提取的样品先检测下内参

作者: mamamiya 时间: 2013-3-15 10:40

最近做大鼠脑组织的NOS，分子量130KD左右，用的是12%分离胶，4%浓缩胶，80V跑到头。转膜是20%甲醛，200mA恒流湿转40分钟.5%脱脂奶粉封闭2H，然后孵育1，2抗。跑完膜marker很清楚，但是曝光看不到目标蛋白，而且背景比较亮，请问可能是什么原因？是我的操作条件有什么问题吗，我看前面楼主的回答说是要300mA，2H，是不是这样更好一点？另外分离胶和浓缩胶的浓度还需要调整吗？

作者: am10 时间: 2013-3-15 10:41

请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？

作者: 911 时间: 2013-3-15 10:41

你好楼主，我想问一下就是我做jnk。做了好几次都出不来条带只有背景色，把上样量从原先的40ug调到了80ug还是那样，我做的这个蛋白是两条带的，分子量好像为46，,54

作者: 911 时间: 2013-3-15 10:42

你好楼主你能把你的游戏地址或者qq留下吗想请教你问题。我是个新手，因为实验时间紧迫很需要有人指点谢谢。

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 10:43

请问半干转恒流前面有1.2毫安/平方厘米，如果有两张膜同时转的话，是两张膜的面积相加呢还是按最大的算？：

内参36KD,目的蛋白106KD,请问这两个每个要转多久呢按上面的电流量？：

没有染色直接曝光，请问转膜的最佳效果就是胶上没有而膜上很清楚吗：？

作者: hold住 时间: 2013-3-15 10:44

谢谢NBA老师的帮助，现在终于把内参做出来了，接下来要做目的了，我要做的是P糖蛋白，今天我才发现原来以前我因为这个抗体的问题曾经在站内短信中咨询过您，现在还是有几个问题请教

1，P糖蛋白是一种跨膜蛋白，那提蛋白的时候是按常规方法还是特殊的呢，我用的是买的蛋白裂解液RIPA，说明书上说可以用来提膜蛋白，但是实验室老师建议收集细胞冰浴超声裂解，究竟应该怎样呢

2，我买的一抗是abcam的鼠单抗说明书上western稀释浓度1/20,是1:20的意思吗，那也太费抗体了吧

3，我内参的片子，前两个是同一样品，后两个是同一样品，为什么最后的条带比前面的弱呢

作者: hold住 时间: 2013-3-15 10:44

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15175

作者: abc816 时间: 2013-3-15 10:45

您好！请问Western blot显影后的带连在了一起是什么原因造成的？有什么解决方法？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:47

最近做大鼠脑组织的NOS，分子量130KD左右，用的是12%分离胶，4%浓缩胶，80V跑到头。转膜是20%甲醛，200mA恒流湿转40分钟.5%脱脂奶粉封闭2H，然后孵育1，2抗。跑完膜marker很清楚，但是曝光看不到目标蛋白，而且背景比较亮，请问可能是什么原因？是我的操作条件有什么问题吗，我看前面楼主的回答说是要300mA，2H，是不是这样更好一点？另外分离胶和浓缩胶的浓度还需要调整吗？

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分离胶:8%

一抗、二抗需要做稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:47

请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？

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3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:48

你好楼主，我想问一下就是我做jnk。做了好几次都出不来条带只有背景色，把上样量从原先的40ug调到了80ug还是那样，我做的这个蛋白是两条带的，分子量好像为46，,54

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恩

这些蛋白我常做

调整一抗、二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:49

请问半干转恒流前面有1.2毫安/平方厘米，如果有两张膜同时转的话，是两张膜的面积相加呢还是按最大的算？：

内参36KD,目的蛋白106KD,请问这两个每个要转多久呢按上面的电流量？：

没有染色直接曝光，请问转膜的最佳效果就是胶上没有而膜上很清楚吗：？

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1、电流相加

2、按照目的分子量来转

3、最佳效果不好说，在膜上比较清楚的丽春红染色条带就行

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:50

老师的帮助，现在终于把内参做出来了，接下来要做目的了，我要做的是P糖蛋白，今天我才发现原来以前我因为这个抗体的问题曾经在站内短信中咨询过您，现在还是有几个问题请教

1，P糖蛋白是一种跨膜蛋白，那提蛋白的时候是按常规方法还是特殊的呢，我用的是买的蛋白裂解液RIPA，说明书上说可以用来提膜蛋白，但是实验室老师建议收集细胞冰浴超声裂解，究竟应该怎样呢

2，我买的一抗是abcam的鼠单抗说明书上western稀释浓度1/20,是1:20的意思吗，那也太费抗体了吧

3，我内参的片子，前两个是同一样品，后两个是同一样品，为什么最后的条带比前面的弱呢

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呵呵

这个蛋白我自己做过几次，也指导过一个站友做过

操作有点麻烦

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:50

QUOTE:

原帖由 hold住 于 2013-3-15 10:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
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抗体孵育或者ECL加的时候不均匀

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:51

您好！请问Western blot显影后的带连在了一起是什么原因造成的？有什么解决方法？谢谢

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胶本身问题

样品有沉淀造成泳道间的扩散。。。

上样量大等

都有可能造成

可以把图片挂上来看看

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 10:51

请问Trans-SD 通用型半干转印电泳槽转膜一个3×1厘米的膜，蛋白是内参，36的。

一般要多久的时间？多少的电流？

我用的是0.01A，三个小时时膜上有marker，胶上也有。

转膜的最佳效果就是胶上刚好转没，而膜上很清吗？

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3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

我用的是20的甲醛呀。膜一般要在纯的甲醛里浸多久呀？浸的太久会不会影响转膜呀/

作者: NBA 时间: 2013-3-15 10:52

3×1厘米的膜，用的是0.01A，三个小时

这么长的转膜时间还有marker啊？

正常情况下这个条件蛋白都转过了

用什么缓冲液？

我用的是20的甲醛呀。膜一般要在纯的甲醛里浸多久呀？浸的太久会不会影响转膜呀/

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转膜一般用甲醇

作者: 66+77 时间: 2013-3-15 10:53

请问老师，目的蛋白100K左右，10%的分离胶，5%的浓缩胶,电泳2h, 5.0*8.3cm的PVDF膜(0.4um孔径)，两张，半干转，15V，30min，这个条件可以吗？最最困惑我的是分离胶的浓度，和半干转的条件，希望老师帮忙解答，谢谢~~

作者: 66+77 时间: 2013-3-15 10:54

错啦，0.2um孔径，不好意思哈~~

作者: 66+77 时间: 2013-3-15 10:57

0.22um的PVDF膜比0.45um的容易有背景。想请教下老师，依据什么来选择PVDF膜的孔径呢？目的蛋白的分子量吗？如果是，那么是怎么划分的呢？谢谢

作者: qumm1985 时间: 2013-3-15 10:57

请问如果用odessay的仪器拍western，即红外荧光法，是否可以来源不同的一抗，同时孵育？例如磷酸化与非磷酸化的两个一抗的抗原，甚至大小相同的，结合会有影响么？

作者: qumm1985 时间: 2013-3-15 10:58

请问做磷酸化蛋白是不是要添加磷酸酶抑制剂？平时用的是罗氏的cocktail，貌似只包含蛋白酶抑制剂

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-15 10:58

请教楼主，我做il-1β的western blot，从组织中提取蛋白质（用的是碧云天的中等强度的试剂盒）。转膜用45分钟，一抗用5%脱脂牛奶封闭。一抗是santa的用到了1:100，上样量用到了100微克。但还是没有出……

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-15 10:59

相关疾病：
禽流感
我用烟草瞬时表达系统，表达了一种与禽流感病毒有关的蛋白，RNA水平已经检测到，但是做western blot，一直没有结果，请问是什么原因，另外我还想知道怎样才能提到活性蛋白，向各位前辈请教

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:00

请问老师，目的蛋白100K左右，10%的分离胶，5%的浓缩胶,电泳2h, 5.0*8.3cm的PVDF膜(0.4um孔径)，两张，半干转，15V，30min，这个条件可以吗？最最困惑我的是分离胶的浓度，和半干转的条件，希望老师帮忙解答，谢谢~~

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转膜条件恒压的我不太了解

我常用恒流

1.2mA/平方厘米膜面积，1h30min

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:00

前面听到fangweibin119老师说：0.22um的PVDF膜比0.45um的容易有背景。想请教下老师，依据什么来选择PVDF膜的孔径呢？目的蛋白的分子量吗？如果是，那么是怎么划分的呢？谢谢

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蛋白分子量

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:00

请问如果用odessay的仪器拍western，即红外荧光法，是否可以来源不同的一抗，同时孵育？例如磷酸化与非磷酸化的两个一抗的抗原，甚至大小相同的，结合会有影响么？

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同时孵育的前提是看一抗的来源，小鼠单抗可以这么做

分子量大小相同的没法一起做

作者: eric930 时间: 2013-3-15 11:01

ECL后暗室荧光条带很清楚，但曝光5分钟才能有很弱的出来，再加发光剂就怎么也曝光不出来了。

作者: duoduo 时间: 2013-3-15 11:02

蛋白分子量

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老师能说具体点儿吗？比如多少KDa选择多少孔径的PVDF膜？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:03

请问做磷酸化蛋白是不是要添加磷酸酶抑制剂？平时用的是罗氏的cocktail，貌似只包含蛋白酶抑制剂

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磷酸化蛋白需要：蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、PMSF（现用现加）

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:04

我用烟草瞬时表达系统，表达了一种与禽流感病毒有关的蛋白，RNA水平已经检测到，但是做western blot，一直没有结果，请问是什么原因，另外我还想知道怎样才能提到活性蛋白，向各位前辈请教

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1、什么蛋白？有抗体？

2、WB体系有没有问题？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:09

请教楼主，我做il-1β的western blot，从组织中提取蛋白质（用的是碧云天的中等强度的试剂盒）。转膜用45分钟，一抗用5%脱脂牛奶封闭。一抗是santa的用到了1:100，上样量用到了100微克。但还是没有出……

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内参做的怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:10

ECL后暗室荧光条带很清楚，但曝光5分钟才能有很弱的出来，再加发光剂就怎么也曝光不出来了。

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把膜用TBST或者PBST洗后

再加ECL

ECL淬灭快的话：注意封闭液是否时间过长、抗体是否回收使用、膜是否碰到金属物质

作者: pengke1983 时间: 2013-3-15 11:15

内参跑的很好

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:16

老师能说具体点儿吗？比如多少KDa选择多少孔径的PVDF膜？谢谢

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Millipore公司建议>20K选用0.45um孔径膜，反之。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:17

内参跑的很好

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如果是这样的话

1、用阳性样品试试

2、换一抗

作者: qqq111 时间: 2013-3-15 11:18

老师您好，最近western blot要做个内参，用tubulin，目的蛋白为23kd，目的蛋白一抗是鼠源，二抗是羊抗鼠。tubulin

一抗是兔源，二抗是羊抗兔。请问两种一抗可以一起孵育吗，两种二抗可以一起孵育吗？也就是说不用剪膜。

tubulin分子量是55kd的，12%的分离胶，目的蛋白和tubulin应该分得开。

作者: lgm 时间: 2013-3-15 11:18

那磷酸化与非磷酸化的抗原，大小一般相同的，都要先敷磷酸化然后strip才可以敷另一个么

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:19

老师您好，最近western blot要做个内参，用tubulin，目的蛋白为23kd，目的蛋白一抗是鼠源，二抗是羊抗鼠。tubulin

一抗是兔源，二抗是羊抗兔。请问两种一抗可以一起孵育吗，两种二抗可以一起孵育吗？也就是说不用剪膜。

tubulin分子量是55kd的，12%的分离胶，目的蛋白和tubulin应该分得开。

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不太好吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:21

那磷酸化与非磷酸化的抗原，大小一般相同的，都要先敷磷酸化然后strip才可以敷另一个么

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可以

也可以分两次电泳再做

作者: 831226 时间: 2013-3-15 11:22

你好，最近做磷酸化的NF-KbP65，显出来的带不清楚，但还可以，而且就是maker那一边总是特别黑，导致空白都看不到，怎么回事？谢谢楼主的回答啊。

作者: eric930 时间: 2013-3-15 11:23

不太好吧

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也就是说最好将膜剪开，分别孵育一抗，二抗吗？

作者: orangecake 时间: 2013-3-15 11:23

我们构建了一个定位载体，就是将基因和GFP融合，然后用烟草瞬时表达系统表达，后来用共聚焦显微镜观察，初步认为是胞间蛋白。另外，我们还构建了表达载体，带有6个HIS标签，western blot 时，我用一抗是HIS 抗体，二抗是辣根过氧化酶。western blot 的体系应该没有问题

作者: mimili_901 时间: 2013-3-15 11:30

ECL后暗室荧光条带很清楚，但曝光5分钟才能有很弱的出来，再加发光剂就怎么也曝光不出来了。

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把膜用TBST或者PBST洗后

再加ECL

ECL淬灭快的话：注意封闭液是否时间过长、抗体是否回收使用、膜是否碰到金属物质

ecl前有TBST洗的，封闭用了5%牛奶一小时，抗体是新配的，膜每次都是夹子从封闭袋里来来回回的，算金属吗？

另外同样的条件，就是一抗有回收，今天什么荧光都没有了，以前也出现过这情况。郁闷啊。

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 11:31

请教老师：

现在在验证Y2H的诱饵蛋白在酵母中是否能够融合表达。做了两次，都只有空载的带（所以裂蛋白方法应该没有问题）。第一次上样15ul，曝了5分钟，只有空载的条带。第二次加大上样量，1.5的胶板上样40ul，曝光了8分钟，在72kd处隐约有很细的带，但空载泳道在此地方也有条断断续续隐约的条带，所以怀疑是非特异的，不是我的目的条带。

WB的条件是转膜100V 65min，5%脱脂奶粉封闭，一抗（myc-tag）1：1000，二抗1：10000。

下次准备提高下一抗稀释比例，再做看看。您觉得是WB的问题还是此基因在酵母中表达就不是很好，已经裂过三次蛋白了，每次表达量都不是很好。

谢谢`

作者: nn255 时间: 2013-3-15 11:38

老师您好

我的蛋白分子量是130KD，我要是用350mA湿转，要转多长时间呢

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:41

你好，最近做磷酸化的NF-KbP65，显出来的带不清楚，但还可以，而且就是maker那一边总是特别黑，导致空白都看不到，怎么回事？谢谢楼主的回答啊。

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1、marker的蛋白中，有磷酸化的NF-KbP65能识别的表位

2、下次做的时候把marker与样品间空一泳道，用1×loading

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:42

也就是说最好将膜剪开，分别孵育一抗，二抗吗？

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这样做可以，需要确保剪的没问题

也可以做完第一个蛋白后，用stripping洗后再做第二个蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:43

我们构建了一个定位载体，就是将基因和GFP融合，然后用烟草瞬时表达系统表达，后来用共聚焦显微镜观察，初步认为是胞间蛋白。另外，我们还构建了表达载体，带有6个HIS标签，western blot 时，我用一抗是HIS 抗体，二抗是辣根过氧化酶。western blot 的体系应该没有问题

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在确定你的WB体系没问题的情况下考虑His一抗，His一抗有些只能识别原核的

所以你可以订一支不同的一抗试用

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:44

把膜用TBST或者PBST洗后

再加ECL

ECL淬灭快的话：注意封闭液是否时间过长、抗体是否回收使用、膜是否碰到金属物质

ecl前有TBST洗的，封闭用了5%牛奶一小时，抗体是新配的，膜每次都是夹子从封闭袋里来来回回的，算金属吗？

另外同样的条件，就是一抗有回收，今天什么荧光都没有了，以前也出现过这情况。郁闷啊。

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问题应该就是回收一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-15 11:45

请教老师：

现在在验证Y2H的诱饵蛋白在酵母中是否能够融合表达。做了两次，都只有空载的带（所以裂蛋白方法应该没有问题）。第一次上样15ul，曝了5分钟，只有空载的条带。第二次加大上样量，1.5的胶板上样40ul，曝光了8分钟，在72kd处隐约有很细的带，但空载泳道在此地方也有条断断续续隐约的条带，所以怀疑是非特异的，不是我的目的条带。

WB的条件是转膜100V 65min，5%脱脂奶粉封闭，一抗（myc-tag）1：1000，二抗1：10000。

下次准备提高下一抗稀释比例，再做看看。您觉得是WB的问题还是此基因在酵母中表达就不是很好，已经裂过三次蛋白了，每次表达量都不是很好。

谢谢`

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先调整一抗浓度试试

有没有裂解酵母后的SDS-PAGE染色图片？

作者: memory 时间: 2013-3-15 11:46

谢谢您的回复，今天又跑了一次磷酸化的NF-kbp65，条带很浅，等定影时又没了，今天用TBST洗了三遍，没有什么背景，一抗过夜，二抗五十五分钟，我们是半干转，膜面积乘2除一千，恒流跑，跑了大概四十五分钟，唉，比较纠结。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:37

谢谢您的回复，今天又跑了一次磷酸化的NF-kbp65，条带很浅，等定影时又没了，今天用TBST洗了三遍，没有什么背景，一抗过夜，二抗五十五分钟，我们是半干转，膜面积乘2除一千，恒流跑，跑了大概四十五分钟，唉，比较纠结。

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定影时又没有是啥意思？

荧光淬灭？

作者: memory 时间: 2013-3-15 12:38

一开始有条带，感觉太浅，就让他多显了会，然后条带就不见了，压了是十一分钟的片。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:39

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一开始有条带，感觉太浅，就让他多显了会，然后条带就不见了，压了是十一分钟的片。

不是吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:39

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原帖由 NBA 于 2013-3-15 12:39 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不是吧

是的，看了您以前的回答，会不会是因为我把ECL吸的太干的原因，这次比往常吸的要狠一点，显完影后，打开保鲜膜后很快就变干了。还有cocktail里有磷酸酶抑制剂什么的吗？Roche公司的规格是什么啊》多少钱。最近一阵总是什么也做不出来，觉得是提取样品或许也有问题，我们用的是碧云天的裂解液，按他的提示只是加了PMSF，没有加其他的裂解液。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:40

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是的，看了您以前的回答，会不会是因为我把ECL吸的太干的原因，这次比往常吸的要狠一点，显完影后，打开保鲜膜后很快就变干了。还有cocktail里有磷酸酶抑制剂什么的吗？Roche公司的规格是什么啊》多少钱。最近一阵总是什么也做 ...

显完影？

是曝光吧

roche的有蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂

一个完整包装价格在两千左右吧

作者: langlang 时间: 2013-3-15 12:41

老师，你好，我刚做WB不久，现在做了内参都可以出来，但目的蛋白出不来，我做的蛋白是在核表达的，提取蛋白的时候，10cm的长满细胞的培养皿我只加了150ul的裂解液去提取蛋白，这样裂解液会不会太少了，导致核蛋白无法提取出来的问题？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:42

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老师，你好，我刚做WB不久，现在做了内参都可以出来，但目的蛋白出不来，我做的蛋白是在核表达的，提取蛋白的时候，10cm的长满细胞的培养皿我只加了150ul的裂解液去提取蛋白，这样裂解液会不会太少了，导致核蛋白无法提取出来的问题？ ...

目的蛋白是什么？10cm直径培养皿加300ul裂解液比较合适

另外可以把细胞消化后，收集到ep管再进行蛋白抽提

作者: tuuu2 时间: 2013-3-15 12:42

我的western中有一个指标是细胞膜蛋白，大小是67KD，不知道该用什么做内参，恳请指教啊，最好还能提供内参抗体的厂家

作者: lixi559 时间: 2013-3-15 12:48

您好，新手，问题比较多，我想问下就是我们以前做WB上样量是40，用的是国外的Amersham ECL Plus? Western Blotting Detection Reagents的发光液，那时不管怎样，都可以做出来。现在换了普利莱的做不出来了，别的实验室也有做跟我们差不多的，但用普利莱的也能做出来，我们的默，曝光以后，什么也没有或者，条带特别模糊，但是曝光完后的膜在保鲜膜风干后就能看见条带，您认为这是怎么回事？用过TMB染膜，也可以看到条带，所以，我想知道是不是ECL的问题？谢谢您了。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 12:49

您好，新手，问题比较多，我想问下就是我们以前做WB上样量是40，用的是国外的Amersham ECL Plus? Western Blotting Detection Reagents的发光液，那时不管怎样，都可以做出来。现在换了普利莱的做不出来了，别的实验室也有做跟我们差不多的，但用普利莱的也能做出来，我们的默，曝光以后，什么也没有或者，条带特别模糊，但是曝光完后的膜在保鲜膜风干后就能看见条带，您认为这是怎么回事？用过TMB染膜，也可以看到条带，所以，我想知道是不是ECL的问题？谢谢您了。

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ECL

作者: is2011 时间: 2013-3-15 12:50

好，新手，检测hTERT蛋白，137kD。为了摸索western blot 条件。我选取了HELA细胞，HEK细胞，HL-60 作为阳性细胞。有文献报导证实的。

前面三次我的分离胶浓度为12.5%，1.5mA/每平方厘米；转膜时间1.5小时，转膜后胶上仍可见少量蛋白，但是mark已经转的可以了；一抗1：200

二抗1:4000

ECL曝光结果基本没有条带。

后来分离胶改为 7% ，2.5mA/每平方厘米转膜，时间2小时。mark就转的很漂亮了。结果出现四条条带，杂蛋白比目的蛋白还明显。但总体来说带条还是很淡的。

到底是我哪里出问题了啊。还有问题的关键是我测了PROTEIN a,和BMI-1 也是基本没有结果，是***作流程有什么问题吗

作者: bamboo16 时间: 2013-3-15 12:56

老师您好！

我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜，一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的，但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去，用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压，10分钟就转过了，因为预染marker已经转到最下层滤纸上了。请问该怎么处理

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:36

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原帖由 bamboo16 于 2013-3-15 12:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

老师您好！

我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜，一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的，但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去，用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压，10分钟就转过了，因为预染marker已 ...

你们买的是PVDF膜吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:36

您好，新手，检测hTERT蛋白，137kD。为了摸索western blot 条件。我选取了HELA细胞，HEK细胞，HL-60 作为阳性细胞。有文献报导证实的。

前面三次我的分离胶浓度为12.5%，1.5mA/每平方厘米；转膜时间1.5小时，转膜后胶上仍可见少量蛋白，但是mark已经转的可以了；一抗1：200

二抗1:4000

ECL曝光结果基本没有条带。

后来分离胶改为 7% ，2.5mA/每平方厘米转膜，时间2小时。mark就转的很漂亮了。结果出现四条条带，杂蛋白比目的蛋白还明显。但总体来说带条还是很淡的。

到底是我哪里出问题了啊。还有问题的关键是我测了PROTEIN a,和BMI-1 也是基本没有结果，是***作流程有什么问题吗

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一抗santa的？

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 14:38

老师，请您帮忙看一下这个图是怎么回事儿
附件里的两张图一个是beta-actin,一个是我的目的蛋白。上样量是80ug。问题有二：1、不知道为什么beta-actin各上样孔之间会连在一起？而同在一块胶上跑出来的目的蛋白就是分开的。我用的是恒压60V跑5%的积层胶，用90V跑12%的分离胶。也注意了在37度约30min促凝后，让胶在室温冷却约40min。我是用的在鼎国昌盛买的5*的SDS上样缓冲液，是把他终体积到1*用的。2、我是同时跑的两块完全一样的胶，两个的加样量完全一致，样品也是相同的，可我的目的蛋白两个做出来结果却不太一致，这是为什么呢？尤其是第一个问题，请老师帮忙指点一下。我也问过师姐，她们也不知道原因。

开始的时候，我的内参老是出不来，考虑之前可能是因为我ECL发光剂用的量不够。现在是出来了，背景却比较高。我们实验室用的是3%的BSA封闭，我可以用1%BSA来配β-actin的封闭液不？

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 14:38

我是说用1%的BSA来配抗体的稀释液

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 14:39

老师您好！

我现在刚开始做WB,实验室买的是NC膜，一般来说NC膜用之前不用甲醇处理的，但是我的膜不用甲醇处理而直接浸泡与缓冲液中的话就死活转不过去，用甲醇处理后伯乐半干转系统15V定压，10分钟就转过了，因为预染marker已经转到最下层滤纸上了。请问该怎么处理

预染marker已经转到最下层滤纸上了，不代表已经转过了。我们实验室是用甲醇浸泡15S，双蒸水平衡5分钟就把PVDF膜放到加有20%的转膜缓冲液中去的。我的目的蛋白是12KD的，用biorad的半干转膜仪转38min次次都可以出来很漂亮的条带，转完之后，胶上的MARKER全部没有了，就是摸上面的夜很淡。预染的marker染料会运动的更快些。43-55KD的转45分钟也很好

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 14:39

我们也是用15V恒压转膜

作者: u234 时间: 2013-3-15 14:40

最近想做western，但不知道买那个公司的试剂，望做western的高手们给我支支招，先行谢过

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 14:45

一抗santa的？

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是的，他们公司的东西有这么不好吗

作者: JK.jon 时间: 2013-3-15 14:46

您好！请问若蛋白的分子量小于20转膜需要多长时间？谢谢

作者: lgm 时间: 2013-3-15 14:47

最近在做Thy1的western blot，分子量是18kDa，跑出来的条带特别不清楚，当时转完膜后最下面的marker的两个条带都看不清，洗完后更是什么都没有了，搜索了一下说是转膜要用小孔径的，我用的是0.45um的，还有的说膜要固定一下，请各位战友指点一下啊

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-15 14:51

大哥：

请问下做SDS-PAGE一般选择哪个厂家的试剂？我最近要做这方面的实验，以前没做过，还望多多指教！谢谢

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 14:52

请教老师，我用10%的分离胶，5%的浓缩胶，预染marker10K~170K的，电泳完之后95k以上的条带分的不是很开(明显比说明书上的紧凑得多)，而我的目的条带在95k~130K之间，不知道这样会不会有影响？还有有什么办法能让marker上95k~130K之间的条带拉宽些吗？我的电泳条件是80V，2h. 谢谢

作者: jkobn 时间: 2013-3-15 14:52

请问版主，封闭液，一抗和二抗分别可以用多少次？回收后能保存多久？

作者: standbyme 时间: 2013-3-15 14:53

老师您好

压片时，把NC膜放到两层塑料膜间，合上塑料膜时原本一些发光的条带就不亮了，有时是过一会儿全都灭了，这是怎么回事？我上样量40ug，一抗1：500（之前试过上样30ug，一抗1：1000，不出现条带）二抗1：5000

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:53

老师，请您帮忙看一下这个图是怎么回事儿
附件里的两张图一个是beta-actin,一个是我的目的蛋白。上样量是80ug。问题有二：1、不知道为什么beta-actin各上样孔之间会连在一起？而同在一块胶上跑出来的目的蛋白就是分开的。我用的是恒压60V跑5%的积层胶，用90V跑12%的分离胶。也注意了在37度约30min促凝后，让胶在室温冷却约40min。我是用的在鼎国昌盛买的5*的SDS上样缓冲液，是把他终体积到1*用的。2、我是同时跑的两块完全一样的胶，两个的加样量完全一致，样品也是相同的，可我的目的蛋白两个做出来结果却不太一致，这是为什么呢？尤其是第一个问题，请老师帮忙指点一下。我也问过师姐，她们也不知道原因。

开始的时候，我的内参老是出不来，考虑之前可能是因为我ECL发光剂用的量不够。现在是出来了，背景却比较高。我们实验室用的是3%的BSA封闭，我可以用1%BSA来配β-actin的封闭液不？

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1、上样量大，因为目的与内参的含量不同

2、结果不一致的原因很多，转膜、抗体、ECL孵育等都会存在

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:54

最近想做western，但不知道买那个公司的试剂，望做western的高手们给我支支招，先行谢过

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这个有点笼统

是买但各组分试剂

还是买直接配制好可以用的成品试剂？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:55

是的，他们公司的东西有这么不好吗

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不好的几率挺大的

作者: NBA 时间: 2013-3-15 14:59

您好！请问若蛋白的分子量小于20转膜需要多长时间？谢谢

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300mA恒流，湿转，20min左右

1.2mA/平方厘米膜面积，恒流，半干，15min左右

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:00

最近在做Thy1的western blot，分子量是18kDa，跑出来的条带特别不清楚，当时转完膜后最下面的marker的两个条带都看不清，洗完后更是什么都没有了，搜索了一下说是转膜要用小孔径的，我用的是0.45um的，还有的说膜要固定一下，请各位战友指点一下啊

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用0.22um孔径的膜

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:00

请教老师，我用10%的分离胶，5%的浓缩胶，预染marker10K~170K的，电泳完之后95k以上的条带分的不是很开(明显比说明书上的紧凑得多)，而我的目的条带在95k~130K之间，不知道这样会不会有影响？还有有什么办法能让marker上95k~130K之间的条带拉宽些吗？我的电泳条件是80V，2h. 谢谢

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影响不会很大

电泳:90V，20min左右，溴酚蓝进入分离胶，调电压至150V，看marker泳动位置，合适后停止电泳

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:01

请问版主，封闭液，一抗和二抗分别可以用多少次？回收后能保存多久？

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1、BSA封闭液，我一般使用3-4次，回收再4度保存

2、一抗回收，-20度保存，很少再次使用

3、二抗，从不回收

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:02

老师您好

压片时，把NC膜放到两层塑料膜间，合上塑料膜时原本一些发光的条带就不亮了，有时是过一会儿全都灭了，这是怎么回事？我上样量40ug，一抗1：500（之前试过上样30ug，一抗1：1000，不出现条带）二抗1：5000

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把胶片直接接触到家了ECL的膜了？

作者: sunnyB 时间: 2013-3-15 15:03

老师，你好。内参tubulin半干转，伯乐半干转膜仪，0.8ma/cm2，pvdf膜，0.45um，转一个小时合适吗。我按这个做，tubulin显不出来。会是一抗二抗的问题吗。

作者: is2011 时间: 2013-3-15 15:03

最近做了几次western，配的是10%的胶，开始跑电泳时，浓缩胶用的是80V，分离胶用的是130V，但是条带跑的非常范，没有出现很漂亮的一个条带，有的过来的师兄师姐说是缓冲液不行，要重新配置。也有的说是浓缩胶用的电压太大，能否解答一下？
还有，缓冲液怎么配置，我用的是师姐她们留下来的，谢谢啦！

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 15:07

请教楼主，我的目的分子量为AQP8-27KD，用的是0.45um的PVDF膜（还是要选择0.22um的膜），浓缩胶4%，分离胶10%，转膜300mA，45分钟（丽春红染膜，未见任何蛋白条带，最后曝光也出来了另一目的p44/42），牛奶封闭2小时，TBS-T洗膜三次，每次15分钟，一抗用的是ABcam 推荐浓度为1:200-500，预实验用过1:300和1:400两个浓度，一抗孵育4°过夜，后洗膜三次，时间同上，二抗用1:2500，碧云天的，洗膜三次，最后ECL发光，目的未见条带，我的内参和另一目的都有比较条带。刚开始用的是satancruz的一抗AQP8，它的分子量是34KD,没做出来，现在换了个ABcam的抗体，还是做不出来。很是郁闷。高手帮忙解决一下。

我还想问下，

1、同一目的，不同公司的抗体，分子量也不同的吗？

2、丽春红染膜，为什么没条带，但最后出现条带？

3、我的转膜条件如何改变一下？

作者: 04906 时间: 2013-3-15 15:08

提取组织蛋白做western-blot，对于标本的采集有些什么要求，比如说时间？

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-15 15:09

老师你好，本人初学，现在用肺癌细胞系做一个较新的蛋白，目标蛋白在59kda，内参actin。上样量40ug和80ug都试过，分离胶浓度10%，80v浓缩胶，120v分离胶。用0.45um的pvdf膜，转印湿转200mA，90分钟，mark转的不错。奶粉封闭2h，抗缓1%BSA，一抗浓度abcam1:250（推荐1：1000~1:200）或scbt1：200（推荐1：1000~1:100），四度过夜。中杉金桥二抗1:5000，2h。每次洗膜均为tbst15min*2+tbs15min。发光液是普利莱，压30min，目标蛋白发的很不理想，浅的几乎没有的黑影，完全无法确定是不是条带，内参发的不错。请老师给点建议，不甚感激！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:11

请教楼主，我的目的分子量为AQP8-27KD，用的是0.45um的PVDF膜（还是要选择0.22um的膜），浓缩胶4%，分离胶10%，转膜300mA，45分钟（丽春红染膜，未见任何蛋白条带，最后曝光也出来了另一目的p44/42），牛奶封闭2小时，TBS-T洗膜三次，每次15分钟，一抗用的是ABcam 推荐浓度为1:200-500，预实验用过1:300和1:400两个浓度，一抗孵育4°过夜，后洗膜三次，时间同上，二抗用1:2500，碧云天的，洗膜三次，最后ECL发光，目的未见条带，我的内参和另一目的都有比较条带。刚开始用的是satancruz的一抗AQP8，它的分子量是34KD,没做出来，现在换了个ABcam的抗体，还是做不出来。很是郁闷。高手帮忙解决一下。

我还想问下，

1、同一目的，不同公司的抗体，分子量也不同的吗？

2、丽春红染膜，为什么没条带，但最后出现条带？

3、我的转膜条件如何改变一下？

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1、用哪里的蛋白抽提试剂？

2、两种孔径膜都可以用

3、分离胶用12%的

4、分子量问题由不同公司自己决定，不要在分子量上纠结，出来结果大致相同就行

5、转膜条件，300mA 恒流， 30min

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:12

提取组织蛋白做western-blot，对于标本的采集有些什么要求，比如说时间？

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具体的你可以看我个人资料中的qq号，可以详细聊

标本采集后用-80或者液氮保存

采集的组织需要把血液用预冷PBS或者生理盐水清洗干净，之后冻存就行

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:13

老师你好，本人初学，现在用肺癌细胞系做一个较新的蛋白，目标蛋白在59kda，内参actin。上样量40ug和80ug都试过，分离胶浓度10%，80v浓缩胶，120v分离胶。用0.45um的pvdf膜，转印湿转200mA，90分钟，mark转的不错。奶粉封闭2h，抗缓1%BSA，一抗浓度abcam1:250（推荐1：1000~1:200）或scbt1：200（推荐1：1000~1:100），四度过夜。中杉金桥二抗1:5000，2h。每次洗膜均为tbst15min*2+tbs15min。发光液是普利莱，压30min，目标蛋白发的很不理想，浅的几乎没有的黑影，完全无法确定是不是条带，内参发的不错。请老师给点建议，不甚感激！

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蛋白如何提取的/

作者: mimili_901 时间: 2013-3-15 15:14

转膜后用丽春红染色没？

先检测转膜效果

再检测后续的一抗、二抗检测效果

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今天用半干转13V，50min做了一下，tubulin内参出来了，不过没有想象中的强，听师兄师姐说细胞中含量很高，不过在显色时肉眼勉强能看到，比我目的蛋白的亮度小很多。最后曝的底片上还有非特异性条带。造成这种情况回事因为tubulin一抗浓度偏小，二抗浓度偏大吗？

作者: nut6694 时间: 2013-3-15 15:14

看到楼主的答复很高兴，真的很热情。佩服。

我买的是避云天的增强型RIPA和PMSF蛋白提取试剂。真的很着急现在，因为做了快4个月了，竟然什么结果都没有。谢谢楼主的帮忙。

作者: wood533 时间: 2013-3-15 15:15

老师，您好，我初学WB。我做的大鼠组织的蛋白，加样量120ug，大概20-30ul左右，目的蛋白分子量22、 65，用80V、120V跑胶，250A 90分钟湿转，5%脱脂牛奶加TBST封闭2h，一抗invitrogen的，1:80稀释（已经是最大的稀释量了），4°过夜，洗5min×3次，二抗1小时，洗15min×3次，曝光后蛋白泳道很明显，目的蛋白有缺失，而且比较淡，（有的泳道有，有的没有），内参（tubnlin、action都试过），偶有能爆出一个条带。

请问是什么原因，是不是上样量太大，蛋白提取的有杂质，才会出现泳道很清晰，但是我上样量减低的话，又没有条带出现。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:16

今天用半干转13V，50min做了一下，tubulin内参出来了，不过没有想象中的强，听师兄师姐说细胞中含量很高，不过在显色时肉眼勉强能看到，比我目的蛋白的亮度小很多。最后曝的底片上还有非特异性条带。造成这种情况回事因为tubulin一抗浓度偏小，二抗浓度偏大吗？

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显色条带的强弱与：抗原含量，抗体特异性，ECL敏感性，显影时间长短等有关

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:17

看到楼主的答复很高兴，真的很热情。佩服。

我买的是避云天的增强型RIPA和PMSF蛋白提取试剂。真的很着急现在，因为做了快4个月了，竟然什么结果都没有。谢谢楼主的帮忙。

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AQP4我做过，我们自己也制备有小鼠单抗

当时做AQP4的时候，用的是Millipore的抗体，效果很好，也容易做

AQP8应该也是与AQP4同家族的蛋白吧？

一抗做过不同的稀释度吗？内参做的如何？WB系统有没有什么问题？

裂解液的情况不太好说，我是用我们自己配制的产品提取蛋白的

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:17

老师，您好，我初学WB。我做的大鼠组织的蛋白，加样量120ug，大概20-30ul左右，目的蛋白分子量22、 65，用80V、120V跑胶，250A 90分钟湿转，5%脱脂牛奶加TBST封闭2h，一抗invitrogen的，1:80稀释（已经是最大的稀释量了），4°过夜，洗5min×3次，二抗1小时，洗15min×3次，曝光后蛋白泳道很明显，目的蛋白有缺失，而且比较淡，（有的泳道有，有的没有），内参（tubnlin、action都试过），偶有能爆出一个条带。

请问是什么原因，是不是上样量太大，蛋白提取的有杂质，才会出现泳道很清晰，但是我上样量减低的话，又没有条带出现。谢谢！

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样品SDS-PAGE后进行过染胶吗？

作者: am10 时间: 2013-3-15 15:18

AQP4我做过，我们自己也制备有小鼠单抗

当时做AQP4的时候，用的是Millipore的抗体，效果很好，也容易做

AQP8应该也是与AQP4同家族的蛋白吧？

一抗做过不同的稀释度吗？内参做的如何？WB系统有没有什么问题？

裂解液的情况不太好说，我是用我们自己配制的产品提取蛋白的

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AQP8和AQP4是同一个种族不同的亚型。前三个月用的是santcruz的抗体，我师姐也是这个公司的AQP3抗体，结果做了好几个月，也没做出来，跟导师说抗体可能有问题，但是导师一直都很相信这个公司的抗体，就没想过要换抗体，后来我师姐自己买了个博士得的国产抗体，出人意料的是居然很容易就做出来了，可是这个公司没有我的AQP8,后来导师建议我换抗体，于是选择了ABcam的抗体，它的推荐浓度是1：200-1：500（鼠抗人），我做过1：300 1：400两种稀释度，二抗推荐用1：2500山羊抗鼠（碧云天的），结果都没出来，我的内参tublin和P44 42是同时做的（同一张膜孵育的），每次都有。不知道为什么我的AQP8 27kd就是没有。现在真的很纠结，不知如何是好，整天重复同样的实验，都没有结果。

作者: H2O 时间: 2013-3-15 15:19

样品SDS-PAGE后进行过染胶吗？

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染过，胶上的泳道也很清晰，可以在泳道之间看见蛋白条带，但同样有缺失，跟曝光之后的X片效果差不多。还有就是我的内参始终爆不出来，请教。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:20

染过，胶上的泳道也很清晰，可以在泳道之间看见蛋白条带，但同样有缺失，跟曝光之后的X片效果差不多。还有就是我的内参始终爆不出来，请教。

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先把电泳跑好

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:23

AQP8和AQP4是同一个种族不同的亚型。前三个月用的是santcruz的抗体，我师姐也是这个公司的AQP3抗体，结果做了好几个月，也没做出来，跟导师说抗体可能有问题，但是导师一直都很相信这个公司的抗体，就没想过要换抗体，后来我师姐自己买了个博士得的国产抗体，出人意料的是居然很容易就做出来了，可是这个公司没有我的AQP8,后来导师建议我换抗体，于是选择了ABcam的抗体，它的推荐浓度是1：200-1：500（鼠抗人），我做过1：300 1：400两种稀释度，二抗推荐用1：2500山羊抗鼠（碧云天的），结果都没出来，我的内参tublin和P44 42是同时做的（同一张膜孵育的），每次都有。不知道为什么我的AQP8 27kd就是没有。现在真的很纠结，不知如何是好，整天重复同样的实验，都没有结果。

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可能裂解液效果不好？

或者ECL检测敏感性不够？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-15 15:24

您好！想请教您一个问题，我做的是小鼠组织的蛋白，目的蛋白预测是43KD，5%牛奶封闭液室温封闭5h，一抗是自制的多抗，4度过夜。最后显色，杂带太多，而我使用的marker没有43这条，只有36 、55，无法分辨那条是我要的。请问有什么方法可以改善一下杂带多的问题？谢谢！

作者: greenbee 时间: 2013-3-15 15:25

我要做的是11kDa 的小分子蛋白，蛋白Marker最小是10kDa，20%浓度跑胶，半干法转膜20V恒压，转30min，但是总也做不出条带，请问是怎么回事啊？谢谢~

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 15:26

先把电泳跑好

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请问是不是组织的蛋白杂质太多呢，我把我取的蛋白上清又反复离心了几次，结果每次离心都能有沉淀析出来，请问还需要再离心吗？

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 15:26

您好！想请教您一个问题，我做的是小鼠组织的蛋白，目的蛋白预测是43KD，5%牛奶封闭液室温封闭5h，一抗是自制的多抗，4度过夜。最后显色，杂带太多，而我使用的marker没有43这条，只有36 、55，无法分辨那条是我要的。请问有什么方法可以改善一下杂带多的问题？谢谢！

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先调整一抗的稀释度，多试几个

封闭不需要这么长时间把

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 15:28

我要做的是11kDa 的小分子蛋白，蛋白Marker最小是10kDa，20%浓度跑胶，半干法转膜20V恒压，转30min，但是总也做不出条带，请问是怎么回事啊？谢谢~

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20%分离胶跑胶？

不是吧

配胶的丙烯酰胺储液浓度是多少的？

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 15:28

请问是不是组织的蛋白杂质太多呢，我把我取的蛋白上清又反复离心了几次，结果每次离心都能有沉淀析出来，请问还需要再离心吗？

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组织容易有脂肪

如果上清最上层有浮着的脂类

需要吸取上清后，再次离心

且提取的组织蛋白不能再-20度冻存，融化后会有沉淀

作者: INK 时间: 2013-3-15 15:29

我是新手，没有做过western，这两天在看做western的资料，我买的是GENSCRIPT ONE HOUR WESTERN KIT。但是我不知道做western前，对提蛋白的要求是什么？就是怎么准备用于做western的蛋白。我有两种蛋白，一个是胞质蛋白，一个是胞膜蛋白。提蛋白是不是用试剂盒？然后提取的蛋白还要怎么样处理才能用来做western呢？什么是调等浓度啊？蛋白质测了OD值，怎么根据OD值算呢？由于没有做过，所以很多不知道。对园子里的好多帖子也看不懂。好多试剂也不知道是干什么用的。谢谢楼主指点一下。

作者: vivian4123 时间: 2013-3-15 15:31

组织容易有脂肪

如果上清最上层有浮着的脂类

需要吸取上清后，再次离心

且提取的组织蛋白不能再-20度冻存，融化后会有沉淀

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谢谢，但是请问如果我放4度保存，对蛋白的本身会不会有影响，如果我放-20冻存的话，每次上样前都离心一次可以吗？谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-15 15:32

你好，

我的WB做出来之后，目的蛋白的大小不太准。本来是26kD的蛋白，但却在34kd（Marker）以上的部分有比较重的带子，在26kD处有非常模糊的带子，几乎看不到但在曝光时间长的时候能看出痕量的带子。不知哪条是我的目的带子？

另外还有一事不明白，就是同样的一分子，不同公司的抗体却显示的大小不一样是什么原因？按理说蛋白大小在跑胶时确定的，跟抗体有什么关系呢？？？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-15 15:33

想知道内参选择的依据是什么？

GAPDH 和ACTIN的区别？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:33

谢谢，但是请问如果我放4度保存，对蛋白的本身会不会有影响，如果我放-20冻存的话，每次上样前都离心一次可以吗？谢谢！

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样品放四度保存？没搞错吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:34

想知道内参选择的依据是什么？

GAPDH 和ACTIN的区别？

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目前好像没有特别的依据

错开与目的蛋白的分子量

在有些处理条件下内参容易有变化，这时候需要选择内参

做肌肉组织的话，actin就不好

作者: ququer787 时间: 2013-3-15 15:34

最近烦扰我很长时间的一个问题，想请教一下LZ老师。

这段时间actin一直做的很差，而目的蛋白却还可以，不知是何原因！每次actin显出的条带都像一条弥散的棍状带（也不直），不能辨认明显的泳道，且条带弥散模糊，有点乱哄哄的不成样子，根本无法用。但目的条带较好，泳道清楚，条带较直。

1.很早之前用同样的条件做出来的actin条带很好，actin用完后重新购买了同货号的actin，条件没变再做便出现这种情况；

2.已更换过别人的actin（别人做的均较好），仍然没有改善，看来不是抗体的问题；

3.一抗浓度由原来的1：1000更换为1：2000，也未见明显改善。

不知是胶（也是用的以前的配方）有问题还是电泳的问题，为何单单actin不好，目的蛋白没事？十分苦恼，恳请LZ老师帮忙分析一下原因，提出解决办法，谢谢

作者: ququer787 时间: 2013-3-15 15:35

您好：

我做的分子量在300kd，属于大分子。1做western blot 是条件如何控制，比如说电压，浓缩胶与分离胶的配法？2 用硝酸纤维膜好还是PVDF膜好？谢谢。

作者: okhaha 时间: 2013-3-15 15:36

老师，您好！

我们实验室这几天刚买了DYCP-40C电泳槽，我在网上看了很多帖子，大家有说稳流也有说稳压的。

按照这台机器的使用说明2mA/cm2我使用30cm2左右的滤纸做（比胶和膜稍小，应该不存在短路）转移41Kd的I-κB，

稳流60mA，80min，但接通电源后电压一直升，到了100V，打开壳子第一张滤纸有点黄有些干，这样没问题么？

希望您能给我点建议，谢谢！

作者: okhaha 时间: 2013-3-15 15:37

我想请教：我做的是细胞的WB ,蛋白提取用RIPA,加磷酸酶抑制剂。通过pirce BCA法蛋白定量后，加入5X的上样缓冲液，PCR仪煮5分钟。根据定量结果，每孔上样20μg。问题1：以前做WB,有条带，现在什么都没有了。抗体稀释度没变。问题2：是否发光时，能看到发亮的条带为好？看不到发光如何掌握？曾试过压片时间延长，有时30分钟，仍什么也没有。问题3：为何发光淬灭的很快？10几秒就没有了，压片延长也没用。因可能是二抗太浓（1:5000），稀释（1:10000）后根本就看不到发光了。问题4：同样的蛋白提取和上样量，为何总测不到α-SMA,和Col1A2（I型胶原）？没有任何条带，已反复多次仍无效。两者的一抗均为ABcam。α-SMA稀释度1:500，Col1A2稀释度1:1000.

作者: okhaha 时间: 2013-3-15 15:37

我用10%的胶，浓缩80V,分离120V,电转250mA,1.5h.α-SMA43KD,Col1A2129Kd.

作者: IAM007 时间: 2013-3-15 15:38

楼主你好，我这两天的SDS-PAGE电泳总是不尽如人意，因为前面的预实验是在别人实验室里，试剂也是那边的，我自己配过之后出现了几个问题，麻烦您帮忙看下，不胜感激！

1.我的marker是预染的，本来是该6条带，分别是108,90,50,36,27,20kD，但是我用15%和10% 的SDS都只能跑出5条，不知道那条缺失了，而且距离很近，跑一段距离再跑的时候，marker不再动了。我的试剂是按照网上查的一个方法配制的，这个情况是什么地方出了问题呢？

2.染色的时候，胶会缩小变成不透明的白色，但是换了脱色液就会恢复。。。这是什么原因？

3.我的胶是这样的，蛋白跑出来没有明显的条带，就像一个大圆点，是加样量多了还是别的？

图片附件: 93380646.jpg (2013-3-15 15:38, 48.49 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15177

作者: kuaizige 时间: 2013-3-15 15:39

晓夜124 wrote:
楼主你好，我这两天的SDS-PAGE电泳总是不尽如人意，因为前面的预实验是在别人实验室里，试剂也是那边的，我自己配过之后出现了几个问题，麻烦您帮忙看下，不胜感激！

1.我的marker是预染的，本来是该6条带，分别是108,90,50,36,27,20kD，但是我用15%和10% 的SDS都只能跑出5条，不知道那条缺失了，而且距离很近，跑一段距离再跑的时候，marker不再动了。我的试剂是按照网上查的一个方法配制的，这个情况是什么地方出了问题呢？

2.染色的时候，胶会缩小变成不透明的白色，但是换了脱色液就会恢复。。。这是什么原因？

3.我的胶是这样的，蛋白跑出来没有明显的条带，就像一个大圆点，是加样量多了还是别的？

麻烦您了~~~

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1、MARKER是否全跑出来，这个不重要，只要那条能标记出你目的蛋白量位置的MARKER出来就行

2、我没有用过染色，无法回答你

3、一般浓缩的时候没有压成一条直线，会出现那样的现象

作者: kuaizige 时间: 2013-3-15 15:40

我想请教：我做的是细胞的WB ,蛋白提取用RIPA,加磷酸酶抑制剂。通过pirce BCA法蛋白定量后，加入5X的上样缓冲液，PCR仪煮5分钟。根据定量结果，每孔上样20μg。问题1：以前做WB,有条带，现在什么都没有了。抗体稀释度没变。问题2：是否发光时，能看到发亮的条带为好？看不到发光如何掌握？曾试过压片时间延长，有时30分钟，仍什么也没有。问题3：为何发光淬灭的很快？10几秒就没有了，压片延长也没用。因可能是二抗太浓（1:5000），稀释（1:10000）后根本就看不到发光了。问题4：同样的蛋白提取和上样量，为何总测不到α-SMA,和Col1A2（I型胶原）？没有任何条带，已反复多次仍无效。两者的一抗均为ABcam。α-SMA稀释度1:500，Col1A2稀释度1:1000.

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1、每次定量的结果准确度不一定一样，20ug不行，你可以上到40ug

2、如果能看到亮光当然很好，看不到亮光的话，一般1分钟、5分钟、10分钟，再根据条带和背景情况，相应的提前或者延后

3、没遇到过这种情况

4、ABCam的，我用过1：100，你可以试试

作者: kuaizige 时间: 2013-3-15 15:41

先调整一抗的稀释度，多试几个

封闭不需要这么长时间把

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嗯首先谢谢楼主的回复，想再问下楼主，相比于室温封闭一小时（或长于一小时）、一抗4度过夜，封闭4度过夜，一抗37度一小时能不能改善背景高条带杂的问题？再次感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:42

老师，您好！

我们实验室这几天刚买了DYCP-40C电泳槽，我在网上看了很多帖子，大家有说稳流也有说稳压的。

按照这台机器的使用说明2mA/cm2我使用30cm2左右的滤纸做（比胶和膜稍小，应该不存在短路）转移41Kd的I-κB，

稳流60mA，80min，但接通电源后电压一直升，到了100V，打开壳子第一张滤纸有点黄有些干，这样没问题么？

希望您能给我点建议，谢谢！

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半干转？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:42

我想请教：我做的是细胞的WB ,蛋白提取用RIPA,加磷酸酶抑制剂。通过pirce BCA法蛋白定量后，加入5X的上样缓冲液，PCR仪煮5分钟。根据定量结果，每孔上样20μg。问题1：以前做WB,有条带，现在什么都没有了。抗体稀释度没变。问题2：是否发光时，能看到发亮的条带为好？看不到发光如何掌握？曾试过压片时间延长，有时30分钟，仍什么也没有。问题3：为何发光淬灭的很快？10几秒就没有了，压片延长也没用。因可能是二抗太浓（1:5000），稀释（1:10000）后根本就看不到发光了。问题4：同样的蛋白提取和上样量，为何总测不到α-SMA,和Col1A2（I型胶原）？没有任何条带，已反复多次仍无效。两者的一抗均为ABcam。α-SMA稀释度1:500，Col1A2稀释度1:1000.

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1、做什么蛋白以前有，现在没有条带？中间不同的步骤及试剂应该有吧，需要注意

2、有些蛋白表达量低，不是说一定要看到发亮的条带才行，如果看不到，第一张先压片1min，然后再调整

3、如果说发生淬灭：封闭液、抗体稀释液等要换成新的，这些缓冲液可能有污染，另外二抗浓度高也会造成

4、collagen 这个要注意，看说明书是检测reducing还是non-reducing

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:44

楼主你好，我这两天的SDS-PAGE电泳总是不尽如人意，因为前面的预实验是在别人实验室里，试剂也是那边的，我自己配过之后出现了几个问题，麻烦您帮忙看下，不胜感激！

1.我的marker是预染的，本来是该6条带，分别是108,90,50,36,27,20kD，但是我用15%和10% 的SDS都只能跑出5条，不知道那条缺失了，而且距离很近，跑一段距离再跑的时候，marker不再动了。我的试剂是按照网上查的一个方法配制的，这个情况是什么地方出了问题呢？

2.染色的时候，胶会缩小变成不透明的白色，但是换了脱色液就会恢复。。。这是什么原因？

3.我的胶是这样的，蛋白跑出来没有明显的条带，就像一个大圆点，是加样量多了还是别的？

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1、缺失的一般是20K的

2、从你的胶图来看，胶有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:45

嗯首先谢谢楼主的回复，想再问下楼主，相比于室温封闭一小时（或长于一小时）、一抗4度过夜，封闭4度过夜，一抗37度一小时能不能改善背景高条带杂的问题？再次感谢！

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主要对于抗体来说，有些是抗血清，一抗就不能孵育过夜

作者: 8princess8 时间: 2013-3-15 15:47

我湿转43kd的蛋白，请问电流和时间是多少？20-30kd的呢？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:48

我湿转43kd的蛋白，请问电流和时间是多少？20-30kd的呢？非常感谢！

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300mA，恒流 40min,43K

300mA，恒流 30min，20-30K

作者: 49888 时间: 2013-3-15 15:49

主要对于抗体来说，有些是抗血清，一抗就不能孵育过夜

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谢谢楼主，我用的目的蛋白的一抗就是抗血清，请问为什么抗血清不能孵育过夜呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 15:51

谢谢楼主，我用的目的蛋白的一抗就是抗血清，请问为什么抗血清不能孵育过夜呢？

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抗血清中各种成分太复杂，孵育时间长容易有背景

作者: qhyu 时间: 2013-3-15 15:52

最近烦扰我很长时间的一个问题，想请教一下LZ老师。

这段时间actin一直做的很差，而目的蛋白却还可以，不知是何原因！每次actin显出的条带都像一条弥散的棍状带（也不直），不能辨认明显的泳道，且条带弥散模糊，有点乱哄哄的不成样子，根本无法用。但目的条带较好，泳道清楚，条带较直。

1.很早之前用同样的条件做出来的actin条带很好，actin用完后重新购买了同货号的actin，条件没变再做便出现这种情况；

2.已更换过别人的actin（别人做的均较好），仍然没有改善，看来不是抗体的问题；

3.一抗浓度由原来的1：1000更换为1：2000，也未见明显改善。

不知是胶（也是用的以前的配方）有问题还是电泳的问题，为何单单actin不好，目的蛋白没事？十分苦恼，恳请LZ老师帮忙分析一下原因，提出解决办法，谢谢

作者: october7 时间: 2013-3-15 15:53

抗血清中各种成分太复杂，孵育时间长容易有背景

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谢谢您给予的解答，我改变一抗孵育时间试试

作者: kswl870 时间: 2013-3-15 15:54

楼主您好！我想做一个分子量20KD左右的蛋白的WB，转膜条件不知道应该是什么样的，您能给一些建议不？

作者: kswl870 时间: 2013-3-15 15:55

我用的是Biorad的小型迷你垂直电泳槽

作者: xyw5 时间: 2013-3-15 15:56

谢谢您！请问楼主，半干转的43kd和20-30kd的电流和时间条件是多少啊？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-15 15:57

您好，我也是个新手，最近在做一个细胞蛋白，他的表达量非常稀少，每次我们做的阳性对照都可以出现条带，但是目的蛋白显不出来，还有国产的一抗和二抗与国外的相比差别大吗？会非常影响结果吗？我坐的目的蛋白分子量41kd 上样量50微克，转膜时间定在40分钟，但是一直都出不来条带，还有一抗浓度1:400.二抗是0.2:500 ，您能帮我分析分析原因么？谢谢你

作者: pengke1983 时间: 2013-3-15 15:59

楼主您好！俺又有问题向您请教了。我做的是小鼠各组织的蛋白（主要有心肝脾肺肾脑肌肉骨髓），请问我应该选哪种内参比较合适？

我之前用过a-tubulin b-actin，有一次我将同一张膜剪开分开孵tubulin和actin，结果我发现它们显示的条带的强弱有所不同，比如说 tubulin的条带是心的较其他组织亮，而actin 就是骨髓的条带比其他亮，所以我不知道该用哪个内参比较好。

另，我的目的蛋白是43kd.如果能在一张膜上分别做目的和内参就好了。等待回答，不胜感激！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:02

楼主您好！我想做一个分子量20KD左右的蛋白的WB，转膜条件不知道应该是什么样的，您能给一些建议不？

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湿转还是半干转？

湿转：300mA 恒流，20min

半干转：1.2mA/平方厘米膜面积，20min

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:03

谢谢您！请问楼主，半干转的43kd和20-30kd的电流和时间条件是多少啊？

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半干：1.2mA/平方厘米膜面积，恒流，30min

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:03

您好，我也是个新手，最近在做一个细胞蛋白，他的表达量非常稀少，每次我们做的阳性对照都可以出现条带，但是目的蛋白显不出来，还有国产的一抗和二抗与国外的相比差别大吗？会非常影响结果吗？我坐的目的蛋白分子量41kd 上样量50微克，转膜时间定在40分钟，但是一直都出不来条带，还有一抗浓度1:400.二抗是0.2:500 ，您能帮我分析分析原因么？谢谢你

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阳性对照是什么样品？同步提取的蛋白？还是纯蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:03

楼主您好！俺又有问题向您请教了。我做的是小鼠各组织的蛋白（主要有心肝脾肺肾脑肌肉骨髓），请问我应该选哪种内参比较合适？

我之前用过a-tubulin b-actin，有一次我将同一张膜剪开分开孵tubulin和actin，结果我发现它们显示的条带的强弱有所不同，比如说 tubulin的条带是心的较其他组织亮，而actin 就是骨髓的条带比其他亮，所以我不知道该用哪个内参比较好。

另，我的目的蛋白是43kd.如果能在一张膜上分别做目的和内参就好了。等待回答，不胜感激！

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肌肉不能用beta actin

组织因为有血液的影响，内参不容易调整齐

作者: summerxx 时间: 2013-3-15 16:05

肌肉不能用beta actin

组织因为有血液的影响，内参不容易调整齐

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楼主英明啊内参老调不齐特别是最近我才发现tubulin 和actin还不一致，不知道该选哪种内参，gapdh我还没试过

作者: summerxx 时间: 2013-3-15 16:07

另，目的蛋白43kD,用tubulin .acin,gapdh做内参，湿转条件是什么？之前我一直80v恒压，2h

作者: wood533 时间: 2013-3-15 16:08

请问高手：

我在电转移时总是发现边缘电泳条带的专业效率高于中间

这是什么原因？怎样解决啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:10

楼主英明啊内参老调不齐特别是最近我才发现tubulin 和actin还不一致，不知道该选哪种内参，gapdh我还没试过

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肌组织建议用GAPDH

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:11

另，目的蛋白43kD,用tubulin .acin,gapdh做内参，湿转条件是什么？之前我一直80v恒压，2h

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湿转恒流，300mA，50min

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:11

请问高手：

我在电转移时总是发现边缘电泳条带的专业效率高于中间

这是什么原因？怎样解决啊？

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确保海绵、滤纸夹紧了

作者: bring 时间: 2013-3-15 16:12

有个问题想请教楼主：

我的目的蛋白是220Kd，显影后在marker的130Kd位置出现了清晰的条带，背景很干净，我就不知道这个条带是不是我的目的蛋白条带？（一抗：1:150，二抗：1:2500）

谢谢！

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 16:12

你好，我是初次做wb，目的蛋白分子量特别小，是12kd左右，电泳和转膜的条件都没不是很明确，不知能不能给我个建议。

我的抗体是milipore的，

1 关于电泳，抗体说明书上的介绍是这样的几句话：

5-50u applied to Minigel Lane （0.75-1.5mm width）and run at standard condision.(60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h).It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h.这里面也没说浓缩胶和分离胶各自的电泳条件是多少，60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h 难道分离胶和浓缩胶都是60毫安吗？似乎是不太可能啊。后面的It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h是指什么胶呢，30mA/gel，那是不是两块胶就还是60毫安，那这两句话是不是在表述一个意思啊。

2 关于转印，说明书上的建议是半干转，（3h 100mA for two minigel gels）.100毫安转三小时是不是有点太长了？师兄们没做过这么小的蛋白的，他们平时转印的时候使用湿转。

非常感谢能为我解答上面的问题，或者给我一个建议的电泳和转印建议，小弟不胜感激！

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 16:13

我要做的是11kDa 的小分子蛋白，蛋白Marker最小是10kDa，20%浓度跑胶，半干法转膜20V恒压，转30min，但是总也做不出条带，请问是怎么回事啊？谢谢~

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你好，我现在也是在做一个小分子的蛋白，分子量是13kD，结果也不是很好。

不知你现在能做出来了吗？能不能给点建议，包括电泳的条件及转膜的条件。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:14

有个问题想请教楼主：

我的目的蛋白是220Kd，显影后在marker的130Kd位置出现了清晰的条带，背景很干净，我就不知道这个条带是不是我的目的蛋白条带？（一抗：1:150，二抗：1:2500）

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谢谢！

有可能是你的目的蛋白

看看这个蛋白不同公司对它分子量的说明

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:15

你好，我是初次做wb，目的蛋白分子量特别小，是12kd左右，电泳和转膜的条件都没不是很明确，不知能不能给我个建议。

我的抗体是milipore的，

1 关于电泳，抗体说明书上的介绍是这样的几句话：

5-50u applied to Minigel Lane （0.75-1.5mm width）and run at standard condision.(60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h).It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h.这里面也没说浓缩胶和分离胶各自的电泳条件是多少，60 mA for 2 1.5mm Minigel gels ,1.4h 难道分离胶和浓缩胶都是60毫安吗？似乎是不太可能啊。后面的It is suggested that you run 5-15% acrlamide(37.5:1) minigel(1.5mm width ) at 30mA/gel 1-1.5h是指什么胶呢，30mA/gel，那是不是两块胶就还是60毫安，那这两句话是不是在表述一个意思啊。

2 关于转印，说明书上的建议是半干转，（3h 100mA for two minigel gels）.100毫安转三小时是不是有点太长了？师兄们没做过这么小的蛋白的，他们平时转印的时候使用湿转。

非常感谢能为我解答上面的问题，或者给我一个建议的电泳和转印建议，小弟不胜感激！

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1、分离胶是梯度胶：5-15%的梯度

2、转膜条件有点过了，12K的蛋白 100mA 30min足够多了

3、用0.22um孔径的膜

作者: DNA 时间: 2013-3-15 16:16

把胶片直接接触到家了ECL的膜了？

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中间有盖一张塑料膜

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:16

中间有盖一张塑料膜

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那引起淬灭的可能是二抗浓度太高

或者膜有污染了

作者: ROSE李 时间: 2013-3-15 16:17

请问老师：

组织中提取的22分子量的蛋白，我用的250A，90min，转膜液tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇20%，一直是白板，但是内参可以爆出来，请问要怎样优化转膜条件呢？

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 16:18

你好，有个问题请教。做PARP，如果用核蛋白提取试剂盒提蛋白，需要超声处理吗？

作者: fei1226com 时间: 2013-3-15 16:20

你好不知道现在还可以提问不，最近做western很是不顺利，貌似在最开始跑胶就没有把蛋白跑下来。

我们用的是兔子主动脉提取蛋白，用的RIPA组织/细胞裂解液按照每20mg组织加200ul裂解液的比例裂解，用天根的BCA蛋白定量试剂盒定量，但是所提取蛋白的总量不高，最高只有3ug/ul，上样时按照35ul加10ul上样缓冲液的比例混合，并在沸水煮5分钟，12000转离心10分钟，上样量为30ul，开始电泳用86V电压跑至分离胶变电压至106，跑2h左右切胶。切完后我将切下的胶都用考马斯亮蓝染色后发下在最底下和溴酚蓝同一平面有一个弱弱的蛋白条带，其次就是在胶孔出有蛋白条带，其他地方基本没有条带，只有泳道。没有像明白是为什么。我们用的是10%的胶。

谢谢楼主

作者: any333 时间: 2013-3-15 16:21

我跑BMI-1蛋白跑了好多天了，结果就是不理想，我详细的把过程写一遍，请老师看看哪里有问题。

分子量37kd。

前面是人家跑的，分别是两个人在同一天跑，不同实验室，同样条件：一抗：1ug/ml，孵育过夜。封闭1%牛奶，二抗两小时。一小时。转膜1.5mA/cm2.图：

另一个人的：

然后她认为，样品浓度太大，就稀释了样品，就成这样了

作者: any333 时间: 2013-3-15 16:21

然后我接过来做了，我把转膜条件改为：2mA/cm2， 1个小时。并且用5%的牛奶封闭，一抗用1%BSA封闭。其他一样。

作者: any333 时间: 2013-3-15 16:22

因为条带非常难看，我决定把浓缩胶变宽一点，让条带变窄一点。那天做胶有点匆忙。

作者: 831226 时间: 2013-3-15 16:23

请问老师，我现在做原代培养的羊膜上皮细胞的MAPK信号转导通路，U0126 是ERK 的抑制剂，想把U0126加入到细胞中去，文献中一般用10uM U0126处理细胞，我现在买的是碧云天的U0126，它是已经用DMSO稀释为10mg/ml。我想请问的是我的U0126 如何加入到我的细胞中，是将其加到我含血清的培养基中去还是加到不含血清的培养基中。我怕血清对我的抑制剂U0126 有影响。

作者: vivian4123 时间: 2013-3-15 16:24

半干转，43kd，我用的10v，400mA，7分半（之前我们实验室的人都按这个条件做出来过）。膜上的marker条带非常清晰，是否能说明转上了？但我看的资料来说，很少有用这么短时间内转膜的。但最近几次做内参都没出结果，我担心是蛋白没转上，请老师评价一下这种短时高强度的转膜到底可不可取？

作者: ending 时间: 2013-3-15 16:24

1、分离胶是梯度胶：5-15%的梯度

2、转膜条件有点过了，12K的蛋白 100mA 30min足够多了

3、用0.22um孔径的膜

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分离胶是梯度胶？跟咱们平时的胶不一样吗？我用的是15%的分离胶

作者: qhyu 时间: 2013-3-15 16:26

个人做WB的一点心得，母液只要是新鲜配制的，不论是湿转还是半干转，把握好两个关键点：转膜时间和一抗浓度就可以了。当然国产的抗体单克隆的还凑合，国外的多克隆也分档次，对实验的影响也很大！祝大家实验顺利！！

作者: qhyu 时间: 2013-3-15 16:26

半干转，43kd，我用的10v，400mA，7分半（之前我们实验室的人都按这个条件做出来过）。膜上的marker条带非常清晰，是否能说明转上了？但我看的资料来说，很少有用这么短时间内转膜的。但最近几次做内参都没出结果，我担心是蛋白没转上，请老师评价一下这种短时高强度的转膜到底可不可取？

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43KD，半干，20V恒压，16分钟。

作者: any333 时间: 2013-3-15 16:27

楼主，俺又有问题麻烦你了，本来想附图的，结果俺结果是tif格式，不太会弄

今天用凝胶成像系统看结果，发现内参条带有些拖尾，目的蛋白就更惊人了，好像封闭的不太好，膜泛白。横着的条带没有，竖着的倒是有不少，就在孔与孔之间，跟栅栏一样，不知道问题出在哪。

作者: youyou99 时间: 2013-3-15 16:27

您好，

ECL发光后有蛋白的位置会出现黄色的条带，这是为什么呢？

麻烦老师尽快解答，很急！

作者: gogo 时间: 2013-3-15 16:28

您好，

ECL发光后有蛋白的位置会出现黄色的条带，这是为什么呢？

麻烦老师尽快解答，很急！

蛋白浓度过高。降低上样量

作者: 2541 时间: 2013-3-15 16:28

您好，

我是做western的新手，最近做一个蛋白经常出现条带相连并延伸至marker道的现象，不知道什么原因，请老师指教。蛋白大小说明书上为31KD左右

图片附件: 71652089.snap.jpg (2013-3-15 16:28, 86.86 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15179

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:29

请问老师：

组织中提取的22分子量的蛋白，我用的250A，90min，转膜液tris 3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇20%，一直是白板，但是内参可以爆出来，请问要怎样优化转膜条件呢？

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湿转的条件？

恒流 300mA，30min

目的蛋白是什么？抗体是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:29

你好，有个问题请教。做PARP，如果用核蛋白提取试剂盒提蛋白，需要超声处理吗？

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用哪个公司的试剂盒呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:30

你好不知道现在还可以提问不，最近做western很是不顺利，貌似在最开始跑胶就没有把蛋白跑下来。

我们用的是兔子主动脉提取蛋白，用的RIPA组织/细胞裂解液按照每20mg组织加200ul裂解液的比例裂解，用天根的BCA蛋白定量试剂盒定量，但是所提取蛋白的总量不高，最高只有3ug/ul，上样时按照35ul加10ul上样缓冲液的比例混合，并在沸水煮5分钟，12000转离心10分钟，上样量为30ul，开始电泳用86V电压跑至分离胶变电压至106，跑2h左右切胶。切完后我将切下的胶都用考马斯亮蓝染色后发下在最底下和溴酚蓝同一平面有一个弱弱的蛋白条带，其次就是在胶孔出有蛋白条带，其他地方基本没有条带，只有泳道。没有像明白是为什么。我们用的是10%的胶。

谢谢楼主

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先跑SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染色，看蛋白如何

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:31

where is my problem?

我跑BMI-1蛋白跑了好多天了，结果就是不理想，我详细的把过程写一遍，请老师看看哪里有问题。

分子量37kd。

前面是人家跑的，分别是两个人在同一天跑，不同实验室，同样条件：一抗：1ug/ml，孵育过夜。封闭1%牛奶，二抗两小时。一小时。转膜1.5mA/cm2.图：

另一个人的：

然后她认为，样品浓度太大，就稀释了样品，就成这样了

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一抗哪个公司的？

蛋白如何提取？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:32

请问老师，我现在做原代培养的羊膜上皮细胞的MAPK信号转导通路，U0126 是ERK 的抑制剂，想把U0126加入到细胞中去，文献中一般用10uM U0126处理细胞，我现在买的是碧云天的U0126，它是已经用DMSO稀释为10mg/ml。我想请问的是我的U0126 如何加入到我的细胞中，是将其加到我含血清的培养基中去还是加到不含血清的培养基中。我怕血清对我的抑制剂U0126 有影响。

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碧云天生产U0126？

具体怎么加到细胞培养基中我不知道呢

这个需要你查查文献，或者到细胞板求助

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:32

半干转，43kd，我用的10v，400mA，7分半（之前我们实验室的人都按这个条件做出来过）。膜上的marker条带非常清晰，是否能说明转上了？但我看的资料来说，很少有用这么短时间内转膜的。但最近几次做内参都没出结果，我担心是蛋白没转上，请老师评价一下这种短时高强度的转膜到底可不可取？

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我没试过呢

我用的是常见的转膜方法

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:33

楼主，俺又有问题麻烦你了，本来想附图的，结果俺结果是tif格式，不太会弄

今天用凝胶成像系统看结果，发现内参条带有些拖尾，目的蛋白就更惊人了，好像封闭的不太好，膜泛白。横着的条带没有，竖着的倒是有不少，就在孔与孔之间，跟栅栏一样，不知道问题出在哪。

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把tif格式用ps改成Jpeg

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:35

您好，

ECL发光后有蛋白的位置会出现黄色的条带，这是为什么呢？

麻烦老师尽快解答，很急！

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确定答案：二抗浓度太高

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:35

您好，

我是做western的新手，最近做一个蛋白经常出现条带相连并延伸至marker道的现象，不知道什么原因，请老师指教。蛋白大小说明书上为31KD左右

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用的是那个公司的marker？

35K处好像非特异性条带

作者: utt0989 时间: 2013-3-15 16:37

是Fermentas的marker

这是正常的结果

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作者: 831226 时间: 2013-3-15 16:38

斑竹您好！

我最近做western，样品为组织总蛋白，一抗是用自己的重组蛋白免疫兔子制得的，没测滴度，按1：100稀释使用，二抗为国产，1:5000。湿转，60伏2小时，0.45的PVDF膜。之前曾做成功过，但是最近做的时候总是这样：把PVDF膜放到ECL发光液上，一片荧光，而且也看不到条带，爆出的胶片一片黑，没有条带状的，请教如何改进？

作者: windy+++ 时间: 2013-3-15 16:40

楼主你好，想请教一个问题，今天WB显影结果出现和考马斯亮蓝染胶很像的结果，每条蛋白都现出来了，很多很多条带，但是有没有目的条带楼主觉得可能是什么原因呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:40

楼主你好，想请教一个问题，今天WB显影结果出现和考马斯亮蓝染胶很像的结果，每条蛋白都现出来了，很多很多条带，但是有没有目的条带楼主觉得可能是什么原因呢？

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延长封闭时间，换用单克隆抗体。

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-15 16:41

那条是tubulin 左下是actin 因为我目的比较杂（一抗是抗血清）所以用它来指示位置，右下就是我的目的了，恳请楼主帮忙分析下

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15181

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-15 16:42

老师你好，有一个问题一直困扰我很久了，我在做ERK的时候，背景总是很脏，怎么洗都洗不掉，我是10%的胶，上样40微升，转膜是0.22的PVDF膜100伏100分钟，封闭是5%的脱脂牛奶2小时，一抗是CST的1:1000两个小时，TBST10分钟洗三次，二抗1:5000一个小时，再用TBST洗10分钟3次。

可是背景总是很脏，一抗是新买新配的还不行，希望能指导一下我，问题到底是出在哪里了

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 16:42

本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教

作者: 鸽子不哭 时间: 2013-3-15 16:44

本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教

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我也和你有同样的问题，目的蛋白的一抗也是多抗 (抗血清),条带很杂，目前还在调整条件中~同求指教

作者: owanaka 时间: 2013-3-15 16:45

我现在做的是一个16分子量的蛋白，转膜后立春红染膜条带10-90都很清晰，但是没有曝出条带，一抗是cst的，之前也有一次是这样，结果我又重新利用膜再孵了一次结果曝出了不很清晰的条带，不知是一抗问题还是别的原因。

作者: bring 时间: 2013-3-15 16:46

请教前辈：我做的蛋白分子量25kD，用5%压缩胶，80V，45min，12%分离胶，120V，2h，LB在压缩胶底部是压成一条直线的，但是进入分离胶后就有点分开越下去就越开，有时会出现三条相连的线，显影时发现蛋白会有重影。查了配胶用的tris-hcl，PH是没有问题的。还有相同东西，相同条件配10%的胶跑就没有问题。还请帮忙解疑！谢谢！！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-15 16:47

你好，有个问题请教。做PARP，如果用核蛋白提取试剂盒提蛋白，需要超声处理吗？

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用哪个公司的试剂盒呢？

问：还没拿到试剂盒，准备用的是Pierce的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（cuturl('http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=06010435')）。还有请教一下，做Cytochrome C，由于其定位于线粒体，提蛋白是否需要特殊处理？我看有的文献就是用总蛋白做的。能检测到吗？正打算做。

）

作者: yjf1026 时间: 2013-3-15 16:48

老师您好，我想请问一下：我跑的蛋白分子量是183。最近跑了几次泳道都很脏，蛋白条带也不是很清楚，反而在250左右条带特别清晰。请问泳道怎么处理？目的条带不清晰主要是什么原因引起的？（上样量为60ug)

谢谢老师，在线等待，O(∩_∩)O~

作者: 33号 时间: 2013-3-15 16:49

老师您好：

请教一个问题：我最近在做iNOS的western blot。但做了两个多星期了还是没有结果，我用RIPA裂解液（碧云天）提的蛋白，abcam的一抗（鼠单克隆）,二抗是碧云天羊抗鼠二抗。显影后，背景较深，，但是不见目的条带，请问是何原因？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:50

斑竹您好！

我最近做western，样品为组织总蛋白，一抗是用自己的重组蛋白免疫兔子制得的，没测滴度，按1：100稀释使用，二抗为国产，1:5000。湿转，60伏2小时，0.45的PVDF膜。之前曾做成功过，但是最近做的时候总是这样：把PVDF膜放到ECL发光液上，一片荧光，而且也看不到条带，爆出的胶片一片黑，没有条带状的，请教如何改进？

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建议一抗做一下预实验
兔血清的话1：100稀释度太低了

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:50

楼主你好，想请教一个问题，今天WB显影结果出现和考马斯亮蓝染胶很像的结果，每条蛋白都现出来了，很多很多条带，但是有没有目的条带楼主觉得可能是什么原因呢？

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偶尔出现这样的情况？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:51

不好意思我没标注，上面那条是tubulin 左下是actin 因为我目的比较杂（一抗是抗血清）所以用它来指示位置，右下就是我的目的了，恳请楼主帮忙分析下

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咋不用抗体？

抗血清容易有杂带呢

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:51

老师你好，有一个问题一直困扰我很久了，我在做ERK的时候，背景总是很脏，怎么洗都洗不掉，我是10%的胶，上样40微升，转膜是0.22的PVDF膜100伏100分钟，封闭是5%的脱脂牛奶2小时，一抗是CST的1:1000两个小时，TBST10分钟洗三次，二抗1:5000一个小时，再用TBST洗10分钟3次。

可是背景总是很脏，一抗是新买新配的还不行，希望能指导一下我，问题到底是出在哪里了

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哪里的二抗？

二抗做过稀释度没？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:52

本人正在做AQP4（29KD），12%的胶，一抗1:1000（一抗为多克隆抗体），二抗1:10000，封闭2小时，结果是多克隆杂带太多，与目的条带分不清，现在很着急啊，请大家指教

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摸索一下一抗的不同稀释度

如1:2000,1:4000等

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:52

我现在做的是一个16分子量的蛋白，转膜后立春红染膜条带10-90都很清晰，但是没有曝出条带，一抗是cst的，之前也有一次是这样，结果我又重新利用膜再孵了一次结果曝出了不很清晰的条带，不知是一抗问题还是别的原因。

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二抗呢？

缓冲液的pH呢？

ECL呢？

这些都需要考虑

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:52

请教前辈：我做的蛋白分子量25kD，用5%压缩胶，80V，45min，12%分离胶，120V，2h，LB在压缩胶底部是压成一条直线的，但是进入分离胶后就有点分开越下去就越开，有时会出现三条相连的线，显影时发现蛋白会有重影。查了配胶用的tris-hcl，PH是没有问题的。还有相同东西，相同条件配10%的胶跑就没有问题。还请帮忙解疑！谢谢！！

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这个我不太懂，10%的没问题，12%的就有问题

没明白

胶配错了？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:53

用哪个公司的试剂盒呢？

问：还没拿到试剂盒，准备用的是Pierce的NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents（cuturl('http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=06010435')）。还有请教一下，做Cytochrome C，由于其定位于线粒体，提蛋白是否需要特殊处理？我看有的文献就是用总蛋白做的。能检测到吗？正打算做。

）

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实验设计上有具体的要求吗？

是必须要分离线粒体膜蛋白来检测还是/

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:53

老师您好，我想请问一下：我跑的蛋白分子量是183。最近跑了几次泳道都很脏，蛋白条带也不是很清楚，反而在250左右条带特别清晰。请问泳道怎么处理？目的条带不清晰主要是什么原因引起的？（上样量为60ug)

谢谢老师，在线等待，O(∩_∩)O~

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有250K的marker？

作者: kswl870 时间: 2013-3-15 16:54

是的，使用的marker最大分子量为300，fermentas公司的

作者: gmjghh 时间: 2013-3-15 16:54

这个我不太懂，10%的没问题，12%的就有问题

没明白

胶配错了？

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不好意思，表达不清。

胶是没有配错啦，就是用一样的东西配胶，相同条件下跑胶的话，12%的分离胶中溴酚蓝就会散开来。

这种情况不知道是不是导致条带重影的原因。今天用100v压分离胶还是出现这种情况，不知道咋办啊

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:55

是的，使用的marker最大分子量为300，fermentas公司的

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哦，分子量在大于100K后，分的就不会像100K以内蛋白那么清楚，150与300K的marker之间可能间隔很小

作者: NBA 时间: 2013-3-15 16:55

不好意思，表达不清。

胶是没有配错啦，就是用一样的东西配胶，相同条件下跑胶的话，12%的分离胶中溴酚蓝就会散开来。

这种情况不知道是不是导致条带重影的原因。今天用100v压分离胶还是出现这种情况，不知道咋办啊

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蛋白染色后结果如何呢？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-15 16:56

湿转的条件？

恒流 300mA，30min

目的蛋白是什么？抗体是哪里的？

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对，是湿转，目的蛋白是claudin-1。invitrogen的抗体，说明书上建议1-2ug/ml稀释，我已经是超过最大量了。1:100稀释的，始终爆不出来。

作者: loli 时间: 2013-3-15 16:57

请教下，我做的GLI-1，160KD.现在做出来的结果是这样，我不明白是怎么回事，因为同时一起做了HIF-1a，是做出的，所以很迷茫，请高手指点下。

图片附件: 35664814.jpg (2013-3-15 16:57, 42.95 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15182

作者: hyuu 时间: 2013-3-15 16:59

你好楼主我最近在做的蛋白苦于没有结果（白片99%）请你赐教

蛋白名称：Reg3a（分泌型蛋白)

蛋白大小：17-19KD

蛋白来源：大鼠胰腺组织（文献和芯片、PCR结果证实高表达且有5倍以上显著差异）

一抗来源：SANTA CRUZ（sc-50969 此款抗体适用于WB IF; IF我一直在做有结果）

分离胶：10%做出来过一次（黑底条带弱无趋势） 12%（全部白片黑底）

上样量：10ul-20ul

转膜条件：NC膜（0.2孔径）

半干转 10%gel 15min 12%gel 22min

转膜后可以看到17KD处的MARK清晰转于膜上胶上剩余一点没有过转现象

没有试过染胶或染膜

封闭液和抗体稀释液：5% milk-TBST

封闭：室温平摇2h 或37度静置1h

一抗浓度：1:100-200（40ul）

4度平摇过夜

二抗浓度：1:1000

室温平摇2h 或37度静置1h

此条件下阴参Beta-actin条带正常

文献（1996-2011）中查不到此蛋白的western结果一般仅有mRNA表达情况不知为何国际上都不做如果真的无法做出结果那么SANTA此款标明可以用于WB的抗体是怎么生产贩售的呢

此款抗体仅SANTA有售短期内不可能重买

我和同学都做不出前后做了超过10次原因为何请赐教

作者: moonlight45 时间: 2013-3-15 17:01

QUOTE:

原帖由 hyuu 于 2013-3-15 16:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好楼主我最近在做的蛋白苦于没有结果（白片99%）请你赐教

蛋白名称：Reg3a（分泌型蛋白)

蛋白大小：17-19KD

蛋白来源：大鼠胰腺组织（文献和芯片、PCR结果证实高表达且有5倍以上显著差异）

一抗来源：SANTA CRUZ（sc-50969 此款 ...

1.首先要确定提取你的蛋白有没有问题，用考马斯亮蓝染胶看看。
2.我没看到你的转膜条件，也不明白半干转“ 10%gel 15min 12%gel 22min”是什么意思？

3.转膜后可以用丽春红染下膜，看看。而且我觉得marker在膜上未必是转过去了，就是你不转，你的放置一会，marker的颜色也有可能到膜上，而且你的胶上有，是不是转的不很完全呢

4.我也做过一个分泌蛋白，文献上没有查到做WB的，其他地方也没抗体，只有SANTA有,说是能做WB，但是我从来没有做出来过，呵呵，所以放弃了

作者: 04906 时间: 2013-3-15 17:02

咋不用抗体？

抗血清容易有杂带呢

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俺这个因为是自己实验室克隆出的片段，所以市面上没有相关的抗体。我用的是上届师兄制备的兔的抗血清。

作者: u234 时间: 2013-3-15 17:04

1.首先要确定提取你的蛋白有没有问题，用考马斯亮蓝染胶看看。
2.我没看到你的转膜条件，也不明白半干转“ 10%gel 15min 12%gel 22min”是什么意思？

3.转膜后可以用丽春红染下膜，看看。而且我觉得marker在膜上未必是转过去了，就是你不转，你的放置一会，marker的颜色也有可能到膜上，而且你的胶上有，是不是转的不很完全呢

4.我也做过一个分泌蛋白，文献上没有查到做WB的，其他地方也没抗体，只有SANTA有,说是能做WB，但是我从来没有做出来过，呵呵，所以放弃了

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转膜条件：半干转

10%的分离胶转15分钟

12%的分离胶转22分钟（比10%的胶相应延长7Min）

作者: DONT 时间: 2013-3-15 17:04

转膜条件：半干转

10%的分离胶转15分钟

12%的分离胶转22分钟（比10%的胶相应延长7Min）

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1.半干转多少电流、电压啊？

2.还有你的蛋白是分泌型的，蛋白主要分布在什么地方你查清楚没？比如分泌到血清中啊。我觉得这点比较重要。你提蛋白，做出内参很正常，但是你提的这些蛋白中是否含有你的目的蛋白，或者目的蛋白表达极其微弱呢

作者: u234 时间: 2013-3-15 17:05

1.半干转多少电流、电压啊？

2.还有你的蛋白是分泌型的，蛋白主要分布在什么地方你查清楚没？比如分泌到血清中啊。我觉得这点比较重要。你提蛋白，做出内参很正常，但是你提的这些蛋白中是否含有你的目的蛋白，或者目的蛋白表达极其微弱呢

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不好意思是我没说清楚
1.恒流：膜面积x1.0（mA/平方cm）

2.我用同款一抗做了同批组织石蜡切片的免疫荧光试验有阳性组织细胞定位且有差异说明此种分泌型蛋白在组织中有表达没有完全分泌入血清

作者: kuohao17 时间: 2013-3-15 17:09

1、缺失的一般是20K的

2、从你的胶图来看，胶有问题

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我重新配置了我的溶液.tris hcl的PH也准确测量过了,试验用的水也换了,可是结果还是这样,完全没有改善,我在别的实验室用相同的配置溶液却能跑出来,考虑是试剂的问题,请问您这个可能是什么呢??谢谢

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-15 17:10

不好意思是我没说清楚
1.恒流：膜面积x1.0（mA/平方cm）

2.我用同款一抗做了同批组织石蜡切片的免疫荧光试验有阳性组织细胞定位且有差异说明此种分泌型蛋白在组织中有表达没有完全分泌入血清

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那我觉得是抗体的问题了，因为我记得WB的抗体是和线性表位上的抗原结合的（蛋白在loading buffer中煮就已经被切），而免疫荧光的不一定啦，可以是空间表位，也可以是线性表位，所以可能你免疫荧光做的出来，但不一定做的出WB来。

作者: eric930 时间: 2013-3-15 17:11

您好：做了三个月的WB，还是没有头绪。我的指标是ucp2（32kd），内参为actin.具体步骤：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)，电泳70V,120V,转膜液20%甲醇（不加SDS）转膜45分钟（伯乐电泳仪），转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，未见条带。5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗10*3min,Proteintech Group的ucp2一抗1:1000稀释（建议是1:1000，采用碧云天的一抗稀释液，以便抗体再利用），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗10*3min,二抗1:1000（建议是1:1000）室温1h,TBST洗10*3minpiere超强ECL发光曝光，机器曝光。结果：内参较清晰，没有背景。未见目的条带，但在相应的位置有一条线，很细。

我的问题：1、丽春红染色有条带，是不是表示转膜之前的步骤是正确的？

2、同个厂家的抗体，我之前有结果出来的，但是用完了，买的是同个厂家的同个抗体，目的条带就没有了，样本实验条件都是一样的，这是什么问题？

3、我的一抗是Proteintech Group公司的，该公司的抗体如何？是不是我抗体问题存在问题？

谢谢！

作者: eric930 时间: 2013-3-15 17:11

曝光结果未见目的条带，但在相应位置有一条细线，这是代表什么?

作者: yjf1026 时间: 2013-3-15 17:19

曝光结果未见目的条带，但在相应位置有一条细线，这是代表什么?

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我分析可能有如下结果，

1.污染 2.非特异性条带 3.目的蛋白表达量极低。我觉得前两种可能性较大

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:19

对，是湿转，目的蛋白是claudin-1。invitrogen的抗体，说明书上建议1-2ug/ml稀释，我已经是超过最大量了。1:100稀释的，始终爆不出来。

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请在转膜后用丽春红对膜进行染色
检查转膜效果
同时注意孵育抗体的pH

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:20

你好楼主我最近在做的蛋白苦于没有结果（白片99%）请你赐教

蛋白名称：Reg3a（分泌型蛋白)

蛋白大小：17-19KD

蛋白来源：大鼠胰腺组织（文献和芯片、PCR结果证实高表达且有5倍以上显著差异）

一抗来源：SANTA CRUZ（sc-50969 此款抗体适用于WB IF; IF我一直在做有结果）

分离胶：10%做出来过一次（黑底条带弱无趋势） 12%（全部白片黑底）

上样量：10ul-20ul

转膜条件：NC膜（0.2孔径）

半干转 10%gel 15min 12%gel 22min

转膜后可以看到17KD处的MARK清晰转于膜上胶上剩余一点没有过转现象

没有试过染胶或染膜

封闭液和抗体稀释液：5% milk-TBST

封闭：室温平摇2h 或37度静置1h

一抗浓度：1:100-200（40ul）

4度平摇过夜

二抗浓度：1:1000

室温平摇2h 或37度静置1h

此条件下阴参Beta-actin条带正常

文献（1996-2011）中查不到此蛋白的western结果一般仅有mRNA表达情况不知为何国际上都不做如果真的无法做出结果那么SANTA此款标明可以用于WB的抗体是怎么生产贩售的呢

此款抗体仅SANTA有售短期内不可能重买

我和同学都做不出前后做了超过10次原因为何请赐教

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问题分析的很仔细
分泌型的蛋白一般都不做WB

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:20

您好：做了三个月的WB，还是没有头绪。我的指标是ucp2（32kd），内参为actin.具体步骤：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)，电泳70V,120V,转膜液20%甲醇（不加SDS）转膜45分钟（伯乐电泳仪），转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，未见条带。5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗10*3min,Proteintech Group的ucp2一抗1:1000稀释（建议是1:1000，采用碧云天的一抗稀释液，以便抗体再利用），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗10*3min,二抗1:1000（建议是1:1000）室温1h,TBST洗10*3minpiere超强ECL发光曝光，机器曝光。结果：内参较清晰，没有背景。未见目的条带，但在相应的位置有一条线，很细。

我的问题：1、丽春红染色有条带，是不是表示转膜之前的步骤是正确的？

2、同个厂家的抗体，我之前有结果出来的，但是用完了，买的是同个厂家的同个抗体，目的条带就没有了，样本实验条件都是一样的，这是什么问题？

3、我的一抗是Proteintech Group公司的，该公司的抗体如何？是不是我抗体问题存在问题？

谢谢！

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一抗有没有做过不同的稀释度啊

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 17:22

一抗有没有做过不同的稀释度啊

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一抗说明书推荐1：1000，我之前用旧的该公司的抗体，做出来过，且结果较满意。但是用完后，买了新的同个公司抗体后，就一直没出结果。抗体浓度，我试过1:500,1:1000.二抗我试过1:500，1:1000，1:2000

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:22

一抗说明书推荐1：1000，我之前用旧的该公司的抗体，做出来过，且结果较满意。但是用完后，买了新的同个公司抗体后，就一直没出结果。抗体浓度，我试过1:500,1:1000.二抗我试过1:500，1:1000，1:2000

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注意缓冲液的pH及样品

作者: DNA 时间: 2013-3-15 17:27

请在转膜后用丽春红对膜进行染色
检查转膜效果
同时注意孵育抗体的pH

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请问孵育抗体的PH值应该在多少呢，我是TBST配的5%的脱脂牛奶稀释的抗体。

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:27

请问孵育抗体的PH值应该在多少呢，我是TBST配的5%的脱脂牛奶稀释的抗体。

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7.5

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-15 17:28

注意缓冲液的pH及样品

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缓冲液的PH值，我在配液体的时候调到7.5。同样样品跑两块胶，一块孵新抗体，另一块孵旧抗体，结果旧的有条带，而新的没有条带。这可以排除是样本的问题。我今天用阳性对照去做了，结果也没有结果。你觉得我的抗体会不会有问题?我的目的32kd，用的是1.5mm 的板，转膜45min，你觉得合理吗？

作者: yonger 时间: 2013-3-15 17:28

楼主，你好，请教一个问题，我跑SDS-PAGE胶的时候一直有一个问题，样品在浓缩胶中跑了5分钟左右，就会从浓缩胶和玻璃板之间漏到浓缩胶和分离胶之间，每次都这样，一开始我以为玻璃板没有洗干净或是浓缩胶没有凝好，但是我排除了这两个原因，所以想问下楼主这个问题还有可能是什么原因呢？非常感谢！急盼回复！

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-15 17:29

版主，您好，想请教您几个问题。

我之后要跑Ⅰ型前胶原蛋白，分子量约180kD，打算用8%的分离胶跑，积层胶我之前用的是4%的，需不需要改啊？

还有我们实验室转膜习惯用稳流，350mA，2.5h，我如果还用这个条件，Ⅰ型前胶原蛋白能够转上去吗？请问版主转大的分子，有没有什么其他的问题需要注意？谢谢啊！

作者: ukonptp 时间: 2013-3-15 17:29

我做过几次mTOR，都没有做出来，丽春红染色没见到条带，考马斯亮蓝染胶可以见到条带，怀疑转膜有问题，我用的半干转，PVDF膜，想请教一下转膜条件

作者: 3648755 时间: 2013-3-15 17:29

版主，您好！

我正做iNOS的WB,一抗需要用Santa Cruz公司的，但是原装进口的比较贵，想问下用分装的效果是一样吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:30

缓冲液的PH值，我在配液体的时候调到7.5。同样样品跑两块胶，一块孵新抗体，另一块孵旧抗体，结果旧的有条带，而新的没有条带。这可以排除是样本的问题。我今天用阳性对照去做了，结果也没有结果。你觉得我的抗体会不会有问题?我的目的32kd，用的是1.5mm 的板，转膜45min，你觉得合理吗？

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如果所有条件相同

只是换了抗体

哪就需要考虑是不是抗体的问题了

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:30

楼主，你好，请教一个问题，我跑SDS-PAGE胶的时候一直有一个问题，样品在浓缩胶中跑了5分钟左右，就会从浓缩胶和玻璃板之间漏到浓缩胶和分离胶之间，每次都这样，一开始我以为玻璃板没有洗干净或是浓缩胶没有凝好，但是我排除了这两个原因，所以想问下楼主这个问题还有可能是什么原因呢？非常感谢！急盼回复！

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漏到浓缩胶与分离胶之间？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:31

版主，您好，想请教您几个问题。

我之后要跑Ⅰ型前胶原蛋白，分子量约180kD，打算用8%的分离胶跑，积层胶我之前用的是4%的，需不需要改啊？

还有我们实验室转膜习惯用稳流，350mA，2.5h，我如果还用这个条件，Ⅰ型前胶原蛋白能够转上去吗？请问版主转大的分子，有没有什么其他的问题需要注意？谢谢啊！

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这个条件没问题

需要注意抗体识别的是还原型的还是非还原型的胶原蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:31

版主，您好！

我正做iNOS的WB,一抗需要用Santa Cruz公司的，但是原装进口的比较贵，想问下用分装的效果是一样吗？谢谢！

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分装的不好说

这个看你的运气吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:31

你好，请问WB的结果怎么看，谢谢！我是菜鸟，我把数据和图片都传上来了，请赐教！

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用这个软件读出来的数据不是很好吧。。。

建议用ImageQuant TL读取积分光密度值，IOD

作者: 9900 时间: 2013-3-15 17:32

分装的不好说

这个看你的运气吧

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版主，那能问下你做 iNOS的一抗除了SANTA的，还有什么公司的比较好，或者国产的也行，能麻烦推荐下吗？谢谢！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 17:32

楼主，你好，最近我开始做WB，加ECL基本上看不到荧光，可是再加TMB却可以看到明显条带。问题会是在什么地方？我直接在ECL里加了二抗可见荧光，ECL是没问题的。PVDF膜在二抗孵育玩用PBST洗膜后，我又用水漂洗了一下，会是因为这个吗？ECL显色受膜上离子强度和PH影响大吗？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 17:33

漏到浓缩胶与分离胶之间？

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是的，是漏到浓缩胶和分离胶之间，
我看了另外的帖子说说是封闭用的溶液没有弄干净，可以先用浓缩胶洗一下，去掉后在重新注入，但是我试过了还是不能避免，请高手帮忙看看还有什么可能的原因！谢谢！盼回复

作者: langlang 时间: 2013-3-15 17:33

您好！我现在决定换抗体了，参考文献用的是Santa Cruz，但是目前该抗体的反响不好，我选用abcam的，这样不知道好不好？你能给个建议吗？还有，同是abcam的同个指标，但是有山羊、小鼠，兔来源的，我该如何选择？谢谢！

作者: 04906 时间: 2013-3-15 17:33

目的蛋白：17KDa 内参：37KDa
跑胶电压：上层胶70V，分离胶90V；转膜：250mA，目的时间25分钟，内参时间35分钟。
用的是0.2um的膜
一抗：1：2000 4度过夜（未摇）；二抗：1：2000常温1小时，均是ABCam的
内参：1：2000 碧云天的
ECL plus+显色
显色后是整片空白，什么都没有；然后进行染胶和染膜发现在17和37的位置都是有蛋白的，不知道是什么问题，故请教高手们，给点建议！！！？

作者: 2541 时间: 2013-3-15 17:34

请问版主如何根据目的蛋白分子量大小来调整转膜的条件。

作者: TAT 时间: 2013-3-15 17:35

您好，我刚开始做WB，我要做的是食管癌细胞叶酸受体的表达，一种膜蛋白，38KD，用的抗体是Enzo公司旗下Alexis的一抗，给的浓度，是1：1000-1：100，二抗是进口分装的，做了一次actin，用的70v，100v电泳，300mA，60min电转，条带有出来，背景不是很高。那我在做目的蛋白的时候您可以给些什么建议吗？该怎么入手把条件给摸好呢，刚开始做，很多不懂，希望不吝赐教，谢谢！

作者: 小荷尖尖 时间: 2013-3-15 17:35

版主，您好！上一次问您关于Ⅰ型前胶原蛋白的问题，您说“需要注意抗体识别的是还原型的还是非还原型的胶原蛋白”，我现在不太清楚“还原型的和非还原型的胶原蛋白”是指什么意思，有什么区别？我买了Santa Cruz，关于Ⅰ型前胶原蛋白的一抗，看了说明书，给出的图，好像是有两个条带。胶原方面，我刚刚才开始学习，不懂的东西比较多，麻烦版主了，谢谢！

图片附件: 56566219.png (2013-3-15 17:35, 9.5 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15183

作者: zhezhe 时间: 2013-3-15 17:36

我用的也是六一的电泳仪，我要的是Actin43KD和80多KD的目的蛋白，用60mA稳流跑能把Marker都跑开，然后用90V湿转90min，看胶上的Marker都已经转到PVDF膜上，但是用丽春红染膜，却看不到蛋白条带，望能予以指教。谢谢

作者: pengke1983 时间: 2013-3-15 17:36

版主您好，我最近作western遇到一个奇怪的问题，我做western已经半年了，这次是新提的动物蛋白，肾脏的，拿来做内参和目的，内参杂带非常的多，我是用脱脂牛奶封闭了2小时，一抗是1:1000，4°过夜，但是显影五分钟整个胶片像是把膜的大小框也显示了出来，而且非常黑非常乱，但是条带看的还是比较清楚。这是内参，不知道什么问题，是不是一抗不行了？

还有目的是做的LC3B，分子量很小，才14左右，我提的细胞蛋白试了几次都没做出来，都是一片白板，转膜时间是200电流，恒流，60分钟，0.45的PVDF膜。这次换用新提的动物肾脏蛋白做的，条件也换了，用了0.22的PVDF膜，恒流200的电流，50分钟，一抗是CST的1:1000,特别改用BSA封闭，抗体稀释液也都是换成BSA了，显影的时候居然出来了，但是是一团团的浓墨状的黑影，非常晕，不知道到底哪里出了问题，应该怎么改正，谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:37

版主，那能问下你做 iNOS的一抗除了SANTA的，还有什么公司的比较好，或者国产的也行，能麻烦推荐下吗？谢谢！

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用了Abcam的，还不错

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:37

楼主，你好，最近我开始做WB，加ECL基本上看不到荧光，可是再加TMB却可以看到明显条带。问题会是在什么地方？我直接在ECL里加了二抗可见荧光，ECL是没问题的。PVDF膜在二抗孵育玩用PBST洗膜后，我又用水漂洗了一下，会是因为这个吗？ECL显色受膜上离子强度和PH影响大吗？

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在加ECL前的最后一个遍，不能用水

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:39

您好！我现在决定换抗体了，参考文献用的是Santa Cruz，但是目前该抗体的反响不好，我选用abcam的，这样不知道好不好？你能给个建议吗？还有，同是abcam的同个指标，但是有山羊、小鼠，兔来源的，我该如何选择？谢谢！

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什么指标呢？样品的种属是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:39

目的蛋白：17KDa 内参：37KDa
跑胶电压：上层胶70V，分离胶90V；转膜：250mA，目的时间25分钟，内参时间35分钟。
用的是0.2um的膜
一抗：1：2000 4度过夜（未摇）；二抗：1：2000常温1小时，均是ABCam的
内参：1：2000 碧云天的
ECL plus+显色
显色后是整片空白，什么都没有；然后进行染胶和染膜发现在17和37的位置都是有蛋白的，不知道是什么问题，故请教高手们，给点建议！！！？？？

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转膜后染色了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:40

请问版主如何根据目的蛋白分子量大小来调整转膜的条件。

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这个不是一两句能说清楚的

需要积累

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:40

您好，我刚开始做WB，我要做的是食管癌细胞叶酸受体的表达，一种膜蛋白，38KD，用的抗体是Enzo公司旗下Alexis的一抗，给的浓度，是1：1000-1：100，二抗是进口分装的，做了一次actin，用的70v，100v电泳，300mA，60min电转，条带有出来，背景不是很高。那我在做目的蛋白的时候您可以给些什么建议吗？该怎么入手把条件给摸好呢，刚开始做，很多不懂，希望不吝赐教，谢谢！

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转膜后丽春红把膜染色

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:40

版主，您好！上一次问您关于Ⅰ型前胶原蛋白的问题，您说“需要注意抗体识别的是还原型的还是非还原型的胶原蛋白”，我现在不太清楚“还原型的和非还原型的胶原蛋白”是指什么意思，有什么区别？我买了Santa Cruz，关于Ⅰ型前胶原蛋白的一抗，看了说明书，给出的图，好像是有两个条带。胶原方面，我刚刚才开始学习，不懂的东西比较多，麻烦版主了，谢谢！

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一般没有说明的情况下WB是还原型的

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:41

我用的也是六一的电泳仪，我要的是Actin43KD和80多KD的目的蛋白，用60mA稳流跑能把Marker都跑开，然后用90V湿转90min，看胶上的Marker都已经转到PVDF膜上，但是用丽春红染膜，却看不到蛋白条带，望能予以指教。谢谢

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先做SDS-PAGE后的考马斯亮蓝染色

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:44

版主您好，我最近作western遇到一个奇怪的问题，我做western已经半年了，这次是新提的动物蛋白，肾脏的，拿来做内参和目的，内参杂带非常的多，我是用脱脂牛奶封闭了2小时，一抗是1:1000，4°过夜，但是显影五分钟整个胶片像是把膜的大小框也显示了出来，而且非常黑非常乱，但是条带看的还是比较清楚。这是内参，不知道什么问题，是不是一抗不行了？

还有目的是做的LC3B，分子量很小，才14左右，我提的细胞蛋白试了几次都没做出来，都是一片白板，转膜时间是200电流，恒流，60分钟，0.45的PVDF膜。这次换用新提的动物肾脏蛋白做的，条件也换了，用了0.22的PVDF膜，恒流200的电流，50分钟，一抗是CST的1:1000,特别改用BSA封闭，抗体稀释液也都是换成BSA了，显影的时候居然出来了，但是是一团团的浓墨状的黑影，非常晕，不知道到底哪里出了问题，应该怎么改正，谢谢！！

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LC3B不太好做，CST的这个抗体我用过，效果一般

转膜时间缩短下，30min

内参出现杂带，以前出现过吗？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-15 17:44

刚刚接触wb，什么都是现学的

有人推荐我用image j来分析荧光图

我对着英文的说明书看了半天也不确定

image j是不是提供两个方法

1、在ps平台测出图像的mean和Pixels，然后再到image j里面进一步操作area，mean还有intden

2、直接image J里面操作，最后得到的是area和percent

如果是这样的话，那得到的这两类数据又该如何进一步分析呢

多谢前辈赐教

作者: 8s5g 时间: 2013-3-15 17:45

以前跑的都挺好,可是最近做的几块胶都是这样,我跑的是纤维蛋白原,分子量较大340KD,好象还不是染色没染好,染之前还用NaCl洗了一小下,请大侠帮忙看一下,问题出在哪了.电压是,100V,150V跑的.又做过80V,120V的,也有这样的现象.

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作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:45

刚刚接触wb，什么都是现学的

有人推荐我用image j来分析荧光图

我对着英文的说明书看了半天也不确定

image j是不是提供两个方法

1、在ps平台测出图像的mean和Pixels，然后再到image j里面进一步操作area，mean还有intden

2、直接image J里面操作，最后得到的是area和percent

如果是这样的话，那得到的这两类数据又该如何进一步分析呢

多谢前辈赐教

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呵呵，我不用ImageJ读数

我自己花了1100美金买了一个软件：Total Lab Quant读取条带的积分光密度值

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:46

以前跑的都挺好,可是最近做的几块胶都是这样,我跑的是纤维蛋白原,分子量较大340KD,好象还不是染色没染好,染之前还用NaCl洗了一小下,请大侠帮忙看一下,问题出在哪了.电压是,100V,150V跑的.又做过80V,120V的,也有这样的现象.

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总蛋白还是纯化后的蛋白呢？

作者: memory 时间: 2013-3-15 17:46

用了Abcam的，还不错

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我已下订单购买SANTA的一抗了。谢谢

希望能出结果。

对了顺便问下，Abcam的一抗大概多少钱一个？还有SANTA的一抗最便宜是多少钱一个？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:47

我已下订单购买SANTA的一抗了。谢谢

希望能出结果。

对了顺便问下，Abcam的一抗大概多少钱一个？还有SANTA的一抗最便宜是多少钱一个？

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abcam的抗体网上有报价，你可以上去看看

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-15 17:48

楼主，这是我第一次跑的 β-actin，8%的胶。电泳条件是 80v，30min，100v60min，转膜的条件是 250mA 1h，蛋白的量大概在45μg左右，结果图就成这个样子了，请帮忙分析一下原因，为什么条带是一条线啊？多谢

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15185

作者: 8princess8 时间: 2013-3-15 17:49

什么指标呢？样品的种属是什么？

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ucp2,人

作者: 49888 时间: 2013-3-15 17:50

版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-15 17:50

版主你好，我作western blot,提取脑组织蛋白。提取的蛋白开始一两次WB效果可以；1,2次以后，EP管内就出现白色沉淀，跑不出蛋白条带？我的蛋白提取变性后冻存在-40度。请版主解惑，谢谢！

作者: 49888 时间: 2013-3-15 17:51

版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！

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能不能告诉我你上样的量，电泳，转膜的条件？我的蛋白也是32kd，是UCP2，你的呢？做了好长时间了，都没有结果。谢谢！

作者: junjie05 时间: 2013-3-15 17:51

我做的是il-8，分子量只有10kd左右，一直做不出来，对于小分子蛋白，不知道还有什么优化实验的方法呢？

作者: junjie05 时间: 2013-3-15 17:52

应该如何选择合适的内参。

如果内参和目的都是在34-43kd之间的话怎么办？gapdh和β-Actin都是在这个范围的，而用β-Tublin 效果又不明显。

作者: wsll 时间: 2013-3-15 17:52

能不能告诉我你上样的量，电泳，转膜的条件？我的蛋白也是32kd，是UCP2，你的呢？做了好长时间了，都没有结果。谢谢！

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我的上样量是18μl。电泳用的是稳压，80V积层胶，120V分离胶；转膜用的是稳流，350mV，2,5h。我做的是细胞凋亡方面的一个蛋白，ARTS。

作者: ququer787 时间: 2013-3-15 17:53

求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法。谢谢！！bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13753.png', '%s')

上面这张是pln的，下面是β-actin的bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13995.png', '%s')

蛋白处理：常温,未变性。蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s

作者: ququer787 时间: 2013-3-15 17:53

求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法，谢谢！！

蛋白处理：常温,未变性。蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s

作者: ukonptp 时间: 2013-3-15 17:53

你好，我最近几次做WB都发现在暗室发光可以看到很亮的条带，但是一压胶片什么都暴不出来，压两小时都看不到条到。可是转膜染色可以看到很漂亮的条带，滴上发光液也可以看到明显的条带没背景，就是压胶片显不出条带胡或者胶片发黑。以前有一次NC膜stripe3次后出现过这样的情况。但这几次新转的膜也是这样。换了新买的发光液也是这样……求解。

可能原因稀释好的一抗在4度放置时间太久，效价降低了。我以前是用一抗稀释液稀释，但是最近用完了，就用PBST稀释，而且放了3周多了。如果没有一抗稀释液一般可以用什么稀释，因为筛选下游分子我的抗体是从其他组借的，一次只能拿1ml稀释好抗体的，所以比较珍惜，每次点膜都是加100ul的。

之前做出来的条带还勉强可以，但最近想再做做，发出好点的胶片就悲剧了。求指教。下面是以前和最近的的图片比较^………………bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\1.jpg', '%s')bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\2.jpg', '%s')

作者: mickeylin 时间: 2013-3-15 17:54

最近GAPDH都做得很心烦，可惜图传不上来。
我提的是大鼠心肌组织蛋白，液氮研磨加三去污裂解，转膜后5%BSATBST封闭1小时，GAPDH是康城的带HRP，4度1：5000孵育过夜，ECL用的是进口超敏ECL（忘记什么公司了），该图片曝光10s，别人做出来都是1条带，而我却有二至三条！曝光完我发现膜上出现黄色条带，是不是蛋白浓度太高HRP富集导致的”烧灼样“？
我们实验室的老师说是我蛋白上样太多，下次减到20ug，GAPDH用1：10000。
不知大师是不是一样指教？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:54

楼主，这是我第一次跑的 β-actin，8%的胶。电泳条件是 80v，30min，100v60min，转膜的条件是 250mA 1h，蛋白的量大概在45μg左右，结果图就成这个样子了，请帮忙分析一下原因，为什么条带是一条线啊？多谢

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以前出现过类似的结果吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:55

ucp2,人

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如果步骤没问题的话

投诉一下抗体吧

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:55

版主，您好！我最近在跑一个32kD的蛋白，显影出来总是背景特别深，之后显了GD，很好，条带很清晰；后来，降低了二抗浓度，从1:1000降到1:2000，未显出来。又提高了，使用1:1500，显出来了，可是背景还是很深。后来也在孵完二抗后，洗了50min，背景仍然比较深。我用5%脱脂牛奶封闭2H，一抗孵过夜，洗40min，二抗孵2H，洗50min。请教版主，您有没有碰到过这种情况，到底问题出在哪？应该怎么解决啊？我用的是Santa Cruz的抗体。谢谢！

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有一点可以很确定的告诉你

二抗从1：1000提高到1：2000不会有质上的区别，即1：1000有条带，而1：2000没有条带。如果出现这种情况要考虑试剂或者操作的问题

二抗孵育40min，室温，足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:55

版主你好，我作western blot,提取脑组织蛋白。提取的蛋白开始一两次WB效果可以；1,2次以后，EP管内就出现白色沉淀，跑不出蛋白条带？我的蛋白提取变性后冻存在-40度。请版主解惑，谢谢！

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变性时的蛋白浓度是多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:55

我做的是il-8，分子量只有10kd左右，一直做不出来，对于小分子蛋白，不知道还有什么优化实验的方法呢？

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不适合用WB来检测

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:56

应该如何选择合适的内参。

如果内参和目的都是在34-43kd之间的话怎么办？gapdh和β-Actin都是在这个范围的，而用β-Tublin 效果又不明显。

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做完目的蛋白后

把目的抗体stripping 掉

然后孵育内参

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:56

求教！最近做了PLN,分子量25（五聚体），6（单体）。出来的条带宽大相连，丰度比β-actin还高。分别调整了上样量，一抗二抗浓度，封闭时间，封闭液，结果还是这样。老板对结果很不满意，请做过这个蛋白的战友、前辈帮我看看，有没有其他更好的调整办法。谢谢！！bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13753.png', '%s')

上面这张是pln的，下面是β-actin的bbcodeurl('file:///C:\Users\ADMINI~1.DAD\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-13995.png', '%s')

蛋白处理：常温,未变性。蛋白上样量20ug蛋白上样体积25ul电泳电压80v4h
转膜300mA2h
封闭3%BSA30min
一抗PLN(UPSTATE) :1:5000
β -actin 1:500.4℃ 过夜
封闭3%BSA,30min
二抗 1:10001.5h
曝光时间PLN 90s;β-actin 90s

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调整一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:57

你好，我最近几次做WB都发现在暗室发光可以看到很亮的条带，但是一压胶片什么都暴不出来，压两小时都看不到条到。可是转膜染色可以看到很漂亮的条带，滴上发光液也可以看到明显的条带没背景，就是压胶片显不出条带胡或者胶片发黑。以前有一次NC膜stripe3次后出现过这样的情况。但这几次新转的膜也是这样。换了新买的发光液也是这样……求解。

可能原因稀释好的一抗在4度放置时间太久，效价降低了。我以前是用一抗稀释液稀释，但是最近用完了，就用PBST稀释，而且放了3周多了。如果没有一抗稀释液一般可以用什么稀释，因为筛选下游分子我的抗体是从其他组借的，一次只能拿1ml稀释好抗体的，所以比较珍惜，每次点膜都是加100ul的。

之前做出来的条带还勉强可以，但最近想再做做，发出好点的胶片就悲剧了。求指教。下面是以前和最近的的图片比较^………………bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\1.jpg', '%s')bbcodeurl('file://D:\360data\重要数据\桌面\2.jpg', '%s')

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胶片或者显影液的问题（如果在压片前还能看到荧光的话）

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:57

最近GAPDH都做得很心烦，可惜图传不上来。
我提的是大鼠心肌组织蛋白，液氮研磨加三去污裂解，转膜后5%BSATBST封闭1小时，GAPDH是康城的带HRP，4度1：5000孵育过夜，ECL用的是进口超敏ECL（忘记什么公司了），该图片曝光10s，别人做出来都是1条带，而我却有二至三条！曝光完我发现膜上出现黄色条带，是不是蛋白浓度太高HRP富集导致的”烧灼样“？
我们实验室的老师说是我蛋白上样太多，下次减到20ug，GAPDH用1：10000。
不知大师是不是一样指教？

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超敏的ECL？Pierce（Thermo）的？

调整一抗浓度

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-15 17:57

做完目的蛋白后

把目的抗体stripping 掉

然后孵育内参

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如何stripping？

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-15 17:58

不适合用WB来检测

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为什么呢？能解释一下嘛？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:58

为什么呢？能解释一下嘛？

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IL-8是分泌型蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:58

如何stripping？

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用stripping buffer

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-15 17:59

用stripping buffer

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红外二抗，用扫描仪扫的也是可以stripping嘛？

作者: NBA 时间: 2013-3-15 17:59

红外二抗，用扫描仪扫的也是可以stripping嘛？

可以

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pierce（Thermo）有相关产品

作者: ha111 时间: 2013-3-15 17:59

如果步骤没问题的话

投诉一下抗体吧

版主，原来的抗体已经退货处理了。我现在要买个新的抗体，你能推荐一下吗？我做的是人的UCP2指标。谢谢！

作者: october7 时间: 2013-3-15 18:00

首先感谢版主，我想问个问题，我在提取肝组织蛋白的时候，应用1mlRIPA裂解液+100mM PMSF10微升，匀浆完成后，离心12000rpm，蛋白浓度测定，吸取上清，不小心吸到了上边的悬浮物，加5x loading buffer，煮沸蛋白10分钟，加样的时候发现样品就像凝胶样掉在加样槽中，曝光的时候蛋白条带很不规整，想问下离心后上清中含的是什么物质，要是不小心吸到后怎么处理，能降低影像，因为蛋白样品比较宝贵，要测比较多的指标，吸取的上清比较多。

作者: october7 时间: 2013-3-15 18:00

这个版面挺好的，但是不知道怎么方便啊，我每次看都要从头开始点击

作者: october7 时间: 2013-3-15 18:00

电流太大了
需要降温

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我做western的时候也碰到过跑的很慢的情况，有时候跑了很长时间就是不marker就是不往下边走，有时候就直接放弃了，但是我曾经试过换电泳液，换了电泳液就好了。

作者: october7 时间: 2013-3-15 18:01

加点SDS

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NBA 老师，您好

我也碰到过这样的情况，加样孔中有沉淀的时候胶跑的不好，曝光后条带很怪异，想知道sds是怎么加的，是直接和煮沸过的样品混合？还是在煮蛋白的时候加？我感觉里边有沉淀可能是里边含脂质教多，我提过肝肺和肾组织的蛋白样品，只有肝组织中出现过几次这样的问题，肺和肾未出现这样的问题，提取肝组织的时候，离心后常见到上边的油状物。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:55

版主，原来的抗体已经退货处理了。我现在要买个新的抗体，你能推荐一下吗？我做的是人的UCP2指标。谢谢！

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http://www.abcam.com/UCP2-antibody-ab67241.html

作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:55

首先感谢版主，我想问个问题，我在提取肝组织蛋白的时候，应用1mlRIPA裂解液+100mM PMSF10微升，匀浆完成后，离心12000rpm，蛋白浓度测定，吸取上清，不小心吸到了上边的悬浮物，加5x loading buffer，煮沸蛋白10分钟，加样的时候发现样品就像凝胶样掉在加样槽中，曝光的时候蛋白条带很不规整，想问下离心后上清中含的是什么物质，要是不小心吸到后怎么处理，能降低影像，因为蛋白样品比较宝贵，要测比较多的指标，吸取的上清比较多。

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一般是脂类物质

作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:55

NBA老师，您好

我也碰到过这样的情况，加样孔中有沉淀的时候胶跑的不好，曝光后条带很怪异，想知道sds是怎么加的，是直接和煮沸过的样品混合？还是在煮蛋白的时候加？我感觉里边有沉淀可能是里边含脂质教多，我提过肝肺和肾组织的蛋白样品，只有肝组织中出现过几次这样的问题，肺和肾未出现这样的问题，提取肝组织的时候，离心后常见到上边的油状物。谢谢

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脂类物质

作者: DONT 时间: 2013-3-18 09:56

您好，我最近也打算做心肌组织western blot膜蛋白--LC3蛋白，想请教您几个问题：1. 裂解液您是用的RIPA的裂解液还是自己配的？我买的是碧云天的RIPA强裂解液，但是听有的人说裂解效果太强可能有很多杂带，2. 我提取的是膜蛋白和胞浆蛋白，需要分别用不同的裂解液处理吗？再就是用几成的loading buffer比较好呢？我们这以前没有开展过，有很多问题不懂，希望您能赐教！谢谢！

作者: DONT 时间: 2013-3-18 09:56

相关疾病：
肿瘤
楼主您好：首先表示感谢，我是新手，我刚开始学习做WEST，我想知道一抗和二抗怎么选择。谢谢，我主要是做灵芝抗肿瘤的，想看下灵芝提取物是如何影响蛋白表达的。期待您的回复。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:57

您好，我最近也打算做心肌组织western blot膜蛋白--LC3蛋白，想请教您几个问题：1. 裂解液您是用的RIPA的裂解液还是自己配的？我买的是碧云天的RIPA强裂解液，但是听有的人说裂解效果太强可能有很多杂带，2. 我提取的是膜蛋白和胞浆蛋白，需要分别用不同的裂解液处理吗？再就是用几成的loading buffer比较好呢？我们这以前没有开展过，有很多问题不懂，希望您能赐教！谢谢！

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强裂解液效果太强可能有很多杂带？不会吧。。。原理想不通

膜蛋白与胞浆蛋白你要分别提取吗？

常规用5×loading buffer

作者: 8princess8 时间: 2013-3-18 09:58

cuturl('http://www.abcam.com/UCP2-antibody-ab67241.html')

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我看过您推荐的抗体了。同是UCP2指标，有三种来源的，分别是鼠抗人，兔抗人，羊抗人，该如何选择？我选用的内参是鼠抗人的actin，42kd，目的 UCP2 32kd 。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 09:59

我看过您推荐的抗体了。同是UCP2指标，有三种来源的，分别是鼠抗人，兔抗人，羊抗人，该如何选择？我选用的内参是鼠抗人的actin，42kd，目的 UCP2 32kd 。

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一般别选择羊来源的抗体

可以选择与你内参相同来源的鼠抗人UCP2

作者: Ao7 时间: 2013-3-18 10:00

B的marker 与发光液结合的原理是什么，marker显影能看得到是否与所加抗体有关。一直困惑中，谢谢了。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:00

请问WB的marker 与发光液结合的原理是什么，marker显影能看得到是否与所加抗体有关。一直困惑中，谢谢了。

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与抗体有关

作者: eric930 时间: 2013-3-18 10:01

楼主您好。向您请教一个问题。我要用western方法检测一个细胞表面的蛋白，之前买的两种抗体都不好用。那个蛋白的western其实以往的文献做的不多，质量也很一般。最近在一篇7分左右的文献上看到他们做的这个蛋白的western非常漂亮。查了下他们用的抗体，是R&D公司生产的用于做流式的直标抗体，也就是他的抗体上已经加了一种荧光标记。那篇文献上做了这中蛋白的免疫荧光和western，免疫荧光毫无疑问是用的这种抗体。western测这种蛋白时没说是哪种抗体，但是材料方法中用于测这个蛋白的抗体只给出了这一种。所以我觉得很可能就是用的这种抗体。
但我不解的是：这种抗体既然已经标记上了荧光，那么用来做western的时候还能再加上二抗吗？
我发邮件问文章的作者没回音。打电话问R&D公司的技术人员，他们最终只是说文献可能用的这种抗体做的western，但不敢保证。没有正面回答我关于二抗的问题。
所以在这想请教楼主：已经标记上了荧光的一抗，用来做western的时候还能再加上二抗吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:02

楼主您好。向您请教一个问题。我要用western方法检测一个细胞表面的蛋白，之前买的两种抗体都不好用。那个蛋白的western其实以往的文献做的不多，质量也很一般。最近在一篇7分左右的文献上看到他们做的这个蛋白的western非常漂亮。查了下他们用的抗体，是R&D公司生产的用于做流式的直标抗体，也就是他的抗体上已经加了一种荧光标记。那篇文献上做了这中蛋白的免疫荧光和western，免疫荧光毫无疑问是用的这种抗体。western测这种蛋白时没说是哪种抗体，但是材料方法中用于测这个蛋白的抗体只给出了这一种。所以我觉得很可能就是用的这种抗体。
但我不解的是：这种抗体既然已经标记上了荧光，那么用来做western的时候还能再加上二抗吗？
我发邮件问文章的作者没回音。打电话问R&D公司的技术人员，他们最终只是说文献可能用的这种抗体做的western，但不敢保证。没有正面回答我关于二抗的问题。
所以在这想请教楼主：已经标记上了荧光的一抗，用来做western的时候还能再加上二抗吗？

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可以加二抗

作者: hulu呼噜 时间: 2013-3-18 10:02

一般别选择羊来源的抗体

可以选择与你内参相同来源的鼠抗人UCP2

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我内参和目的是没有剪开，一起孵育的。要是内参和目的的来源相同，都是鼠来源的，那孵育二抗时会不会产生竞争，而影响结果。兔来源和鼠来源有区别吗？它们都是多克隆抗体。

作者: bamboo16 时间: 2013-3-18 10:03

你好，我是个新手，最近开始做WB。我的目标蛋白是256KD，采用凯基全蛋白试剂盒提取蛋白，SDS-PAGE电泳250KD、300KD的MARKER都已跑进分离胶，停止电泳，考马斯亮蓝染胶，发现胶上目标条带很淡，几乎看不到，怀疑是不是提取蛋白的时候没提好。对于像这种分子量大于200KD的蛋白提取的时候应该注意些什么呢？

作者: bling 时间: 2013-3-18 10:04

楼主您好。又有个问题请教。
请问我要western检测一个趋化因子受体,它是个膜蛋白，那么我就一定要用提取膜蛋白的试剂盒来提取码？提取总蛋白检测不到吗？之前我一直提的总蛋白，基本做不出来，但是偶然两次能做出来，趋势也符合预期。
我查了下碧云天的膜蛋白提取试剂盒说明，要收集2000-5000万个细胞，好像要比提总蛋白所需的细胞量多很多啊，是因为膜蛋白含量比较低吗？

作者: 33号 时间: 2013-3-18 10:05

Stripping Buffer：配置量100ml

β-巯基乙醇 684ul
10%SDS 20ml
1M Tris-HCL pH6.8 6.25ml

dd水定容至100ml。

1、将膜放入stripping buffer中，50℃水浴30min，间断摇晃。
2、TBST洗5min*3次。
3、封闭。

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-18 10:05

我内参和目的是没有剪开，一起孵育的。要是内参和目的的来源相同，都是鼠来源的，那孵育二抗时会不会产生竞争，而影响结果。兔来源和鼠来源有区别吗？它们都是多克隆抗体。

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1、小鼠来源的单抗在做完预实验摸索好稀释度的条件下，可以一起孵育一抗及二抗，不会竞争

2、兔来源的多抗不能多个抗体一起孵育

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-18 10:06

你好，我是个新手，最近开始做WB。我的目标蛋白是256KD，采用凯基全蛋白试剂盒提取蛋白，SDS-PAGE电泳250KD、300KD的MARKER都已跑进分离胶，停止电泳，考马斯亮蓝染胶，发现胶上目标条带很淡，几乎看不到，怀疑是不是提取蛋白的时候没提好。对于像这种分子量大于200KD的蛋白提取的时候应该注意些什么呢？

==============================================

100K以上蛋白比较少，SDS—PAGE后染色看不见很正常

但是要确保整体的蛋白提取好

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-18 10:06

楼主您好。又有个问题请教。
请问我要western检测一个趋化因子受体,它是个膜蛋白，那么我就一定要用提取膜蛋白的试剂盒来提取码？提取总蛋白检测不到吗？之前我一直提的总蛋白，基本做不出来，但是偶然两次能做出来，趋势也符合预期。
我查了下碧云天的膜蛋白提取试剂盒说明，要收集2000-5000万个细胞，好像要比提总蛋白所需的细胞量多很多啊，是因为膜蛋白含量比较低吗？

========================================================

如果不是实验的特殊要求，不建议用膜蛋白抽提试剂盒进行

现有市面上的试剂盒我用过Pierce（Thermo）、Merck等公司的盒子

效果一般

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-18 10:07

Stripping Buffer：配置量100ml

β-巯基乙醇 684ul
10%SDS 20ml
1M Tris-HCL pH6.8 6.25ml

dd水定容至100ml。

1、将膜放入stripping buffer中，50℃水浴30min，间断摇晃。
2、TBST洗5min*3次。
3、封闭。

===============

这个配方行吗？

你试过？

作者: birdfish 时间: 2013-3-18 10:07

想请教一下，蛋白分子量在280KD的蛋白如何做WB？做了几次蛋白都很弥散，背景很深，谢谢

作者: tianmei001 时间: 2013-3-18 10:08

楼主，我刚买的碧云天的非预染蛋白质分子量，跑胶后考马斯亮蓝染色无任何条带，但彩色预染蛋白分子量有条带且清晰。上样量都是5微升。这是为什么啊谢谢啦

作者: 04906 时间: 2013-3-18 10:08

斑竹，你好，以前没有出现过类似的情况，后来出来了一次比较不错的结果，但是现在连条带都没有了，背景很黑，感觉条带是模糊不清的。请问用牛奶封闭4个小时，另外用TBST稀释抗体这些有没有问题呢？

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以前出现过类似的结果吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:09

楼主，我刚买的碧云天的非预染蛋白质分子量，跑胶后考马斯亮蓝染色无任何条带，但彩色预染蛋白分子量有条带且清晰。上样量都是5微升。这是为什么啊谢谢啦

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换marker

作者: 131415 时间: 2013-3-18 10:09

楼主:您好！

我做WESTERN 用的是没有预染的marker，所以转膜后用丽春红染色标记marker，也把红色染料全部洗掉了，另外用含有1%的脱脂奶粉稀释一抗了，用的是荧光二抗，最后荧光显色时出现的是均匀光亮的红色，其他什么都没有。同时显色的同学人家是黑背景、绿色条带、红色marker 很漂亮的图。我的却是一块均匀的红色。请楼主指点一下。谢谢！

作者: qhyu 时间: 2013-3-18 10:10

RIPA裂解蛋白，10000转离心后发现没有液体都是呈胶冻状？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-18 10:11

楼主，您好！我的样本蛋白稀释的浓度太大了，有什么方法能够浓缩吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 10:11

好文，学习了！！请问封闭用的脱脂奶粉会不会对背景有影响？我们用的完达山的。背景一直很亮。一抗用自制的血清多抗。

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 10:12

另外，您说一般别选择羊来源的抗体，为什么呢？

是说的一抗还是二抗？

作者: loli 时间: 2013-3-18 10:13

这个配方行吗？

你试过？

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这个配方OK，同一张膜重复洗3-4次都没问题。
而且，Stripping Buffer可以回收重复使用。

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 10:14

请教版主，我最近在做Western Blot，遇到这样一个问题：显影时，当ECL铺在PVDF膜上后，很快有亮光出现，但当我将膜放进压片盒准备压片时，就没有亮光了，后来压了挺长时间也未见条带。之后，我提高的二抗的稀释度，从1:2000到1:3000，就没有看见亮光，也没有压出条带。想问一下的是，这种情况除了抗体浓度过高，还有没有什么原因啦！

还有PVDF膜在ECL里多久可以拿出来压片？说明书上写了5min，但我觉得也要视情况而定吧。谢谢版主！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 10:14

版主，您好！我想知道为什么我们要用5%的脱脂牛奶来进行封闭？

如果背景太深，可否提高脱脂牛奶的浓度来进行封闭？谢谢O(∩_∩)O~

图片附件: 73243956.jpg (2013-3-18 10:14, 106.65 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15186

作者: 3N4G 时间: 2013-3-18 10:15

楼主你好，跑western可以不测浓度，直接跑内参么，那跑出的结果是不是得用那种灰度分析软件呢？谢谢

作者: avi317 时间: 2013-3-18 10:15

我用的一抗是多抗，那么全菌表达的产物，用一抗WB检测的时候是不是会出现不止我目的条带一条啊？我昨天刚做的WB一个槽就出现了几个条带，其中有我的目的条带。另外我SDS-PAGE的时候电泳缓冲液不小心用了5乘的了，是不是会对我的WB有影响啊，我看到DAB染色的时候出现了槽的形状。是不是因为缓冲液的原因啊？
求教啊！

作者: yonger 时间: 2013-3-18 10:16

麻烦您，帮我指点一下，我最近蛋白电泳，每次加完样品后，待样品刚刚跑离样品孔的时候，样品就从浓缩胶中漏了下来，然后沿着浓缩胶与分离胶的界面向两侧流动，后来原因找了很多如：玻璃板是否干净、平整、浓缩时间、压胶用的正丁醇是否清洗干净，这些都注意了！仍没有解决好！都快崩溃了，但每次两侧只加loading buffer 和marker的孔都没漏过，蛋白提取试剂都换了三种方法了，RIPA 和用加入buffer后水煮提取等都漏真不知道是怎么回事

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:17

楼主:您好！

我做WESTERN 用的是没有预染的marker，所以转膜后用丽春红染色标记marker，也把红色染料全部洗掉了，另外用含有1%的脱脂奶粉稀释一抗了，用的是荧光二抗，最后荧光显色时出现的是均匀光亮的红色，其他什么都没有。同时显色的同学人家是黑背景、绿色条带、红色marker 很漂亮的图。我的却是一块均匀的红色。请楼主指点一下。谢谢！

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1、增加洗膜次数

2、做一下一抗的不同的稀释度

3、内参做的怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:17

RIPA裂解蛋白，10000转离心后发现没有液体都是呈胶冻状？

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细胞还是组织？

哪个公司的产品？

超声了？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:17

好文，学习了！！请问封闭用的脱脂奶粉会不会对背景有影响？我们用的完达山的。背景一直很亮。一抗用自制的血清多抗。

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纯化一下抗体

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:18

To 版主：
这个配方OK，同一张膜重复洗3-4次都没问题。
而且，Stripping Buffer可以回收重复使用。

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呵呵

挺好

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:19

请教版主，我最近在做Western Blot，遇到这样一个问题：显影时，当ECL铺在PVDF膜上后，很快有亮光出现，但当我将膜放进压片盒准备压片时，就没有亮光了，后来压了挺长时间也未见条带。之后，我提高的二抗的稀释度，从1:2000到1:3000，就没有看见亮光，也没有压出条带。想问一下的是，这种情况除了抗体浓度过高，还有没有什么原因啦！

还有PVDF膜在ECL里多久可以拿出来压片？说明书上写了5min，但我觉得也要视情况而定吧。谢谢版主！

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继续稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:19

麻烦您，帮我指点一下，我最近蛋白电泳，每次加完样品后，待样品刚刚跑离样品孔的时候，样品就从浓缩胶中漏了下来，然后沿着浓缩胶与分离胶的界面向两侧流动，后来原因找了很多如：玻璃板是否干净、平整、浓缩时间、压胶用的正丁醇是否清洗干净，这些都注意了！仍没有解决好！都快崩溃了，但每次两侧只加loading buffer 和marker的孔都没漏过，蛋白提取试剂都换了三种方法了，RIPA 和用加入buffer后水煮提取等都漏真不知道是怎么回事

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应该是胶的问题

天热

胶凝的快

减低aps与temed用量

作者: qhyu 时间: 2013-3-18 10:19

楼主你好，麻烦问哈，我最近也刚做了几次western blot，上次做的时候没有采用阳性对照，没有显色，但是用丽春红染色Maker可见，还有些杂蛋白，但是昨天做的采用了阳性对照，可是也没有显色，用丽春红染色什么都没有，什么情况呢？是不是转膜有问题，可是操作一样啊，不知什么问题

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-18 10:20

楼主，孤啡肽和CGRP做过WB吗我看了一下它们的分子量都很小我没查错的话应该是1.8kda，3.7kda，这儿怎么做啊多大浓度的胶能跑出来啊

作者: bring 时间: 2013-3-18 10:20

楼主，孤啡肽和CGRP做过WB吗我看了一下它们的分子量都很小我没查错的话应该是1.8kda，3.7kda，这儿怎么做啊多大浓度的胶能跑出来啊

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cuturl('http://www.abcam.com/CGRP-antibody-ab47027.html')

cuturl('http://www.abcam.com/Nociceptin-antibody-ab98152.html')

可能楼主需要看看这个链接，CGRP的分子量大概是15kD，孤啡肽（Orphanin FQ）的分子量大概是20kD。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:21

楼主你好，麻烦问哈，我最近也刚做了几次western blot，上次做的时候没有采用阳性对照，没有显色，但是用丽春红染色Maker可见，还有些杂蛋白，但是昨天做的采用了阳性对照，可是也没有显色，用丽春红染色什么都没有，什么情况呢？是不是转膜有问题，可是操作一样啊，不知什么问题

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转膜后有膜上除了marker能看到外，还能看到样品蛋白吗？

作者: JK.jon 时间: 2013-3-18 10:21

急问老师：
我想分离34和37kD的蛋白，请问您分离胶的浓度，之前用10%和12.5%的浓度结果都是一条带，分不出来，谢谢指教

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:22

liaman wrote:
急问老师：
我想分离34和37kD的蛋白，请问您分离胶的浓度，之前用10%和12.5%的浓度结果都是一条带，分不出来，谢谢指教

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分子量差别太小

作者: utt0989 时间: 2013-3-18 10:22

老师，请教一下：我们实验室现在在做一些小分子蛋白，用的胶在12%-15%，发现不论是MARK还是目的条带在浓度越高的胶中会被压得越细长，有时还会相连，我们的上样量在20ug左右，不知道这种现象是否正常？另外，我听实验室老师说在胶里或是电泳液中加一种的溶剂可能可以改善，但是具体是啥他也忘了，不知道老师知道不？

麻烦老师解答，谢谢！！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:23

老师，请教一下：我们实验室现在在做一些小分子蛋白，用的胶在12%-15%，发现不论是MARK还是目的条带在浓度越高的胶中会被压得越细长，有时还会相连，我们的上样量在20ug左右，不知道这种现象是否正常？另外，我听实验室老师说在胶里或是电泳液中加一种的溶剂可能可以改善，但是具体是啥他也忘了，不知道老师知道不？

麻烦老师解答，谢谢！！

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应该是在配胶的时候加甘油吧
不是很确定

你可以试试

如果效果好，希望能放到帖子上来

作者: orangecake 时间: 2013-3-18 10:23

300ma，2h30min，冰浴电泳湿转，转完膜后，膜染色有条带，胶染色发现仍有条带占一半色淡，MAKER隐隐约约有几条大分子量的条带，200kda的目的条带最后发光检测没东西。53的目的条带有。这是为什么呢？求解

作者: abc816 时间: 2013-3-18 10:24

老师您好，请教您两个问题啊

1、同我们实验室的人用相同的电泳缓冲液，我用8%的胶跑出来的电流比他们用10、12、15%的胶电流都要小很多，这是什么原因啊？电流大小跟胶浓度有关吗？

2、我用8%的胶做分子量为142kda的蛋白，发现目的蛋白条带超宽（预染maker也很宽），而跑胶是溴酚蓝已经压成一条线了，这是什么原因啊？

作者: wsll 时间: 2013-3-18 10:24

只做了一次还是重复过很多次？

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重复了很多次呐

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-18 10:25

老师您好，请教您两个问题啊

1、同我们实验室的人用相同的电泳缓冲液，我用8%的胶跑出来的电流比他们用10、12、15%的胶电流都要小很多，这是什么原因啊？电流大小跟胶浓度有关吗？

2、我用8%的胶做分子量为142kda的蛋白，发现目的蛋白条带超宽（预染maker也很宽），而跑胶是溴酚蓝已经压成一条线了，这是什么原因啊？

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你好，我想问一下，你跑142kda的蛋白，分离胶用8%，那浓缩胶用多大浓度的？谢谢！

作者: mamamiya 时间: 2013-3-18 10:25

做WB分子量43 53挨得比较近的。不想把膜剪开。它们的一抗一个大鼠的一个兔的，可以混合在一起同时孵育吗二抗是抗鼠单克隆和抗兔多克隆的能否混在一起孵育？哪位了解，帮帮忙解答一下，谢谢啦。还有就是MAKER怎样才能在膜上发光显影呢?我用的是非预染的可是不发光，有劳大家推荐一个。

作者: 04906 时间: 2013-3-18 10:26

你好，我想问一下，你跑142kda的蛋白，分离胶用8%，那浓缩胶用多大浓度的？谢谢！

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浓缩胶就用5%的！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:26

300ma，2h30min，冰浴电泳湿转，转完膜后，膜染色有条带，胶染色发现仍有条带占一半色淡，MAKER隐隐约约有几条大分子量的条带，200kda的目的条带最后发光检测没东西。53的目的条带有。这是为什么呢？求解

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转膜条件已经很充分

用8%的胶吗？

上样量多少？

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-18 10:27

版主您好，新手上路，在半个月的试验中遇到无数问题，现在请教一下。

我的目的蛋白（膜蛋白）：ZO-1(220Kda)、Claudin-4（23Kda），抗体来自santa cruz。蛋白来源：大鼠肺组织。

内参：β-actin。

蛋白是用凯基的全蛋白试剂盒提取的。

配胶厚度1mm，梳子1.5mm。加入蛋白40微升（不包括loading buffer）

220Kda：浓缩胶4%80v，30min。分离胶8%110v，1h30min。

转膜：0.45的PVDF膜，甲醇活化2min，湿转，转膜液中加入0.1%SDS与10%甲醇，100v转膜2h。

染胶未见明显条带，丽春红染膜未见明显条带。

脱脂奶粉封闭1h，一抗四度孵育过夜，PBST洗5min×5次，二抗室温孵育1h。

曝光只能曝出内参。

23Kda：空跑胶300v30min，浓缩胶4%80v，30min。分离胶15%110v，1h30min。

转膜：022的PVDF膜，甲醇活化2min，转膜液中加入20%甲醇，296mA1h。

染胶未见明显条带，丽春红染膜未见明显条带。

0.45的PVDF膜，甲醇活化2min，转膜液中加入0.1%SDS与10%甲醇，100v转膜2h。

染胶未见明显条带，丽春红染膜未见明显条带。

曝光也是只能曝出内参。

问题：1、因为内参可以曝出，但目的蛋白位于胞膜，有没有必要重新提取膜蛋白？

2、抗体做免疫组化可以做出，但做WB一抗浓度1:50，还是没有结果，有没有必要换抗体？

3、步骤上还有啥需要注意的？

谢谢版主。

作者: lgm 时间: 2013-3-18 10:27

楼主您好，最近做的时候，加完ECL进到暗室以后，可以看见很强的亮光，持续时间很久，压片的时候接触就拿出来，感觉条带还可以，也是比较粗黑，但是能分清楚，如上面的图。时间延长至5s，就黑成一片了，孔与孔之间也连接起来了，如下面的图。ECL少加一点，情况就好一点。

我的蛋白上样量80ug，，两个板子同时跑，40v，80v，转膜100-110v，80min左右。5%脱脂奶粉室温封闭2h。图中上面的是目的蛋白，135kd，一抗1:3000，（abcam的，推荐1:5000-1:10000），洗膜3次，10-15min/次，二抗1:5000（国产）。下面的为actin，1:3000（proteintech的，没有推荐度，只是说明书上的WB图写的1:2000），洗膜二抗同上。您说我的问题是什么？蛋白量太多？一抗二抗高？请指教，谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15187

作者: 2541 时间: 2013-3-18 10:28

请问老师有没有碰到这种情况，整张膜背景很深，目的条带是白的，连β-actin也是这样，整个是翻过来的，mark也显出来了。不知道是不是RIPA的问题（1M Tris-HCl PH 8.0, 5ML ，氯化钠 0.88g， 10%SDS 1ml ，np-40 1ml ，10%叠氮化钠 0.5ml ，脱氧胆酸钠1g ，超纯水定容到100ml），原来一直是这么用的，这次新配的RIPA中10%叠氮化钠是去年10月配的，不知道会不会有影响。实在是想不出有什么原因了，很苦闷，压力很大....

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:28

请问老师有没有碰到这种情况，整张膜背景很深，目的条带是白的，连β-actin也是这样，整个是翻过来的，mark也显出来了。不知道是不是RIPA的问题（1M Tris-HCl PH 8.0, 5ML ，氯化钠 0.88g， 10%SDS 1ml ，np-40 1ml ，10%叠氮化钠 0.5ml ，脱氧胆酸钠1g ，超纯水定容到100ml），原来一直是这么用的，这次新配的RIPA中10%叠氮化钠是去年10月配的，不知道会不会有影响。实在是想不出有什么原因了，很苦闷，压力很大....

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调整一抗与二抗浓度

加大稀释度

作者: utt0989 时间: 2013-3-18 10:29

我是做western blot 的新手，这几次经常有ECL显色后可见的样本个数比上样的个数少，请问是怎么回事，感激不尽

作者: 8princess8 时间: 2013-3-18 10:32

我一直在做脊髓中髓鞘碱性蛋白MBP (21.5 kda)，条件：12%分离胶，5%浓缩胶，电泳80v/120V,转膜250mA，2h，用的是millipore的0.45的膜，Santa cruz一抗（1:500）4度过两夜，二抗HRP标记（1:2000）室温下两小时，重复很多次都没出来。请教下，实验条件对不？

作者: greenbee 时间: 2013-3-18 10:32

最近开始WB实验。蛋白上样量20微克，目的蛋白分子量70KD，选用4-15%的Bio-rad预制胶，100伏电泳70分钟，60毫安半干转膜1小时，5%PBS-Tween-milk封闭，0.5%PBS-Tween-milk配制一抗（单克隆）4度过夜，二抗室温1小时，洗膜0.5%PBS-Tween-milk，ECL-PLUS发光。内参actin42KD很好，实验本身应该没什么问题。但是目的蛋白的检测杂带很多，目的蛋白却很弱。下一步不知道如何调整实验条件。2个想法不知是否可行，请指导：1. 增加蛋白上样量；2. 一抗用封闭液配制。不知道楼主还有什么更好的建议没有

作者: 3648755 时间: 2013-3-18 10:33

请问有没有碰到这种问题，最近曝光时整张膜都很亮，爆出来黑乎乎一片，影响观察目的条带，所有的缓冲液和抗体都是新配的，实在是想不出有什么原因了，很着急啊求教啊

作者: is2011 时间: 2013-3-18 10:33

你好，我想问一下，发光后，膜上什么信号都没有，但是做的内参是有的，是不是抗体的问题呢？

作者: 49888 时间: 2013-3-18 10:34

前辈，您好！我想请问您一下，做western blot一个多月了，老是转膜转不好，用得是bio-rad的机子,湿转，我的目的蛋白是140Kd，最近转膜转后发现膜很花，肉眼就可看到蛋白泳道，非蛋白泳道的地方很花，像是膜干了的样子，而且胶明显缩小，marker很淡，用丽春红染色蛋白条带不明显，转膜条件是350mA，2小时（以前也是用这个条件，没有出现这次情况），转膜液是Tris-base 5.8g, glycine 2.9g, 0.37g SDS，200ml 甲醇，溶至终体积1000ml，胶是用8％的，胶是电泳前一天做的，转膜前膜转膜液中泡了5分钟，请问下前辈这是怎么回事呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:34

我是做western blot 的新手，这几次经常有ECL显色后可见的样本个数比上样的个数少，请问是怎么回事，感激不尽

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先把样品跑SDS-PAGE后染胶

同时还做一步：转膜后的丽春红染色

确认样品及转膜没有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:34

我一直在做脊髓中髓鞘碱性蛋白MBP (21.5 kda)，条件：12%分离胶，5%浓缩胶，电泳80v/120V,转膜250mA，2h，用的是millipore的0.45的膜，Santa cruz一抗（1:500）4度过两夜，二抗HRP标记（1:2000）室温下两小时，重复很多次都没出来。请教下，实验条件对不？

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实验条件基本可以

转膜：250mA，30min

内参做的如何？

我刚订购了MBP、MAP2抗体，近期要做

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:35

最近开始WB实验。蛋白上样量20微克，目的蛋白分子量70KD，选用4-15%的Bio-rad预制胶，100伏电泳70分钟，60毫安半干转膜1小时，5%PBS-Tween-milk封闭，0.5%PBS-Tween-milk配制一抗（单克隆）4度过夜，二抗室温1小时，洗膜0.5%PBS-Tween-milk，ECL-PLUS发光。内参actin42KD很好，实验本身应该没什么问题。但是目的蛋白的检测杂带很多，目的蛋白却很弱。下一步不知道如何调整实验条件。2个想法不知是否可行，请指导：1. 增加蛋白上样量；2. 一抗用封闭液配制。不知道楼主还有什么更好的建议没有

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调整一抗稀释度

可以试试3% BSA-TBST

把图片放上来

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:37

请问有没有碰到这种问题，最近曝光时整张膜都很亮，爆出来黑乎乎一片，影响观察目的条带，所有的缓冲液和抗体都是新配的，实在是想不出有什么原因了，很着急啊求教啊

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1、封闭及抗体稀释液

2、洗膜时间

3、ECL是哪个公司的？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:38

你好，我想问一下，发光后，膜上什么信号都没有，但是做的内参是有的，是不是抗体的问题呢？

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内参的结果呢？是有还是很好？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:45

前辈，您好！我想请问您一下，做western blot一个多月了，老是转膜转不好，用得是bio-rad的机子,湿转，我的目的蛋白是140Kd，最近转膜转后发现膜很花，肉眼就可看到蛋白泳道，非蛋白泳道的地方很花，像是膜干了的样子，而且胶明显缩小，marker很淡，用丽春红染色蛋白条带不明显，转膜条件是350mA，2小时（以前也是用这个条件，没有出现这次情况），转膜液是Tris-base 5.8g, glycine 2.9g, 0.37g SDS，200ml 甲醇，溶至终体积1000ml，胶是用8％的，胶是电泳前一天做的，转膜前膜转膜液中泡了5分钟，请问下前辈这是怎么回事呢？

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湿转体系：25mM tris，192mM glycine，0.01%SDS，20% 甲醇

转膜条件可以：300mA 2h

作者: xyw5 时间: 2013-3-18 10:46

内参能出来，我用的是DAB显色，ECL发光是不是更好点？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-18 10:46

内参的结果呢？是有还是很好？

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内参的结果很好。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:46

内参能出来，我用的是DAB显色，ECL发光是不是更好点？

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ECL敏感性要比DAB高N多倍

建议用ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:47

内参的结果很好。

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找厂家投诉试试

作者: wu11998866 时间: 2013-3-18 10:47

昨天又尝试了1次，蛋白上样量增加到30微克，一抗采用封闭液（5%milk-pbs-tween)配制，结果依然不理想。我们的LAS-4000机器操作后存档的是tif文件，好像上传不了啊

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:48

昨天又尝试了1次，蛋白上样量增加到30微克，一抗采用封闭液（5%milk-pbs-tween)配制，结果依然不理想。我们的LAS-4000机器操作后存档的是tif文件，好像上传不了啊

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做的是什么蛋白？

内参？

作者: xingyi08 时间: 2013-3-18 10:55

您好！

最近我提取了3只老鼠大脑标本，每只老鼠分同侧和对侧，共六个蛋白样品。

跑wb的结果是：(未附actin图片)

1、目的蛋白条带（26KD）：六个样本灰密度相差不大

2、beta-actin条带（43KD）：第三只鼠的两个样本灰密度比其他四个样本弱很多

3、考马斯亮蓝染色：第三只鼠的两个样本与其他样本有差异

（已做过5、6次，结果都差不多）是第三只鼠的蛋白提取有问题吗？如果是，那为什么目的条带灰密度差不多。

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图片附件: 58416770.jpg (2013-3-18 10:55, 41.52 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15189

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 10:56

楼主，您好！我今天做western时出现了一个奇怪的问题，我的目的蛋白是18kd的小分子蛋白，起初用200mA恒流 1.5h湿转（电压约30V），发现膜上完全没有预染marker的痕迹；加大电流至250mA 1.5h湿转（电压约50-60V），还是没转上，膜用丽春红染色也是什么都没有。膜用的是Millipore 0.45um的PVDF膜，“三明治”排列顺序和电极都没错，电转液也是新配的，实验室的师兄用同样的电转液转膜也没出现问题。请问这是什么原因呢？谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 10:56

还有，我提取的是组织蛋白（血管壁），裂解液用CST的cell lysis buffer，跑电泳时有拖尾现象，是不是存在杂质呢？如果是的话应如何去除？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:57

您好！

最近我提取了3只老鼠大脑标本，每只老鼠分同侧和对侧，共六个蛋白样品。

跑wb的结果是：(未附actin图片)

1、目的蛋白条带（26KD）：六个样本灰密度相差不大

2、beta-actin条带（43KD）：第三只鼠的两个样本灰密度比其他四个样本弱很多

3、考马斯亮蓝染色：第三只鼠的两个样本与其他样本有差异

（已做过5、6次，结果都差不多）是第三只鼠的蛋白提取有问题吗？如果是，那为什么目的条带灰密度差不多。

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对你的结果影响不大就没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:57

楼主，您好！我今天做western时出现了一个奇怪的问题，我的目的蛋白是18kd的小分子蛋白，起初用200mA恒流 1.5h湿转（电压约30V），发现膜上完全没有预染marker的痕迹；加大电流至250mA 1.5h湿转（电压约50-60V），还是没转上，膜用丽春红染色也是什么都没有。膜用的是Millipore 0.45um的PVDF膜，“三明治”排列顺序和电极都没错，电转液也是新配的，实验室的师兄用同样的电转液转膜也没出现问题。请问这是什么原因呢？谢谢！

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1、PVDF用无水甲醇浸泡活化10s

2、后用转缓浸泡PVDF膜，平衡

3、确保电极没有放反

4、18K的蛋白，250mA恒流，转膜20min

5、如果预染marker一点都没有，请再次确认电极！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 10:57

还有，我提取的是组织蛋白（血管壁），裂解液用CST的cell lysis buffer，跑电泳时有拖尾现象，是不是存在杂质呢？如果是的话应如何去除？

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是不是把提取蛋白的时候悬浮在上清中的脂类物质也收集了？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 10:58

对你的结果影响不大就没问题

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非常感谢您的回复。
问题就是：actin相差太大，势必对结果有影响。
疑惑就是：为什么该样品里43kd的大分子影响大，而26kd的小分子影响就小。如为了actin平，加大该样品的上样量，那么目的蛋白会有很大改变。

作者: www.1 时间: 2013-3-18 10:58

请教版主，我要跑一个180kDa的分子，转膜条件是稳流，350mA，因为我没有经验，想问一下，最好转多长时间？谢谢版主。

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-18 10:59

谢谢楼主！之前的问题已经解决了，现在有另外一个问题需要请教您。我显影的时候膜上荧光强度很高，压片10s条带比荧光上可视条带明显增粗、弥散，减少压片时间后表达程度较高的条带仍增粗较明显，请问应如何解决？降低一抗浓度是否可行？另显影和定影时间约为多少较佳呢？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:00

请教版主，我要跑一个180kDa的分子，转膜条件是稳流，350mA，因为我没有经验，想问一下，最好转多长时间？谢谢版主。

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300mA恒流，2h30min

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:00

谢谢楼主！之前的问题已经解决了，现在有另外一个问题需要请教您。我显影的时候膜上荧光强度很高，压片10s条带比荧光上可视条带明显增粗、弥散，减少压片时间后表达程度较高的条带仍增粗较明显，请问应如何解决？降低一抗浓度是否可行？另显影和定影时间约为多少较佳呢？谢谢！

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1、减少上样量

2、降低一抗浓度

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 11:01

请高手指点：

1、提取蛋白后，得到的蛋白上清液与Loading buffer混合，在沸水中煮5min变性，然后分装-80度保管。分装的小管蛋白上样前还需要再在沸水中煮吗？还是室温融化后直接上样？

2、在同一块胶上跑的蛋白样品，一定要是同一批次提取的蛋白吗？

3、蛋白提取过程中最容易出的错误是什么？

我的步骤是：

一、蛋白提取
(1）从-80℃冰箱取出脑组织标本，先放入液氮中，然后取出来称量湿重
（EP管从液氮中取出后立即旋开，防止爆开掉出标本）
（EP管中蛋白取出放在锡箔纸上称量）。
(2）提取蛋白工作液配制：细胞裂解液lysis+蛋白酶抑制剂+超纯水(lysis和蛋白酶抑制剂均稀释成1x)
(3）加入工作液（标本重量：蛋白提取液=1mg：4-5ul）
(4）裂解组织的方法：
1、研磨：预冷的细胞裂解液加入盛有标本的EP管，置于冰上；用小棒研磨（10min）至无可视微粒；充分裂解30min
2、超声破碎仪（每次作用4-5s，间歇6s，每个标本作用5-6次）；在冰上操作，注意清洗钻头
（5）25 000 rpm 离心30min。
（6）收集上清液，分装，-80℃保存。

7、蛋白变性：（100℃煮5min蛋白液：4x的LB=3:1），然后再保存变性蛋白在-80℃冰箱。
（变性时，EP管用封口膜缠紧，防止爆开！，变性时间超过3.5min爆开的几率最大）

可是有一次蛋白提取出了问题，实在想不出是哪一步。还请高手指点一二，谢谢！

作者: IAM007 时间: 2013-3-18 11:02

我的蛋白13KDa，最近跑出来总是这个样子，请问版主这是什么原因呢？（4%压缩胶，10%分离胶，转膜200mA 90min）

还有就是我的目的条带每次都出，但是Bactin却出的不理想，条带很浅有的甚至不出。抗体应该没有问题的。

图片附件: 21569750.jpg (2013-3-18 11:02, 16.7 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15190

作者: lgm 时间: 2013-3-18 11:02

楼主老师，还想请教个问题，由于实验室条件所限，我做的抗体分子量和actin大小都是42KD，请问做实验时下列两种方式哪个更准确，更可取？

1. 一抗与actin分别各做一次完整的western blot流程，第一次只做actin，下次只做一抗，两次上样量相等。

2. 只上一次样，先做actin，显影完毕后，取出膜漂洗，再加一抗孵育，再显影。

再一个问题，我的文章刚刚修回，审稿人就提到了western图片问题，人家要求我在图上同时标出蛋白markers以便准确知道一抗与actin的分子量，这可愁坏了我，由于两者分子量相等不知如何标才是？

恳请楼主老师给些建议，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:03

请高手指点：

1、提取蛋白后，得到的蛋白上清液与Loading buffer混合，在沸水中煮5min变性，然后分装-80度保管。分装的小管蛋白上样前还需要再在沸水中煮吗？还是室温融化后直接上样？

2、在同一块胶上跑的蛋白样品，一定要是同一批次提取的蛋白吗？

3、蛋白提取过程中最容易出的错误是什么？

我的步骤是：

一、蛋白提取
(1）从-80℃冰箱取出脑组织标本，先放入液氮中，然后取出来称量湿重
（EP管从液氮中取出后立即旋开，防止爆开掉出标本）
（EP管中蛋白取出放在锡箔纸上称量）。
(2）提取蛋白工作液配制：细胞裂解液lysis+蛋白酶抑制剂+超纯水(lysis和蛋白酶抑制剂均稀释成1x)
(3）加入工作液（标本重量：蛋白提取液=1mg：4-5ul）
(4）裂解组织的方法：
1、研磨：预冷的细胞裂解液加入盛有标本的EP管，置于冰上；用小棒研磨（10min）至无可视微粒；充分裂解30min
2、超声破碎仪（每次作用4-5s，间歇6s，每个标本作用5-6次）；在冰上操作，注意清洗钻头
（5）25 000 rpm 离心30min。
（6）收集上清液，分装，-80℃保存。

7、蛋白变性：（100℃煮5min蛋白液：4x的LB=3:1），然后再保存变性蛋白在-80℃冰箱。
（变性时，EP管用封口膜缠紧，防止爆开！，变性时间超过3.5min爆开的几率最大）

可是有一次蛋白提取出了问题，实在想不出是哪一步。还请高手指点一二，谢谢！

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变性分装后直接在室温融化跑电泳

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:03

我的蛋白13KDa，最近跑出来总是这个样子，请问版主这是什么原因呢？（4%压缩胶，10%分离胶，转膜200mA 90min）
还有就是我的目的条带每次都出，但是Bactin却出的不理想，条带很浅有的甚至不出。抗体应该没有问题的。

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胶浓度用12%的试试

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:03

楼主老师，还想请教个问题，由于实验室条件所限，我做的抗体分子量和actin大小都是42KD，请问做实验时下列两种方式哪个更准确，更可取？

1. 一抗与actin分别各做一次完整的western blot流程，第一次只做actin，下次只做一抗，两次上样量相等。

2. 只上一次样，先做actin，显影完毕后，取出膜漂洗，再加一抗孵育，再显影。

再一个问题，我的文章刚刚修回，审稿人就提到了western图片问题，人家要求我在图上同时标出蛋白markers以便准确知道一抗与actin的分子量，这可愁坏了我，由于两者分子量相等不知如何标才是？

恳请楼主老师给些建议，谢谢

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1、你用的是那一种方法？

2、marker直接标上去就行了

作者: lgm 时间: 2013-3-18 11:06

我两种都用过，一开始用的第一种，后来听别人说第二种比较好，就改成第二种了。但是自己心里还是糊里糊涂的，希望老师能帮忙分析一下。

我现在最愁的是，两者的分子量相等，marker如何标上去才好？我怕一旦标上去会是自找麻烦，审稿人又要在分子量相等这方面找麻烦

所以请楼主老师给些建议，谢谢了

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 11:07

楼主您好：

我用到的一抗稀释比例大1:1万，因此配制一抗一次都是10ml，可是短时间内用不完。用封闭液稀释一抗，然后保存在-20，可是又担心：

1、反复冻融会不会影响一抗？

2、牛奶会不会变质？

3、牛奶会不会有沉淀？

谢谢您！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 11:07

还有一个问题：

我要跑16kd和26kd的蛋白，用的是0.22um的PVDF膜，结果发现26kd的背景很干净，而16kd的分子有背景，是不是膜的问题？还是其他原因？

所以请楼主您给些建议，谢谢了

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-18 11:07

提蛋白的时候为何要在冰上进行啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:08

我两种都用过，一开始用的第一种，后来听别人说第二种比较好，就改成第二种了。但是自己心里还是糊里糊涂的，希望老师能帮忙分析一下。

我现在最愁的是，两者的分子量相等，marker如何标上去才好？我怕一旦标上去会是自找麻烦，审稿人又要在分子量相等这方面找麻烦

所以请楼主老师给些建议，谢谢了

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没什么好的建议

换成我，我会直接标上

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:08

楼主您好：

我用到的一抗稀释比例大1:1万，因此配制一抗一次都是10ml，可是短时间内用不完。用封闭液稀释一抗，然后保存在-20，可是又担心：

1、反复冻融会不会影响一抗？

2、牛奶会不会变质？

3、牛奶会不会有沉淀？

谢谢您！

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-20度冻存，拿出来使用一次问题不大，我试过

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:09

还有一个问题：

我要跑16kd和26kd的蛋白，用的是0.22um的PVDF膜，结果发现26kd的背景很干净，而16kd的分子有背景，是不是膜的问题？还是其他原因？

所以请楼主您给些建议，谢谢了

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1、二抗相同吗？

2、调整一抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:09

提蛋白的时候为何要在冰上进行啊？

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防止蛋白降解

作者: am10 时间: 2013-3-18 11:10

做过几个羊二抗的抗体，背景很黑，膜在发光，请问有什么解决方案不

还有，做CO-IP时，最后压片，很多时候泳道都是黑的，请问有什么解决方案吗

作者: lgm 时间: 2013-3-18 11:11

楼主你好，我最近在跑一个磷酸化蛋白，分子量是48

15%的胶，电压是80v 150V,

湿转300mA，60分钟

5%BSA封闭两小时，TBST洗膜10min 3次，一抗是ABcam的，1:2000,二抗中杉的 1:5000

用的是ECL发光，电脑曝光的

但是我的图片总是这样，图片好像反向了，泳道间隔处是暗的泳道是亮的

我重复两次，图片均是这样的

另外一个非磷酸化的蛋白也不太理想，之前用的5%光明脱脂奶粉，santa的一抗1:200，其他和上述类似

后来我改用了10%脱脂奶粉，增加了封闭时间，一抗改为1:100

可是条带也不行

问题有点多，麻烦楼主帮忙分析下，我需要怎样改进，我刚做wb不久，很多东西还不太会分析，谢谢啦！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 11:11

楼主您好：

最近跑wb在拔梳子这一步时，发现有时候会上样孔坍陷，导致不能加样进去。不知道是什么原因

：配胶的试剂？拔梳子的方法？拔梳子的过程中有气泡？（我是浸电泳液中拔的，梳子和玻璃板配套，浓缩胶凝固30min以上，温度24度+）

作者: ukonptp 时间: 2013-3-18 11:12

楼主你好，我做了一段时间WB了，有些条带能做得挺漂亮，但是有些条带不尽人意。我想就以下几个问题向你请教下，到底是什么原因导致的。
首先是，条带的中间为什么会出现“中空现象”，碰到过几次，有时候中间淡边上一圈黑，有时候一边黑一边淡，不均匀。的是上样的问题（孔的问题？），转膜的问题（气泡）？还是什么问题呢？如图：

还有就是以前我跑胶的时候无论8%还是12%，跑到后面分离胶的时候溴酚蓝基本是挺平的一条线如图：

但是最近的2次，我跑的是12%的胶，制胶过程啊什么的都跟以前一样，结果那个溴酚蓝从开始都最后都很丑，没压平，如图：

然后，曝光出来的条带也不好看，有些宽，有些窄。特别是最边上的2个孔。如图：

然后我想问你，这个溴酚蓝不能压平会是什么原因？胶的问题？跟跑胶电流大小有关（浓缩胶35mA，分离胶45mA）？电泳液的问题（用过好多次了）？然后，这样会不会影响结果条带？
还有，如果我就用这张胶片扫描后，用Quantity One 分析，其结果会不会因为条带宽窄不同而影响准确性呢（条带的宽窄会不会影响最终灰度值（曲线下面积）既真正的蛋白定量）？

最后，还有个问题：我做的某些个蛋白，做了几次都很淡（一抗我是参照说明书按最高浓度来的 santa 1：100；曝光压了15min）如图：

请问,我该怎么分析这个条带淡的原因，是本身这个蛋白表达很少（膜再生，内参条带不淡的）？还是我实验过程的原因（转膜不够充分）？还是这个抗体质量不过关？我该怎么改进？我试过增加上样量（2.5倍），其结果是内参粘连波浪形，惨不忍睹。

望楼主能耐心赐教，学弟感激不尽~

图片附件: 67492850.jpg (2013-3-18 11:12, 11.91 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15191

作者: ukonptp 时间: 2013-3-18 11:12

最后张图片好像没上传成功，补上，很淡的条带如图：

作者: wu11998866 时间: 2013-3-18 11:12

老师你好，我刚开始做WB，提取贴壁细胞蛋白的时候用细胞刮刮下细胞，直接将细胞收集到小EP管里面（和着培养液一起），然后离心取细胞，用RIPA裂解（450ulRIPA配了50ulPMSF），结果有两管细胞浓度非常低，但是收集的细胞的量都差不多，做了两次，都是这样。我就想问是不是裂解液的问题？还是其他什么问题啊？先谢了！

作者: 101010 时间: 2013-3-18 11:13

转膜后为什么胶上和膜上都没有条带了，而且白白的，没有任何颜色？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:13

楼主您好：

最近跑wb在拔梳子这一步时，发现有时候会上样孔坍陷，导致不能加样进去。不知道是什么原因

：配胶的试剂？拔梳子的方法？拔梳子的过程中有气泡？（我是浸电泳液中拔的，梳子和玻璃板配套，浓缩胶凝固30min以上，温度24度+）

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别在电泳液中拔

看看你的浓缩胶是否聚合好了

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:14

楼主你好，我做了一段时间WB了，有些条带能做得挺漂亮，但是有些条带不尽人意。我想就以下几个问题向你请教下，到底是什么原因导致的。
首先是，条带的中间为什么会出现“中空现象”，碰到过几次，有时候中间淡边上一圈黑，有时候一边黑一边淡，不均匀。的是上样的问题（孔的问题？），转膜的问题（气泡）？还是什么问题呢？如图：

还有就是以前我跑胶的时候无论8%还是12%，跑到后面分离胶的时候溴酚蓝基本是挺平的一条线如图：

但是最近的2次，我跑的是12%的胶，制胶过程啊什么的都跟以前一样，结果那个溴酚蓝从开始都最后都很丑，没压平，如图：

然后，曝光出来的条带也不好看，有些宽，有些窄。特别是最边上的2个孔。如图：

然后我想问你，这个溴酚蓝不能压平会是什么原因？胶的问题？跟跑胶电流大小有关（浓缩胶35mA，分离胶45mA）？电泳液的问题（用过好多次了）？然后，这样会不会影响结果条带？
还有，如果我就用这张胶片扫描后，用Quantity One 分析，其结果会不会因为条带宽窄不同而影响准确性呢（条带的宽窄会不会影响最终灰度值（曲线下面积）既真正的蛋白定量）？

最后，还有个问题：我做的某些个蛋白，做了几次都很淡（一抗我是参照说明书按最高浓度来的 santa 1：100；曝光压了15min）如图：

请问,我该怎么分析这个条带淡的原因，是本身这个蛋白表达很少（膜再生，内参条带不淡的）？还是我实验过程的原因（转膜不够充分）？还是这个抗体质量不过关？我该怎么改进？我试过增加上样量（2.5倍），其结果是内参粘连波浪形，惨不忍睹。

望楼主能耐心赐教，学弟感激不尽~

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1、第一个问题由于胶的问题造成

2、中间换试剂了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:15

老师你好，我刚开始做WB，提取贴壁细胞蛋白的时候用细胞刮刮下细胞，直接将细胞收集到小EP管里面（和着培养液一起），然后离心取细胞，用RIPA裂解（450ulRIPA配了50ulPMSF），结果有两管细胞浓度非常低，但是收集的细胞的量都差不多，做了两次，都是这样。我就想问是不是裂解液的问题？还是其他什么问题啊？先谢了！

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细胞数量有多少？

RIPA是你自己配制的吗？

450ulRIPA加了50ul PMSF，那么PMSF储液浓度是多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:16

转膜后为什么胶上和膜上都没有条带了，而且白白的，没有任何颜色？

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位置放反了？

请检查胶、膜位置与正负极

作者: tuuu2 时间: 2013-3-18 11:16

别在电泳液中拔

看看你的浓缩胶是否聚合好了

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请问不在电泳液中拔梳子，应该在哪儿拔呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:17

请问不在电泳液中拔梳子，应该在哪儿拔呢？

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直接拔梳子，之后放到电泳槽中，加电泳缓冲液

作者: 2541 时间: 2013-3-18 11:17

做DAB染色需要注意什么？反应条件怎么摸？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:17

做DAB染色需要注意什么？反应条件怎么摸？

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参考说明书

作者: INK 时间: 2013-3-18 11:18

请教大神了，小弟最近正跑个15kDa的小蛋白，用的15%下层胶，1抗1比2000，二抗1比1500，但是beta-actin和目的条带都跑出多个，是什么原因啊？

此为beta-actin。。。

此为目的条带。。。

好丢人哦。。。。

作者: zhezhe 时间: 2013-3-18 11:18

最近做WB一直做不出来，上样量已经100ug了。7.5%分离胶，3.5%积层胶，电泳60v跑到底，预染marker分开。转膜湿转300ma 2.5h，转完之后膜丽春红染色10min,目的条带分子量（140KD）附近都没有条带，小分子的条带清晰，250KD附近隐约有条带。难道是转膜不够？？？
就继续做了，5%BSA封闭室温1.5h，一抗是R&D，这个抗体之前做免疫组化是出了结果，多克隆兔抗人，1:1000,4°过夜，TBST 15min,3次，二抗是ICELAB，1:5000室温1h，TBST 15Min ,3次。
显色用的是milippore的DAB显色，曝光时整个膜都在发光，但是随着时间延长，慢慢荧光是不是淬灭了，荧光就越来越少，某个时间点就只有目的条带那里有荧光了，爆了底片30s，拿出来之后目的条带那里的荧光液没有了，整个膜就一点荧光就没有了。重新加了显色液，上述过程又再一次出现。观察爆完之后的膜，非常黄，像烤焦了一样？
出了什么问题吗？？？纠结？？？

作者: zhezhe 时间: 2013-3-18 11:19

补充下，同一个胶转的膜，内参GAPDH和 P-AKT、P-ERK都出的蛮好的，完全没有背景。

作者: zhezhe 时间: 2013-3-18 11:20

封闭条件都是一样的，二抗也是用的一样的兔1:5000，为什么这几个蛋白就背景很干净呢？？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:21

请教大神了，小弟最近正跑个15kDa的小蛋白，用的15%下层胶，1抗1比2000，二抗1比1500，但是beta-actin和目的条带都跑出多个，是什么原因啊？

此为beta-actin。。。

此为目的条带。。。

好丢人哦。。。。

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调整一抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:21

最近做WB一直做不出来，上样量已经100ug了。7.5%分离胶，3.5%积层胶，电泳60v跑到底，预染marker分开。转膜湿转300ma 2.5h，转完之后膜丽春红染色10min,目的条带分子量（140KD）附近都没有条带，小分子的条带清晰，250KD附近隐约有条带。难道是转膜不够？？？
就继续做了，5%BSA封闭室温1.5h，一抗是R&D，这个抗体之前做免疫组化是出了结果，多克隆兔抗人，1:1000,4°过夜，TBST 15min,3次，二抗是ICELAB，1:5000室温1h，TBST 15Min ,3次。
显色用的是milippore的DAB显色，曝光时整个膜都在发光，但是随着时间延长，慢慢荧光是不是淬灭了，荧光就越来越少，某个时间点就只有目的条带那里有荧光了，爆了底片30s，拿出来之后目的条带那里的荧光液没有了，整个膜就一点荧光就没有了。重新加了显色液，上述过程又再一次出现。观察爆完之后的膜，非常黄，像烤焦了一样？
出了什么问题吗？？？纠结？？？

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1、上样量不是关键，100ug已经太大

2、大分子量处，丽春红染色不会有很多清晰的条带

3、组化与WB不是一回事，不要相提并论

4、蛋白名称？货号？

5、加了DAB显色液，然后曝光？这个不对哦。请确认！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:21

补充下，同一个胶转的膜，内参GAPDH和 P-AKT、P-ERK都出的蛮好的，完全没有背景。

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用ECL的还是DAB？

作者: 66+77 时间: 2013-3-18 11:22

老师：您好！下图是我做的PARP和tubulin，这两个蛋白以前做过，都做出来，但是最近不知为何出现这种情况？我的一抗和二抗及ECL都是CST的，实验条件都跟以前一样。一抗比例1：2000和1：1000（PARP)

图片附件: 57002352.jpg (2013-3-18 11:22, 36.72 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15192

作者: qqq111 时间: 2013-3-18 11:22

请问-80度冰箱冻存一年的外周血单个核细胞可不可以做WESTERN 检测蛋白含量?有没有人做过?

作者: avi317 时间: 2013-3-18 11:23

请问楼主用过驴抗羊的二抗没有，国内公司哪家的比较好呢

作者: qumm1985 时间: 2013-3-18 11:23

你好呀，fang 老师，我刚学western没多久，之间出现了一下几点问题，望帮我解答一下，谢谢！
1、胶凝后，拔掉梳子后，上样孔里面有很多残留胶，拔梳子的时候也看到梳子跟玻璃板之间有空隙，但并没有出现漏胶情况，请问这个是什么导致的呢？
2、100V冰域转膜后，其中一块膜上有多条肉眼可以看到的蓝色的与marker对齐的条带，跟marker 是平行的，很是奇怪！
3、我们从abcam买的一抗，浓度要求1:500--1:250，我就采用了这两个浓度，二抗1：1000， ECL发光，显影的时候我膜铺到保鲜膜上面，然后在其正面点滴ECL，反应一会后暗视野中观察，背景慢慢才会有亮光，但只要一抗是1：250的有亮光，而且是整张膜都亮，显影一到两分钟显影定影后，胶片上第二块膜显出来了，第一块没有一点现出来。但是，第二块显出来的是黑背景上面隐约有条带，黑背景呈现泳道状清晰可见，不知道这个是怎么回事，一抗应该没问题吧？是不是孵完二抗后用TBST多洗一会会好呢？请帮帮忙，给点建议，谢谢啦！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:24

请问-80度冰箱冻存一年的外周血单个核细胞可不可以做WESTERN 检测蛋白含量?有没有人做过?

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应该可以

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:24

老师：您好！下图是我做的PARP和tubulin，这两个蛋白以前做过，都做出来，但是最近不知为何出现这种情况？我的一抗和二抗及ECL都是CST的，实验条件都跟以前一样。一抗比例1：2000和1：1000（PARP)

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检查缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:25

请问楼主用过驴抗羊的二抗没有，国内公司哪家的比较好呢

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我们一般用兔抗羊

驴抗羊没用过

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:25

你好呀，fang 老师，我刚学western没多久，之间出现了一下几点问题，望帮我解答一下，谢谢！
1、胶凝后，拔掉梳子后，上样孔里面有很多残留胶，拔梳子的时候也看到梳子跟玻璃板之间有空隙，但并没有出现漏胶情况，请问这个是什么导致的呢？
2、100V冰域转膜后，其中一块膜上有多条肉眼可以看到的蓝色的与marker对齐的条带，跟marker 是平行的，很是奇怪！
3、我们从abcam买的一抗，浓度要求1:500--1:250，我就采用了这两个浓度，二抗1：1000， ECL发光，显影的时候我膜铺到保鲜膜上面，然后在其正面点滴ECL，反应一会后暗视野中观察，背景慢慢才会有亮光，但只要一抗是1：250的有亮光，而且是整张膜都亮，显影一到两分钟显影定影后，胶片上第二块膜显出来了，第一块没有一点现出来。但是，第二块显出来的是黑背景上面隐约有条带，黑背景呈现泳道状清晰可见，不知道这个是怎么回事，一抗应该没问题吧？是不是孵完二抗后用TBST多洗一会会好呢？请帮帮忙，给点建议，谢谢啦！

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1、胶聚合条件不合适

2、没看懂

3、一抗、二抗做稀释度

作者: wood533 时间: 2013-3-18 11:26

应该可以

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但是,NBA老师,一直做WESTERN的预实验没有跑出条带,而且奇怪的是实验前定量有蛋白,量也不低,但是电泳没有跑出条带,是什么原因呢?蛋白质降解的可能性大,还是有其他原因呢?请老师帮忙解答

作者: vivian4123 时间: 2013-3-18 11:26

更正都是用的ECL发光液，我们常规做法就是把发光液滴到膜上，然后进暗室曝光。
1、上样量不是关键，100ug已经太大
之前做30ug、50ug都没有做出来，所以就上到100ug这么大了。

2、大分子量处，丽春红染色不会有很多清晰的条带
昨天又做了一次，300ma转了3h30min，丽春红染膜还是一样的，小分那里有条带，100以上的完全没有了，考染胶发现小分子量那里仍然还是有很多清晰的条带，大分子量那里也有条带，但是比较模糊。
请问，我的转膜条件到底对不对呀？？？纠结。。。。

3、组化与WB不是一回事，不要相提并论
做了很久了，WB就是做出来，组化和免疫荧光都出来了，但是就是WB出不来，所以实验一直无法进行下去。悲剧，，，，

4、蛋白名称？货号？
蛋白是P-AXL R&D AF2228

作者: vivian4123 时间: 2013-3-18 11:26

1、上样量不是关键，100ug已经太大

2、大分子量处，丽春红染色不会有很多清晰的条带

3、组化与WB不是一回事，不要相提并论

4、蛋白名称？货号？

5、加了DAB显色液，然后曝光？这个不对哦。请确认！

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更正都是用的ECL发光液，我们常规做法就是把发光液滴到膜上，然后进暗室曝光。
1、上样量不是关键，100ug已经太大
之前做30ug、50ug都没有做出来，所以就上到100ug这么大了。

2、大分子量处，丽春红染色不会有很多清晰的条带
昨天又做了一次，300ma转了3h30min，丽春红染膜还是一样的，小分那里有条带，100以上的完全没有了，考染胶发现小分子量那里仍然还是有很多清晰的条带，大分子量那里也有条带，但是比较模糊。
请问，我的转膜条件到底对不对呀？？？纠结。。。。

3、组化与WB不是一回事，不要相提并论
做了很久了，WB就是做出来，组化和免疫荧光都出来了，但是就是WB出不来，所以实验一直无法进行下去。悲剧，，，，

4、蛋白名称？货号？
蛋白是P-AXL R&D AF2228

作者: 131415 时间: 2013-3-18 11:27

楼主啊

脑组织的nogo-a大家有做过WB的吗我做了快俩月了就是没出哪位有空麻烦指点一下啊不胜感激，谢谢啊
5% 100v 40min

10%120v 60min

转膜 PVDF0.45 300mA 4度冰浴 2h30min

5%脱脂奶粉封闭1h

一抗过夜 4度

二抗 2h室温摇床

ECL发光

同一张膜的内参【转膜60min】和另一个目的蛋白都有条带且清晰，nogo-a就是没出过，抗体也换了还是没有，试剂公司说是裂解液的问题，nogo-a是核蛋白，我的裂解配方是【50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS】
大家帮忙看看，这个配方能提出核蛋白吗

我的实验过程和方法有什么需要改正的地方吗麻烦大家了先谢过了。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:27

但是,方老师,一直做WESTERN的预实验没有跑出条带,而且奇怪的是实验前定量有蛋白,量也不低,但是电泳没有跑出条带,是什么原因呢?蛋白质降解的可能性大,还是有其他原因呢?请老师帮忙解答

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定量受到影响

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:27

更正都是用的ECL发光液，我们常规做法就是把发光液滴到膜上，然后进暗室曝光。
1、上样量不是关键，100ug已经太大
之前做30ug、50ug都没有做出来，所以就上到100ug这么大了。

2、大分子量处，丽春红染色不会有很多清晰的条带
昨天又做了一次，300ma转了3h30min，丽春红染膜还是一样的，小分那里有条带，100以上的完全没有了，考染胶发现小分子量那里仍然还是有很多清晰的条带，大分子量那里也有条带，但是比较模糊。
请问，我的转膜条件到底对不对呀？？？纠结。。。。

3、组化与WB不是一回事，不要相提并论
做了很久了，WB就是做出来，组化和免疫荧光都出来了，但是就是WB出不来，所以实验一直无法进行下去。悲剧，，，，

4、蛋白名称？货号？
蛋白是P-AXL R&D AF2228

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内参做的怎样？
是磷酸化的AXL？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:28

楼主啊

脑组织的nogo-a大家有做过WB的吗我做了快俩月了就是没出哪位有空麻烦指点一下啊不胜感激，谢谢啊
5% 100v 40min

10%120v 60min

转膜 PVDF0.45 300mA 4度冰浴 2h30min

5%脱脂奶粉封闭1h

一抗过夜 4度

二抗 2h室温摇床

ECL发光

同一张膜的内参【转膜60min】和另一个目的蛋白都有条带且清晰，nogo-a就是没出过，抗体也换了还是没有，试剂公司说是裂解液的问题，nogo-a是核蛋白，我的裂解配方是【50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton x-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS】
大家帮忙看看，这个配方能提出核蛋白吗

我的实验过程和方法有什么需要改正的地方吗麻烦大家了先谢过了。

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裂解液没什么问题

ECL用的是哪里的？

另一个做出来的目的蛋白是什么情况？

作者: vcve 时间: 2013-3-18 11:28

内参做的怎样？

是磷酸化的AXL？

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内参很整齐，没背景。
是磷酸化的AXL，我要做总AXL和磷酸化的AXL，两个现在都没有出来，曝光结果都是一样全是背景。昨天做的封闭改为1h30min，还是背景比较深，没有条带。
AXL是羊抗人的多克隆，P-AXL是兔抗人多克隆。羊的二抗实验室其他师姐也没有做出来，因为兔二抗同时做内参什么的，都可以做出来，所以觉得至少二抗应该是没有问题，所以期望着P-AXL能做出来，结果还是悲剧，一直做出出来。
今天做了细胞免疫化学，结果很好。
所以我想请问下如果WB实在做不出来，可不可以用细胞免疫荧光或者免疫化学代替WB做个半定量。我是准备做AXL干扰下调和上调，进而看下游蛋白和细胞生物学功能的改变。

作者: moonlight45 时间: 2013-3-18 11:29

做RB蛋白，是核蛋白，提蛋白提的是总蛋白可以做的出来吗？理论上。

如果半干转时根据3毫安/cm2算话，，就只有30毫安，3伏左右，36KD的内参要三个小时，请教了老师说太小了电压，可以加大到15伏，一般内参半小时可以。请问是这样嘛？（转膜液应该是没有问题的。）

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-18 11:30

裂解液没什么问题

ECL用的是哪里的？

另一个做出来的目的蛋白是什么情况？

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ECL是thermo的supersignal west pico另一个做出来的目的蛋白另一个做出来的目的蛋白

另一个做出来的目的蛋白条见下图

那我现在该怎么办呢

图片附件: 88496830.jpg (2013-3-18 11:30, 3.2 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15194

作者: eric930 时间: 2013-3-18 11:30

我的目的蛋白位于线粒体膜上，收集的样本是细胞，一定要把线粒体蛋白提取出来做WB，还是可以直接提取总蛋白呢？要是提取线粒体蛋白，用什么裂解液好呢？

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-18 11:30

小弟第一次做western blot。不明白为什么从组织中提完蛋白后不能直接加抗体检测，正如ELIZA一样。而要跑电泳呢？

作者: lxh031 时间: 2013-3-18 11:31

老师，你好，我最近在跑一个分子量47kd左右的蛋白，内参用的β-actin，每次跑两个胶一板做目的蛋白，一板做内参，两边加样完全相同，除了一抗不同外其它步骤完全相同，但内参显影正常，目的蛋白的那张膜没有目的蛋白显影，膜的边缘经常出现连续的条带，有时是上缘或下缘，有时是整个膜的边缘。请老师指教。暂时没有图片。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:31

内参很整齐，没背景。
是磷酸化的AXL，我要做总AXL和磷酸化的AXL，两个现在都没有出来，曝光结果都是一样全是背景。昨天做的封闭改为1h30min，还是背景比较深，没有条带。
AXL是羊抗人的多克隆，P-AXL是兔抗人多克隆。羊的二抗实验室其他师姐也没有做出来，因为兔二抗同时做内参什么的，都可以做出来，所以觉得至少二抗应该是没有问题，所以期望着P-AXL能做出来，结果还是悲剧，一直做出出来。
今天做了细胞免疫化学，结果很好。
所以我想请问下如果WB实在做不出来，可不可以用细胞免疫荧光或者免疫化学代替WB做个半定量。我是准备做AXL干扰下调和上调，进而看下游蛋白和细胞生物学功能的改变。

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我查了下AXL蛋白，做AXL应该问题不大，但是磷酸化的似乎很少

调整一抗稀释度，做预实验

细胞免疫等方法做不了半定量吧

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:33

ECL是thermo的supersignal west pico另一个做出来的目的蛋白另一个做出来的目的蛋白

另一个做出来的目的蛋白条见下图

那我现在该怎么办呢

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调整一下一抗的稀释度

不行可以投诉抗体

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:33

我的目的蛋白位于线粒体膜上，收集的样本是细胞，一定要把线粒体蛋白提取出来做WB，还是可以直接提取总蛋白呢？要是提取线粒体蛋白，用什么裂解液好呢？

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做什么蛋白？研究目的是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 11:34

老师，你好，我最近在跑一个分子量47kd左右的蛋白，内参用的β-actin，每次跑两个胶一板做目的蛋白，一板做内参，两边加样完全相同，除了一抗不同外其它步骤完全相同，但内参显影正常，目的蛋白的那张膜没有目的蛋白显影，膜的边缘经常出现连续的条带，有时是上缘或下缘，有时是整个膜的边缘。请老师指教。暂时没有图片。

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一抗造成的非特异

目的是什么蛋白？

哪里的抗体？

作者: mickeylin 时间: 2013-3-18 11:44

我查了下AXL蛋白，做AXL应该问题不大，但是磷酸化的似乎很少

调整一抗稀释度，做预实验

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细胞免疫等方法做不了半定量吧
这是老板从国外带回来的课题。她在国外的实验室里面也是一直做wb做不出来，所以老板自己也很困惑。我已经试了一个月了，还是没有条带，全是背景，完全没有条带。实验时间紧迫呀，不能一直这样耗着呀。我改怎么办呀？？

作者: tianmei001 时间: 2013-3-18 12:05

请问国产电泳装置：北京六一和上海天能那个会好一些？

作者: yjf1026 时间: 2013-3-18 12:08

一抗造成的非特异

目的是什么蛋白？

哪里的抗体？

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这是图片，上面是内参

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15195

作者: yjf1026 时间: 2013-3-18 12:08

这是前面做的，下面是内参，上面的条带是目的蛋白那张膜的上下缘。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15196

作者: one 时间: 2013-3-18 12:11

请楼主指教一下，我跑的蛋白电泳条带怎么也跑不开是什么原因？我也找了很多原因，但都没好转啊！谢谢了！

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-18 12:11

做什么蛋白？研究目的是什么？

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ucp2，研究其表达量的变化

作者: 8princess8 时间: 2013-3-18 12:11

做过两次western，第一次做什么都没有，内参很好的。第二次有条带，但是非特异性条带很多，不知道结果靠不靠谱。（蛋白浓度稍微提高了一点点，一抗和二抗稀释比例降低了一点点，ECL试剂作用时间增长了一点点）。不知道该如何解释或者如何改进呢？？

作者: abc816 时间: 2013-3-18 12:14

做过两次western，第一次做什么都没有，内参很好的。第二次有条带，但是非特异性条带很多，不知道结果靠不靠谱。（蛋白浓度稍微提高了一点点，一抗和二抗稀释比例降低了一点点，ECL试剂作用时间增长了一点点）。不知道该如何解释或者如何改进呢？？（再次传图片）

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作者: langlang 时间: 2013-3-18 12:14

老师，你好。我们最近做了WB，先是用了那张膜跑了β-actin，然后曝光效果也很好。然后就把这张膜放在PBST里洗，先洗了2次，每次10分钟，然后观察到β-actin位置上有黄色残留物，就又洗了一次，大约30min，还没洗掉，就放弃了。然后重新加另外一种蛋白的一抗过夜，然后二抗两个小时，然后曝光。加了ECL后，β-actin的位置荧光很强烈，整张膜上也都有荧光，目标蛋白处没有荧光，然后就曝光，5min，结果片子上什么都没有，连β-actin都沒有，特別干净，希望老师能帮忙找出问题。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:14

请楼主指教一下，我跑的蛋白电泳条带怎么也跑不开是什么原因？我也找了很多原因，但都没好转啊！谢谢了！

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缓冲液的pH

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:15

ucp2，研究其表达量的变化

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总蛋白就ok

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:15

请问国产电泳装置：北京六一和上海天能那个会好一些？

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建议天能

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:16

做过两次western，第一次做什么都没有，内参很好的。第二次有条带，但是非特异性条带很多，不知道结果靠不靠谱。（蛋白浓度稍微提高了一点点，一抗和二抗稀释比例降低了一点点，ECL试剂作用时间增长了一点点）。不知道该如何解释或者如何改进呢？？

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其他条件相同

做一下一抗不同的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:17

老师，你好。我们最近做了WB，先是用了那张膜跑了β-actin，然后曝光效果也很好。然后就把这张膜放在PBST里洗，先洗了2次，每次10分钟，然后观察到β-actin位置上有黄色残留物，就又洗了一次，大约30min，还没洗掉，就放弃了。然后重新加另外一种蛋白的一抗过夜，然后二抗两个小时，然后曝光。加了ECL后，β-actin的位置荧光很强烈，整张膜上也都有荧光，目标蛋白处没有荧光，然后就曝光，5min，结果片子上什么都没有，连β-actin都沒有，特別干净，希望老师能帮忙找出问题。

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继续稀释二抗

同时孵育时间缩短至30min，室温

作者: KGZ564 时间: 2013-3-18 12:17

从细胞瓶里面裂解细胞收蛋白是什么程序？需要用刮刀刮下吗？我每次都是加200ul/25cm2,加1mm蛋白酶抑制剂，粘性大，最后的总蛋白浓度并不高。这样统一上样量着实困难。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:18

从细胞瓶里面裂解细胞收蛋白是什么程序？需要用刮刀刮下吗？我每次都是加200ul/25cm2,加1mm蛋白酶抑制剂，粘性大，最后的总蛋白浓度并不高。这样统一上样量着实困难。

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我们做蛋白定量的

作者: ending 时间: 2013-3-18 12:18

您好，刚开始做western ，请问做血清的蛋白用什么做内参呢？白蛋白吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:19

您好，刚开始做western ，请问做血清的蛋白用什么做内参呢？白蛋白吗？

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我自己没做过

原来指导过一个客户做过，他们选择的是beta-actin

作者: kuaizige 时间: 2013-3-18 12:19

老师你好，我显色的时候，一下就出来了，
但是压片盒里面压片的时候就突然没了，
是怎么回事？
用的碧云天的ECLplus

另外曝光的时候底片容易变深，是什么回事啊？
显影液定影液用哪家的好

压片盒那个白色的屏用什么洗？无水乙醇

谢谢

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-18 12:20

总蛋白就ok

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谢谢NBA老师。我一直也用总蛋白做的，但是文献上都是先提取线粒体，再提线粒体蛋白来做。考虑到我的样本是收集的人体细胞，没有经过培养，数量相对少，所以一直提取总蛋白进行做的。可是结果总是不理想。

指标:ucp2（32kd），内参:actin.具体步骤：

1.制胶：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)；

2.电泳：70V,120V；

3.转膜：转膜液：20%甲醇（不加SDS）300ma转膜45分钟（伯乐电泳仪）（转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，见少许条带残留。）；

4.5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗15*3min；

5.一抗ucp2 santa cruz 山羊抗人（C-20）1:200 （建议稀释1:100-1：1000，条带在35kd），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗，15*3min；

6.二抗中杉兔抗羊1:1000（建议是1:1000-1:10000）室温1h,TBST洗15*3min，

7.piere超强ECL发光曝光5s，机器曝光。

结果：内参较清晰，没有背景。目的：在35kd上下各有一条，相距较近。
方老师：帮我看看有哪里可以改进的，谢谢！盼早日回复！

作者: windy+++ 时间: 2013-3-18 12:20

老师，你好。我们最近做了WB，先是用了那张膜跑了β-actin，然后曝光效果也很好。然后就把这张膜放在PBST里洗，先洗了2次，每次10分钟，然后观察到β-actin位置上有黄色残留物，就又洗了一次，大约30min，还没洗掉，就放弃了。然后重新加另外一种蛋白的一抗过夜，然后二抗两个小时，然后曝光。加了ECL后，β-actin的位置荧光很强烈，整张膜上也都有荧光，目标蛋白处没有荧光，然后就曝光，5min，结果片子上什么都没有，连β-actin都沒有，特別干净，希望老师能帮忙找出问题。

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你后边的问题很简单，若看到了荧光，曝光没有东西。肯定是后边显影液定影液或者胶片的问题。你确定显影液没有配错？

作者: bamboo16 时间: 2013-3-18 12:21

老师：您好。我做的是人正常肝细胞LO2的bax和bcl-2。上样量是10微升，蛋白量为30.后来改为50，80.100，但是总是β-action出来，而目标蛋白出不来。抗体是sunta的，电泳仪和电转仪都是bio-rad，电泳条件是100v，1h30min（12％的胶），湿转，100v，45min（30min也试过）。5％脱脂奶粉封闭1h，一抗（鼠抗）过夜1：200-1000都试过，二抗（抗鼠抗）1：5000.碧云天ECL显色液，次次都是β-action出来，而目标蛋白死也出不来。原先以为是抗体不好，但是做小鼠的组织蛋白，就可以。

一直不知道问题出在什么地方，请老师指教！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:21

老师你好，我显色的时候，一下就出来了，
但是压片盒里面压片的时候就突然没了，
是怎么回事？
用的碧云天的ECLplus

另外曝光的时候底片容易变深，是什么回事啊？
显影液定影液用哪家的好

压片盒那个白色的屏用什么洗？无水乙醇

谢谢

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1、这种情况一般是二抗浓度太高，稀释二抗试试

2、容易变深是因为胶片走光。显影、定影用国产的就没问题

3、白色瓶用水，湿纱布擦擦就行

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:22

谢谢NBA老师。我一直也用总蛋白做的，但是文献上都是先提取线粒体，再提线粒体蛋白来做。考虑到我的样本是收集的人体细胞，没有经过培养，数量相对少，所以一直提取总蛋白进行做的。可是结果总是不理想。

指标:ucp2（32kd），内参:actin.具体步骤：

1.制胶：4%浓缩胶，10%分离胶。上样量是50ug，30ul（1.5mm板)；

2.电泳：70V,120V；

3.转膜：转膜液：20%甲醇（不加SDS）300ma转膜45分钟（伯乐电泳仪）（转膜后maker均胶清晰。立春红染膜后，在相应的位置有条带，考马斯蓝染转膜后的胶，见少许条带残留。）；

4.5%牛奶封闭2小时室温，TBST洗15*3min；

5.一抗ucp2 santa cruz 山羊抗人（C-20）1:200 （建议稀释1:100-1：1000，条带在35kd），4度摇床过夜，次日约孵育18-20小时，TBST洗，15*3min；

6.二抗中杉兔抗羊1:1000（建议是1:1000-1:10000）室温1h,TBST洗15*3min，

7.piere超强ECL发光曝光5s，机器曝光。

结果：内参较清晰，没有背景。目的：在35kd上下各有一条，相距较近。
方老师：帮我看看有哪里可以改进的，谢谢！盼早日回复！

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1、UCP2可能在细胞中表达较弱

2、有图片吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:22

老师：您好。我做的是人正常肝细胞LO2的bax和bcl-2。上样量是10微升，蛋白量为30.后来改为50，80.100，但是总是β-action出来，而目标蛋白出不来。抗体是sunta的，电泳仪和电转仪都是bio-rad，电泳条件是100v，1h30min（12％的胶），湿转，100v，45min（30min也试过）。5％脱脂奶粉封闭1h，一抗（鼠抗）过夜1：200-1000都试过，二抗（抗鼠抗）1：5000.碧云天ECL显色液，次次都是β-action出来，而目标蛋白死也出不来。原先以为是抗体不好，但是做小鼠的组织蛋白，就可以。

一直不知道问题出在什么地方，请老师指教！

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这几个抗体能识别人的吗？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-18 12:22

这几个抗体能识别人的吗？

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说明书上说可以识别人、小鼠和大鼠的蛋白

作者: nn255 时间: 2013-3-18 12:23

您好，问个比较基础的问题，我们得到的westernblot结果是目的蛋白灰度值比内参灰度值，然后用这个结果进行t检验吗？

作者: 49888 时间: 2013-3-18 12:23

你好，这是我跑的小鼠血清白蛋白的WB，上样量是1：20稀释的血清10微升，一抗（abcam）1:5000稀释，二抗(中杉)1:3000，用bio-rad的机器曝的光，但是跑出来的结果不好，麻烦您给指导一下，非常感谢！
bbcodeurl('file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtml1/01/clip_image001.jpg', '%s')

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 12:24

如果我的目的蛋白分子量比较接近，我想通过重复染膜来检测这几个指标，我应该咋处理已染过的膜呢？都需要注意些什么？

谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-3-18 12:24

老师您好

最近在做LC3蛋白，条带都能出来，但是背景很脏，不知道怎么处理。。。。。

作者: 66+77 时间: 2013-3-18 12:24

我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量，如何选择内参，查文献发现这些上清中不存在β-actin，β-tubulin等常用的内参，但看到有人提到可引入外源性的参照物，好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中，再进行western，由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的，因此，也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗？还有没有其它的办法比较？

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比较上清液中蛋白的变化可以用ELISA啊，买相关试剂盒就行，比WB好做

作者: vivian4123 时间: 2013-3-18 12:26

调整一下一抗的稀释度

不行可以投诉抗体

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谢谢楼主我换了一家公司的抗体出结果了还不错，
应该就是抗体的事了。

作者: birdfish 时间: 2013-3-18 12:27

小弟做WB次数不多，有这麽个问题：

我做的是植物叶片提取的蛋白，过程是：TCA/Acetone法制备蛋白样品，裂解后蛋白浓度未定量，一般在1-5mg/ml，12%SDS-PAGE 40-60V电泳5小时（电极缓冲液是新配的），NC膜过夜转膜（转膜缓冲液用过大概3次多了），牛血清蛋白封闭大概3小时，一抗混合着兔抗内参rubisco大亚基52kDa、兔抗70kDa蛋白和兔抗90kDa蛋白的抗体（抗体说明书写着1:3000稀释，我按1:1000稀释）室温孵育2小时，TBST洗膜3*10min，二抗羊抗兔标记碱性磷酸酶（AP）1:5000室温孵育1小时，TBST洗膜3*10min，膜上加入底物NBT/BCIP避光反应5-10min。

现在的问题是：做了很多次，每次都只能看到70kDa和内参rubisco的显色条带，却一点都看不到90kDa的条带。据维基百科查，90kDa蛋白在总蛋白中正常含量约1%-2%，一抗用的全部是瑞典agrisera公司的商品化抗体，抗原都来自拟南芥。（但是按照90kDa蛋白抗体说明书上写着该抗原属于该蛋白家族中的一种异构体）请问版主这会是啥原因？谢谢版主大人！

作者: #问号# 时间: 2013-3-18 12:27

你好，我第一次做WB,电泳跑出来的marker从43到72分子量的都没有分开，是怎么回事呀，实验室有人说是胶配的不好，但小分子量得分的很开？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:27

说明书上说可以识别人、小鼠和大鼠的蛋白

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这个就不好说了

只能说是种属及组织特异性不同

把小鼠的样品处理好后先跑个电泳，染胶看看

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:28

您好，问个比较基础的问题，我们得到的westernblot结果是目的蛋白灰度值比内参灰度值，然后用这个结果进行t检验吗？

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使用比值进行统计检测

这个比值还需要进行normalization处理

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:28

你好，这是我跑的小鼠血清白蛋白的WB，上样量是1：20稀释的血清10微升，一抗（abcam）1:5000稀释，二抗(中杉)1:3000，用bio-rad的机器曝的光，但是跑出来的结果不好，麻烦您给指导一下，非常感谢！
bbcodeurl('file:///C:/Users/ADMINI~1/AppData/Local/Temp/msohtml1/01/clip_image001.jpg', '%s')

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1:100稀释样品，上样1ul

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:29

如果我的目的蛋白分子量比较接近，我想通过重复染膜来检测这几个指标，我应该咋处理已染过的膜呢？都需要注意些什么？

谢谢！

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目的蛋白1抗体，二抗，曝光

Stripping，封闭，目的蛋白2抗体，二抗，曝光。。。以此类推

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:29

老师您好

最近在做LC3蛋白，条带都能出来，但是背景很脏，不知道怎么处理。。。。。

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调整二抗及洗膜时间

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:29

你好，我第一次做WB,电泳跑出来的marker从43到72分子量的都没有分开，是怎么回事呀，实验室有人说是胶配的不好，但小分子量得分的很开？

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胶浓度多少？

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-18 12:30

我今天做了WB 用恒流300mA湿转了1.5个小时转完后发现PVDF膜上的maker在55KD以下就有点漂了想向您请教一下可能是那些原因呀？谢谢您了

静待佳音

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-18 12:30

老师你好！

最近做核蛋白，用的H3做内参，但是它的位置和上样缓冲液的蓝色在一起了，怎么办？
还有什么常用的核蛋白内参？
磷酸化蛋白洗膜后还能做出来么？因为有2个磷酸化位点

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-18 12:31

楼主您好，关于wb条带曝光的几个问题想请教您，谢谢！

1、怎么用同一条带曝光分子量相同的两个蛋白：？（两个蛋白的一抗种属来源相同和不同两种情况）

：两个目的蛋白A和B的分子量相同，在先曝光A后，利用同一条带再去曝光B，应该如何操作？

2、第一次曝光不理想，如何用该条带再次曝光？（TBST洗20min后重新加发光液？tbst洗后从加一抗或二抗开始？重新孵抗体之前是否需要封闭？）

3、如果两个目的蛋白相隔很近，在一条条带上，是不是可以将两个一抗混合一起孵育，同时曝光？

谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:31

老师你好！

最近做核蛋白，用的H3做内参，但是它的位置和上样缓冲液的蓝色在一起了，怎么办？
还有什么常用的核蛋白内参？
磷酸化蛋白洗膜后还能做出来么？因为有2个磷酸化位点

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核蛋白内参很多，请参考文献

比如Lamin B，PCNA，等等

洗膜之后可能做出来，看敏感性及表达量

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-18 12:31

谢谢老师。
最近两次电泳，我和同学的所有抗体包括内参都跑不出来，
抗体不是重复用，有什么原因啊，就在前一次的电泳结果都不错的。
急死了，谢谢@！

作者: newway 时间: 2013-3-18 12:32

老师：您好！下图是我做的PARP和tubulin，这两个蛋白以前做过，都做出来，但是最近不知为何出现这种情况？我的一抗和二抗及ECL都是CST的，实验条件都跟以前一样。一抗比例1：2000和1：1000（PARP)

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请问一下，你之前是怎么提取蛋白的？其具体操作步骤如何？是用核蛋白提取试剂盒提取的吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:32

谢谢老师。
最近两次电泳，我和同学的所有抗体包括内参都跑不出来，
抗体不是重复用，有什么原因啊，就在前一次的电泳结果都不错的。
急死了，谢谢@！

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注意所有的缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:33

请问一下，你之前是怎么提取蛋白的？其具体操作步骤如何？是用核蛋白提取试剂盒提取的吗？

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在做配制做胞浆、胞核抽提试剂的时候分离过。提取的是胞核组分做的，PARP-1效果一般

作者: tieshazhang 时间: 2013-3-18 12:33

多谢楼主！但是只上样1微升会不会太小了？我蛋白的浓度在8.2ug/ul，我曾经一起做过1:30的稀释，条带看不清楚~~~多谢楼主的帮助！

作者: duoduo 时间: 2013-3-18 12:34

各位大家好，我是最近开始做WB实验的新手有几个问题请教大家：
提取组织蛋白，BCA检测将各组蛋白浓度是2ug/ul，上样量是20ul，目的蛋白约75kd，内参43kd，10%胶电泳60v 30min后100v 60min，湿法转膜300mA 70min后，丽春红染色有蛋白，5%牛奶TBST液封闭3h，TBST液洗膜5min*3次，一抗：abcom 1:1000 4度12h后，TBST液洗膜5min*3次后，二抗碧云天 1:1000 3h，洗膜5min*3次，曝光出现：目的蛋白只有一组显示明显的条带，二内参各个组的条带粗细不一，有一个组没有显示条带。

请教的问题有：1.提取的蛋白是存在问题？

2.蛋白浓度是不太低了？

3.电泳、转膜、封闭、结合抗体条件是否有问题？

图片附件: 45840474.jpg (2013-3-18 12:34, 4.42 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15198

图片附件: 87767293.jpg (2013-3-18 12:35, 9.71 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15199

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:34

多谢楼主！但是只上样1微升会不会太小了？我蛋白的浓度在8.2ug/ul，我曾经一起做过1:30的稀释，条带看不清楚~~~多谢楼主的帮助！

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总蛋白上样量在20ug就足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:35

QUOTE:

原帖由 duoduo 于 2013-3-18 12:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位大家好，我是最近开始做WB实验的新手有几个问题请教大家：
提取组织蛋白，BCA检测将各组蛋白浓度是2ug/ul，上样量是20ul，目的蛋白约75kd，内参43kd，10%胶电泳60v 30min后100v 60min，湿法转膜300mA 70min后，丽春红染色有蛋白，5% ...

1、提取应该问题不大

2、浓度不低，但是你的定量方法误差特别大，从内参就可以看出

3、从目的来看是有表达的，与之对应的内参强度也很大。所以还是与你提取样品的上样量有关

4、二抗室温孵育30-40min就足够了

作者: duoduo 时间: 2013-3-18 12:36

谢谢版主，我们在检测蛋白浓度是使用的BCA法，做出来的曲线也挺好的，只是标准品第一个量不够了，就只加了8个孔。上面图片中显示的那组目的蛋白是与右侧最粗的内参相对应的还要请教版主：

1、上样量都是20ul，请问我应该怎么样调整上样量？

2、还是我应该重新再提取蛋白？

作者: duoduo 时间: 2013-3-18 12:37

我是提取的大鼠组织，在裂解组织前需要加入红细胞裂解液，这会不会对BCA法检测蛋白浓度产生影响？

请问版主蛋白该怎么定量？该怎样调整上样量？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:37

我是提取的大鼠组织，在裂解组织前需要加入红细胞裂解液，这会不会对BCA法检测蛋白浓度产生影响？

请问版主蛋白该怎么定量？该怎样调整上样量？

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大鼠组织要加入红细胞裂解液是为何呢？

作者: duoduo 时间: 2013-3-18 12:37

我取的是大鼠的肺，即使放血了也还是有少量的血残留在肺组织内，因此加入一定量的红细胞裂解液，但这是在加在细胞裂解液之前

版主，在提取好蛋白之后是不是最好在上样前将蛋白煮沸？

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-18 12:38

你好，我做的蛋白分子量分别是34KD，18KD，每次做内参（43KD）都能曝出条带，但是两个目的蛋白一直没能曝光出来，用的是15%的分离胶，请问我应该注意哪方面的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:38

我取的是大鼠的肺，即使放血了也还是有少量的血残留在肺组织内，因此加入一定量的红细胞裂解液，但这是在加在细胞裂解液之前

版主，在提取好蛋白之后是不是最好在上样前将蛋白煮沸？

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用预冷的PBS洗洗即可

变性后分装，冻存

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:39

你好，我做的蛋白分子量分别是34KD，18KD，每次做内参（43KD）都能曝出条带，但是两个目的蛋白一直没能曝光出来，用的是15%的分离胶，请问我应该注意哪方面的问题

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什么蛋白？

抗体是哪里的？

作者: 49888 时间: 2013-3-18 12:39

您好！

我最近WB出现了一个奇怪的现象，就是加入ECL显影液以后内参能看到很强的光，在半分钟到3分钟之内很快脆灭掉，尝试过换新鲜抗体，稀释二抗浓度，胶片压片盒放在4度预冷等方法都没有解决。

问题出现之前一直做的很好，出了问题以后条件基本没有变，但是就是内参是这样的情况，目的蛋白更是什么都没有，现在回想一下，中间就是换了新膜，MILLIPORE的PVDF，开始用的0。45UM，后来买的0。22UM的，都是原装整膜（个人感觉不是这个问题)。问过别的同学，有人以前也遇到过类似情况，但是都没有真正解决过问题。

谢谢赐教！

作者: lixi559 时间: 2013-3-18 12:39

你好版主，我的一抗一个买的是santa的，另一个买的是上海生工的，NC膜是0.22um，我做的是组织蛋白，是不是组织蛋白要比细胞提取的蛋白难做，另外我的分子量小，是不是在做的过程中应该更加注意些什么

作者: owanaka 时间: 2013-3-18 12:40

老师你好，我做的是15KDa的蛋白，开始还有条带，但后来换了个实验室就经常空白，有也很不清楚。实在是不知道什么原因，胶也染过，膜也染过，感觉都没什么大问题啊。

我用的是bio-rad的半干转仪，条件是12v，60ma，30min。上下十层滤纸。NC膜。每个大小约8cm2。我知道这个跟您说的条件有不同，但是我以前用这个条件也是出条带的，而且很清晰。maker也转的非常清楚啊。

难道是我的NC膜有问题？或者是我的蛋白样品出了问题？

还有就是，我的内参也出来的，就是比较淡，所以才考虑是不是蛋白样品量的问题，但是按照计算，我每个孔加样的总蛋白早超过50ug了，是不是因为经常冻融和使用，样品出问题？

作者: PINK 时间: 2013-3-18 12:40

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了

作者: memory 时间: 2013-3-18 12:41

在做配制做胞浆、胞核抽提试剂的时候分离过。提取的是胞核组分做的，PARP-1效果一般

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如果提取蛋白时，胞浆和胞核蛋白不分开提，可以吗？即最终的蛋白提取液里，既有核蛋白，也有胞浆蛋白，这样的提取方法你用过没有？

作者: S6044 时间: 2013-3-18 12:41

请问120kd的蛋白，转膜条件是什么？

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 12:41

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了

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有可能这个是低表达的蛋白，或者根本没有表达这个蛋白。尝试阳性标本检查是否为抗体原因

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 12:42

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了
有可能这个是低表达的蛋白，或者根本没有表达这个蛋白。尝试阳性标本检查是否为抗体原因

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这几种细胞都是阳性标本，都含有大量的胶原。
但不知为什吗就是做不出来130KD和300KD的条带。

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-18 12:42

10%的脱脂奶粉不会有什么问题
我怀疑你重复使用一抗

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请问楼主，是不是不可以重复使用一抗？还有就是：我现在正在做一个膜蛋白的WB，分子量是120KD，表达量比较低，提的是总蛋白，转膜条件：湿转：250mA，2.5h，有时候用200mA，3h，也试过半干转：100mA，40-50min，可是一直没出条带，或者有疑似条带出现，每次actin都有，每次都是以失败告终，请楼主给点建议。

作者: nn255 时间: 2013-3-18 12:43

有一个的问题请老师答疑一下：
如何确保内参一致？
我的样品提取后用考马斯亮蓝蛋白定量，然后调浓度一致，但是上样跑内参结果条带灰度值却不一致，肉眼看差异都很明显。蛋白定量还有意义吗？
但是根据这次的结果灰度值调节一下上样量，再跑内参，还是不太一致。所以到底该如何确保内参一致？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-18 12:43

相关疾病：
肝癌
楼主您好：我一直在做肝癌细胞的雌激素受体、磷酸化雌激素受体、MMP9、NF-KB，很不稳定，做出过一两次，而且条带很浅。但是b-actin做的蛮好的。
我的wb条件：
细胞制备
配胶、电泳
转膜：转膜我没完全按照园子里说的那种三明治做法，我是金字塔形的做法，怕不仪器弄短路了。17v，20-30min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（bioworld，稀释液用的是碧云天的成品）
TBST洗涤10min*3次
二抗室温1小时
TBST洗涤10min*3次
ECL显色1-2分钟
结果是背景很浅，就再没什么其他的了？我也是个新手，也是一个人做实验，没有人指导，我尝试改变过抗体稀释度，封闭时间，ECL时间，增加上样量，就是没有效果。谢谢您给一些指导和意见！

作者: IAM007 时间: 2013-3-18 12:44

楼主您好：我在做肝癌细胞WB,其中一种蛋白结果很奇怪。目的蛋白31kDa左右
我的wb条件：
新鲜抽提的蛋白
新鲜配制的胶12%和电泳液
湿法转膜220mA，40min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（sigma 1:500，太高，后又用过1:1000，还是老问题，稀释液用的是封闭液）
PBST洗涤10min*3次
二抗室温1.5小时（稀释液用的牛奶）
PBST洗涤10min*3次
ECL显色10s
结果如图。这个问题并非每次都出现，使用同样的抗体和样品，条件也不变，有时出现，有时正常，请楼主看看，万分感谢

图片附件: 33540117.jpg (2013-3-18 12:44, 8.21 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15200

作者: IAM007 时间: 2013-3-18 12:44

补充：加样量是15ug，谢谢各位

作者: qhyu 时间: 2013-3-18 12:44

大家好我是新手有个问题想不明白希望大家帮我解答一下

WB 细胞裂解时要加入蛋白酶抑制剂但整个步骤都是在冰上进行问题

1.为什么要在冰上进行是为了降低蛋白酶的活性以防止蛋白质裂解吗

2.蛋白酶抑制剂的化学本质是蛋白质吗或是别的物质若是蛋白质的话

3.它的活性温度是多少应该是37度左右吧那么在冰上时它还有活性吗

谢谢了

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-18 12:45

我最近做的蛋白是ikkb，分子量是87kd，转膜100v，1.5h,2h,2.5h 都试过了，一抗：1:500,1:1000(CST), 二抗：1:3000.每次都是出现下面图像，请大师指导。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:45

您好！

我最近WB出现了一个奇怪的现象，就是加入ECL显影液以后内参能看到很强的光，在半分钟到3分钟之内很快脆灭掉，尝试过换新鲜抗体，稀释二抗浓度，胶片压片盒放在4度预冷等方法都没有解决。

问题出现之前一直做的很好，出了问题以后条件基本没有变，但是就是内参是这样的情况，目的蛋白更是什么都没有，现在回想一下，中间就是换了新膜，MILLIPORE的PVDF，开始用的0。45UM，后来买的0。22UM的，都是原装整膜（个人感觉不是这个问题)。问过别的同学，有人以前也遇到过类似情况，但是都没有真正解决过问题。

谢谢赐教！

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换NC膜试试

另外注意需要校正pH的缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:46

你好版主，我的一抗一个买的是santa的，另一个买的是上海生工的，NC膜是0.22um，我做的是组织蛋白，是不是组织蛋白要比细胞提取的蛋白难做，另外我的分子量小，是不是在做的过程中应该更加注意些什么

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如果这么比较的话，可以说不存在组织还是细胞蛋白难做的问题。都是一样的

分子量多小？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:46

老师你好，我做的是15KDa的蛋白，开始还有条带，但后来换了个实验室就经常空白，有也很不清楚。实在是不知道什么原因，胶也染过，膜也染过，感觉都没什么大问题啊。

我用的是bio-rad的半干转仪，条件是12v，60ma，30min。上下十层滤纸。NC膜。每个大小约8cm2。我知道这个跟您说的条件有不同，但是我以前用这个条件也是出条带的，而且很清晰。maker也转的非常清楚啊。

难道是我的NC膜有问题？或者是我的蛋白样品出了问题？

还有就是，我的内参也出来的，就是比较淡，所以才考虑是不是蛋白样品量的问题，但是按照计算，我每个孔加样的总蛋白早超过50ug了，是不是因为经常冻融和使用，样品出问题？

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不出结果的情况与出结果的时候换了什么条件？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:46

我现在在做I型胶原和III型胶原的wb,一抗是abcam的，上清和细胞的都做了，但是总是出不来条带，。用的是韧带细胞ACL和mcl，总蛋白都达到200mg了，请各位帮帮忙分析一下原因。同条件下另一蛋白250KD的都出来了

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看一下这两个抗体是识别还原性的还是非还原性的collagen I、III

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:46

如果提取蛋白时，胞浆和胞核蛋白不分开提，可以吗？即最终的蛋白提取液里，既有核蛋白，也有胞浆蛋白，这样的提取方法你用过没有？

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一般的WB都是提取总蛋白进行

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:47

请问120kd的蛋白，转膜条件是什么？

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湿转：300mA恒流，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:47

请问楼主，是不是不可以重复使用一抗？还有就是：我现在正在做一个膜蛋白的WB，分子量是120KD，表达量比较低，提的是总蛋白，转膜条件：湿转：250mA，2.5h，有时候用200mA，3h，也试过半干转：100mA，40-50min，可是一直没出条带，或者有疑似条带出现，每次actin都有，每次都是以失败告终，请楼主给点建议。

===========

什么蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:47

有一个的问题请老师答疑一下：
如何确保内参一致？
我的样品提取后用考马斯亮蓝蛋白定量，然后调浓度一致，但是上样跑内参结果条带灰度值却不一致，肉眼看差异都很明显。蛋白定量还有意义吗？
但是根据这次的结果灰度值调节一下上样量，再跑内参，还是不太一致。所以到底该如何确保内参一致？

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蛋白定量当然有意义

首先要保证蛋白定量的尽量准确

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:48

楼主您好：我一直在做肝癌细胞的雌激素受体、磷酸化雌激素受体、MMP9、NF-KB，很不稳定，做出过一两次，而且条带很浅。但是b-actin做的蛮好的。
我的wb条件：
细胞制备
配胶、电泳
转膜：转膜我没完全按照园子里说的那种三明治做法，我是金字塔形的做法，怕不仪器弄短路了。17v，20-30min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（bioworld，稀释液用的是碧云天的成品）
TBST洗涤10min*3次
二抗室温1小时
TBST洗涤10min*3次
ECL显色1-2分钟
结果是背景很浅，就再没什么其他的了？我也是个新手，也是一个人做实验，没有人指导，我尝试改变过抗体稀释度，封闭时间，ECL时间，增加上样量，就是没有效果。谢谢您给一些指导和意见！

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你说的这些蛋白我都做过

1、自己配制一抗稀释液

2、注意TBST的pH值，7.0-8.0之间，尽量配制成8.0

3、ECL是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:48

楼主您好：我在做肝癌细胞WB,其中一种蛋白结果很奇怪。目的蛋白31kDa左右
我的wb条件：
新鲜抽提的蛋白
新鲜配制的胶12%和电泳液
湿法转膜220mA，40min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（sigma 1:500，太高，后又用过1:1000，还是老问题，稀释液用的是封闭液）
PBST洗涤10min*3次
二抗室温1.5小时（稀释液用的牛奶）
PBST洗涤10min*3次
ECL显色10s
结果如图。这个问题并非每次都出现，使用同样的抗体和样品，条件也不变，有时出现，有时正常，请楼主看看，万分感谢

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出现什么现象呢？

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-18 12:49

蛋白定量当然有意义

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首先要保证蛋白定量的尽量准确
根据内参的条带反过来微调上样量为什么还是不能保证内参的一致呢？

作者: xue258 时间: 2013-3-18 12:49

现象是目的条带的稍下方会出现一条横贯NC膜的条带，甚至延伸至marker泳道，影响我的实验结果

作者: greenbee 时间: 2013-3-18 12:50

你说的这些蛋白我都做过

1、自己配制一抗稀释液

2、注意TBST的pH值，7.0-8.0之间，尽量配制成8.0

3、ECL是哪里的？

==============================================================

谢谢老师！

1.我以前用过PBS稀释一抗的，没有一抗稀释液的配方，望老师给我发一份

2.TBST保持在7.5左右，我将把它调到8.0

2.ECL是碧云天生产的

3.我的转膜时间会不会长了啊？听讲会转过了（我用的是半干法）

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:50

根据内参的条带反过来微调上样量为什么还是不能保证内参的一致呢？

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这个整个过程中的操作手法有很大关系

因为WB的灵敏度是有线性范围的

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:50

现象是目的条带的稍下方会出现一条横贯NC膜的条带，甚至延伸至marker泳道，影响我的实验结果

=============================

做一个抗体由这种现象

还是做所有的抗体都有这种现象？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:51

谢谢老师！

1.我以前用过PBS稀释一抗的，没有一抗稀释液的配方，望老师给我发一份

2.TBST保持在7.5左右，我将把它调到8.0

2.ECL是碧云天生产的

3.我的转膜时间会不会长了啊？听讲会转过了（我用的是半干法）

=================================

转膜时间没问题

试试Millipore的ECL吧，货号：WBKLS0100

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-18 12:51

转膜时间没问题

试试Millipore的ECL吧，货号：WBKLS0100

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谢谢老师！

Millipore的现在没货。用PIERCE的先试试，希望自己有好运

作者: fei1226com 时间: 2013-3-18 12:52

做一个抗体由这种现象

还是做所有的抗体都有这种现象？

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只有这种抗体

作者: star#room 时间: 2013-3-18 12:52

本人做的是小窝蛋白，caveolin-1。需要做出胞浆，胞膜，还有总蛋白，版主能不能提供点提蛋白的方法和注意事项。

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-18 12:52

你好，我想请问一下，我每次各个步骤的条件都一样，为什么目的有时候能跑出来有时候又跑不出来呢？我试了丽春红染色，蛋白条带每次都是在膜上的。封闭和一抗、二抗稀释都是用5%脱脂牛奶；一抗孵育先室温摇一小时，4度过夜，第二天复温一小时；TBST10min*3次；二抗室温1小时（1:3000）；TBST10min*2次，TBS10min*1次。ECL显影，曝光。我都不知道怎么回事了。

作者: 了了 时间: 2013-3-18 12:53

什么蛋白？

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是CD133

作者: avi317 时间: 2013-3-18 12:53

斑竹您好，因为我收集的是临床病例，很珍贵。所以用TRIZOL提过RNA后想继续提蛋白用于western。按照TRIZOl的说明书离心最后一步1%SDS反复吹打50度温水浴重悬蛋白时很难溶解。我查了下这是个普遍问题，请问斑竹您对此有什么建议促使蛋白溶解？哪位战友有高招欢迎指导，谢谢各位

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:54

只有这种抗体

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那得考虑这种抗体的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:54

本人做的是小窝蛋白，caveolin-1。需要做出胞浆，胞膜，还有总蛋白，版主能不能提供点提蛋白的方法和注意事项。

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不太好操作

市面上现有的试剂盒或多或少都会交叉污染

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:54

你好，我想请问一下，我每次各个步骤的条件都一样，为什么目的有时候能跑出来有时候又跑不出来呢？我试了丽春红染色，蛋白条带每次都是在膜上的。封闭和一抗、二抗稀释都是用5%脱脂牛奶；一抗孵育先室温摇一小时，4度过夜，第二天复温一小时；TBST10min*3次；二抗室温1小时（1:3000）；TBST10min*2次，TBS10min*1次。ECL显影，曝光。我都不知道怎么回事了。

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出与不出结果的样品相同？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 12:55

这个蛋白有难度，做WB的人很少

作者: u234 时间: 2013-3-18 14:24

我显出来的组织胶原为什么是这样的呢？本来应该是实心的，但是却是空心的。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15201

作者: duoduo 时间: 2013-3-18 14:25

请问版主：

1、WB中BCA法测蛋白浓度有误差，已经加入了上样缓冲液和水稀释，还有方法可以调整？

2、如果上样蛋白总量一样，而总体积（蛋白+水+上样缓冲液）不一样，这样跑出来的电泳结果可信？

作者: ROSE李 时间: 2013-3-18 14:45

请问楼主，我做蛋白印迹不知怎么回事一只做不出来，感觉每次蛋白都转过来了，不过我不知道我裂解的细菌一定有我需要的目的蛋白，这个目的蛋白是在布氏杆菌表达的一种外膜蛋白，现在是通过卡介苗来表达这种蛋白，我做的是关于基因疫苗的制备实验，可是我最近用我买的乳胶颗粒抗原以及用布氏杆菌裂解蛋白再次实验，依然没有结果，显色的时候看不到条带，我一抗用的是牛布氏杆菌阳性血清，二抗用的兔抗牛，最后显色用自己配置的DAB，我稀释的浓度都是安说明书来弄的，自己反复思索也找不到原因所在，***楼主解答，谢谢老师了哦！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 14:47

我显出来的组织胶原为什么是这样的呢？本来应该是实心的，但是却是空心的。

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减少上样量

加大一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-18 14:47

请问版主：

1、WB中BCA法测蛋白浓度有误差，已经加入了上样缓冲液和水稀释，还有方法可以调整？

2、如果上样蛋白总量一样，而总体积（蛋白+水+上样缓冲液）不一样，这样跑出来的电泳结果可信？

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目前只能通过内参来判定

我们的做法是上样体积与上样量都调整为一致的

作者: NBA 时间: 2013-3-18 14:48

请问楼主，我做蛋白印迹不知怎么回事一只做不出来，感觉每次蛋白都转过来了，不过我不知道我裂解的细菌一定有我需要的目的蛋白，这个目的蛋白是在布氏杆菌表达的一种外膜蛋白，现在是通过卡介苗来表达这种蛋白，我做的是关于基因疫苗的制备实验，可是我最近用我买的乳胶颗粒抗原以及用布氏杆菌裂解蛋白再次实验，依然没有结果，显色的时候看不到条带，我一抗用的是牛布氏杆菌阳性血清，二抗用的兔抗牛，最后显色用自己配置的DAB，我稀释的浓度都是安说明书来弄的，自己反复思索也找不到原因所在，***楼主解答，谢谢老师了哦！

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1、转膜是否成功不是靠感觉，要考验证丽春红等手段来验证

2、用ECL来进行后续的检测吧。DAB方法敏感性太差

作者: bring 时间: 2013-3-18 15:20

我显出来的组织胶原为什么是这样的呢？本来应该是实心的，但是却是空心的。

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貌似电泳过程已经出现问题哦

作者: star#room 时间: 2013-3-18 15:21

版主您好，今天跑了Western Blot，有一个泳道的背景较高，而其他的泳道背景正常，内参跑出来也比较一致，想问一下，是什么原因啊？我自己也分析了，应该不是封闭的问题，我用的是10%牛奶，室温，摇床2h；蛋白是三天前提的，第一次跑该分子，这一泳道并未出现很高的背景，我现在不知道问题出在哪，麻烦版主啦！

（第二个泳道）

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作者: DDD 时间: 2013-3-18 15:21

楼主你好。我最近作western很是不顺。现是做了一个这样的图，上样量大致一样。我做的内参。5个泳道，为什么颜色这样淡，而最右边的泳道颜色与其他的不一致。我用的是碧云天的试剂盒，配的10%的胶。100v电泳，中间不换电压。电转250mA 1个小时。5%牛奶封闭2个小时，加1抗过夜，第二天洗膜TBST10min洗3次，加2抗2小时，TBST10min洗3次，发光如下：

图片附件: 90693937.snap.jpg (2013-3-18 15:22, 143.3 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15203

作者: DDD 时间: 2013-3-18 15:22

今天重新做了一次，我用考马亮蓝染了胶，发现很多蛋白在分离胶和浓缩胶的中间（见图），请问这是怎么回事？是不是蛋白没有跑下来？正常的是不是那个位置没有蛋白？谢谢！（从左到右1到5为我的上样道，第6为marker道。第7也是我的上样道，但是没有转膜。中间的一条切掉的胶为转膜过后的胶。）

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作者: DDD 时间: 2013-3-18 15:22

对了，我的蛋白是刚刚提的

作者: zhenxin 时间: 2013-3-18 15:23

楼主您好，关于wb条带曝光的几个问题想请教您，谢谢！

1、怎么用同一条带曝光分子量相同的两个蛋白：？（两个蛋白的一抗种属来源相同和不同两种情况）

：两个目的蛋白A和B的分子量相同，在先曝光A后，利用同一条带再去曝光B，应该如何操作？

2、第一次曝光不理想，如何用该条带再次曝光？（TBST洗20min后重新加发光液？tbst洗后从加一抗或二抗开始？重新孵抗体之前是否需要封闭？）

3、如果两个目的蛋白相隔很近，在一条条带上，是不是可以将两个一抗混合一起孵育，同时曝光

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:23

版主您好，今天跑了Western Blot，有一个泳道的背景较高，而其他的泳道背景正常，内参跑出来也比较一致，想问一下，是什么原因啊？我自己也分析了，应该不是封闭的问题，我用的是10%牛奶，室温，摇床2h；蛋白是三天前提的，第一次跑该分子，这一泳道并未出现很高的背景，我现在不知道问题出在哪，麻烦版主啦！

（第二个泳道）

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稀释二抗

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-18 15:26

楼主您好：

最近做wb出现了比较奇怪的现象：我总共是8个样品孔，结果发现6个孔的actin曝光有两条带，而其他一个目的蛋白无此现象；又作了一次的结果是，8个孔的actin和目的蛋白曝光结果都是两条带。不知道是什么原因，还请楼主帮助，谢谢！

作者: windy+++ 时间: 2013-3-18 15:27

做WB哪种测定蛋白浓度的方法好些呢？

作者: loli 时间: 2013-3-18 15:28

你好。我最近做的两次WB，上胶跑的速度都变慢了（下胶基本上没变），后来发现配胶用的30%丙烯酰胺有点点浑浊，请问是不是这个原因造成的？？还有就是SDS需不需要隔一段时间就重配一次？？我一直用的原来配的SDS（配了不到2个月）。

作者: kuaizige 时间: 2013-3-18 15:28

你好，我做120kd的CD133，上样100ug总蛋白，1抗用santa的，浓度用到了1：25，跑出这样的多条条带，而且最黑的那条分子量也不太对。是不是因为抗体的质量不好？
CD133为糖基化的膜蛋白，是不是，煮沸对其有影响？

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您好，我现在正在做CD133的Western ,可是怎么也出不来结果，请教您一下，您是怎么提的蛋白？后面怎么做的？

作者: kuaizige 时间: 2013-3-18 15:29

您好，封膜的的时候如果是磷酸化蛋白的话不能用脱脂奶粉吧？用BSA，应该使用多少浓度的啊？
谢谢
CD133做western的话，一抗应该加多少啊

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您好，请问您后来CD133做出来了吗？是怎么提的蛋白？

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-18 15:29

楼主您好，
我正在学做磷酸化，战友们都说p-erk不容易做出来，可我按厂家提供的稀释比例做出来的p-erk比erk的条带还要粗，并且有时候能分清楚两个条带，有时候又分不出来，cst抗体，磷酸化的1：2000，erk的1：500～1000，二抗1：2000，开始的时候我用牛奶封闭1h，背景挺干净的，用的国产的ecl，只是有时候有非特异性条带。后来看到可以用5%bsa可以减少非特异性条带，我开始用bsa封闭1h，抗体浓度没有改变，ecl换成了进口的,但背景非常的深，并且非特异性条带也没有明显减少，我用一抗二抗清除液（碧云天）洗了10分钟后重新ecl，背景干净了，条带也清洗了很多，但不知道这样做行否？我今天降低了一抗的浓度看看背景是否有所改善。
磷酸化的stripping您有经验吗？碧云天的我用过，根本清洗不下来，?-mercaptoethanol +2% SDS Tris-Cl pH6.7 50 度30分好些，但仍然洗不干净。
下一步看来只能同时跑两块胶，用tubulin做内参了。但又担心上样量存在差异。唉，好难啊。
楼主给些建议吧。谢谢。

作者: okhaha 时间: 2013-3-18 15:30

最近做了三次Western blot，总是出现问题，因为是新手，但是又很急，所以有很多问题都想问下楼主，希望楼主能够不耐其烦，帮忙解答一下，也许有很多问题都很幼稚，楼主的试剂和材料都是在哪里购买的，以及做实验所需配制的溶液配方是什么，希望可以拿出来分享一下！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:30

做WB哪种测定蛋白浓度的方法好些呢？

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我们常用BCA

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:30

你好。我最近做的两次WB，上胶跑的速度都变慢了（下胶基本上没变），后来发现配胶用的30%丙烯酰胺有点点浑浊，请问是不是这个原因造成的？？还有就是SDS需不需要隔一段时间就重配一次？？我一直用的原来配的SDS（配了不到2个月）。

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可能是丙烯酰胺造成

SDS 2个月不需要重配

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:32

您好，我现在正在做CD133的Western ,可是怎么也出不来结果，请教您一下，您是怎么提的蛋白？后面怎么做的？

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santa上我怎么没有查到CD133？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:32

楼主您好，
我正在学做磷酸化，战友们都说p-erk不容易做出来，可我按厂家提供的稀释比例做出来的p-erk比erk的条带还要粗，并且有时候能分清楚两个条带，有时候又分不出来，cst抗体，磷酸化的1：2000，erk的1：500～1000，二抗1：2000，开始的时候我用牛奶封闭1h，背景挺干净的，用的国产的ecl，只是有时候有非特异性条带。后来看到可以用5%bsa可以减少非特异性条带，我开始用bsa封闭1h，抗体浓度没有改变，ecl换成了进口的,但背景非常的深，并且非特异性条带也没有明显减少，我用一抗二抗清除液（碧云天）洗了10分钟后重新ecl，背景干净了，条带也清洗了很多，但不知道这样做行否？我今天降低了一抗的浓度看看背景是否有所改善。
磷酸化的stripping您有经验吗？碧云天的我用过，根本清洗不下来，?-mercaptoethanol +2% SDS Tris-Cl pH6.7 50 度30分好些，但仍然洗不干净。
下一步看来只能同时跑两块胶，用tubulin做内参了。但又担心上样量存在差异。唉，好难啊。
楼主给些建议吧。谢谢。

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1、p-erk强于erk很正常，p-erk可以继续稀释一抗

2、bey。。。的stripping就别在用了，根本就是扯淡

我自己做过对比，你可以试试pierce的。我自己有配制的，可以给你点试试。

前提是如果条带表达太强，目前还没有能有效全部清除前一条带的stripping

3、做这些指标的时候，我都会选择用两块胶

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:32

最近做了三次Western blot，总是出现问题，因为是新手，但是又很急，所以有很多问题都想问下楼主，希望楼主能够不耐其烦，帮忙解答一下，也许有很多问题都很幼稚，楼主的试剂和材料都是在哪里购买的，以及做实验所需配制的溶液配方是什么，希望可以拿出来分享一下！

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试剂我都用进口的，不同的公司都有，常用amresco、sigma、millipore的

配方网上都有，不需要单独再做说明了

作者: 阿司匹林 时间: 2013-3-18 15:34

1、p-erk强于erk很正常，p-erk可以继续稀释一抗

2、bey。。。的stripping就别在用了，根本就是扯淡

我自己做过对比，你可以试试pierce的。我自己有配制的，可以给你点试试。

前提是如果条带表达太强，目前还没有能有效全部清除前一条带的stripping

3、做这些指标的时候，我都会选择用两块胶

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谢谢版主！
我也准备跑两块胶了，这个洗膜真是太不可靠了。
昨天我洗的膜又没有条带出来了。唉，要么不够，要么过了。折磨人啊。

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 15:36

可能是丙烯酰胺造成

SDS 2个月不需要重配

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我把配胶的东西都重新配了一遍，结果还是一样！！！怎么回事啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:37

我把配胶的东西都重新配了一遍，结果还是一样！！！怎么回事啊？

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所有试剂都没换？

作者: loli 时间: 2013-3-18 15:37

所有试剂都没换？

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那倒没有，还是原来买的那些，因为是1.2月份才买的。而且今天跑的时候还发现在上交有一点“拖尾”的现象，图片晚上才能上传。

作者: mimili_901 时间: 2013-3-18 15:38

新手请教楼主，210kd的蛋白选择什么内参合适？担心分子量相差太大，内参跑出胶外。如果用beta-actin，是不是要用梯度胶？

作者: DNA 时间: 2013-3-18 15:38

你好，我刚学了Western，自己全过程做了2次，但是两次显影都没有结果，都是空白胶片，连Mark都没有显影。
我做的步骤是：胶是自己做的，电泳花了大概2个半小时，浓缩胶电压80V，分离胶电压150V，转膜300mA，1个半小时，转膜结果应该是好的，mark什么的都有，封闭液是用5%牛奶，摇床上震动1个小时，敷一抗用的是封闭液1：:1000，4℃过夜，二抗用TBST稀释，1:2000，A和B两种化学荧光剂各0.5ml混合，压片2min，显影2min，定影5min。但结果都是空白胶片，连Mark都没有显影。希望能得到您的解答，谢谢！我还是一个新手，可能存在很多问题吧

作者: one 时间: 2013-3-18 15:38

我是western
blot菜鸟级新手，最近捣鼓了半个月，终于把目的蛋白做出来了，但由于该蛋白表达不是很多，而且使用的抗体是国产的，整张片子背景很深，杂条带很多（对
着光看的话目的蛋白还是蛮清晰的）。今天我尝试着扫描了一下片子，令人失望的是目的蛋白完全淹没在黑漆漆的背景中了，伤心啊我该怎么做呢？还有，如果扫出来怎么分析啊，要下载什么软件吗？我初涉此领域，基本啥都不懂，求前辈多多指教，不甚感激！

作者: tianmei001 时间: 2013-3-18 15:39

请问楼主，您做过VEGF的WB，有做过VEGF受体的WB吗？我在做VEGF受体2，都已经几个月了，目的蛋白都没出来过。

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请问，您是怎么提的蛋白？我现在也在做这个蛋白的WB，也还没成功呢。

作者: tianmei001 时间: 2013-3-18 15:39

santa上我怎么没有查到CD133？

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现在只有miltenyi有CD133，别的公司不卖了，我们的抗体是用的miltenyi的一抗，1:200,1:100都试过，没出来，我觉得还是在提蛋白的过程中有问题，就是不知道这个膜蛋白在提取时应该是用什么样的配方，之前也苦苦追寻，希望您能指点迷津。

作者: tianmei001 时间: 2013-3-18 15:40

santa cruz的ECL质量肯定没有问题
但是敏感性是不一样的
你查查ECL的敏感性，这一块是值得学习和摸索的（其实在WB中这一块非常重要）
膜蛋白的提取可以增加脱氧胆酸钠的比例

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楼主，请问你有具体的配方吗？可以分享一下吗？我也正在做膜蛋白提取，一直没做出来，一头雾水。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:40

新手请教楼主，210kd的蛋白选择什么内参合适？担心分子量相差太大，内参跑出胶外。如果用beta-actin，是不是要用梯度胶？

选择beta-tubulin

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有梯度胶最好

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:41

你好，我刚学了Western，自己全过程做了2次，但是两次显影都没有结果，都是空白胶片，连Mark都没有显影。
我做的步骤是：胶是自己做的，电泳花了大概2个半小时，浓缩胶电压80V，分离胶电压150V，转膜300mA，1个半小时，转膜结果应该是好的，mark什么的都有，封闭液是用5%牛奶，摇床上震动1个小时，敷一抗用的是封闭液1：:1000，4℃过夜，二抗用TBST稀释，1:2000，A和B两种化学荧光剂各0.5ml混合，压片2min，显影2min，定影5min。但结果都是空白胶片，连Mark都没有显影。希望能得到您的解答，谢谢！我还是一个新手，可能存在很多问题吧

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膜上用丽春红染色有蛋白条带？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:41

我是western
blot菜鸟级新手，最近捣鼓了半个月，终于把目的蛋白做出来了，但由于该蛋白表达不是很多，而且使用的抗体是国产的，整张片子背景很深，杂条带很多（对
着光看的话目的蛋白还是蛮清晰的）。今天我尝试着扫描了一下片子，令人失望的是目的蛋白完全淹没在黑漆漆的背景中了，伤心啊我该怎么做呢？还有，如果扫出来怎么分析啊，要下载什么软件吗？我初涉此领域，基本啥都不懂，求前辈多多指教，不甚感激！

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1、做的内参吗？

2、需要软件进行读数处理

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:41

请问，您是怎么提的蛋白？我现在也在做这个蛋白的WB，也还没成功呢。

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VEGFR好做

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:42

现在只有miltenyi有CD133，别的公司不卖了，我们的抗体是用的miltenyi的一抗，1:200,1:100都试过，没出来，我觉得还是在提蛋白的过程中有问题，就是不知道这个膜蛋白在提取时应该是用什么样的配方，之前也苦苦追寻，希望您能指点迷津。

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这个蛋白适合做WB吗？

作者: 米囡 时间: 2013-3-18 15:43

麻烦版主帮忙分析下原因，谢谢，第一张是actin，第二章是目的蛋白，怎么会泡成这样的

图片附件: 81088422.jpg (2013-3-18 15:43, 289.06 KB) / 该附件被下载次数 1
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作者: 米囡 时间: 2013-3-18 15:43

麻烦版主帮忙分析下原因，谢谢，第一张是actin，第二章是目的蛋白，怎么会泡成这样的

图片附件: 81088422.jpg (2013-3-18 15:43, 289.06 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15206

作者: star#room 时间: 2013-3-18 15:44

亲爱的楼主，最近遇到一个奇怪的现象。
都说BSA封闭比牛奶好。我做酪氨酸位点的磷酸化stat3，一开始用牛奶封闭，一抗稀释液用BSA，结果一直做不出来，只见黑黑的背景。后来在没做出来的膜的基础上换BSA封闭，BSA稀释一抗，竟然做出来了。所以当时我觉得问题出在封闭液上，就决定用BSA封闭膜和稀释一抗。
奇怪的是，当我用新鲜的膜，用BSA封闭和稀释一抗竟然和之前的牛奶封闭一样，只有黑的背景色。
百思不得其解。之前做出来的两次都是在重新封闭的基础上做的（就是之前用牛奶封闭过）。而后者是新鲜的膜。但是单纯的牛奶封闭又做不出来。难道需要牛奶+BSA联合封闭？

大概过程如下：
一抗：1:500 二抗：1:500
A膜，
先牛奶封闭2h，BSA稀释一抗无条带，只有黑色背景
再次重复以上过程，仍无条带，黑色背景
改用BSA封闭，BSA稀释一抗条带清晰，背景浅

B膜
BSA封闭2h，BSA稀释一抗无条带，整张膜呈黑色背景色
重复2~3次结果不变

我还没灰心，只是有点无助。所以楼主我想听听您的建议。我下面打算在B膜的基础上重新用牛奶封闭，再分别用牛奶和BSA稀释一抗试试看。

作者: 雪花子 时间: 2013-3-18 15:47

请问一下如果是检测内质网的蛋白的话，应该用什么做内参蛋白啊？谢谢啦

作者: 脱水萝卜 时间: 2013-3-18 15:47

版主：
你好，
我最近western blot 一直做不出结果，苦恼中，实验失败的原因考虑过1、样品制备过程中蛋白被降解；2、半干转没有转过去；3、一抗的问题；4、二抗的问题

因为我们实验室膜，裂解液，PMSF, 配胶试剂，洗液，还有一抗和二抗都是公用的，有别人报出条带了，我就一直没有曝出条带来，难道就是我技术这么差吗？我到底哪里没有注意到呢？

等待您的指导！

作者: kuohao17 时间: 2013-3-18 15:48

这个蛋白适合做WB吗？

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请楼主指点，为什么不合适？我看文献上也很少有WB的结果。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:48

亲爱的楼主，最近遇到一个奇怪的现象。
都说BSA封闭比牛奶好。我做酪氨酸位点的磷酸化stat3，一开始用牛奶封闭，一抗稀释液用BSA，结果一直做不出来，只见黑黑的背景。后来在没做出来的膜的基础上换BSA封闭，BSA稀释一抗，竟然做出来了。所以当时我觉得问题出在封闭液上，就决定用BSA封闭膜和稀释一抗。
奇怪的是，当我用新鲜的膜，用BSA封闭和稀释一抗竟然和之前的牛奶封闭一样，只有黑的背景色。
百思不得其解。之前做出来的两次都是在重新封闭的基础上做的（就是之前用牛奶封闭过）。而后者是新鲜的膜。但是单纯的牛奶封闭又做不出来。难道需要牛奶+BSA联合封闭？

大概过程如下：
一抗：1:500 二抗：1:500
A膜，
先牛奶封闭2h，BSA稀释一抗无条带，只有黑色背景
再次重复以上过程，仍无条带，黑色背景
改用BSA封闭，BSA稀释一抗条带清晰，背景浅

B膜
BSA封闭2h，BSA稀释一抗无条带，整张膜呈黑色背景色
重复2~3次结果不变

我还没灰心，只是有点无助。所以楼主我想听听您的建议。我下面打算在B膜的基础上重新用牛奶封闭，再分别用牛奶和BSA稀释一抗试试看。

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呵呵，有点奇怪

我们都是用BSA封闭及稀释一抗，二抗用奶粉

你用BSA浓度多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:49

请问一下如果是检测内质网的蛋白的话，应该用什么做内参蛋白啊？谢谢啦

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参考文献吧

以文献为准

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:49

版主：
你好，
我最近western blot 一直做不出结果，苦恼中，实验失败的原因考虑过1、样品制备过程中蛋白被降解；2、半干转没有转过去；3、一抗的问题；4、二抗的问题

因为我们实验室膜，裂解液，PMSF, 配胶试剂，洗液，还有一抗和二抗都是公用的，有别人报出条带了，我就一直没有曝出条带来，难道就是我技术这么差吗？我到底哪里没有注意到呢？

等待您的指导！

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用你同学的样品及抗体做预实验摸索你的条件

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:50

请楼主指点，为什么不合适？我看文献上也很少有WB的结果。

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既然你找文献也很少做

说不上为什么吧，如果基本没人做的蛋白，对于咱们来说只能试试

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-18 15:52

呵呵，有点奇怪

我们都是用BSA封闭及稀释一抗，二抗用奶粉

你用BSA浓度多少？

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封闭和稀释一抗都是5%，稀释一抗用5%BSA是按CST的说明书来的

作者: mamamiya 时间: 2013-3-18 15:52

那倒没有，还是原来买的那些，因为是4,5月份才买的。而且今天跑的时候还发现在上交有一点“拖尾”的现象，图片晚上才能上传。

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图片是用手机拍的不大清楚，图中用红色圈起来的地方就是蛋白跑的不同步的部分……请问这是怎么回事

图片附件: 36937789.snap.jpg (2013-3-18 15:52, 24.91 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15207

作者: tie8 时间: 2013-3-18 15:55

你好，非常感谢你耐心的解答和帮助！
我是WB新手，现在想对鱼的不同胚胎发育期的胚胎样品进行某蛋白定量，因Actin会随着细胞分裂发生很大变化，不稳定！请问哪种内参比较合适？另外，样品裂解时用的裂解液是买商品化的好还是自己配置的好？做WB用哪种蛋白酶抑制剂较好？非常感谢您的帮助！

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-18 15:55

你好，我想请教下列问题：辛苦楼主帮我解答下吧：

我做的过程：

1、我们的胶是自己做的，跑电泳的时候，Mark（7ul）在大概90-170KD的条带比较清楚，淡拉开的距离不大，跟我们实验室其他人的条带相比我的mark还是比较淡的，90KD以下的条带比较糊，而且拉得比较开，颜色也更淡了，要仔细看才能看清楚，是我胶做的有问题吗？

2、电泳的时候我的上样量是10ul，但是跑电泳的时候尾巴都拖得很长，是不是也是胶的问题呢？

3、电泳的电压：浓缩胶80V，分离胶160V。

4、转膜：300mV，2个小时

5、我用丽春红染色后膜上好像没有蛋白，这是什么原因呢？

6、虽然膜上没有特别清楚的蛋白，我还是把接下去的都坐完了，结果还是没有，我还特地把压片时间延长了，但是结果还是令人失望。我是一个新手，总共做了3次，3次都是一样的结果，我想肯定是犯了很多错误，希望楼主能帮助我这个新手解答下我的疑惑，不胜感激。

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-18 15:55

楼主您好：我一直在做肝癌细胞的雌激素受体、磷酸化雌激素受体、MMP9、NF-KB，很不稳定，做出过一两次，而且条带很浅。但是b-actin做的蛮好的。
我的wb条件：
细胞制备
配胶、电泳
转膜：转膜我没完全按照园子里说的那种三明治做法，我是金字塔形的做法，怕不仪器弄短路了。17v，20-30min。
5%牛奶封闭1小时
一抗4度过夜（bioworld，稀释液用的是碧云天的成品）
TBST洗涤10min*3次
二抗室温1小时
TBST洗涤10min*3次
ECL显色1-2分钟
结果是背景很浅，就再没什么其他的了？我也是个新手，也是一个人做实验，没有人指导，我尝试改变过抗体稀释度，封闭时间，ECL时间，增加上样量，就是没有效果。谢谢您给一些指导和意见！

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版主老师：我把TBST的PH调到8左右，ECL发光试剂盒换成了Thermo的，还是不行，加上发光剂，瞬间整个膜变亮，压几秒或几分钟，放入显影剂后，底片全都变黑了，什么原因啊？封闭的原因？还是一抗的原因？稀释的原因？洗涤的原因？我的神呢！

作者: 831226 时间: 2013-3-18 15:56

你好，我做了几次WB，但结果都是没有条带出现，一抗和内参都有这种现象，请问有哪些原因？

我跑电泳的条件是：上层胶80v、80mA半个小时，下层胶120v、80mA一个小时，转膜80mA恒流2小时，5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗4度孵育过夜，TBST洗3次（10min/次），二抗孵育2小时，TBST洗3次，显影定影。上样量为60ug/20ul。

谢谢回答！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:57

你好，非常感谢你耐心的解答和帮助！
我是WB新手，现在想对鱼的不同胚胎发育期的胚胎样品进行某蛋白定量，因Actin会随着细胞分裂发生很大变化，不稳定！请问哪种内参比较合适？另外，样品裂解时用的裂解液是买商品化的好还是自己配置的好？做WB用哪种蛋白酶抑制剂较好？非常感谢您的帮助！

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这种研究我不太懂

裂解液你可以买商业化的。蛋白酶抑制剂我用的是Roche的

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:58

你好，我想请教下列问题：辛苦楼主帮我解答下吧：

我做的过程：

1、我们的胶是自己做的，跑电泳的时候，Mark（7ul）在大概90-170KD的条带比较清楚，淡拉开的距离不大，跟我们实验室其他人的条带相比我的mark还是比较淡的，90KD以下的条带比较糊，而且拉得比较开，颜色也更淡了，要仔细看才能看清楚，是我胶做的有问题吗？

2、电泳的时候我的上样量是10ul，但是跑电泳的时候尾巴都拖得很长，是不是也是胶的问题呢？

3、电泳的电压：浓缩胶80V，分离胶160V。

4、转膜：300mV，2个小时

5、我用丽春红染色后膜上好像没有蛋白，这是什么原因呢？

6、虽然膜上没有特别清楚的蛋白，我还是把接下去的都坐完了，结果还是没有，我还特地把压片时间延长了，但是结果还是令人失望。我是一个新手，总共做了3次，3次都是一样的结果，我想肯定是犯了很多错误，希望楼主能帮助我这个新手解答下我的疑惑，不胜感激。

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1、marker是fermentas的？

2、分离胶浓度多少？

3、胶的可能有问题。有图片吗？

4、转膜300mV还是mA？这个要确定好

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:59

版主老师：我把TBST的PH调到8左右，ECL发光试剂盒换成了Thermo的，还是不行，加上发光剂，瞬间整个膜变亮，压几秒或几分钟，放入显影剂后，底片全都变黑了，什么原因啊？封闭的原因？还是一抗的原因？稀释的原因？洗涤的原因？我的神呢！

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用什么二抗？

放入显影剂，胶片全黑有两种情况：1、胶片被提前曝光了；2、显影剂不对

整张膜发光与一抗、二抗有关系

作者: NBA 时间: 2013-3-18 15:59

你好，我做了几次WB，但结果都是没有条带出现，一抗和内参都有这种现象，请问有哪些原因？

我跑电泳的条件是：上层胶80v、80mA半个小时，下层胶120v、80mA一个小时，转膜80mA恒流2小时，5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗4度孵育过夜，TBST洗3次（10min/次），二抗孵育2小时，TBST洗3次，显影定影。上样量为60ug/20ul。

谢谢回答！

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1、内参都没有条带，说明系统还不work

2、跑电泳没有大问题

3、孵育抗体也没有大问题

4、注意TBST的pH，在7。5-8.0

5、上样量有点大

6、用质量好的试剂

作者: ukonptp 时间: 2013-3-18 16:00

一抗是santa的，内参是coring的，二抗为国产试剂，上样量一般为多少合适，除了TBST还有哪些要调PH的吗？转膜后用立春红染了膜，膜上有条带，是否说明问题出现在转膜后的步骤？

谢谢解答！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-18 16:00

用什么二抗？

放入显影剂，胶片全黑有两种情况：1、胶片被提前曝光了；2、显影剂不对

整张膜发光与一抗、二抗有关系

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版主老师：我用的是中杉金桥的二抗，我用新的显影剂也出现同样的问题，以前没出现过，胶片曝光了有可能！老师能不能给我整个实验一些意见和建议！

作者: yes4 时间: 2013-3-18 16:00

请教楼主，提取出来的蛋白，添加dye煮沸5分钟后，保存-80摄氏度几个月，这个样本还可以用吗？

作者: yes4 时间: 2013-3-18 16:01

请教楼主，提取出来的蛋白，添加dye煮沸5分钟后，保存-80摄氏度几个月，这个样本还可以用吗？

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可以用

作者: windy+++ 时间: 2013-3-18 16:02

请教NBA：今天做了一次WESTERN BLOT,出现了一个很诡异的现象，实验室的同仁讨论了一下还是没有肯定的结论。
是这样子的，我加一抗之前在袋子上标记了一抗的名称：β actin，V6.(需要说明的是先用标记笔标记后才在袋子内加载有蛋白的膜和一抗稀释液)，在最后荧光成像的时候蛋白的条带不是很清楚，可是每张膜的成像上都可以看见我标记的字迹β actin或者V6，而且很清楚。
想不清楚为什么，请您给我解释一下。谢谢！

作者: DONT 时间: 2013-3-18 16:03

scant cruz抗体，建议稀释浓度1：200，我分别用了1：200，1：500，1：1000，ecl显示整张膜都是亮的，但就是没有条带，同张膜的gapdh和perk 都很好，封闭用的5％脱脂牛奶，一抗用封闭液稀释，二抗1：4000，请楼主指导下一步该如何做？谢谢～

作者: wood533 时间: 2013-3-18 16:04

你好，我刚刚开始做WB，很多问题想请教，跑胶的时候各个样品之间出现融合现象是什么原因呢？上样量过大？有可能是玻璃板没洗干净或者没烘干然后胶与玻璃板之间没有融合好的原因吗？谢谢您！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-18 16:04

一个分子量26KD的蛋白，12%的胶，1.0mm厚度，转膜方法：半干转10V，60min，或湿转100V，40min，膜孔径0.2um；一抗、二抗均为进口单抗，每次都为白板，但膜上Marker清晰可见，染胶亦未见有蛋白残留，请帮我分析分析。
蛋白分子量十分明确，及该蛋白在细胞中肯定表达，另有34KD及55KD的蛋白用湿转100V，40min，膜孔径0.45um，均可做出，蛋白提取也应该没问题。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:05

scant cruz抗体，建议稀释浓度1：200，我分别用了1：200，1：500，1：1000，ecl显示整张膜都是亮的，但就是没有条带，同张膜的gapdh和perk 都很好，封闭用的5％脱脂牛奶，一抗用封闭液稀释，二抗1：4000，请楼主指导下一步该如何做？谢谢～

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一抗的原因吧

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:05

你好，我刚刚开始做WB，很多问题想请教，跑胶的时候各个样品之间出现融合现象是什么原因呢？上样量过大？有可能是玻璃板没洗干净或者没烘干然后胶与玻璃板之间没有融合好的原因吗？谢谢您！

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上样量大

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:06

一个分子量26KD的蛋白，12%的胶，1.0mm厚度，转膜方法：半干转10V，60min，或湿转100V，40min，膜孔径0.2um；一抗、二抗均为进口单抗，每次都为白板，但膜上Marker清晰可见，染胶亦未见有蛋白残留，请帮我分析分析。
蛋白分子量十分明确，及该蛋白在细胞中肯定表达，另有34KD及55KD的蛋白用湿转100V，40min，膜孔径0.45um，均可做出，蛋白提取也应该没问题。

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什么蛋白？
转膜没什么条件

作者: pencil菲 时间: 2013-3-18 16:06

FSCN, 55KD,电泳80V，30min，120V60min，转膜湿转，100V，40min，膜孔径0.45
，一抗二抗均为进口，第一个为上样5ul，第二个为上样10ul，没有测蛋白浓度，预实验，怎么蛋白变成竖的形状，从上到下分子量距离为72-43KD，最黑的地方差不多是55KD，反复几次试验结果均差不多，这是什么原因？

作者: pencil菲 时间: 2013-3-18 16:06

第一个也为FSCN，上样10ul，余条件同上，中间的为Cyclin D1，最下边为Bcl-2，26kd，但是仅有背景，无蛋白条带，电泳、转膜条件与前相同。

作者: pencil菲 时间: 2013-3-18 16:06

GAPDH内参，电泳及转膜条件同上

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:07

FSCN, 55KD,电泳80V，30min，120V60min，转膜湿转，100V，40min，膜孔径0.45
，一抗二抗均为进口，第一个为上样5ul，第二个为上样10ul，没有测蛋白浓度，预实验，怎么蛋白变成竖的形状，从上到下分子量距离为72-43KD，最黑的地方差不多是55KD，反复几次试验结果均差不多，这是什么原因？

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结果还可以，调整一下二抗的浓度

作者: yychen 时间: 2013-3-18 16:07

请问楼主，我做的内参怎么是这个样呢？周围很多杂质，
另外问下组织蛋白变性的时候我是沸水煮5分钟！如果变性10分钟有没有什么影响？谢谢

作者: ukonptp 时间: 2013-3-18 16:08

之前做WB一直都非常正常，抗HIF1a、MK5以及actin条带清晰，背景干净。用的条件是milk block 1h，一抗用推荐浓度1h（HIF 4度 3h），TBST10min*3，二抗1:5000 1h，TBST10min*3。
但是这三天不知道什么原因这三种蛋白的信号都变得非常弱，加大二抗的浓度和作用时间之后可以看到预期条带，但是和背景之间的对比度很差。不知道是什么原因？怎样调整条件？
P.S.用以前曝光结果非常漂亮的膜洗去抗体后重新block一抗二抗仍然出现上述问题，说明不是样品出问题了。

作者: abc816 时间: 2013-3-18 16:08

楼主您好，我在胶片曝光时膜上有明显的荧光条带，可是压片过夜后仍曝不出目的条带，显色液每次都是新配的，请问是不是胶片质量的问题啊

作者: fei1226com 时间: 2013-3-18 16:09

版主老师：你以前做ER、P-ER、NF-KB P65、 MMP9都买的是那些公司的抗体啊？

作者: TAT 时间: 2013-3-18 16:09

marker如果加5u，样品加20u的话，是不是要把加marker的孔再加上1x上样缓冲液15u?
BCA测定蛋白浓度后，要把总蛋白调成一致，那么，选择调成一致的液体用什么呢？
我使用博彩生物的RIPA裂解液，是用这个调浓度后再加上样buffer煮么？

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1，Marker与样品之间加一个空，上20ul 1倍缓冲液，再上样品。如果没有空余泳道首先保证样品，Marker泳道5ul的话不会有太多的影响

请问20ul 1倍缓冲液指电泳缓冲液还是上样缓冲液？
谢谢。

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-18 16:10

NBA老师您好，想请教您几个问题：
1，我做的蛋白分子量110kd，用8%的胶，56v,110v，1o5mA半干转2h, santa 一抗1：3000（推荐1：1000-1：5000）, santa二抗1：20000，5%封闭2h，跑两块胶，一块跑3个多小时将maker72条带跑到最下面，另一块单跑内参，内参没问题，但是条带非常模糊，感觉有一团黑的，但是看不清带，不知道是什么问题，请您指点，非常感谢！！
2，我还准备做一个分子量520kd的蛋白，不只是不是要特殊的maker和胶，感觉太大了，谢谢指教。

作者: ritou1985 时间: 2013-3-18 16:10

老师你好，请教下：
我在做一个15KD的KIAA0101蛋白，一直用的伯乐的半干转，现在B-actin是12V，1小时，上下10层滤纸，效果还不错。但是这个目的蛋白12V，半小时，上下10层滤纸，却总是白板。不知什么原因。
请问我应该怎么调整我目的蛋白的转膜条件？
PS。因为我用的PVDF膜，所以转膜后晾干可以隐约看到我膜上已经有蛋白痕迹，但是就是不出结果。

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:11

请问楼主，我做的内参怎么是这个样呢？周围很多杂质，
另外问下组织蛋白变性的时候我是沸水煮5分钟！如果变性10分钟有没有什么影响？谢谢

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变性10min也可以
1、样品中可能有沉淀
2、膜上有污染

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:11

之前做WB一直都非常正常，抗HIF1a、MK5以及actin条带清晰，背景干净。用的条件是milk block 1h，一抗用推荐浓度1h（HIF 4度 3h），TBST10min*3，二抗1:5000 1h，TBST10min*3。
但是这三天不知道什么原因这三种蛋白的信号都变得非常弱，加大二抗的浓度和作用时间之后可以看到预期条带，但是和背景之间的对比度很差。不知道是什么原因？怎样调整条件？
P.S.用以前曝光结果非常漂亮的膜洗去抗体后重新block一抗二抗仍然出现上述问题，说明不是样品出问题了。

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认真考虑下是否更换了试剂

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:11

楼主您好，我在胶片曝光时膜上有明显的荧光条带，可是压片过夜后仍曝不出目的条带，显色液每次都是新配的，请问是不是胶片质量的问题啊

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可以把胶片从盒子里拿出来直接用显影液显影2min，放入定影液定影
看胶片是什么样的
应该是胶片的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:12

版主老师：你以前做ER、P-ER、NF-KB P65、 MMP9都买的是那些公司的抗体啊？

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各个公司的都有
你要做的样品是什么种属的？
可以加我的qq群讨论

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:12

1，Marker与样品之间加一个空，上20ul 1倍缓冲液，再上样品。如果没有空余泳道首先保证样品，Marker泳道5ul的话不会有太多的影响

请问20ul 1倍缓冲液指电泳缓冲液还是上样缓冲液？
谢谢。

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1倍的缓冲液指1倍的上样缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:13

NBA老师您好，想请教您几个问题：
1，我做的蛋白分子量110kd，用8%的胶，56v,110v，1o5mA半干转2h, santa 一抗1：3000（推荐1：1000-1：5000）, santa二抗1：20000，5%封闭2h，跑两块胶，一块跑3个多小时将maker72条带跑到最下面，另一块单跑内参，内参没问题，但是条带非常模糊，感觉有一团黑的，但是看不清带，不知道是什么问题，请您指点，非常感谢！！
2，我还准备做一个分子量520kd的蛋白，不只是不是要特殊的maker和胶，感觉太大了，谢谢指教。

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样品跑完电泳后染过胶吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:13

老师你好，请教下：
我在做一个15KD的KIAA0101蛋白，一直用的伯乐的半干转，现在B-actin是12V，1小时，上下10层滤纸，效果还不错。但是这个目的蛋白12V，半小时，上下10层滤纸，却总是白板。不知什么原因。
请问我应该怎么调整我目的蛋白的转膜条件？
PS。因为我用的PVDF膜，所以转膜后晾干可以隐约看到我膜上已经有蛋白痕迹，但是就是不出结果。

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0.22孔径的膜吗？
转膜后是否用丽春红染膜？

作者: qqq111 时间: 2013-3-18 16:14

请问：western blot 用半干转好还是用湿转好，正要买一个做转膜的仪器。蛋白质的大小20－50kD

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分子量在100K一下建议用半干，
是100K还是100KD?谢谢

作者: yjf1026 时间: 2013-3-18 16:14

老师您好，我最近在做western遇到几个问题：
我们实验室用的是TANON的设备，跑胶没什么问题，彩虹预染maker（碧云天）在单一孔道，很漂亮，但是在转膜的时候，彩虹预染maker会有一小部分转到其他的孔道去，这是为什么呢？我们实验室用的是湿转法，一般是250mA,60min.转膜液才用了一次，应该还好吧，也是4度条件下跑，难道说是滤纸太大了造成电流不均，蛋白转歪了？还是？请指教，谢谢！

作者: douding66 时间: 2013-3-18 16:14

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

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good luck
RT干燥指什么啊？

作者: yes4 时间: 2013-3-18 16:15

老师，你好：我内参抗体用的是康成生物的那种一抗直接带HRP酶的B-ACTIN抗体，按1：5k稀释，过夜4度孵育，然后用TBST洗10min*3次，用pierce的ECL曝光【新买的】，却老是白板，这是为什么呢？每次孵膜之前我都会用丽春红染一下，条带十分清楚。。。我实在不知道问题出在了哪里？求指导，谢谢。。。

作者: tie8 时间: 2013-3-18 16:15

NBA老师：我跑完没有染色。

作者: 831226 时间: 2013-3-18 16:16

版主老师，您好！请教一下，10%SDS的配制需要加盐酸助溶吗，它的pH值一般是多少，过酸对配制电泳液会有什么影响吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:16

老师您好，我最近在做western遇到几个问题：
我们实验室用的是TANON的设备，跑胶没什么问题，彩虹预染maker（碧云天）在单一孔道，很漂亮，但是在转膜的时候，彩虹预染maker会有一小部分转到其他的孔道去，这是为什么呢？我们实验室用的是湿转法，一般是250mA,60min.转膜液才用了一次，应该还好吧，也是4度条件下跑，难道说是滤纸太大了造成电流不均，蛋白转歪了？还是？请指教，谢谢！

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湿转不存在滤纸大小问题
主要起支持作用
转膜条件没问题
扩散的厉害吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:17

RT干燥指什么啊？

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room temperature

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:17

老师，你好：我内参抗体用的是康成生物的那种一抗直接带HRP酶的B-ACTIN抗体，按1：5k稀释，过夜4度孵育，然后用TBST洗10min*3次，用pierce的ECL曝光【新买的】，却老是白板，这是为什么呢？每次孵膜之前我都会用丽春红染一下，条带十分清楚。。。我实在不知道问题出在了哪里？求指导，谢谢。。。

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1、样品处理后，跑电泳染过胶吗？
2、丽春红染色很清楚的话，说明转膜等没问题
3、稀释抗体的缓冲液pH多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:18

NBA老师：我跑完没有染色。

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1、样品跑完电泳后请染胶
2、转膜后请用丽春红染色

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:19

版主老师，您好！请教一下，10%SDS的配制需要加盐酸助溶吗，它的pH值一般是多少，过酸对配制电泳液会有什么影响吗？谢谢！

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不需要添加任何东西
直接溶解即可
或者加热至50-60度溶解

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-18 16:20

1、样品处理后，跑电泳染过胶吗？
2、丽春红染色很清楚的话，说明转膜等没问题
3、稀释抗体的缓冲液pH多少？

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样品处理后，跑过电泳，条带没有问题。。

转膜条件是100v,1.5h,湿转，从丽春红染色来看，转膜没有问题，蛋白量也不少。。

抗体稀释用的是碧云天的一抗稀释液，不知道PH值。。。楼主建议用什么来稀释呢？

今天，在暗室里做了1UL的该抗体+ECL液，有明显的光反应，说明，没有问题呀。。。

就是不出来信号，是不是因为抗体稀释有问题，它说明书上是1：10000，而我用的是1：5000。。。

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-18 16:21

楼主老师您好：最近刚刚开始做wb。我的目的蛋白分子量为98kd，为一种核蛋白。我们6孔板从培养箱取出，马上置于冰上，预冷PBS冲洗后，RIPA法提取总蛋白。蛋白上样量为100ug，转膜后丽春红染色条带很清晰（250ma，3h，0.2umPVDF膜）。一抗为abcam 1:300稀释（建议1:100-500），二抗为中杉金桥的按1:6000稀释。（一抗为mouse来源的单克隆抗体，二抗为抗mouse的）内参GAPDH条带很清晰，而普通发光液为光板，超敏发光液在100kd左右有杂乱不清的条带。请楼主帮我找下原因。是不是因为没有单独提取核蛋白，而此因子在总蛋白的比率非常低。我查阅了文献，这种核蛋白在我培养的细胞中是表达的。谢谢！

图片附件: 39060047.jpg (2013-3-18 16:21, 149.69 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15208

作者: 987789 时间: 2013-3-18 16:23

以前提取的蛋白跑western效果还可以，丽春红染色有条带，发光也能显示，挺清楚的，但是最近还是用的这个蛋白做完之后，发现maker已经转到膜上，但是用丽春红染色没有条带，加抗体之后发光十分弱，连内参都要压十分钟才能显示出来，其他蛋白基本都不显示，每孔上样蛋白为70微克，已经很高了啊，想了想转膜过程中也没有什么大的问题啊，请教一下能有什么原因？谢谢

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-18 16:23

lz，各位高手，请务必看到我，看到我~
我有个关于磷酸化蛋白的WB问题，急需大家的解答，小女子先行谢过了！~

请问对于信号通路上的蛋白，有磷酸化和非磷酸化两种形式，如A和Pho-A。我做WB的时候选择total A做内参，这个total A是如何进行检测的，平时实验所买的A抗体是指单纯的非磷酸化的A，还是就是指total A呢？如果我们平时用的A只是指单纯性的非磷酸化A，那么，我要检测total A是不是要在同一张膜上先做A，stripping 后再做一次Pho-A，然后两者之和算total A？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:24

样品处理后，跑过电泳，条带没有问题。。

转膜条件是100v,1.5h,湿转，从丽春红染色来看，转膜没有问题，蛋白量也不少。。

抗体稀释用的是碧云天的一抗稀释液，不知道PH值。。。楼主建议用什么来稀释呢？

今天，在暗室里做了1UL的该抗体+ECL液，有明显的光反应，说明，没有问题呀。。。

就是不出来信号，是不是因为抗体稀释有问题，它说明书上是1：10000，而我用的是1：5000。。。

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内参做的如何？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:24

楼主老师您好：最近刚刚开始做wb。我的目的蛋白分子量为98kd，为一种核蛋白。我们6孔板从培养箱取出，马上置于冰上，预冷PBS冲洗后，RIPA法提取总蛋白。蛋白上样量为100ug，转膜后丽春红染色条带很清晰（250ma，3h，0.2umPVDF膜）。一抗为abcam 1:300稀释（建议1:100-500），二抗为中杉金桥的按1:6000稀释。（一抗为mouse来源的单克隆抗体，二抗为抗mouse的）内参GAPDH条带很清晰，而普通发光液为光板，超敏发光液在100kd左右有杂乱不清的条带。请楼主帮我找下原因。是不是因为没有单独提取核蛋白，而此因子在总蛋白的比率非常低。我查阅了文献，这种核蛋白在我培养的细胞中是表达的。谢谢！

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核蛋白用提取总蛋白来做没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:25

以前提取的蛋白跑western效果还可以，丽春红染色有条带，发光也能显示，挺清楚的，但是最近还是用的这个蛋白做完之后，发现maker已经转到膜上，但是用丽春红染色没有条带，加抗体之后发光十分弱，连内参都要压十分钟才能显示出来，其他蛋白基本都不显示，每孔上样蛋白为70微克，已经很高了啊，想了想转膜过程中也没有什么大的问题啊，请教一下能有什么原因？谢谢

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先解决把蛋白转到膜上的问题

作者: 49888 时间: 2013-3-18 16:25

楼主老师好，我刚开始做WB，P-AKT的蛋白总是做不出来，一直是白板，AKT做的结果很好。我用的抗体都是CST公司的，稀释倍数也是按照说明书来的，用的是化学发光凝胶成像系统。已经一个月了，原来以为是一抗的问题，现在换了新的抗体，还是不出来，想请教一下有什么原因？谢谢~~

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:31

楼主老师好，我刚开始做WB，P-AKT的蛋白总是做不出来，一直是白板，AKT做的结果很好。我用的抗体都是CST公司的，稀释倍数也是按照说明书来的，用的是化学发光凝胶成像系统。已经一个月了，原来以为是一抗的问题，现在换了新的抗体，还是不出来，想请教一下有什么原因？谢谢~~

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内参做的怎么样？p-akt用的是那个货号？
系统稳定吗？

作者: remenb 时间: 2013-3-18 16:32

相关疾病：
头痛
没想到帖子开通到现在都没有关闭，太感谢楼主了！刚开始做western blot，却遇到了头疼的问题。蛋白提取失败，或者是蛋白样品保存失败吧。第一次做，最后去曝光，结果什么也没有，第二次做，转膜后用丽春红染，结果阴性，再往前推，用考马斯亮蓝染刚电泳的胶，结果也是阴性，问题基本确定是蛋白样品的问题了。咨询做过的同学，硬说我胶做的不行，或是裂解液不行，蛋白酶抑制剂加的不行（她没来过我们实验室），我预染marker及样品跑的时候不错，转膜预染marker也转的不错，虽然marker很容易电泳和转膜，但至少证明我做的胶还行，电泳（都是按配方做的，也没气泡什么的），然后说裂解液，但我的裂解液是pierce的M-PER mammalian protein extraction reagent，够质量了吧，蛋白酶抑制剂也是900块的蛋白酶抑制剂混合物（国产的），然后说加的不行，我是按说明书1：100加抑制剂，我又不是用鼻孔吸进去的！反正觉的她的回答太不靠谱了，甚至觉得她在搞笑。第一次裂解细胞用的六孔板，两孔的细胞裂解收集在一个ep管，测浓度是1.2ug/ul，6ug/ul，7ug/ul，有人说这浓度低了，然后第二次提就直接用瓶子提了，每瓶加500ul裂解液，摇床上冰上裂解5min，这次没测浓度了，加5倍上样缓冲液（碧云天），煮沸5min，电泳后考马斯亮蓝染阴性，转膜后丽春红染也是阴性。确确实实感觉是蛋白样品的问题了，但却不知道问题在哪。恳切楼主或各位战友指点迷津。还有我裂解细胞细胞刮收集离心后ep管底一点沉渣都没有（细胞基本常满），不知什么原因？贝博的蛋白酶抑制剂在4℃也是凝结像冰一样的，是这样吗？

作者: ero11 时间: 2013-3-18 16:33

您好附图是我做的细胞提取蛋白胶片 5%脱脂奶粉室温封闭1h，santa一抗1：1500，用脱脂奶粉稀释，二抗1：5000，用TBST稀释，ECl反应1min，出来背景很深，看不到条带；之前做过一个蛋白可以看见条带，但就是在条带周围也有这样的背景，麻烦帮我分析一下原因

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这种情况我也遇见过，我觉得原因可能有：
1.封闭不完全
2.二抗浓度偏高，可以做到1:10000
3.抗体稀释液可以试用一下百分之二或百分之五的脱脂奶粉，BSA更好
个人观点，希望对你有些帮助，加油

作者: ero11 时间: 2013-3-18 16:33

没想到帖子开通到现在都没有关闭，太感谢楼主了！刚开始做western blot，却遇到了头疼的问题。蛋白提取失败，或者是蛋白样品保存失败吧。第一次做，最后去曝光，结果什么也没有，第二次做，转膜后用丽春红染，结果阴性，再往前推，用考马斯亮蓝染刚电泳的胶，结果也是阴性，问题基本确定是蛋白样品的问题了。咨询做过的同学，硬说我胶做的不行，或是裂解液不行，蛋白酶抑制剂加的不行（她没来过我们实验室），我预染marker及样品跑的时候不错，转膜预染marker也转的不错，虽然marker很容易电泳和转膜，但至少证明我做的胶还行，电泳（都是按配方做的，也没气泡什么的），然后说裂解液，但我的裂解液是pierce的M-PER mammalian protein extraction reagent，够质量了吧，蛋白酶抑制剂也是900块的蛋白酶抑制剂混合物（国产的），然后说加的不行，我是按说明书1：100加抑制剂，我又不是用鼻孔吸进去的！反正觉的她的回答太不靠谱了，甚至觉得她在搞笑。第一次裂解细胞用的六孔板，两孔的细胞裂解收集在一个ep管，测浓度是1.2ug/ul，6ug/ul，7ug/ul，有人说这浓度低了，然后第二次提就直接用瓶子提了，每瓶加500ul裂解液，摇床上冰上裂解5min，这次没测浓度了，加5倍上样缓冲液（碧云天），煮沸5min，电泳后考马斯亮蓝染阴性，转膜后丽春红染也是阴性。确确实实感觉是蛋白样品的问题了，但却不知道问题在哪。恳切楼主或各位战友指点迷津。还有我裂解细胞细胞刮收集离心后ep管底一点沉渣都没有（细胞基本常满），不知什么原因？贝博的蛋白酶抑制剂在4℃也是凝结像冰一样的，是这样吗？

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裂解液买的是原装进口还是分装的？

作者: standbyme 时间: 2013-3-18 16:34

裂解液买的是原装进口还是分装的？

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裂解液是原装的。现在发现不是蛋白样品的问题了。因为周五我转完膜后把胶放在考马斯亮蓝里面就走了，今天来看竟然出现了清晰的蛋白条带，看样子染这东西真的不能太性急，那天就染了20min不到，但新问题又出来了，为什么转膜失败？我的转膜缓冲液是6.05gtris base、甘氨酸28.83、甲醇400ml，定容至2000ml，湿转，300mA，1h，预染marker转的还行，但这似乎不能说明任何问题？为何转膜失败？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 16:35

我想请问版主，什么原因会导致膜是花的，可以从下图看到膜的左边和右边的显色程度不一样，一抗和二抗大概是3ml左右，用封口膜封好孵育的，曝光时，先赶掉气泡才曝光的，但不知为什么膜是花的，求指导。

图片附件: 38638245.jpg (2013-3-18 16:36, 7.42 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15209

作者: 小野花 时间: 2013-3-18 16:37

我最近在做ERK和P38，同样的蛋白上样量，ERK用的12%的分离胶，P38用的10%的分离胶，最后出来的条带ERK有一个样要比其他的窄一半左右，而P38却好很多，能给我分析一下可能的原因吗？

作者: eric930 时间: 2013-3-18 16:37

请问4KD大小的短肽能通过0.22um的滤膜吧？

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 16:43

版主帮忙看下条带
最近做了两个月的western blot，做组织蛋白条带很好，现在做细胞样品总是杂带很多，找不出目的条带，很亮的那条带所对应的marker位置又不对，就像下面这张图

图片附件: 92081043.snap.jpg (2013-3-18 16:43, 14.04 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15211

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 16:44

后来换了二抗，条带总算出来了，如下图。最左边是组织蛋白，上样量大了。上面的那条很深的带是目的蛋白（100kDa），下面那条深的带是另一个目的蛋白（65kDa），没有strip干净。右边三条是细胞样品，虽然目的条带出来了，但在别的位置有几条很深的条带，不知为什么 ?这个不是没有strip干净的原因，在做第一个蛋白时也是这样的情况

图片附件: 86552319.snap.jpg (2013-3-18 16:44, 49.39 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15212

作者: youyou99 时间: 2013-3-18 16:44

下面这张图左边五条是细胞样品，最右边一条是组织样品。有几个问题想请教：1、为什么细胞样品都有很明显的背景，而组织样品没有背景?组织样品和细胞样品的处理方法基本一样，都是直接加loading buffer 超声裂解，然后4度离心，取上清沸水浴5min。2.看条带位置，组织样品的那条带略高于细胞样品的条带，难道细胞样品仍没有出现目的条带？

作者: am10 时间: 2013-3-18 16:45

我跑WB，曝光时内参GAPDH出来还可以，但是目的蛋白却什么也没有。之前做过几次，虽不漂亮，但是至少有出来很多的条带。我可以肯定，膜没有放反。根据marker的位置切的膜，按理也不可能切掉了目的条带呀。请各位帮忙分析下是什么原因造成的什么也爆不出来》

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:45

裂解液是原装的。现在发现不是蛋白样品的问题了。因为周五我转完膜后把胶放在考马斯亮蓝里面就走了，今天来看竟然出现了清晰的蛋白条带，看样子染这东西真的不能太性急，那天就染了20min不到，但新问题又出来了，为什么转膜失败？我的转膜缓冲液是6.05gtris base、甘氨酸28.83、甲醇400ml，定容至2000ml，湿转，300mA，1h，预染marker转的还行，但这似乎不能说明任何问题？为何转膜失败？

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转缓没问题
在转膜前，样品染过胶吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:46

我想请问版主，什么原因会导致膜是花的，可以从下图看到膜的左边和右边的显色程度不一样，一抗和二抗大概是3ml左右，用封口膜封好孵育的，曝光时，先赶掉气泡才曝光的，但不知为什么膜是花的，求指导。

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调整二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:46

请问4KD大小的短肽能通过0.22um的滤膜吧？

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应该过不了

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:46

版主帮忙看下条带
最近做了两个月的western blot，做组织蛋白条带很好，现在做细胞样品总是杂带很多，找不出目的条带，很亮的那条带所对应的marker位置又不对，就像下面这张图

后来换了二抗，条带总算出来了，如下图。最左边是组织蛋白，上样量大了。上面的那条很深的带是目的蛋白（100kDa），下面那条深的带是另一个目的蛋白（65kDa），没有strip干净。右边三条是细胞样品，虽然目的条带出来了，但在别的位置有几条很深的条带，不知为什么 ?这个不是没有strip干净的原因，在做第一个蛋白时也是这样的情况

下面这张图左边五条是细胞样品，最右边一条是组织样品。有几个问题想请教：1、为什么细胞样品都有很明显的背景，而组织样品没有背景?组织样品和细胞样品的处理方法基本一样，都是直接加loading buffer 超声裂解，然后4度离心，取上清沸水浴5min。2.看条带位置，组织样品的那条带略高于细胞样品的条带，难道细胞样品仍没有出现目的条带？

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目的蛋白分子量多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 16:47

我跑WB，曝光时内参GAPDH出来还可以，但是目的蛋白却什么也没有。之前做过几次，虽不漂亮，但是至少有出来很多的条带。我可以肯定，膜没有放反。根据marker的位置切的膜，按理也不可能切掉了目的条带呀。请各位帮忙分析下是什么原因造成的什么也爆不出来

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转膜后丽春红染色了吗？
每次转完的：做不出目的都检测了GAPDH？

作者: DONT 时间: 2013-3-18 16:48

请教版主，关于蛋白上样量的问题。看了一些资料，也问了师兄师姐，有的上20-40μg，也有上100μg的。我提细胞蛋白，得到的蛋白裂解液浓度有28μg/μl,就用300μg去除以这个浓度，基本上10-11μl就行啦。想问一下，这样可以吗？

作者: 3N4G 时间: 2013-3-18 16:54

目的蛋白分子量多少？

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第三张图的目的蛋白分子量65kDa
谢谢解答

作者: ququer787 时间: 2013-3-18 16:56

我用120v，110min转膜，发现下部的几条marker条带还在胶上，只有一点点转到膜上，这是我转膜的时间太短了吗？我记得相同的条件，我最初做的时候没有出现这样的情况。但是在到后面内参还是可以很好的爆出来的。大家帮忙分析下

作者: ququer787 时间: 2013-3-18 16:57

我是爆完光才用丽春红染色的，可以看到条带的。

作者: Ao7 时间: 2013-3-18 17:01

请教您一下，这是我今天出的图，不懂啊。

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上面一条是beta-actin，下面一条是我的目的蛋白，15KDa。
两条是同一版胶切下来分次转膜的，内参还整齐，可目的就成这了。
我用的是15%的胶，目的蛋白的转膜条件是半干转，10V，60mA，30min。可能跟您的转膜条件有所不同，但的确是转上了啊。
我考虑是不是胶的问题？可为什么43KDa的条带整齐，15KDa的就成这种样子呢？
或者有没有可能是因为我转膜电流过大，让蛋白条带在转膜的时候变形了？
或者是因为我上样前没有离心？

特此请教，感谢啊！！！

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:02

请教版主，关于蛋白上样量的问题。看了一些资料，也问了师兄师姐，有的上20-40μg，也有上100μg的。我提细胞蛋白，得到的蛋白裂解液浓度有28μg/μl,就用300μg去除以这个浓度，基本上10-11μl就行啦。想问一下，这样可以吗？

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我做WB上样量
细胞：10-15ug
组织：20-40ug
BCA定量

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:03

第三张图的目的蛋白分子量65kDa
谢谢解答

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实际条带结果与65的预测目的差多少KD？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:03

我用120v，110min转膜，发现下部的几条marker条带还在胶上，只有一点点转到膜上，这是我转膜的时间太短了吗？我记得相同的条件，我最初做的时候没有出现这样的情况。但是在到后面内参还是可以很好的爆出来的。大家帮忙分析下

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转膜条件已经很强了
请再次确认你的转膜条件电泳仪的设定是否同你所说

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:03

请教您一下，这是我今天出的图，不懂啊。

上面一条是beta-actin，下面一条是我的目的蛋白，15KDa。
两条是同一版胶切下来分次转膜的，内参还整齐，可目的就成这了。
我用的是15%的胶，目的蛋白的转膜条件是半干转，10V，60mA，30min。可能跟您的转膜条件有所不同，但的确是转上了啊。
我考虑是不是胶的问题？可为什么43KDa的条带整齐，15KDa的就成这种样子呢？
或者有没有可能是因为我转膜电流过大，让蛋白条带在转膜的时候变形了？
或者是因为我上样前没有离心？

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特此请教，感谢啊！！！
用12%的分离胶吧
上样量多大？

作者: 49888 时间: 2013-3-18 17:04

调整二抗浓度

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调大以后不出了，我想请教为什么膜是一边曝光强一边弱呢

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:05

调大以后不出了，我想请教为什么膜是一边曝光强一边弱呢

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抗体孵育充分吗？
多大的膜加了多少毫升一抗、二抗稀释液？
ECL充分覆盖膜了吗？等等。。。

作者: yonger 时间: 2013-3-18 17:05

我做的是289的mTOR和185的 ErBb3，但是做出来都发现有拖尾现象，用的小梳子，加的15ul的量，转膜条件是100V，4h，想问一下是什么原因出现这样的情况！

作者: yonger 时间: 2013-3-18 17:06

都仍了，拖得很严重，感觉都糊成一片了，每个之间也无法很好的隔开

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-18 17:07

你好，我的目的蛋白是54kDa，用过10%，12%的分离胶，上样量30μg，电泳80v，30min，110v，90min，转膜350mA，2h，封闭5%TBST脱脂牛奶，室温2h，抗体是用封闭液稀释的，一抗是Santa Cruz的，建议1:50-1:200，用过1:100和1:50，都是4度过夜的，洗3*5min，二抗是bioworld的，建议1:5000-1:100000，室温2h，洗5*5min，ECL显色，有光，可是我的条带总是很弥散，有什么可以优化的吗？电泳液转膜液都是新的，没有回收过

一抗二抗滴度分别是

一抗1:100，二抗1:3000

一抗1:100，二抗1:4000

一抗1:50，二抗1:4000

一抗1:50，二抗1:5000

一抗1:50，二抗1:10000

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作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:07

你好，我的目的蛋白是54kDa，用过10%，12%的分离胶，上样量30μg，电泳80v，30min，110v，90min，转膜350mA，2h，封闭5%TBST脱脂牛奶，室温2h，抗体是用封闭液稀释的，一抗是Santa Cruz的，建议1:50-1:200，用过1:100和1:50，都是4度过夜的，洗3*5min，二抗是bioworld的，建议1:5000-1:100000，室温2h，洗5*5min，ECL显色，有光，可是我的条带总是很弥散，有什么可以优化的吗？电泳液转膜液都是新的，没有回收过

一抗二抗滴度分别是

一抗1:100，二抗1:3000

一抗1:100，二抗1:4000

一抗1:50，二抗1:4000

一抗1:50，二抗1:5000

一抗1:50，二抗1:10000

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你试下：一抗1:200，二抗1:10000

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-18 17:08

我跑WB，曝光时内参GAPDH出来还可以，但是目的蛋白却什么也没有。之前做过几次，虽不漂亮，但是至少有出来很多的条带。我可以肯定，膜没有放反。根据marker的位置切的膜，按理也不可能切掉了目的条带呀。请各位帮忙分析下是什么原因造成的什么也爆不出来》

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你好，请问你GAPDH条带怎么样？我也是GAPDH，可是条带很细，只有0.1mm粗，你用的是哪家的抗体啊？

作者: 3N4G 时间: 2013-3-18 17:09

相关疾病：
感染
您好，最近作一个蛋白的WB，一抗用的是感染血清，稀释度用1：100，总是做不出条带？怀疑是这个蛋白在感染过程中属于含量较少的，没有刺激动物产生很多抗体，请问除了增加稀释度外还有其他的方法么？

或者是其他的原因造成WB无结果？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-18 17:09

楼主好，我是个新手，做WB一抗用的是牛血清二抗羊抗牛用什么做封闭液呢

作者: wmp1234 时间: 2013-3-18 17:10

楼主你好我最近才开始做WB 但是所需蛋白是培养液中细胞所分泌的蛋白请问我应该用哪种方法提取培养液中的蛋白呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:11

你好，请问你GAPDH条带怎么样？我也是GAPDH，可是条带很细，只有0.1mm粗，你用的是哪家的抗体啊？

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条带粗细与上样量大小、ecl敏感性、曝光时间长短、胶片显影时间长短等有关

作者: NBA 时间: 2013-3-18 17:12

您好，最近作一个蛋白的WB，一抗用的是感染血清，稀释度用1：100，总是做不出条带？怀疑是这个蛋白在感染过程中属于含量较少的，没有刺激动物产生很多抗体，请问除了增加稀释度外还有其他的方法么？

或者是其他的原因造成WB无结果？

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抗原是什么？
电泳后染过胶吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:50

楼主好，我是个新手，做WB一抗用的是牛血清二抗羊抗牛用什么做封闭液呢

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试试羊血清

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:51

楼主你好我最近才开始做WB 但是所需蛋白是培养液中细胞所分泌的蛋白请问我应该用哪种方法提取培养液中的蛋白呢？

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培养液中的蛋白进行WB，我没做过
不好意思
不过你可以试试冷冻干燥法，把上清液浓缩后进行检测
good luck

作者: duoduo 时间: 2013-3-19 14:51

你试下：一抗1:200，二抗1:10000

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我又做了一次，按照你说的，其他条件没有变，可是条带还是那样，背景也很深，是不是要改二抗滴度，1:15000行吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:52

我又做了一次，按照你说的，其他条件没有变，可是条带还是那样，背景也很深，是不是要改二抗滴度，1:15000行吗？

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二抗用1:20000,1:40000

作者: ha111 时间: 2013-3-19 14:52

你好，我的目的蛋白是70kb, 一抗1：100（santa),多克隆抗体，四度过夜，二抗1：2000，常温一小时，封闭剂用5%TBST脱脂牛奶，常温一小时，洗膜TBST15min/time, 共四次。可是出来的杂带很多，目的带虽然出来，但是比杂带弱多了，可能是封闭时间不够还是抗体特异性不高呢？或是抗体浓度不准确？
另外做内参的beta-actin虽然目标条带比较清楚，但也在目标条带附近和顶部出现了杂带，不知是为什么？

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作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:54

你好，我的目的蛋白是70kb, 一抗1：100（santa),多克隆抗体，四度过夜，二抗1：2000，常温一小时，封闭剂用5%TBST脱脂牛奶，常温一小时，洗膜TBST15min/time, 共四次。可是出来的杂带很多，目的带虽然出来，但是比杂带弱多了，可能是封闭时间不够还是抗体特异性不高呢？或是抗体浓度不准确？
另外做内参的beta-actin虽然目标条带比较清楚，但也在目标条带附近和顶部出现了杂带，不知是为什么？

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1、内参这个样子，有点差哦。内参也是santa的？
2、目的蛋白的一抗稀释度调整到1:500.1:1000两个浓度试试

作者: ha111 时间: 2013-3-19 14:54

内参是sigma的，按理说质量应该可以呀

作者: tie8 时间: 2013-3-19 14:55

楼主请帮我看看这是什么原因，膜都是黑的，但是有蛋白的地方确是亮的，确没有杂交出条带。还有总是有一块地方好像没做上是空的，是不是膜不干净？
实验条件是：BSA室温封闭2小时，一抗1:1000 4度杂交过夜，二抗1:20000
还有一个问题是：pbs加吐温是封闭，一抗，二抗以及洗膜每步都加么？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15233

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:55

内参是sigma的，按理说质量应该可以呀

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那就是操作上哪一步做的不好了？
不过怎么说内参抗体一般都没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:56

楼主请帮我看看这是什么原因，膜都是黑的，但是有蛋白的地方确是亮的，确没有杂交出条带。还有总是有一块地方好像没做上是空的，是不是膜不干净？
实验条件是：BSA室温封闭2小时，一抗1:1000 4度杂交过夜，二抗1:20000
还有一个问题是：pbs加吐温是封闭，一抗，二抗以及洗膜每步都加么？

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羊来源一抗？

作者: tie8 时间: 2013-3-19 14:56

是老鼠的一抗啊

作者: tie8 时间: 2013-3-19 14:56

看实验结果，是不是由于封闭没有做好呢？还是需要调整一抗或者二抗的浓度？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 14:57

是老鼠的一抗啊

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是抗小鼠、抗大鼠的一抗
还是小鼠或者大鼠来源的一抗？
不是一个概念哦
蛋白样品上样量有点大，降低上样量，稀释一抗、二抗

作者: windy+++ 时间: 2013-3-19 14:58

楼主，WB新手向你请教下
我的2个目的蛋白分子量分别是90和20 内参用的actin ，光跑内参时条带还不错，清晰平整，但这2次跑目的蛋白时
膜整个就是黑的，若有若无的看见条带，一抗都是santa 的1:200的（1：100~1:1000）二抗是普通的1:5000。别人说是抗体浓度太高，我改成了一抗1:200 二抗1：10000和一抗1:400 二抗1:10000
结果是一抗没换的还是膜很黑，能看到条带好像还有很多杂带样，换一抗的膜背景不是很黑，但条带只有前面几个孔有，后面的都没看到了。
封闭时间第一次1H 第二次>1H 请帮分析下
接下来该怎么调整啊？谢谢！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-19 14:59

首先在此感谢版主为大家不断的回复帖子帮助大家~~

然后我说一下自己的western问题：

自己从今年6月开始做western，条带每次都有，尽管质量一般，

目的蛋白apoe 35kd

一抗santa 1:300，

二抗中杉金桥1:5000，

内参actin

一抗碧云天1:2000

二抗中杉金桥1:5000

5%脱脂牛奶封闭和稀释抗体，

碧云天配胶试剂盒，

国产western装备，

蛋白使用碧云天western IP裂解液和PMSF，使用碧云天5乘buffer加入后煮5min，分装-80冻存。

上样量一般在20ug左右，
转膜时间50min，250mA，使用0.22um的膜。

常温封闭1h

常温杂交带装一抗摇床140转/min 1h后4度过夜，

洗膜10min 3次

常温杂交带装二抗摇床140转/min 1h后

洗膜10min 3次

然后碧云天ECL显色。

然后自己的目的和内参都出来了。

8月底的时候自己抽提了一批蛋白然后做western，条件和上述全部一致，上样量没有精确计算，使用15孔的梳子，每孔10ul上样量，预跑了下面这个western，图片效果很好，如图1：

图片附件: 46138731.jpg (2013-3-19 14:59, 10.42 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15234

作者: kuaizige 时间: 2013-3-19 14:59

但是5天后，也就是9月初开始就再也没有做出来过上述的图片，尽管还是同一批抽提的蛋白，目的和内参一起变得非常淡，如图2：

图片附件: 74024067.jpg (2013-3-19 14:59, 9.16 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15235

作者: kuaizige 时间: 2013-3-19 15:00

其后又反复跑了3次，并且把上样量增加到20ul（之前最后跑出来那次是10ul），还是这个样子，淡淡的。。。

然后自己重新抽提了蛋白，更换所有的液体，更换膜，使用别人的ECL显色剂，延长曝光时间等等。另外每次转膜的蛋白质marker都是转的很清楚的，但是目的和内参的条带还是暗淡。

我知道条带暗淡的原因很多，从蛋白到转膜到抗体到显色......现在实在是没有办法了，所以在此向版主求助。

非常感谢~~~

作者: DONT 时间: 2013-3-19 15:00

楼主，您好！
我是WB新手，实验的目的蛋白是TLR9，从人外周血单个核细胞中提取。但我做了几次，WB结果显示内参蛋白很少，而目的蛋白基本看不到。请问是不是蛋白量太少？
以下是我提取蛋白的粗略步骤：
1.将分离得到的外周血单个核细胞接种于6孔板，2X106/孔；加药物刺激
2.1000rpm，5min收集细胞；用PBS漂洗两遍
3.用RIPA+PMSF提取蛋白（每孔100ulRIPA+1ulPMSF），冰上30min
4.加入等体积的2X上样缓冲液，煮沸3-5min
5.12000rpm，4度，10min，分装-80度保存
没有用BCA法测定蛋白量

请问楼主，用外周血单个核细胞做WB，上述细胞密度是否合适？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:08

楼主，WB新手向你请教下
我的2个目的蛋白分子量分别是90和20 内参用的actin ，光跑内参时条带还不错，清晰平整，但这2次跑目的蛋白时
膜整个就是黑的，若有若无的看见条带，一抗都是santa 的1:200的（1：100~1:1000）二抗是普通的1:5000。别人说是抗体浓度太高，我改成了一抗1:200 二抗1：10000和一抗1:400 二抗1:10000
结果是一抗没换的还是膜很黑，能看到条带好像还有很多杂带样，换一抗的膜背景不是很黑，但条带只有前面几个孔有，后面的都没看到了。
封闭时间第一次1H 第二次>1H 请帮分析下
接下来该怎么调整啊？谢谢！

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与你做的内参用的二抗相同吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:09

首先在此感谢版主为大家不断的回复帖子帮助大家~~

然后我说一下自己的western问题：

自己从今年6月开始做western，条带每次都有，尽管质量一般，

目的蛋白apoe 35kd

一抗santa 1:300，

二抗中杉金桥1:5000，

内参actin

一抗碧云天1:2000

二抗中杉金桥1:5000

5%脱脂牛奶封闭和稀释抗体，

碧云天配胶试剂盒，

国产western装备，

蛋白使用碧云天western IP裂解液和PMSF，使用碧云天5乘buffer加入后煮5min，分装-80冻存。

上样量一般在20ug左右，
转膜时间50min，250mA，使用0.22um的膜。

常温封闭1h

常温杂交带装一抗摇床140转/min 1h后4度过夜，

洗膜10min 3次

常温杂交带装二抗摇床140转/min 1h后

洗膜10min 3次

然后碧云天ECL显色。

然后自己的目的和内参都出来了。

8月底的时候自己抽提了一批蛋白然后做western，条件和上述全部一致，上样量没有精确计算，使用15孔的梳子，每孔10ul上样量，预跑了下面这个western，图片效果很好，如图1：

但是5天后，也就是9月初开始就再也没有做出来过上述的图片，尽管还是同一批抽提的蛋白，目的和内参一起变得非常淡，如图2：

其后又反复跑了3次，并且把上样量增加到20ul（之前最后跑出来那次是10ul），还是这个样子，淡淡的。。。

然后自己重新抽提了蛋白，更换所有的液体，更换膜，使用别人的ECL显色剂，延长曝光时间等等。另外每次转膜的蛋白质marker都是转的很清楚的，但是目的和内参的条带还是暗淡。

我知道条带暗淡的原因很多，从蛋白到转膜到抗体到显色......现在实在是没有办法了，所以在此向版主求助。

非常感谢~~~

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注意缓冲液

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:10

楼主，您好！
我是WB新手，实验的目的蛋白是TLR9，从人外周血单个核细胞中提取。但我做了几次，WB结果显示内参蛋白很少，而目的蛋白基本看不到。请问是不是蛋白量太少？
以下是我提取蛋白的粗略步骤：
1.将分离得到的外周血单个核细胞接种于6孔板，2X106/孔；加药物刺激
2.1000rpm，5min收集细胞；用PBS漂洗两遍
3.用RIPA+PMSF提取蛋白（每孔100ulRIPA+1ulPMSF），冰上30min
4.加入等体积的2X上样缓冲液，煮沸3-5min
5.12000rpm，4度，10min，分装-80度保存
没有用BCA法测定蛋白量

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请问楼主，用外周血单个核细胞做WB，上述细胞密度是否合适？
有多少细胞？
上样量多大呢？

作者: 831226 时间: 2013-3-19 15:13

细胞数每孔2X106
上样量每孔20ul

作者: yjf1026 时间: 2013-3-19 15:15

是抗小鼠、抗大鼠的一抗
还是小鼠或者大鼠来源的一抗？
不是一个概念哦
蛋白样品上样量有点大，降低上样量，稀释一抗、二抗

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谢谢楼主，按照您的说法做了以后，果然做出来了。

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:15

细胞数每孔2X106
上样量每孔20ul

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请提取蛋白后进行SDS-PAGE染色

作者: bring 时间: 2013-3-19 15:16

请问从外周血单个核细胞提取蛋白，每孔2X106细胞数能否获得足够的蛋白量进行WB？

作者: duoduo 时间: 2013-3-19 15:16

注意缓冲液

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谢谢楼主的回复，不过再请教楼主一下，我该注意电泳缓冲液还是转膜缓冲液，应该注意哪个指标的呢？如果是注意PH值，那么我该设定PH值为多少？

非常感谢~

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:17

请问从外周血单个核细胞提取蛋白，每孔2X106细胞数能否获得足够的蛋白量进行WB？

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可以进行WB啊
我就做过
2X106细胞加100ul的裂解液，提取的蛋白浓度太小啦

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:18

谢谢楼主的回复，不过再请教楼主一下，我该注意电泳缓冲液还是转膜缓冲液，应该注意哪个指标的呢？如果是注意PH值，那么我该设定PH值为多少？

非常感谢~

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封闭、洗膜、稀释一抗、二抗的缓冲液pH在7.0-8.0之间

作者: kulee 时间: 2013-3-19 15:18

我的目的蛋白是18KD,湿转0.22的pvdf膜，100v,50分钟，胶染色有条带，膜染色没条带，但膜上预染的marker 条带很清楚，请问这是什么原因啊

作者: DONT 时间: 2013-3-19 15:18

NBA老师，那如何提取才能获得合适的蛋白浓度？

作者: S6044 时间: 2013-3-19 15:19

楼主你好，想请教一个问题，我要跑的一个蛋白有好几个isoform，分子量在30~60KD之间，想用WB对几个isoform进行区分，胶的浓度及跑胶的电压该如何控制？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:19

我的目的蛋白是18KD,湿转0.22的pvdf膜，100v,50分钟，胶染色有条带，膜染色没条带，但膜上预染的marker 条带很清楚，请问这是什么原因啊

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转膜不成功吧
丽春红work吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:20

那如何提取才能获得合适的蛋白浓度？

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加大细胞量
降低裂解液量

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:20

楼主你好，想请教一个问题，我要跑的一个蛋白有好几个isoform，分子量在30~60KD之间，想用WB对几个isoform进行区分，胶的浓度及跑胶的电压该如何控制？谢谢

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胶浓度用12%的就可以
浓缩胶80-90V
分离胶150-160V都可以

作者: 3N4G 时间: 2013-3-19 15:21

请教：最近在做血管平滑肌细胞中MMP2及mmp9的WB ，目的蛋白一直不出，内参出的很好，一抗浓度，转膜时间等都做了调整，目的蛋白还是没出来，内参出，不知道什么原因？
期待您的答复，谢谢。

作者: ending 时间: 2013-3-19 15:21

老师好
我想做的两个蛋白一个分子量为42KD，一个为17KD，请问分离胶和浓缩胶该用多大浓度的比较合适呢？谢谢了！

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:39

请教：最近在做血管平滑肌细胞中MMP2及mmp9的WB ，目的蛋白一直不出，内参出的很好，一抗浓度，转膜时间等都做了调整，目的蛋白还是没出来，内参出，不知道什么原因？
期待您的答复，谢谢。

====================================

这两个蛋白做WB确实有一定难度
技术没有难度，主要是没有特异性好的抗体
你用哪里的抗体？
转膜后丽春红染膜了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:40

老师好
我想做的两个蛋白一个分子量为42KD，一个为17KD，请问分离胶和浓缩胶该用多大浓度的比较合适呢？谢谢了！

===================

12%的分离胶就可以
浓缩胶5%

作者: 831226 时间: 2013-3-19 15:42

这两个蛋白做WB确实有一定难度
技术没有难度，主要是没有特异性好的抗体
你用哪里的抗体？
转膜后丽春红染膜了吗？

====================================================================

用的abcam的抗体，转膜后还没有用丽春红染膜，下一步准备染一下看看，请问版主
1.这种情况是不是抗体的问题比较大？
2.这两个蛋白在细胞内表达情况怎么样？
3.会不会表达太低不好检测？

作者: sunnyB 时间: 2013-3-19 15:43

想请教下楼主，我提蛋白的时候，用裂解液裂解细胞12000rpm 5min离心会看到最上面怎么有絮状物？谢谢您的解答

作者: 2541 时间: 2013-3-19 15:44

楼主：

您好！
我是western新手。最近做的两次试验，目的蛋白倒还将就，内参GAPDH带子总是中间发白，另外还有杂带。用的是CST的一抗和二抗。一抗1：3000，二抗1：5000。是用Biorad仪器进行扫描的照片。能提供指导意见吗？非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:45

用的abcam的抗体，转膜后还没有用丽春红染膜，下一步准备染一下看看，请问版主
1.这种情况是不是抗体的问题比较大？
2.这两个蛋白在细胞内表达情况怎么样？
3.会不会表达太低不好检测？

=====================================================

这两个蛋白我做过很多，主要是这两个抗体识别出的条带杂带很多
也就是说效果不好，主带不明显
WB的敏感性肯定够检测的
不存在表达量太低的情况

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:46

想请教下楼主，我提蛋白的时候，用裂解液裂解细胞12000rpm 5min离心会看到最上面怎么有絮状物？谢谢您的解答

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是油脂吧

作者: NBA 时间: 2013-3-19 15:46

楼主：

您好！
我是western新手。最近做的两次试验，目的蛋白倒还将就，内参GAPDH带子总是中间发白，另外还有杂带。用的是CST的一抗和二抗。一抗1：3000，二抗1：5000。是用Biorad仪器进行扫描的照片。能提供指导意见吗？非常感谢！

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一抗、二抗浓度太高

作者: wiwi 时间: 2013-3-19 15:47

我的目的蛋白是18KD,湿转0.22的pvdf膜，100v,50分钟，胶染色有条带，膜染色没条带，但膜上预染的marker 条带很清楚，请问这是什么原因啊

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我今天又做了一次，湿转0.22的pvdf膜，170MA,2.5小时，胶考马斯染色大分子的位置有条带，差不多60-70kd左右的位置，膜丽春红染色大分子40-50kd 的位置条带清晰，但是我的目的蛋白是 18KD，是小分子的，没看到条带，15-30 KD位置的地方都没有条带，我觉得是不是时间转久了造成的，小分子的蛋白应该转上了啊，那为什么丽春红染色看不到啊？0.22的膜应该不会转过啊？请教高人指点。（电泳液，转膜液都是现配的。）

作者: lixi559 时间: 2013-3-19 15:48

请教：
为什么我的膜会出现这样的情况呢？
见下图：

第一张是β-actin
第二张是目的蛋白

作者: lixi559 时间: 2013-3-19 15:49

我用的是PVDF膜
5%的牛奶4℃封闭过夜
一抗在37℃孵育2小时（1:1000）
二抗孵育1小时（1：20000）

作者: lixi559 时间: 2013-3-19 15:49

都是48k的蛋白
一起做的
都用同样的条件
真是郁闷啊。。。。。。。

作者: lixi559 时间: 2013-3-19 15:49

这是前次做的：

上面是β-actin
下面是目的蛋白

作者: mimili_901 时间: 2013-3-19 15:50

版主你好，非常感谢你一直以来对大家的帮助，我看了一些帖子，收获颇丰。我现在也遇到了一些问题，希望能够得到您的帮助。
我用western测3个目的蛋白加1个内参，其中目的蛋白A大小为120KD，目的蛋白B为45KD,目的蛋白C为22KD，内参有b-actin。最近的实验结果是，只有b-actin和大小为45KD的蛋白B出了结果。我主要操作过程是：
1、我现在这几个蛋白都一起跑电泳，一起转膜。其中A胶的浓度为10%，90V 跑30min，120V跑1.5h；
2、转膜：硝酸纤维素膜 200mA恒流转1.5h,结果可见膜上有150KD大小的Marker;
3、用I抗稀释液以1:200的比例稀释从Abcam 购买的I抗（当然它的推荐最浓浓度是1:500）,4摄氏度过夜；
4、II抗是用5%的牛奶配制，浓度为1:2000；
5、其中洗膜等各步骤不再赘述。
我的问题：
1、我配胶的浓度是否合适？120KD的蛋白是不是不应该与20KD的蛋白同时跑？
2、120KD一直不出，是否和转膜所用的电流过小以及转膜时间过短有关？
3、封闭用的牛奶用双蒸水配效果好还是用TBST配效果好？
4、I抗4度孵育是不是时间越长越好？有人建议我可以4度孵育24小时，甚至48小时，版主觉得如何？
5、I抗用I抗稀释液稀释后大概能反复利用多少次？我的I抗已经用I抗稀释液配制了快1个月了，平均每周用2次，那是不是不能再用了？

作者: newway 时间: 2013-3-19 15:50

楼主你好，我的目的显得挺好，没有背景，条带之间也分得很开，就是条带太粗，一抗是1:800，二抗是1:5000，现在我想条带细点，一抗降到1:1000和1:2000，请问二抗要降吗？O(∩_∩)O谢谢

作者: fei1226com 时间: 2013-3-19 15:51

版主你好，这是我WESTERN测试骨骼肌MHC的结果图，你帮我看一下这样的结果行不行啊？或者哪里有问题需要改进一下的，谢谢啦。而且上面两条带一抗浓度1:2000，下面的条带一抗浓度1:3000，左边的条带二抗浓度为1:10000，右边的条带二抗浓度为1:20000，你觉得一抗和二抗浓度最为合适呀？

作者: zranqi_1 时间: 2013-3-19 15:51

版主老师：您好，我做了几个月的15kd分子量蛋白的western了，我的一抗浓度1:20，1:50，1:100，1:500,1:1000,1:1500,1:2000都做过，都没有做出来过，瀑光之后，膜上是一片荧光，我的内参每次做的都好好的。

作者: 33号 时间: 2013-3-19 15:52

现在连着做western2个礼拜了，很崩溃。
阳性对照都有，但是家蚕、蚕蛹中都检测不到。用了his抗体和兔抗。
本来以为是兔抗失效了，可是今天检测了，没问题。
我想请教下，PVDF膜上加显色液哪种好？现在用过康维的，配好是1ml加到膜上，感觉显色不均匀。还用过bio-rad的显色液，配好是10ml，显色效果很好，可是不能放久了用，显色敏感度下降很明显，而且很贵。
另外，上样量太高以至于跑胶呈糊状，也是做不出来的吧？

主要是这些问题。

作者: 66+77 时间: 2013-3-19 15:55

您好，我是一个初学者，但是查了些资料却没有找到具体原因，只有结果。请问为什么浓缩胶可以将样品浓缩到一条很窄的区域内，原理是什么呀？谢谢

作者: 49888 时间: 2013-3-19 15:57

我今天又做了一次，湿转0.22的pvdf膜，170MA,2.5小时，胶考马斯染色大分子的位置有条带，差不多60-70kd左右的位置，膜丽春红染色大分子40-50kd 的位置条带清晰，但是我的目的蛋白是 18KD，是小分子的，没看到条带，15-30 KD位置的地方都没有条带，我觉得是不是时间转久了造成的，小分子的蛋白应该转上了啊，那为什么丽春红染色看不到啊？0.22的膜应该不会转过啊？请教高人指点。（电泳液，转膜液都是现配的。）

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丽春红的敏感性比较低

作者: 49888 时间: 2013-3-19 15:57

都是48k的蛋白
一起做的
都用同样的条件
真是郁闷啊。。。。。。。

===================

目的蛋白是什么

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:05

版主你好，非常感谢你一直以来对大家的帮助，我看了一些帖子，收获颇丰。我现在也遇到了一些问题，希望能够得到您的帮助。
我用western测3个目的蛋白加1个内参，其中目的蛋白A大小为120KD，目的蛋白B为45KD,目的蛋白C为22KD，内参有b-actin。最近的实验结果是，只有b-actin和大小为45KD的蛋白B出了结果。我主要操作过程是：
1、我现在这几个蛋白都一起跑电泳，一起转膜。其中A胶的浓度为10%，90V 跑30min，120V跑1.5h；
2、转膜：硝酸纤维素膜 200mA恒流转1.5h,结果可见膜上有150KD大小的Marker;
3、用I抗稀释液以1:200的比例稀释从Abcam 购买的I抗（当然它的推荐最浓浓度是1:500）,4摄氏度过夜；
4、II抗是用5%的牛奶配制，浓度为1:2000；
5、其中洗膜等各步骤不再赘述。
我的问题：
1、我配胶的浓度是否合适？120KD的蛋白是不是不应该与20KD的蛋白同时跑？
2、120KD一直不出，是否和转膜所用的电流过小以及转膜时间过短有关？
3、封闭用的牛奶用双蒸水配效果好还是用TBST配效果好？
4、I抗4度孵育是不是时间越长越好？有人建议我可以4度孵育24小时，甚至48小时，版主觉得如何？
5、I抗用I抗稀释液稀释后大概能反复利用多少次？我的I抗已经用I抗稀释液配制了快1个月了，平均每周用2次，那是不是不能再用了？

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1、转膜的条件基本可以，对于120KD的分子量需要调整一下，300mA，2h
2、不要使用回收这么多次的抗体，回收的抗体用一次就可以了

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:05

楼主你好，我的目的显得挺好，没有背景，条带之间也分得很开，就是条带太粗，一抗是1:800，二抗是1:5000，现在我想条带细点，一抗降到1:1000和1:2000，请问二抗要降吗？O(∩_∩)O谢谢

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1、一抗用1:2000
2、上样量减少一半
3、二抗不要变

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:06

版主你好，这是我WESTERN测试骨骼肌MHC的结果图，你帮我看一下这样的结果行不行啊？或者哪里有问题需要改进一下的，谢谢啦。而且上面两条带一抗浓度1:2000，下面的条带一抗浓度1:3000，左边的条带二抗浓度为1:10000，右边的条带二抗浓度为1:20000，你觉得一抗和二抗浓度最为合适呀？

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1、降低上样量，1/3
2、一抗继续喜事，用1:20000试试

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:06

版主老师：您好，我做了几个月的15kd分子量蛋白的western了，我的一抗浓度1:20，1:50，1:100，1:500,1:1000,1:1500,1:2000都做过，都没有做出来过，瀑光之后，膜上是一片荧光，我的内参每次做的都好好的。

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电泳、转膜条件呢？
什么蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:07

现在连着做western2个礼拜了，很崩溃。
阳性对照都有，但是家蚕、蚕蛹中都检测不到。用了his抗体和兔抗。
本来以为是兔抗失效了，可是今天检测了，没问题。
我想请教下，PVDF膜上加显色液哪种好？现在用过康维的，配好是1ml加到膜上，感觉显色不均匀。还用过bio-rad的显色液，配好是10ml，显色效果很好，可是不能放久了用，显色敏感度下降很明显，而且很贵。
另外，上样量太高以至于跑胶呈糊状，也是做不出来的吧？

主要是这些问题。

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家蚕、蚕蛹？

作者: summerxx 时间: 2013-3-19 16:07

你好，我做Western时marker最下面几条电泳带总是粘在一起，跑不开来，请问这是什么原因呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:08

你好，我做Western时marker最下面几条电泳带总是粘在一起，跑不开来，请问这是什么原因呢？

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多大浓度的分离胶？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-19 16:08

请问一下，不点样的空白泳道也能做出明显条带是什么原因，以前从来没出现这种问题。
详细情况是这样的：
最近试了一个新的目的蛋白，发现表达量非常非常的高（条带布满整个膜，跟黑背景似的，开始上样量为120ug，侯降到60ug），后来把上样量减少到18ug。还是出现很粗的条带，斑点很漂亮，背景很白。问题是我是隔着孔点的，空着的孔也出现了黑色斑点。不知为什么会出现这种情况。
这次做得跟以往不太一样的是，一抗和二抗是用0.8%的脱脂牛奶稀释的（说明书推荐用0.5-1%牛奶），以往我们习惯是用5%的BSA或牛奶稀释抗体。
用的是abcam的抗体，之前没用过这个牌子的抗体。
指教，盼回复！

作者: tudou85 时间: 2013-3-19 16:09

家蚕、蚕蛹？

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恩。我是制备杆状病毒感染家蚕和蚕蛹，取血或者研磨上清来检测病毒是否表达了我的蛋白。

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:09

请问一下，不点样的空白泳道也能做出明显条带是什么原因，以前从来没出现这种问题。
详细情况是这样的：
最近试了一个新的目的蛋白，发现表达量非常非常的高（条带布满整个膜，跟黑背景似的，开始上样量为120ug，侯降到60ug），后来把上样量减少到18ug。还是出现很粗的条带，斑点很漂亮，背景很白。问题是我是隔着孔点的，空着的孔也出现了黑色斑点。不知为什么会出现这种情况。
这次做得跟以往不太一样的是，一抗和二抗是用0.8%的脱脂牛奶稀释的（说明书推荐用0.5-1%牛奶），以往我们习惯是用5%的BSA或牛奶稀释抗体。
用的是abcam的抗体，之前没用过这个牌子的抗体。
指教，盼回复！

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1、样品是什么来源的？
2、图片放上来看看

作者: wood533 时间: 2013-3-19 16:11

问题：
想要请教楼主，转膜条件：260mA 1h，转膜时电压大概在90左右。转完后用立春红染色，看到大概在40-50kd的地方出现了一块空白，大概在第三-第五泳道的位置，出现过几次了，都是如此。而且两个膜用两个三明治转，放在中间的就出现问题，放在旁边的没事。想问问可能的原因。

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:11

问题：
想要请教楼主，转膜条件：260mA 1h，转膜时电压大概在90左右。转完后用立春红染色，看到大概在40-50kd的地方出现了一块空白，大概在第三-第五泳道的位置，出现过几次了，都是如此。而且两个膜用两个三明治转，放在中间的就出现问题，放在旁边的没事。想问问可能的原因。

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空白？
丽春红染色出现空白说明转膜转得不好呗

作者: wood533 时间: 2013-3-19 16:12

空白？
丽春红染色出现空白说明转膜转得不好呗

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是的，但是因为几次都是同一个地方，同样的空白，所以我怀疑是不是出了手法以外其他地方出问题了，并且每一次靠外的那一个三明治都转得很完整。有可能是中间太热吗？

作者: zzzz 时间: 2013-3-19 16:12

谢谢楼主，按照您的说法做了以后，果然做出来了。

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但是我发现做出来的这个条带大小是55kd和45kd两条，但是我的蛋白有200个氨基酸，而且空白对照材料也有这条带，所以怀疑是非特异性的带。但是在20kd附近没有看到条带啊，或者非常弱不确定是不是有，片子的背景很干净，我用的一抗是1:10000，二抗也是1:10000，请问要怎么做才能提高特异性，把我需要的条带得到？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:18

但是我发现做出来的这个条带大小是55kd和45kd两条，但是我的蛋白有200个氨基酸，而且空白对照材料也有这条带，所以怀疑是非特异性的带。但是在20kd附近没有看到条带啊，或者非常弱不确定是不是有，片子的背景很干净，我用的一抗是1:10000，二抗也是1:10000，请问要怎么做才能提高特异性，把我需要的条带得到？

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你的目的条带多少？

作者: 49888 时间: 2013-3-19 16:19

有几个问题想请教老师：
1 我用BCA方法定量之后再上等量的蛋白，为什么跑出来的内参beta-Acitin很不一致？我定量的标曲R方值有0.99，我觉得定量应该是没得什么问题的。请问有没有什么比较准确的定量方法?
2 我的细胞经过药物诱导处理之后收样做western，出现很奇怪的现象：药物诱导五天的细胞做出来的western带总是没有actin，但有我的目的带。后来换做GAPDH做内参还是杂不出来。请问这是什么原因？我怀疑是细胞死了（收样之前没有看细胞的状态）。但是如果是细胞死了，为什么我的目的带还有?不会随之一块降解吗？
谢谢！

作者: 8princess8 时间: 2013-3-19 16:19

目的条带是23KD

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你的目的条带多少？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-19 16:21

我是WB新手做了两次都没做出来只是在PVDF膜的最下面有一天带，但不是想要的带啊
我得电泳是6%的想分离250kda的蛋白，但转膜时想转55kda的蛋白，这样有影响吗？帮忙分析下电泳图和印记图。转膜条件是半干，电流不知道为什么最大只能到95mA，再大就短路了，电压就1,2V那么大。
多谢了！

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作者: lgm 时间: 2013-3-19 16:23

老师：
你好，我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请老师分析一下吧！下面是我的图片。最下面，模糊的一条（图片中间的一条）是我的目的条带！

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作者: utt0989 时间: 2013-3-19 16:23

Tricine-SDS-PAGE 凝胶，目的蛋45kD及10kD，到了10kD处，条带皱眉现象非常严重，但是只用一块胶跑电泳，另外一边使用塑料板时，条带皱眉得到明显改善，不知道问题出在哪里啊？求解啊！

作者: u234 时间: 2013-3-19 16:24

1、样品是什么来源的？
2、图片放上来看看

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这是上120ug的肠粘膜的样品。这么黑有可能是条带表达量高吗？还是只是背景。

作者: u234 时间: 2013-3-19 16:24

上面两条是是60ug的肠粘膜样品，下面是对应做得内参。上面中间黑的是背景？目的蛋白？

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作者: u234 时间: 2013-3-19 16:25

出现的黑点和我们点样不一致。不点样的地方也出现黑点。是ECL显色液的背景吗？根本就没有出现目的蛋白？

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作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:25

有几个问题想请教老师：
1 我用BCA方法定量之后再上等量的蛋白，为什么跑出来的内参beta-Acitin很不一致？我定量的标曲R方值有0.99，我觉得定量应该是没得什么问题的。请问有没有什么比较准确的定量方法?
2 我的细胞经过药物诱导处理之后收样做western，出现很奇怪的现象：药物诱导五天的细胞做出来的western带总是没有actin，但有我的目的带。后来换做GAPDH做内参还是杂不出来。请问这是什么原因？我怀疑是细胞死了（收样之前没有看细胞的状态）。但是如果是细胞死了，为什么我的目的带还有?不会随之一块降解吗？
谢谢！

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1、定量后做内参，不齐很正常
2、不齐的原因很多，涉及到：定量误差，调整蛋白浓度时的误差，上样误差，细胞本身表达量误差等等。
3、你做的是什么细胞？难道是不识别这个种属？亦或是你的WB系统不稳定

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:26

目的条带是23KD

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那应该是没有特异的目的条带

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:27

我是WB新手做了两次都没做出来只是在PVDF膜的最下面有一天带，但不是想要的带啊
我得电泳是6%的想分离250kda的蛋白，但转膜时想转55kda的蛋白，这样有影响吗？帮忙分析下电泳图和印记图。转膜条件是半干，电流不知道为什么最大只能到95mA，再大就短路了，电压就1,2V那么大。
多谢了！

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膜上怎么没东西啊
大分子量的要湿转

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:28

老师：
你好，我做了1个多月western blot了，内参跑得还可以，但是目的蛋白总是跑不好，今天跑出来非特异性条带很清楚，而目的条带却很淡，不知是什么原因！前一次也是这种情况，我就延长封闭时间至2h，一抗1:700，二抗1:5000，请老师分析一下吧！下面是我的图片。最下面，模糊的一条（图片中间的一条）是我的目的条带！

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内参图怎么不附上呢？
分子量多少呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:29

出现的黑点和我们点样不一致。不点样的地方也出现黑点。是ECL显色液的背景吗？根本就没有出现目的蛋白？

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内参做的还不错
黑点原因：二抗带出的非特异背景，一抗本身的影响
上样40-60ug就够了
内参与目的一抗用的二抗相同吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:30

Tricine-SDS-PAGE 凝胶，目的蛋45kD及10kD，到了10kD处，条带皱眉现象非常严重，但是只用一块胶跑电泳，另外一边使用塑料板时，条带皱眉得到明显改善，不知道问题出在哪里啊？求解啊！

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这个胶我也跑的不好

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-19 16:31

版主：
你好！请问37KD、42KD与49KD的蛋白可以用湿转250mA 100min一起转吗？还是需要分开转啊？谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-19 16:31

老师：我的内参是GAPDH 36KD,目的蛋白是RAC1，分子量30kd。以下是我的内参和目的条带：第一张是内参，第二张是目的

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作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:33

版主：
你好！请问37KD、42KD与49KD的蛋白可以用湿转250mA 100min一起转吗？还是需要分开转啊？谢谢！

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可以一起转
60min就够了

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:33

老师：我的内参是GAPDH 36KD,目的蛋白是RAC1，分子量30kd。以下是我的内参和目的条带：第一张是内参，第二张是目的

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Rac1这个蛋白我们做过
建议新跑一次电泳，转膜，再孵育抗体试试
条带的感觉像是泳道有点缺失
另外用的是CCD扫描还是ECL后的胶片曝光？
从GAPDH上来看敏感性较弱

作者: loli 时间: 2013-3-19 16:34

内参做的还不错
黑点原因：二抗带出的非特异背景，一抗本身的影响
上样40-60ug就够了
内参与目的一抗用的二抗相同吗？

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内参与一抗用的不同，目的蛋白是兔源的，内参是鼠源的。我怀疑是一抗有问题，根本就没有做出来。

作者: fox_79 时间: 2013-3-19 16:34

膜上怎么没东西啊
大分子量的要湿转

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我不知道什么原因啊是不是没转上啊
如果是没转上我该怎么调整啊？
我已经 95mA 转了两小时半干转

作者: one 时间: 2013-3-19 16:35

哦，我用的是ECL化学发光后凝胶成像系统拍照的！
我转膜的时候没有放好，所以转得不好，可能是这个原因！
我RAC1抗体是PRETEACH公司的，你们做过RAC1啊，那你们用的是哪个公司的抗体哦，不知道跟抗体有没有关系！

作者: youyou99 时间: 2013-3-19 16:36

怎么没有人认为是样本被降解了呢？
1.这样的条带通常是样本污染或者是降解了，或者根本就是选择细胞裂解液错误，比如是膜蛋白或者是核蛋白就不能用全细胞裂解液，应该选择适当的裂解液提取蛋白。
2.建议从新提取标本，从样本收集、蛋白提取、配平、蛋白变性等做起。
3.建议加倍罗氏的蛋白酶抑制剂药片（俗称：cock tail tablet），不要只加cell signaling 的细胞裂解液，蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、氟化钠等该加的都要加全了。
4.业界都知道太大分子和太小分子的蛋白是两个极端都是比较难把握，只有高手具有丰富的WB经验才能把握的住。
5.在保证样本的条件下再调整电泳和转膜的条件。
6.只有做的次数多了一些微调的东西才能领会。

作者: DONT 时间: 2013-3-19 16:36

老师：
您好！我想请教您几个问题：
1、我准备做的目标蛋白是140kd的，您建议的条件是什么？包括蛋白含量、上样量、浓缩胶和分离胶的浓度、电泳的时间及电压、转膜的时间及电压、一抗、二抗浓度、孵育时间、曝光时间。。。。。。

2、如果最后曝光结果显示，是两条分开的条带，可能的原因是什么？

3、如果带比较宽、可能的原因是什么？

4、如果片子的背景很高或很低可能的原因是什么？

谢谢！

作者: DONT 时间: 2013-3-19 16:36

老师还有个问题就是如果两个分子量不同的蛋白一个是60kd 一个是120kd的，可以在同一块胶上做吗？

还是配两块胶来做？

作者: ritou1985 时间: 2013-3-19 16:37

1、降低上样量，1/3
2、一抗继续喜事，用1:20000试试

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我的上样量是40ug，降到多少合适呀？一抗推荐稀释浓度是1：1000,如果稀释到1:20000会不会太过分了~

作者: am10 时间: 2013-3-19 16:38

前辈，您好！
我的实验样本是大鼠脑血管平滑肌组织，之前做了MLCK、CaP、CaD及PKC的WB，都出结果了。现在要做MLCP、以及MLC20磷酸化水平测定。用的都是abcam的一抗。组织样本提取是去年11月底提的，由于脑血管太小，所以差不多五六只大鼠才能凑够一个样本，一次性把所测指标的所需样本都提取了，液氮放置后取出来冰上裂解（RIPA裂解液），12000离心5分钟取上清液放置于-80度保存至今，所做的MLCK、CaP、CaD、PKC的WB是取-80度样本一定量后加上样buffer，然后煮蛋白5分钟，-20度保存，跑胶时现取现用。
我现在要做的是MLCP（肌球蛋白轻链磷酸酶）、MLC20、p-MLC20三个蛋白的WB，内参都能做出来，目的条带都没有。
1、MLCP是肌球蛋白轻链磷酸酶，有130kd、38kd、21kd三个亚基。abcam用“myosin light chain phophatase”输入查找抗体，可以用于Rat的只有ab93766一种一抗（cuturl('http://www.abcam.com/Myosin-light-chain-hHS-M21-phosphatase-antibody-ab93766.html')），测的是21kd的亚基。用“myosin phophatase”输入查找一抗倒是有几个，但是我一不知道“myosin light chain phophatase”和“myosin phophatase”是不是同一种物质（网上查不到两者是否是同一物质），二不知道“myosin phophatase”的几种一抗选择哪一种（根本联系不到abcam总部的技术顾问，都是转接到中国香港或北京中原公司等国内代理商处，这儿的技术顾问是中国人，问他们他们也不清楚）。21kd的一抗做了两个多月了，一直不出目的条带，想问前辈磷酸酶与之前测的MLCK（肌球蛋白轻链激酶）以及CaP、CaD、PKC在跑WB上有什么区别吗？为什么之前的都能测出来，这个同样条件一直不出结果呢？CaP也是34kd的小分子，况且我也用了0.22um的膜试了，没有结果。
2、用于测定MLC20磷酸化水平的两种抗体：MLC20（ab48003。cuturl('http://www.abcam.com/Myosin-Light-Chain-2-antibody-ab48003.html')）和p-MLC20（ab2480。cuturl('http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=reviews&intAbID=2480')）一抗链接附上。之前用脑血管样本做一直出内参不出目的条带，今天用大鼠的腹主动脉组织样本和心肌组织样本测出了MLC20的目的条带，但是却没有内参，其中心肌的MLC20出了两个条带，说明中说MLC20（ab48003）可以检测出非磷酸化的肌球蛋白轻链和单一磷酸化的肌球蛋白轻链，不知道两个条带说明什么（位置对，是19kd左右的）。
问题：1、想让前辈帮我审审，看以上三种抗体有没有选错。
2、MLC20磷酸化水平检测有一种甘油-尿素电泳，和传统的WB有些差别，是跑一次胶加一种抗体就能测出两条条带，分别是磷酸化MLC和非磷酸化的MLC，则MLC20的磷酸化水平就是p-MLC/（p-MLC+非磷酸化的MLC）。您熟悉这种电泳是怎么做的吗？我现在做实验是导师联系的外校的实验室，我问过该实验室的同学，他们不熟悉甘油-尿素电泳，如果用传统的WB能做出来吗，或者能不能在传统WB实验条件上稍做改动就可以做甘油-尿素电泳，用别人的实验室做自己毕业课题，能不变动地方最好。
3、课题经费有限，时间有限，明年毕业。我现有的东西是：a、已经RIPA裂解好存放于-80度的大鼠脑血管组织样本。b、abcam公司的MLCP（ab93766）、MLC20（ab48003）和p-MLC(ab2480)三种抗体。怎样能用现有资源达成我的实验目的:1、测出血管组织样本中MLCP的含量，2、测出样本中MLC20磷酸化水平。
向前辈虔诚求助！！！

附文献查到甘油-尿素方法步骤及结果图片：

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作者: bring 时间: 2013-3-19 16:39

这是之前测出结果的34kd蛋白的WB图片：

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:40

内参与一抗用的不同，目的蛋白是兔源的，内参是鼠源的。我怀疑是一抗有问题，根本就没有做出来。
有可能

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目的蛋白名称呢？抗体那家的？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:40

我不知道什么原因啊是不是没转上啊
如果是没转上我该怎么调整啊？
我已经 95mA 转了两小时半干转

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膜是那个公司的？
蛋白电泳我觉得还可以的

作者: NBA 时间: 2013-3-19 16:41

哦，我用的是ECL化学发光后凝胶成像系统拍照的！
我转膜的时候没有放好，所以转得不好，可能是这个原因！
我RAC1抗体是PRETEACH公司的，你们做过RAC1啊，那你们用的是哪个公司的抗体哦，不知道跟抗体有没有关系！
跟抗体会有很大的关系

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不同厂家抗体由于采用的抗原表位不同，差别非常大的
我用的是Abcam的，效果比你的结果要好很多

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:15

老师还有个问题就是如果两个分子量不同的蛋白一个是60kd 一个是120kd的，可以在同一块胶上做吗？

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还是配两块胶来做？
这两个分子量的可以一块胶上做
但是如果你没有经验的话
建议还是两块胶来做

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:16

我的上样量是40ug，降到多少合适呀？一抗推荐稀释浓度是1：1000,如果稀释到1:20000会不会太过分了~

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试一下不就知道了？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:16

前辈，您好！
我的实验样本是大鼠脑血管平滑肌组织，之前做了MLCK、CaP、CaD及PKC的WB，都出结果了。现在要做MLCP、以及MLC20磷酸化水平测定。用的都是abcam的一抗。组织样本提取是去年11月底提的，由于脑血管太小，所以差不多五六只大鼠才能凑够一个样本，一次性把所测指标的所需样本都提取了，液氮放置后取出来冰上裂解（RIPA裂解液），12000离心5分钟取上清液放置于-80度保存至今，所做的MLCK、CaP、CaD、PKC的WB是取-80度样本一定量后加上样buffer，然后煮蛋白5分钟，-20度保存，跑胶时现取现用。
我现在要做的是MLCP（肌球蛋白轻链磷酸酶）、MLC20、p-MLC20三个蛋白的WB，内参都能做出来，目的条带都没有。
1、MLCP是肌球蛋白轻链磷酸酶，有130kd、38kd、21kd三个亚基。abcam用“myosin light chain phophatase”输入查找抗体，可以用于Rat的只有ab93766一种一抗（cuturl('http://www.abcam.com/Myosin-light-chain-hHS-M21-phosphatase-antibody-ab93766.html')），测的是21kd的亚基。用“myosin phophatase”输入查找一抗倒是有几个，但是我一不知道“myosin light chain phophatase”和“myosin phophatase”是不是同一种物质（网上查不到两者是否是同一物质），二不知道“myosin phophatase”的几种一抗选择哪一种（根本联系不到abcam总部的技术顾问，都是转接到中国香港或北京中原公司等国内代理商处，这儿的技术顾问是中国人，问他们他们也不清楚）。21kd的一抗做了两个多月了，一直不出目的条带，想问前辈磷酸酶与之前测的MLCK（肌球蛋白轻链激酶）以及CaP、CaD、PKC在跑WB上有什么区别吗？为什么之前的都能测出来，这个同样条件一直不出结果呢？CaP也是34kd的小分子，况且我也用了0.22um的膜试了，没有结果。
2、用于测定MLC20磷酸化水平的两种抗体：MLC20（ab48003。cuturl('http://www.abcam.com/Myosin-Light-Chain-2-antibody-ab48003.html')）和p-MLC20（ab2480。cuturl('http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=reviews&intAbID=2480')）一抗链接附上。之前用脑血管样本做一直出内参不出目的条带，今天用大鼠的腹主动脉组织样本和心肌组织样本测出了MLC20的目的条带，但是却没有内参，其中心肌的MLC20出了两个条带，说明中说MLC20（ab48003）可以检测出非磷酸化的肌球蛋白轻链和单一磷酸化的肌球蛋白轻链，不知道两个条带说明什么（位置对，是19kd左右的）。
问题：1、想让前辈帮我审审，看以上三种抗体有没有选错。
2、MLC20磷酸化水平检测有一种甘油-尿素电泳，和传统的WB有些差别，是跑一次胶加一种抗体就能测出两条条带，分别是磷酸化MLC和非磷酸化的MLC，则MLC20的磷酸化水平就是p-MLC/（p-MLC+非磷酸化的MLC）。您熟悉这种电泳是怎么做的吗？我现在做实验是导师联系的外校的实验室，我问过该实验室的同学，他们不熟悉甘油-尿素电泳，如果用传统的WB能做出来吗，或者能不能在传统WB实验条件上稍做改动就可以做甘油-尿素电泳，用别人的实验室做自己毕业课题，能不变动地方最好。
3、课题经费有限，时间有限，明年毕业。我现有的东西是：a、已经RIPA裂解好存放于-80度的大鼠脑血管组织样本。b、abcam公司的MLCP（ab93766）、MLC20（ab48003）和p-MLC(ab2480)三种抗体。怎样能用现有资源达成我的实验目的:1、测出血管组织样本中MLCP的含量，2、测出样本中MLC20磷酸化水平。
向前辈虔诚求助！！！

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你说的这些组织、指标看着好眼熟
是河北的？
没有必要用尿素胶
我觉得可能是样本时间长了
或者ECL的敏感性不够高

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:18

这是之前测出结果的34kd蛋白的WB图片：

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从这个结果来看还不错
样品有新的吗？

作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:21

这是前天测的MLCK，脑血管的

[ 本帖最后由 wood533 于 2013-3-19 17:22 编辑 ]

图片附件: 40310193.jpg (2013-3-19 17:22, 9.67 KB) / 该附件被下载次数 1
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作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:23

这是测的MLCP（21kd）、MLC（19kd）、p-MLC（20kd）的图片：
由于分子量很近。十个孔分别是
1—3：脑血管样本，MLCP抗体
Marker（4孔道）
图片上4—5：脑组织、腹主动脉、心肌组织，MLC一抗
6号有两个条带，5号很粗是因为上样量和一抗浓度都很大（因为脑血管一直测不出结果）
图片上7—9：脑组织、腹主动脉、心肌组织，p-MLC一抗

作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:23

这些图都是用原来样本测的，MLCK能测出来是不是能说明原来样本还能用？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:24

这是前天测的MLCK，脑血管的

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还可以
考虑一下一抗的问题

作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:24

我现在担心一抗抗体选错，那就不可能有希望做出来了，而且好多银子啊～！说明上我看不出来问题，前辈帮我审审看好吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:25

这些图都是用原来样本测的，MLCK能测出来是不是能说明原来样本还能用？

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样品应该还行

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:25

我现在担心一抗抗体选错，那就不可能有希望做出来了，而且好多银子啊～！说明上我看不出来问题，前辈帮我审审看好吗？

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从说明书来看
抗体选得没问题

作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:26

如果常规的SDS-PAGE胶可以，现有样本又能用（MLCK能出，MLCP、MLC20和p-MLC的内参也能出），一抗选择没错，那MLCP、MLC20、p-MLC现在还有什么我没注意到的问题影响了结果吗，为什么一直不出条带呢？前辈做过这些指标吗，或者有认识的朋友做过可以让我求教吗？

作者: wood533 时间: 2013-3-19 17:26

还有MLCP有三个亚基，abcam用“myosin light chain phophatase”输入查找抗体，可以用于Rat的只有ab93766一种一抗，测的是21kd的亚基。用“myosin phophatase”输入查找一抗倒是有几个。
问题：1、“myosin light chain phophatase”和“myosin phophatase”是同一物质吗？
2、我应该三个亚基都测吗，实验目的是想知道脑血管组织中MLCP的含量，测一种亚基可以吗

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:32

如果常规的SDS-PAGE胶可以，现有样本又能用（MLCK能出，MLCP、MLC20和p-MLC的内参也能出），一抗选择没错，那MLCP、MLC20、p-MLC现在还有什么我没注意到的问题影响了结果吗，为什么一直不出条带呢？前辈做过这些指标吗，或者有认识的朋友做过可以让我求教吗？

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抗体当时我查过
但是我没做，从原来公司离职了
所以。。。
不凑巧

作者: yjf1026 时间: 2013-3-19 17:32

新手的第一张WB，AP显色，看到黑点我都很满足了。
结果如图：
自我分析了一下：第一次做，很多都是凭感觉：
1.有非特异条带。可能是提取就有问题，因为提取出来是残留了一些植物细胞。为此，在煮蛋白之后，10000rpm离心了5min，是不是不够？如果是正常的，那么我就用这个办法提取了。
2.湿转了45min，有点过，下次试试30min，甚至15-20min的。
3.这张在做胶的时候，感觉分离胶灌多了，所以浓缩胶比较短，造成没有聚集好？所以条带显得很“大块”？
4.其他问题，欢迎随意批评。

作者: guagua 时间: 2013-3-19 17:32

版主：
你好！
我刚开始做western，试验中碰到许多问题，劳驾帮我一下，非常感谢！
我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）。
1、关于加样及电泳：因为我做的大部分是核蛋白，所以提核蛋白做的。可核蛋白浓度每次提的都很低，最小的只有0.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上样量44ul)最多大约只能加20ug，不知道上样量是不是不够呢？上样的时候总有样品溢出污染另一孔，对于上大体积的样大家有好的加样方法吗？p21较小，电泳的时候跑到底20KD Marker都看不清楚，该如何判断是否已经跑开了呢？
2、关于转膜：我用的湿转0.45umPVDF膜，第一次用250mA转2h，发现预染Marker已经转到滤纸上了，可曝光内参条带还比较清晰，p21没有条带；第二次用250mA转1h，p21隐约有条带，而250mA转2h发现CyclinD1与HDAC3却没有条带。请教下大家：预染Marker转到滤纸上就证明蛋白转过了吗？我到底该如何选择p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）的转膜条件呢？
3、一抗孵育：这里要说一下，我的抗体p21与CyclinD1是Santa的，p21已经过了1年零8个月的样子，CyclinD1快到一年；HDAC3与HDAC4是CST的，超过送货期1年8个月了，不知道做的效果不好是不是跟抗体过期有关啊？可是内参时间也过了很久能做出来啊，这是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎样检验一抗是否过期及效价呢？还有，没有热熔机该如何孵育一抗呢？室温还是4度过夜？
4、发光及显影：发光液加到膜上一般发光多久曝光呢？尤其是看不到荧光的情况下？是不是等一段时间啊？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有时候加发光液后整个膜发亮，但不见荧光条带是怎么回事呢？还有，曝光的时间一般多少比较好啊？
问题太多，希望帮帮忙啊！谢谢啦！

作者: 49888 时间: 2013-3-19 17:33

老师好
谢谢您的回复，因为现在还在准备阶段，所以目前还没有具体的结果图片，只是想在实验之前准备的充分一点、：）

我现在是蛋白已经处理好了，但是上样之前应该要稀释浓度，我不知道是应该用蒸馏水稀释还是用样品缓冲液稀释，稀释后还需要再煮吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:33

新手的第一张WB，AP显色，看到黑点我都很满足了。
结果如图：
自我分析了一下：第一次做，很多都是凭感觉：
1.有非特异条带。可能是提取就有问题，因为提取出来是残留了一些植物细胞。为此，在煮蛋白之后，10000rpm离心了5min，是不是不够？如果是正常的，那么我就用这个办法提取了。
2.湿转了45min，有点过，下次试试30min，甚至15-20min的。
3.这张在做胶的时候，感觉分离胶灌多了，所以浓缩胶比较短，造成没有聚集好？所以条带显得很“大块”？
4.其他问题，欢迎随意批评。

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1、如果不做定量，这个提取方法没问题。离心10min以上
2、湿转用恒压还是恒流？分子量多大？
3、浓缩胶梳孔底部到分离胶界面距离：0.5-1.0cm

作者: is2011 时间: 2013-3-19 17:34

1、如果不做定量，这个提取方法没问题。离心10min以上
2、湿转用恒压还是恒流？分子量多大？
3、浓缩胶梳孔底部到分离胶界面距离：0.5-1.0cm

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1.我做植物材料，以叶绿素为上样量标准，比较叶绿素结合蛋白的相对含量，应该也算是定量了。倒是有沉淀时，叶绿素含量比测定得不是很准。
我考虑因为这次做出来条带显得很黑，上样量可以少点，是不是我在稀释时可以再多稀释一些？
2.100v湿转，恒压
3.这次的确分离胶灌多了，只有0.3-0.4mm。下次注意这个问题。是否聚集不好，所以条带很“厚重”啊？

争取下次再发张图。

作者: abc816 时间: 2013-3-19 17:34

老师，您好！我在组织蛋白定量方面是新手，想请教一下，关于组织蛋白定量哪一种方法最好！另外，冰冻组织可以用来做Westblost蛋白定量，如果可以，一般冰冻组织可以存储的最长时间是多少；还是必须用新鲜组织？期待您的回复，非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:35

老师，您好！我在组织蛋白定量方面是新手，想请教一下，关于组织蛋白定量哪一种方法最好！另外，冰冻组织可以用来做Westblost蛋白定量，如果可以，一般冰冻组织可以存储的最长时间是多少；还是必须用新鲜组织？期待您的回复，非常感谢！

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1、常用BCA进行定量
2、冰冻组织当然可以用来做WB，别超过一年，-80冻存，别冻融。液氮可以久一点

作者: bring 时间: 2013-3-19 17:35

新手求教。。。。很低级的问题。。。做western 为什么蛋白质要经过超声处理呢？？？？有没有什么可以替代的方法。。。。。。。。。。。~~

作者: NBA 时间: 2013-3-19 17:36

新手求教。。。。很低级的问题。。。做western 为什么蛋白质要经过超声处理呢？？？？有没有什么可以替代的方法。。。。。。。。。。。

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破碎细胞器，打断DNA

作者: moonlight45 时间: 2013-3-20 10:36

western blot转膜时气泡没有赶净，膜上很多泡状影子，还能显影吗

作者: moonlight45 时间: 2013-3-20 10:36

做WESTERN BLOT的MARK 条带分别代表多少的分子量
红的是72 往下是55 43 34 26 17 10 绿对吗那往上呢

作者: remenb 时间: 2013-3-20 10:37

您好！我们做的目标蛋白分子量是140kd，上样量是20微升，20微升样品中蛋白含量100微克，浓缩胶5%。分离胶6%，浓缩胶电泳条件是80V，30分钟，分离胶120V，60分钟。电泳结果用考马斯亮蓝染色后，显示小分子蛋白有条带，大分子蛋白没有条带？为什么呢？是胶的问题吗？还是泳条件的问题？您看我的上样量可以吗？是不是浓度小？

作者: remenb 时间: 2013-3-20 10:38

老师，具体情况是，染胶的下半部分有条带，上半部分没有条带，而且很确定。跑胶时没有跑脱。

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-20 10:39

请教下楼主：我们实验室做WB用的跑胶和转膜仪器是BIO-RAD的，我的目的蛋白分子量17-18之间，内参是β-actin。制胶买的是碧云天的试剂盒。上样量40ug,15ul.
电泳条件：浓缩胶5% ，80V，30min左右；分离胶15%，110V,1h以上。转膜条件：湿转，350mA，2h.(看了之前的帖子你推荐15K用300mA ,20min )，膜孔径是millpore 0.2μm的。目的和内参的抗体均是进口的。
目的一抗浓度 1:250（推荐1:1000），二抗是1：10000。
MARKER是fermentas的彩色预染marker 10-260KD，另外还用过Bio-Lab的，感觉分子量都不对，现出来的条带分子量大约有20多，请问这是怎么回事？我的转膜条件是不是该按照你之前的建议修改下？
附图说明：

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作者: yapuyapu 时间: 2013-3-20 10:41

补充一下：封闭5%脱脂牛奶室温2h

作者: NBA 时间: 2013-3-20 10:41

请教下楼主：我们实验室做WB用的跑胶和转膜仪器是BIO-RAD的，我的目的蛋白分子量17-18之间，内参是β-actin。制胶买的是碧云天的试剂盒。上样量40ug,15ul.
电泳条件：浓缩胶5% ，80V，30min左右；分离胶15%，110V,1h以上。转膜条件：湿转，350mA，2h.(看了之前的帖子你推荐15K用300mA ,20min )，膜孔径是millpore 0.2μm的。目的和内参的抗体均是进口的。
目的一抗浓度 1:250（推荐1:1000），二抗是1：10000。
MARKER是fermentas的彩色预染marker 10-260KD，另外还用过Bio-Lab的，感觉分子量都不对，现出来的条带分子量大约有20多，请问这是怎么回事？我的转膜条件是不是该按照你之前的建议修改下？
附图说明：

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是不是切胶了？

作者: am10 时间: 2013-3-20 10:42

切胶了，难道不用切吗？

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-20 10:42

楼主您好，我最近做western出现了很多问题，特向您请教。
1.条件：
电泳：12%分离胶，3%浓缩胶，60v，120v各一小时；
转膜：PVDF膜0.45μm，300mA恒流湿转，按目的蛋白分子量大小计算转膜时间（1KD*1min，一般多10min左右）。内参使用GAPPDH，目的蛋白分子量大小分别为50KD，120KD.
一抗：用一抗稀释液稀释，santa（50KD，120KD各一个）的一抗按1：500稀释，abcam的（120KD一个）一抗按1：1000稀释。
二抗：国产中杉金桥，1：10000稀释，稀释液用5%的脱脂光明牛奶。
上样量大概在20μg左右
2.图片：
a：GAPDH跑的还可以：

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作者: zsxan1990 时间: 2013-3-20 10:43

b：50KD的目的蛋白（santa）一直不大理想，一抗比例试过1：200，1：500，1：800，最后在1：500感觉能看到条带

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作者: zsxan1990 时间: 2013-3-20 10:43

但是，您看，背景一直都有非特异性染色，我用5%脱脂牛奶封闭2h，37度，也用过BSA4度过夜封闭，均是如此。下图是这两天做的，分别用10%脱脂牛奶（右）和5%封闭（左）的效果，而且这次感觉有杂带

图片附件: 14632379.jpg (2013-3-20 10:43, 12.22 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: zsxan1990 时间: 2013-3-20 10:44

c：12KD的目的蛋白这次貌似只爆出了marker，想要的地方全是白板。之前倒是爆出来过的，但也是有的有，有的没有。

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作者: bring 时间: 2013-3-20 10:46

菜鸟提问：有没有可能膜没洗干净第二次换个分子显结果把把第一次的分子显出来

作者: bling 时间: 2013-3-20 10:46

我想做90个血清标本的蛋白印迹，请问整个实验花费要多少钱啊（仪器实验室有提供）。

作者: greenbee 时间: 2013-3-20 10:47

、如果不做定量，这个提取方法没问题。离心10min以上
2、湿转用恒压还是恒流？分子量多大？
3、浓缩胶梳孔底部到分离胶界面距离：0.5-1.0cm

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经过改进，又做了两张。
1.

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作者: greenbee 时间: 2013-3-20 10:47

2~~~~~~~~~~~~.

图片附件: 19221867.snap.jpg (2013-3-20 10:47, 26.68 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15258

作者: greenbee 时间: 2013-3-20 10:48

其中第二张是不同上样梯度，结果不慎把胶撕破了，结果点样较低的几个泳道恰恰看不到。不过好像依然上样量有些偏大，或者如fang老师之前说的，一抗太高，显色有些过。准备把一抗稀释倍数加大，现在是2000，准备用3000试试。

另外，求助，显色点的上方始终有些“拖尾”，如何解决？

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:52

菜鸟提问：有没有可能膜没洗干净第二次换个分子显结果把把第一次的分子显出来

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如果同样的二抗,那必定是能看见第一个分子的

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:52

经过改进，又做了两张。

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其中第二张是不同上样梯度，结果不慎把胶撕破了，结果点样较低的几个泳道恰恰看不到。不过好像依然上样量有些偏大，或者如fang老师之前说的，一抗太高，显色有些过。准备把一抗稀释倍数加大，现在是2000，准备用3000试试。

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:57

楼主您好，我最近做western出现了很多问题，特向您请教。
1.条件：
电泳：12%分离胶，3%浓缩胶，60v，120v各一小时；
转膜：PVDF膜0.45μm，300mA恒流湿转，按目的蛋白分子量大小计算转膜时间（1KD*1min，一般多10min左右）。内参使用GAPPDH，目的蛋白分子量大小分别为50KD，120KD.
一抗：用一抗稀释液稀释，santa（50KD，120KD各一个）的一抗按1：500稀释，abcam的（120KD一个）一抗按1：1000稀释。
二抗：国产中杉金桥，1：10000稀释，稀释液用5%的脱脂光明牛奶。
上样量大概在20μg左右
2.图片：
a：GAPDH跑的还可以：

b：50KD的目的蛋白（santa）一直不大理想，一抗比例试过1：200，1：500，1：800，最后在1：500感觉能看到条带

但是，您看，背景一直都有非特异性染色，我用5%脱脂牛奶封闭2h，37度，也用过BSA4度过夜封闭，均是如此。下图是这两天做的，分别用10%脱脂牛奶（右）和5%封闭（左）的效果，而且这次感觉有杂带

c：12KD的目的蛋白这次貌似只爆出了marker，想要的地方全是白板。之前倒是爆出来过的，但也是有的有，有的没有。

急切盼望您的指点！

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感觉你的目的蛋白浓度不高,尽量多点一些吧,你看人家santa的sample图例里面很多都用了50ug左右的total protein吧
一抗浓度1：500差不多,二抗适当升高一些,还有就是你在incubate的时候尽量多放一点buffer和antibody,咋说要让膜均匀的泡在里面
另外,如果你用commercial的ECL kit来曝光的话可能能增加你的信号强度

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:58

请教下楼主：我们实验室做WB用的跑胶和转膜仪器是BIO-RAD的，我的目的蛋白分子量17-18之间，内参是β-actin。制胶买的是碧云天的试剂盒。上样量40ug,15ul.
电泳条件：浓缩胶5% ，80V，30min左右；分离胶15%，110V,1h以上。转膜条件：湿转，350mA，2h.(看了之前的帖子你推荐15K用300mA ,20min )，膜孔径是millpore 0.2μm的。目的和内参的抗体均是进口的。
目的一抗浓度 1:250（推荐1:1000），二抗是1：10000。
MARKER是fermentas的彩色预染marker 10-260KD，另外还用过Bio-Lab的，感觉分子量都不对，现出来的条带分子量大约有20多，请问这是怎么回事？我的转膜条件是不是该按照你之前的建议修改下？

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感觉你的膜没有泡均匀,另外,有些蛋白会和预测的分子量有差异,我遇到过差20KD的
弄个positive control先试试看吧

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:58

您好！我们做的目标蛋白分子量是140kd，上样量是20微升，20微升样品中蛋白含量100微克，浓缩胶5%。分离胶6%，浓缩胶电泳条件是80V，30分钟，分离胶120V，60分钟。电泳结果用考马斯亮蓝染色后，显示小分子蛋白有条带，大分子蛋白没有条带？为什么呢？是胶的问题吗？还是泳条件的问题？您看我的上样量可以吗？是不是浓度小？

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6%的胶 120V 60min, 要是小胶的话,估计差不多应该是你说的情况了....
你跟marker比, 是不是很多小的marker都跑出去了?

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:59

做WESTERN BLOT的MARK 条带分别代表多少的分子量
红的是72 往下是55 43 34 26 17 10 绿对吗那往上呢

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你用的是fermentas的那个prestain的marker吧?
那个marker往上大概是90,130,170，不过你还是最好去人家网站上自己查下

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 10:59

版主：
你好！
我刚开始做western，试验中碰到许多问题，劳驾帮我一下，非常感谢！
我做的蛋白包括p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）。
1、关于加样及电泳：因为我做的大部分是核蛋白，所以提核蛋白做的。可核蛋白浓度每次提的都很低，最小的只有0.65ug/ul左右，1mm的梳子(最大上样量44ul)最多大约只能加20ug，不知道上样量是不是不够呢？上样的时候总有样品溢出污染另一孔，对于上大体积的样大家有好的加样方法吗？p21较小，电泳的时候跑到底20KD Marker都看不清楚，该如何判断是否已经跑开了呢？
2、关于转膜：我用的湿转0.45umPVDF膜，第一次用250mA转2h，发现预染Marker已经转到滤纸上了，可曝光内参条带还比较清晰，p21没有条带；第二次用250mA转1h，p21隐约有条带，而250mA转2h发现CyclinD1与HDAC3却没有条带。请教下大家：预染Marker转到滤纸上就证明蛋白转过了吗？我到底该如何选择p21（21KD）、CyclinD1（37KD）、HDAC3（49KD）、HDAC4（119KD）及内参beta-actin（42KD）的转膜条件呢？
3、一抗孵育：这里要说一下，我的抗体p21与CyclinD1是Santa的，p21已经过了1年零8个月的样子，CyclinD1快到一年；HDAC3与HDAC4是CST的，超过送货期1年8个月了，不知道做的效果不好是不是跟抗体过期有关啊？可是内参时间也过了很久能做出来啊，这是怎么回事呢？是ProteinTech的！怎样检验一抗是否过期及效价呢？还有，没有热熔机该如何孵育一抗呢？室温还是4度过夜？
4、发光及显影：发光液加到膜上一般发光多久曝光呢？尤其是看不到荧光的情况下？是不是等一段时间啊？我用的是Pierce的SuperSignal Substrate！有时候加发光液后整个膜发亮，但不见荧光条带是怎么回事呢？还有，曝光的时间一般多少比较好啊？
问题太多，希望帮帮忙啊！谢谢啦！

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1. antibody足够好的话,你的上样量足够了,但是要是想增加上样量,就只能换大胶了,还有个办法就是用真空浓缩的办法把你的sample浓缩一下就行了, 你这些蛋白的大小,建议你用12%的分离胶,不然你的21kd够呛看得见
2.用孔径小一点的膜,250mA2hr应该是可以的,一个半小时应该就所有的target protein都能cover,但是我说的是12%的胶,1.5mM厚度,自己根据自己的胶厚度调整,marker到滤纸上确实是一个不好的sign,但是也不一定就是败了
3.santa的antibody质量一般...过期倒是不要紧,只要保存得当,过了两三年都无所谓.效果不好跟antibody肯定有关,前提是你有positive control,如果没有positive control的话,就不一定是antibody的原因了,我个人喜欢4度过夜,更均匀.
4. pierce一般说让你等5分钟吧? 看不到荧光很正常,看到了就太强了...曝光时间要根据自己情况调整,要是肉眼都看见了....那估计10秒就够了,整张膜发光是因为你没洗干净二抗

作者: INK 时间: 2013-3-20 11:00

我想继续追问一下，如何判断一抗浓度过高或者过低呢？是不是看目标条带的显色结果啊？

还有就是，二抗如何判断呢？

想多了解一下，以免每次都来问。呵呵

作者: plaa 时间: 2013-3-20 11:05

如果二抗浓度合适的话，一抗浓度稍微高点没什么事，但是二抗浓度过高显影时就有背景，过低的话条带颜色太浅吧！

作者: xyw5 时间: 2013-3-20 11:05

您好！我想请教您一个困扰了我很久的问题，谢谢您啊！
蛋白信息：是病毒里面的一个蛋白，一个融合了三个HA标签的膜蛋白，预测值是一共是13kDa
样品的处理：用病毒感染细胞以后，收集细胞样品，用裂解液裂解，加DTT等处理，煮样得到的，
我跑的胶是变性胶，用英俊的预制胶跑的
上样量：WB上样量为13ul
检测结果：检测出的蛋白分子量是大约是20kDa，而且由两条挨得很近很近的特异性条带组成（上下两条带之间有一条细的空隙）
这个实验我做了四次都是这样的结果，搞不懂这到底是怎么回事？
如果是被磷酸化或者是糖基化，请问我要怎么样去验证呢？
谢谢您的热心帮助，感激不尽！

作者: 831226 时间: 2013-3-20 11:16

菜鸟求教，做westernblot时，二抗用的是AP标记的山羊抗鼠，显色液是BCIP\NBT,书上说最后形成深蓝色至蓝紫色的物质，但显色后我看到的杂交带是褐色的，为什么呢？

作者: 2541 时间: 2013-3-20 11:18

您好！我想请教您一个困扰了我很久的问题，谢谢您啊！
蛋白信息：是病毒里面的一个蛋白，一个融合了三个HA标签的膜蛋白，预测值是一共是13kDa
样品的处理：用病毒感染细胞以后，收集细胞样品，用裂解液裂解，加DTT等处理，煮样得到的，
我跑的胶是变性胶，用英俊的预制胶跑的
上样量：WB上样量为13ul
检测结果：检测出的蛋白分子量是大约是20kDa，而且由两条挨得很近很近的特异性条带组成（上下两条带之间有一条细的空隙）
这个实验我做了四次都是这样的结果，搞不懂这到底是怎么回事？
如果是被磷酸化或者是糖基化，请问我要怎么样去验证呢？
谢谢您的热心帮助，感激不尽！

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negative control是什么? 没有infect的细胞有没有这两条带?
对比一下就知道了

作者: windy+++ 时间: 2013-3-20 11:18

你好，
在 SDS-PAGE 中我的目的条带应该是28KD左右，但每次跑都是在25KD处（11-13泳道），不知道为什么，而且从图看最前面的应该是溶菌酶，它也不再14KD处而是在14的下面，但是别的样品（如第4-8泳道）也是30KD，条带的大小是正常的。总的看就像是我的这个样品整体都下移3-4KD左右，请问这种情况正常吗？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15259

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 11:19

你好，
在 SDS-PAGE 中我的目的条带应该是28KD左右，但每次跑都是在25KD处（11-13泳道），不知道为什么，而且从图看最前面的应该是溶菌酶，它也不再14KD处而是在14的下面，但是别的样品（如第4-8泳道）也是30KD，条带的大小是正常的。总的看就像是我的这个样品整体都下移3-4KD左右，请问这种情况正常吗？

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正常,marker也不是100%准的,不信你跑个BSA看看?

作者: is2011 时间: 2013-3-20 11:20

正常,marker也不是100%准的,不信你跑个BSA看看?

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可是在同一块胶上，另一个蛋白的指示分子量是正常的啊！这样的情况也正常？

作者: xue258 时间: 2013-3-20 11:21

negative control是什么? 没有infect的细胞有没有这两条带?
对比一下就知道了

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阴性对照是mock细胞，没有被感染的细胞。没有那两条带，也没有其他条带
谢谢你啊！

作者: qqq111 时间: 2013-3-20 11:23

可是在同一块胶上，另一个蛋白的指示分子量是正常的啊！这样的情况也正常？

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正常
你这块胶的情况很像是sample里面盐浓度不一样,你试试每个孔点样体积和盐浓度都调成一样的再看看

作者: qiangren789 时间: 2013-3-20 11:24

你好，我想测血清中的氨基酸，但有人说血清标本不好做WB，浓度太低，请教fangweibin119老师，我现在这种情况可以选择做WB吗？或者只有选择ELISA？

作者: lxh031 时间: 2013-3-20 11:26

楼主你好我最近做Western，分子量195kD，背景较深，没有目的条带，不知是何原因？一抗Santan Cruz，1:150，二抗1:6000.请问是不是一抗浓度高了也不会出条带啊，我打算降低一抗浓度试试。

作者: www.1 时间: 2013-3-20 11:26

请问转膜的时候胶上下的滤纸到底能不能接触到一起？我看到网上说接触是会短路的，可是我们实验室师姐都把膜和滤纸剪很小，不可避免会接触，但是大家一直这么转膜的

作者: 831226 时间: 2013-3-20 11:27

请教一下western blot中的CM是什么东西，我打算用试剂盒提蛋白做WB
不知道提好的蛋白要不要加CM
还有加LOADING DTT按什么比例加呢

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:28

请教一下western blot中的CM是什么东西，我打算用试剂盒提蛋白做WB
不知道提好的蛋白要不要加CM
还有加LOADING DTT按什么比例加呢

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CM全称是什么？
DTT一般的是5×的loading 中300mM左右

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-20 11:29

老师您好，下面的图片是我最近做western的结果，上面是内参，下面是我的目的蛋白NMDAR1，分子量103，可以做出条带，但是泳道也很明显且背景深，我用的封闭液是5%的奶粉，抗体稀释液是1%的溶于PBST的奶粉，请老师帮忙分析一下原因和改进的措施，很着急，谢谢老师！

图片附件: 41441640.jpg (2013-3-20 11:29, 25.52 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15260

作者: zzzz 时间: 2013-3-20 11:29

老师您好！
我的实验是从外周血单个核细胞中提取蛋白，检测TLR9的表达。经上次您的建议，已能做出结果。但现在又出现一个新的问题：同一次提取的蛋白样品，第一次能做出漂亮结果，第二次连目的条带都看不到，而且内参也很弱；两次间隔时间就只有一天，所有操作过程一样。
不知从何着手，请老师指导!

作者: PCR 时间: 2013-3-20 11:29

你好，我最近在做 Western blot 跑胶时，老是电流特别大，以前没有出现过这样的问题。开始考虑是电泳液的浓度问题，从新配置使用后还是过高，您能不能帮着分析一下原因？谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-3-20 11:30

相关疾病：
肾癌
你好，我准备做western blot，组织是肾癌，已经收集了几例标本，都是新鲜的，现在在-80度冰箱里冻存。现在是刚开始做，很多东西都没头绪啊，所以有些问题可能会很低级，先请你不要取笑哦。呵呵。
我们的一抗已经选择好了，是Santa的，羊抗人；二抗是博士德的，羊抗鼠。
因为我们的实验室条件不是很好，所以现在有些试剂或者是器械不知道从何买起，你能不能给些建议啊？
赶紧不尽！！

作者: S6044 时间: 2013-3-20 11:30

我是新手，请各位师哥师姐帮帮忙，我要做转染后细胞裂解液中的病毒蛋白的WB，我想用病人血清做一抗，但病人的血清是用56度还是100度灭活，另用PBS稀释可行么？谢谢各位

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:31

老师您好，下面的图片是我最近做western的结果，上面是内参，下面是我的目的蛋白NMDAR1，分子量103，可以做出条带，但是泳道也很明显且背景深，我用的封闭液是5%的奶粉，抗体稀释液是1%的溶于PBST的奶粉，请老师帮忙分析一下原因和改进的措施，很着急，谢谢老师！

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1、调整一抗、二抗浓度
2、一抗、二抗孵育用5%奶粉-PBST

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:33

老师您好！
我的实验是从外周血单个核细胞中提取蛋白，检测TLR9的表达。经上次您的建议，已能做出结果。但现在又出现一个新的问题：同一次提取的蛋白样品，第一次能做出漂亮结果，第二次连目的条带都看不到，而且内参也很弱；两次间隔时间就只有一天，所有操作过程一样。
不知从何着手，请老师指导!

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缓冲液换了吗？
如果没有的话，请把样品分装，是不是样品反复冻融了？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:34

你好，我最近在做 Western blot 跑胶时，老是电流特别大，以前没有出现过这样的问题。开始考虑是电泳液的浓度问题，从新配置使用后还是过高，您能不能帮着分析一下原因？谢谢！

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你用恒压还是恒流啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:35

你好，我准备做western blot，组织是肾癌，已经收集了几例标本，都是新鲜的，现在在-80度冰箱里冻存。现在是刚开始做，很多东西都没头绪啊，所以有些问题可能会很低级，先请你不要取笑哦。呵呵。
我们的一抗已经选择好了，是Santa的，羊抗人；二抗是博士德的，羊抗鼠。
因为我们的实验室条件不是很好，所以现在有些试剂或者是器械不知道从何买起，你能不能给些建议啊？
赶紧不尽！！

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一抗羊抗人，二抗应该抗羊才对

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:36

我是新手，请各位师哥师姐帮帮忙，我要做转染后细胞裂解液中的病毒蛋白的WB，我想用病人血清做一抗，但病人的血清是用56度还是100度灭活，另用PBS稀释可行么？谢谢各位

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高温灭活的话
血清中抗体就变性了

作者: XYZQ 时间: 2013-3-20 11:42

您好，请问一下，电泳150V，2.5h，转膜150V，1h。用丽春红染色5min，用去离子水冲后，可以看到一些条带，大分子量的看的蛮清晰的，到了内参actin30、40kd的地方就看不清了，是怎么回事啊？用的是新的丽春红。
还有，请问，丽春红染液可以重复用几次？非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:43

您好，请问一下，电泳150V，2.5h，转膜150V，1h。用丽春红染色5min，用去离子水冲后，可以看到一些条带，大分子量的看的蛮清晰的，到了内参actin30、40kd的地方就看不清了，是怎么回事啊？用的是新的丽春红。
还有，请问，丽春红染液可以重复用几次？非常感谢

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对于actin来说，转膜有点过了

作者: ending 时间: 2013-3-20 11:43

对于actin来说，转膜有点过了

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actin的丰度很高不是吗？之前我有用350mA，40min也是这样。目的蛋白分子量是90左右，这样的话只能做两张膜了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 11:48

actin的丰度很高不是吗？之前我有用350mA，40min也是这样。目的蛋白分子量是90左右，这样的话只能做两张膜了吗？
不对啊

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如果是350ma,40min actin应该很好啊

作者: lxh031 时间: 2013-3-20 14:34

楼主您好，我是一个新手，WB实验做了近三个月了，目标蛋白还是没做出来，主要问题有以下几个，望您能给予帮助和解答，先谢谢您！
1，目标蛋白为分子量180-200的跨膜转运蛋白，提取用的是上海生工的膜蛋白提取试剂盒，8%的分离胶，上样量为BCA测定后按100 ug，25 uL（5uL左右蛋白PBS稀释后按蛋白：缓冲液4:1上样），电泳条件为恒压100V，2h转完，转膜为半干法恒流膜长乘以膜宽乘以2，2h，封闭条件为5%完达山脱脂奶粉2h，一抗为SANTA公司的1：200（推荐1:100-1:1000,），二抗为SANTA1:2000（查资料说湿法比较好，可条件限制，还有实验室别人用博士德的抗体做出来过，后来再重复不出来了，博士德这个抗体停产了）结果发现目标蛋白没转过去，增大电流乘以2.5，结果还是不行，请您分析一下看具体是什么问题。
2，β-actin能稳定的做出来，可每次染色后都是双条带
3，用上述的条件能把分子量为140-170的膜蛋白做出来
4，用生工试剂盒提取的蛋白180-300Marker区域蛋白量很少，不知道碧云天RIPA强裂解液的提取效果咋样？
5, 这三张图片分别为：一，考染后图片。二，转膜后图片。三，做出来的140-170的蛋白图片及双条带β-actin

作者: xyw5 时间: 2013-3-20 14:36

不对啊
如果是350ma,40min actin应该很好啊

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目的蛋白分子量90左右，内参用actin，转膜设什么样的条件比较好呢？
丽春红染色可以重复用几次？
谢谢

作者: hold住 时间: 2013-3-20 14:37

缓冲液是每次用储存液现配的（电泳缓冲液5X储存液，转膜缓冲液10X储存液）
蛋白样品是25ul每管分装的

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:37

目的蛋白分子量90左右，内参用actin，转膜设什么样的条件比较好呢？
丽春红染色可以重复用几次？
谢谢

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丽春红可以重复3-5次没问题

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:38

楼主您好，我是一个新手，WB实验做了近三个月了，目标蛋白还是没做出来，主要问题有以下几个，望您能给予帮助和解答，先谢谢您！
1，目标蛋白为分子量180-200的跨膜转运蛋白，提取用的是上海生工的膜蛋白提取试剂盒，8%的分离胶，上样量为BCA测定后按100 ug，25 uL（5uL左右蛋白PBS稀释后按蛋白：缓冲液4:1上样），电泳条件为恒压100V，2h转完，转膜为半干法恒流膜长乘以膜宽乘以2，2h，封闭条件为5%完达山脱脂奶粉2h，一抗为SANTA公司的1：200（推荐1:100-1:1000,），二抗为SANTA1:2000（查资料说湿法比较好，可条件限制，还有实验室别人用博士德的抗体做出来过，后来再重复不出来了，博士德这个抗体停产了）结果发现目标蛋白没转过去，增大电流乘以2.5，结果还是不行，请您分析一下看具体是什么问题。
2，β-actin能稳定的做出来，可每次染色后都是双条带
3，用上述的条件能把分子量为140-170的膜蛋白做出来
4，用生工试剂盒提取的蛋白180-300Marker区域蛋白量很少，不知道碧云天RIPA强裂解液的提取效果咋样？
5, 这三张图片分别为：一，考染后图片。二，转膜后图片。三，做出来的140-170的蛋白图片及双条带β-actin
6，还有一个请求，希望能加楼主为QQ好友，以便有问题可以及时请教，我的QQ：272220232

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上样量有点大

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-20 14:39

我最近采用HepG2细胞和HaCaT细胞检测磷酸化的STAT蛋白含量，因为抗体很贵，所以只能采用小杂交袋封口后进行一抗和二抗的包被，HaCaT细胞在做预实验的时候还能看到条带，但是正式加大样品数量后就看不到条带了，但是内参抗体Actin还是可以看到的，HepG2细胞是做与实验室就连内参抗体Actin蛋白都没有条带。
PS：我上样时多上了两排样品，去考马斯亮蓝染色，是有蛋白的

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-20 14:40

而且，我买的bio-RAD的marker刚转上膜的时候很深，后来越洗就越浅，最后都快看不到了

作者: tuuu2 时间: 2013-3-20 14:40

楼主你好，
要对WB结果做图，手里有pERK，tERK，GAPDH的灰度值，请问怎么进行均一化处理，
例如：pERK/tERK=A, pERK/GAPDH=B。最后用A/B的值作图吗？谢谢了。

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:41

楼主你好，
要对WB结果做图，手里有pERK，tERK，GAPDH的灰度值，请问怎么进行均一化处理，
例如：pERK/tERK=A, pERK/GAPDH=B。最后用A/B的值作图吗？谢谢了。

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均一化的一是正常组的目的/内参

有人用perk/erk/GAPDH
也有人用perk/gapdh=a,erk/gapdh=b a/b....

作者: mamamiya 时间: 2013-3-20 14:41

楼主您好，做了一段时间WB,现在做蛋白的磷酸化，现在出现了一些问题，我的目标蛋白为分子量91，用的是8%的分离胶，蛋白用4*蛋白上样缓冲液稀释，电流条件为恒流30MA电泳，恒流350MV1小时转膜，封闭条件为5%BD脱脂奶粉1小时30分钟，一抗为1：1000，4℃过夜，二抗为1:8000，室温1小时，
现在β-actin能稳定的做出来，效果非常好，背景很干净，但是我的目的蛋白拖尾很严重，有的甚至在整个条带的上下都出现了很浓的黑影，曝光出现空心，这是怎么回事，是抗体还是上样蛋白量的关系？
非常感谢楼主！！

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:43

楼主您好，做了一段时间WB,现在做蛋白的磷酸化，现在出现了一些问题，我的目标蛋白为分子量91，用的是8%的分离胶，蛋白用4*蛋白上样缓冲液稀释，电流条件为恒流30MA电泳，恒流350MV1小时转膜，封闭条件为5%BD脱脂奶粉1小时30分钟，一抗为1：1000，4℃过夜，二抗为1:8000，室温1小时，
现在β-actin能稳定的做出来，效果非常好，背景很干净，但是我的目的蛋白拖尾很严重，有的甚至在整个条带的上下都出现了很浓的黑影，曝光出现空心，这是怎么回事，是抗体还是上样蛋白量的关系？
非常感谢楼主！！

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1、把膜用丽春红染色后观察效果
2、曝光空心是二抗浓度太高

作者: caihong 时间: 2013-3-20 14:44

出现目的蛋白拖尾严重，在整个条带的上下都出现了很浓的黑影也是二抗浓度的关系吗？

作者: 131415 时间: 2013-3-20 14:45

老师：我后来有做了几次，有一个结果。但是后来就做不出来了，连前面的都重复不出来了，是不是因为天气变冷了，所以2抗敷育时间应该延长一点啊，还是放到37度敷育1小时啊！这是我前面的目的条带，中间那一条是我的。我现在都快急死了！后面是我现在做出来的内参！帮帮忙啊！

图片附件: 80621422.jpg (2013-3-20 14:46, 8.23 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15274

作者: DONT 时间: 2013-3-20 14:46

出现目的蛋白拖尾严重，在整个条带的上下都出现了很浓的黑影也是二抗浓度的关系吗？

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蛋白拖尾与二抗关系不大

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:47

老师：我后来有做了几次，有一个结果。但是后来就做不出来了，连前面的都重复不出来了，是不是因为天气变冷了，所以2抗敷育时间应该延长一点啊，还是放到37度敷育1小时啊！这是我前面的目的条带，中间那一条是我的。我现在都快急死了！后面是我现在做出来的内参！帮帮忙啊！

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ECL孵育后，胶片曝光的结果？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-20 14:48

本人最近做WESTERN是老遇到同一个问题~~~配完胶，上样后，开始跑胶，大概2分钟后，样品从底部先是冒了一个尖尖头，然后就慢慢的飘飘然的漏到了分离胶与积层胶之间，这样虽然不影响内参的曝光，但是目的条带曝光时周围就会漂一层漏掉的蛋白~~很郁闷啊。我的上样量30ug左右。我配的5%、10%胶，目的条带90-110KDa，恒压跑胶，60-110V,我真的没有撬动两个板~~~~~~所有配胶的东西我又重新配了一份，还是不行啊，我真的不知道怎么办了~~楼主有没有什么好建议？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:51

本人最近做WESTERN是老遇到同一个问题~~~配完胶，上样后，开始跑胶，大概2分钟后，样品从底部先是冒了一个尖尖头，然后就慢慢的飘飘然的漏到了分离胶与积层胶之间，这样虽然不影响内参的曝光，但是目的条带曝光时周围就会漂一层漏掉的蛋白~~很郁闷啊。我的上样量30ug左右。我配的5%、10%胶，目的条带90-110KDa，恒压跑胶，60-110V,我真的没有撬动两个板~~~~~~所有配胶的东西我又重新配了一份，还是不行啊，我真的不知道怎么办了~~楼主有没有什么好建议？

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请自己观察浓缩胶是否有气泡

作者: popo520 时间: 2013-3-20 14:52

没有气泡，而且今天我配胶的时候没有用到浓缩胶，直接用10%分离胶全程跑下来，就没有那种很飘逸的絮状漏出物了，但是这样没有积层胶的压缩效果后，MARKER条带成了V字型，蛋白条带还要等明天曝光才知道，唉这两个月做的WESTERN一直都是这样~~~真的要请楼主帮我分析分析~~~不胜感激

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-20 14:52

可以把胶片从盒子里拿出来直接用显影液显影2min，放入定影液定影
看胶片是什么样的
应该是胶片的问题

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谢谢老师，问题解决了，一直没机会跟您道谢，就这么做了，发现也曝光，最后发现是红灯的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:53

没有气泡，而且今天我配胶的时候没有用到浓缩胶，直接用10%分离胶全程跑下来，就没有那种很飘逸的絮状漏出物了，但是这样没有积层胶的压缩效果后，MARKER条带成了V字型，蛋白条带还要等明天曝光才知道，唉这两个月做的WESTERN一直都是这样~~~真的要请楼主帮我分析分析~~~不胜感激

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不能这么做啊
配浓缩胶与分离胶的pH可能有问题

作者: 小野花 时间: 2013-3-20 14:53

版主，你好！最近刚开始做WB，目的蛋白表达量很低，以前上样量蛋白总量200ug也没有做出来，目前蛋白总量300ug，体积是20ul，这样可以跑？浓度是不是太大？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 14:54

版主，你好！最近刚开始做WB，目的蛋白表达量很低，以前上样量蛋白总量200ug也没有做出来，目前蛋白总量300ug，体积是20ul，这样可以跑？浓度是不是太大？

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蛋白上样量太大了

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-20 15:02

老师您好，我最近一直在做WB，遇到一个问题，目的蛋白260左右，最近做了好几次WB，曝光时加上ECL发光剂后目的蛋白的那张膜都是亮的，目的蛋白都很弥散，以前做时没有出现目的蛋白弥散的情况，以前和这几次的内参都曝光挺好的，分离胶10%，浓缩胶5%，以前分离胶和浓缩胶的浓度也是这样的，没有出现蛋白弥散的情况，目的蛋白一抗1比500，二抗1比4000，第一张至第三张都是目的蛋白，很弥散，不知道为什么，最后一张是当时曝光的内参。

图片附件: 51897448.jpg (2013-3-20 15:03, 11.72 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15276

作者: 987789 时间: 2013-3-20 15:11

请教：目的蛋白分子量58KDa,核蛋白，提取人组织蛋白，BCA测蛋白浓度，10%分离胶，3%浓缩胶，上样量60ug,电泳90V，110V，湿转，200mA恒流，2小时半，一抗按照说明说1:1000,4度过夜，2抗1:8000，ECL发光法，没有任何条带。内参actin条带还可以。请问怎么办？

作者: wood533 时间: 2013-3-20 15:11

老师，我是小白，转膜问题请教下。湿法转膜，PVDF膜，恒定电压100V，蛋白质约15KD，电转液是新配的，20%甲醇。先前有试过一次能转过去，但是有时候却不行，表现为电流很低，只有140MA左右，转了半小时，蛋白还在胶上。先前也是同样的条件能转成功。。。。。。。。。。。

作者: am10 时间: 2013-3-20 15:12

请问楼主，我做细胞色素C 15KD，目的蛋白很清楚，但是内参一直都做不出来，GAPDH和actin都用过，不行；内参的抗体应该没有什么问题，因为这两个抗体我之前做出来过。目的和内参是在一起转膜和封闭的。

作者: fsdd817 时间: 2013-3-20 15:12

版主，您好！我最近在跑一个17kDa凋亡蛋白—活化的Caspase3，用的是15%的分离胶，4%积层胶；电泳稳压，80V积层胶，120V分离胶；转膜稳流，350mA 90min；转膜结束后，用丽春红染膜，发现分子量在25KDa下的蛋白并不明显；之后显影，目的分子未显出来，但内参GD出来了。我就想请教一下版主，我这样的转膜条件跑17kDa的分子，会不会把它转出膜外去了？还有小分子蛋白用丽春红能染出来吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:13

老师您好，我最近一直在做WB，遇到一个问题，目的蛋白260左右，最近做了好几次WB，曝光时加上ECL发光剂后目的蛋白的那张膜都是亮的，目的蛋白都很弥散，以前做时没有出现目的蛋白弥散的情况，以前和这几次的内参都曝光挺好的，分离胶10%，浓缩胶5%，以前分离胶和浓缩胶的浓度也是这样的，没有出现蛋白弥散的情况，目的蛋白一抗1比500，二抗1比4000，第一张至第三张都是目的蛋白，很弥散，不知道为什么，最后一张是当时曝光的内参。

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260K的蛋白用10%的分离胶？
从你的描述来看样品出现问题的可能性较大

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:13

请教：目的蛋白分子量58KDa,核蛋白，提取人组织蛋白，BCA测蛋白浓度，10%分离胶，3%浓缩胶，上样量60ug,电泳90V，110V，湿转，200mA恒流，2小时半，一抗按照说明说1:1000,4度过夜，2抗1:8000，ECL发光法，没有任何条带。内参actin条带还可以。请问怎么办？

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目的蛋白是什么？
内参结果附上来。
目的蛋白抗体从哪里买的？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:15

老师，我是小白，转膜问题请教下。湿法转膜，PVDF膜，恒定电压100V，蛋白质约15KD，电转液是新配的，20%甲醇。先前有试过一次能转过去，但是有时候却不行，表现为电流很低，只有140MA左右，转了半小时，蛋白还在胶上。先前也是同样的条件能转成功。。。。。。。。。。。

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电转液每次都是新配制的？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:16

请问楼主，我做细胞色素C 15KD，目的蛋白很清楚，但是内参一直都做不出来，GAPDH和actin都用过，不行；内参的抗体应该没有什么问题，因为这两个抗体我之前做出来过。目的和内参是在一起转膜和封闭的。

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如果不是抗体的问题
那应该是什么问题呢？
不可能每个内参都做不出来啊
没道理撒

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:20

版主，您好！我最近在跑一个17kDa凋亡蛋白—活化的Caspase3，用的是15%的分离胶，4%积层胶；电泳稳压，80V积层胶，120V分离胶；转膜稳流，350mA 90min；转膜结束后，用丽春红染膜，发现分子量在25KDa下的蛋白并不明显；之后显影，目的分子未显出来，但内参GD出来了。我就想请教一下版主，我这样的转膜条件跑17kDa的分子，会不会把它转出膜外去了？还有小分子蛋白用丽春红能染出来吗？谢谢！

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0.22um 孔径膜
转膜300mA 恒流，20min

作者: wood533 时间: 2013-3-20 15:21

260K的蛋白用10%的分离胶？
从你的描述来看样品出现问题的可能性较大

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原来用过6% 8%的分离胶，由于marker跑不开，只可能出来最上面的4个带，就换成10%的了，我的样品是刚煮过没多久的，煮过后一直在-20度放着，如果样本出现问题了，那内参GAPDH怎么会有那？版主你的意思是不是目的蛋白分解掉了？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:21

原来用过6% 8%的分离胶，由于marker跑不开，只可能出来最上面的4个带，就换成10%的了，我的样品是刚煮过没多久的，煮过后一直在-20度放着，如果样本出现问题了，那内参GAPDH怎么会有那？版主你的意思是不是目的蛋白分解掉了？

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先把你的胶的问题解决了
6%或者8%的胶marker跑不开是什么意思？有图吗？

作者: duoduo 时间: 2013-3-20 15:22

我最近又做了几张WB。照相机照的。
如图：
（1）根据之前的意见，我把一抗浓度由稀释2000，降到了稀释5000，明显好多了。至于那个断裂的条带，是蛋白电泳制胶的问题。

（2）看着觉得条带不如以前的那么明显，于是想看看4000的是什么效果，第二天又做了一次：

结果，就出了问题。第二天的条带明显比第一天的宽厚，有一些拖尾的感觉。不知道大家有没有什么意见呢？

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作者: tangxin_80 时间: 2013-3-20 15:24

先把你的胶的问题解决了
6%或者8%的胶marker跑不开是什么意思？有图吗？

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6%或者8%的分离胶marker跑不开就是marker的样品都是能出来十条左右的有颜色的条带，我每次用6%或8%的胶即使跑到最下面也都只能跑出来marker最上面的4个条带，改用10%的胶后，同样的条件，就能跑出来6个左右的marker条带。

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:25

我最近又做了几张WB。照相机照的。
如图：
（1）根据之前的意见，我把一抗浓度由稀释2000，降到了稀释5000，明显好多了。至于那个断裂的条带，是蛋白电泳制胶的问题。

（2）看着觉得条带不如以前的那么明显，于是想看看4000的是什么效果，第二天又做了一次：

结果，就出了问题。第二天的条带明显比第一天的宽厚，有一些拖尾的感觉。不知道大家有没有什么意见呢？

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这是什么蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:25

6%或者8%的分离胶marker跑不开就是marker的样品都是能出来十条左右的有颜色的条带，我每次用6%或8%的胶即使跑到最下面也都只能跑出来marker最上面的4个条带，改用10%的胶后，同样的条件，就能跑出来6个左右的marker条带。

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marker在6%或者8%的胶里面分子量小的是分不开的
请用小浓度的分离胶来做260KD的蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:26

这是什么蛋白？

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植物捕光蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:27

植物捕光蛋白

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蛋白表达量非常高啊

作者: wmp1234 时间: 2013-3-20 15:28

蛋白表达量非常高啊

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何以见得？我另外一个蛋白，也是捕光蛋白，分子量略大，按照说明书，稀释7000倍，就不太好，很淡很淡。

作者: NBA 时间: 2013-3-20 15:29

看你的结果啊
蛋白条带很强

作者: IAM007 时间: 2013-3-20 15:29

我用的是百乐的凝胶成像系统拍照。

作者: lixi559 时间: 2013-3-20 15:46

老师：可不可以把你们做的RAC1的图片和RAC1的抗体说明书发给我看看嘛，我想换抗体了，换你们买得那家公司的吧，我看看你们买的跟我在网上查的一不一样。因为我看那个抗体说明书上说预测RAC1为21KD，但他图片上做出来的条带在26-36KD之间，我不知道是怎么回事！

作者: lixi559 时间: 2013-3-21 10:28

版主你好：我现在还在所RAC1，还是没有出结果，因为你以前也做过RAC1，所以能不能把你当时RAC1抗体说明书发给我参考参考，我想换你那个抗体用。

作者: DONT 时间: 2013-3-21 10:29

本科二年级的小白明天要做个蔗糖酶的WB实验。。。老师没有给任何protocol，网上的也是说法不以……特来请教。
1.对于亚基60KD左右的蔗糖酶，电泳的电流电压条件应该怎么样设定？是恒流好还是恒压好。。具体电压、电流参数设定为多少？时间？是不是设定了恒压的话，电流就是会不断变化的？分离胶和浓缩胶中的电流和电压参数要分别设定的吗？
2、转膜的电压和电流参数？时间？
3、转膜液和电泳液的配方是？貌似这个网上很多版本啊。。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:31

版主你好：我现在还在所RAC1，还是没有出结果，因为你以前也做过RAC1，所以能不能把你当时RAC1抗体说明书发给我参考参考，我想换你那个抗体用。

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05-389,Millipore

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:32

本科二年级的小白明天要做个蔗糖酶的WB实验。。。老师没有给任何protocol，网上的也是说法不以……特来请教。
1.对于亚基60KD左右的蔗糖酶，电泳的电流电压条件应该怎么样设定？是恒流好还是恒压好。。具体电压、电流参数设定为多少？时间？是不是设定了恒压的话，电流就是会不断变化的？分离胶和浓缩胶中的电流和电压参数要分别设定的吗？
2、转膜的电压和电流参数？时间？
3、转膜液和电泳液的配方是？貌似这个网上很多版本啊。。。。

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电泳：恒压
转膜：恒流
转膜：300mA，恒流，1h
配方请参考分子克隆或者蛋白质技术手册

作者: pencil菲 时间: 2013-3-21 10:33

你好，我有个问题想请教一下：我的目的蛋白的分子量都很大，在300-460KD之间，请问分离胶
和浓缩胶分别用多少浓度的？在文献看过用6%的分离胶，3%的浓缩胶，请问怎么配置？电泳及
转膜时需要注意什么？还有内参怎么选择？问的问题比较多，还请见谅。

作者: tie8 时间: 2013-3-21 10:33

版主，您好：
请教个关于转膜的问题：
我做的两个蛋白分别为43kd（内参）和132kd（靶蛋白），用8%分离胶，转膜100mA，2h，PVDF膜（0.45μm），转膜后发现marker中130kd和170kd的条带很浅，其他条带很清晰，曝光时43kd的条带曝2min就很深，而132kd条带要压片1h，一抗均为santa的，按推荐比例稀释，考虑是不是100mA，2h，转膜电流小？或者时间短？132kd部分没有转上？
转膜后胶考染后看到170kd以下较干净，170kd大蛋白条带较多。
谢谢您的解答！

作者: duoduo 时间: 2013-3-21 10:34

版主，你好！
我做WB将近4个月，但是最近两个月，老是在加完样后，跑浓缩胶（电压40v）时总有一、两个孔的蛋白样品在大概是10分钟左右就开始往下漏到分离胶，成人字型或直接往下漏，跑到分离胶又是平行的。曝光有时内参（β-actin）都连在一起呈直线，这时目的就没有结果；有时内参是正常的，目的也有结果。
同门做就没有出现这种情况，我们都是用同意的试剂。
开始以为是试剂问题，用其他同学的试剂还是出现同样的问题。后来考虑是拔梳子，请其他同学拔梳子也是一样。
请版主帮我分析，不胜感激！

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-21 10:34

western blot最核心的问题是要选择好一抗和二抗，欢迎登陆恩必美生物沟通实验技术：cuturl('www.abmaking.com')

作者: eric930 时间: 2013-3-21 10:35

老师您好，为什么我8%的分离胶老是不凝啊？有时候都等了一个多小时了还是凝的不好？APS是现配先用的。谢谢啊

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-3-21 10:35

楼主，我想弱弱的问一句转膜是用恒压还是恒流好？怎样根据蛋白分子量选择电压或电流？不胜感激

作者: abc816 时间: 2013-3-21 10:36

请问封闭用BSA，需用无IgG的吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:37

你好，我有个问题想请教一下：我的目的蛋白的分子量都很大，在300-460KD之间，请问分离胶
和浓缩胶分别用多少浓度的？在文献看过用6%的分离胶，3%的浓缩胶，请问怎么配置？电泳及
转膜时需要注意什么？还有内参怎么选择？问的问题比较多，还请见谅。

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最好用梯度胶
用梯度胶：转膜，电泳，内参选择都可以解决了

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:37

版主，您好：
请教个关于转膜的问题：
我做的两个蛋白分别为43kd（内参）和132kd（靶蛋白），用8%分离胶，转膜100mA，2h，PVDF膜（0.45μm），转膜后发现marker中130kd和170kd的条带很浅，其他条带很清晰，曝光时43kd的条带曝2min就很深，而132kd条带要压片1h，一抗均为santa的，按推荐比例稀释，考虑是不是100mA，2h，转膜电流小？或者时间短？132kd部分没有转上？
转膜后胶考染后看到170kd以下较干净，170kd大蛋白条带较多。
谢谢您的解答！

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用什么ECL？
100K以上蛋白就是很少啊
300mA，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:38

老师您好，为什么我8%的分离胶老是不凝啊？有时候都等了一个多小时了还是凝的不好？APS是现配先用的。谢谢啊
现在温度低

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注意适当加大APS与TEMED的量

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:38

楼主，我想弱弱的问一句转膜是用恒压还是恒流好？怎样根据蛋白分子量选择电压或电流？不胜感激

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实验室或者个人的习惯
我们转膜习惯用恒流

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:39

请问封闭用BSA，需用无IgG的吗？

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这个没有讲究，除非某个指标有要求

作者: ritou1985 时间: 2013-3-21 10:43

楼主你好,我是新手,现在想做一个大小为10KD的蛋白,用的胶浓度是15%,用80V电压跑两个小时,200mA电流转膜,一抗浓度是1:1000, 二抗浓度是1:10000. 但是一直都做不出来,连内参都没有出来,求解答.

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:43

QUOTE:

原帖由 ritou1985 于 2013-3-21 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主你好,我是新手,现在想做一个大小为10KD的蛋白,用的胶浓度是15%,用80V电压跑两个小时,200mA电流转膜,一抗浓度是1:1000, 二抗浓度是1:10000. 但是一直都做不出来,连内参都没有出来,求解答. ...

先把内参折腾出来再说

作者: vcve 时间: 2013-3-21 10:44

想请教哈我跑的蛋白电泳MAKER亮度很弱是什么问题了但是蛋白好像也跑得不是很开是不是胶的问题很大啊我按照分子克隆书上配置的 12%的分离胶 5#的浓缩胶

作者: orangecake 时间: 2013-3-21 10:48

OP我最近做Western 目的蛋白的分子量为76KD 配10%的分离胶，5%的浓缩胶跑胶还是很顺利的，Marker（预染蛋白质分子量标准---碧云天公司的）的条带非常清楚，只是在转膜的时候遇到麻烦了，我用的0.45UM的PVDF膜，恒流250mA，时间90分钟，但转完的时候膜和胶都一片空白。Marker找不到了，我疑问了好几天，好几天的心血都白费了，请问我到底哪个环节错了呀？希望楼主给我参考参考，我将会不胜感激。

作者: zhenxin 时间: 2013-3-21 10:48

你好，我想问问，在做Western之前，提取蛋白样品时，将收的细胞放在-80度冰箱，等几天再定量可以吗？如果可以能放多久？蛋白样品在-20 度中能放多久？

作者: yonger 时间: 2013-3-21 10:53

你好，请教一下：我前几天做WB还有结果，昨天把乙酸当甲醇配转膜缓冲液了，结果转膜不成功，今天注意了这个问题，结果marker还是没有怎么转过去，请问有什么情况会导致这种结果啊？谢谢

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-21 10:54

用什么ECL？
100K以上蛋白就是很少啊
300mA，2h

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版主您好，我用的ECL是碧云天的ECL Plus，前两天做的时候靶蛋白直接压片过夜了，第二天早上显影后条带还很暗，而且背景深。请教一下，300mA转膜2h后43kD的内参会转走吗？0.45的PVDF，谢谢您的解答！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:54

想请教哈我跑的蛋白电泳MAKER亮度很弱是什么问题了但是蛋白好像也跑得不是很开是不是胶的问题很大啊我按照分子克隆书上配置的 12%的分离胶 5#的浓缩胶

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注意配胶缓冲液的pH

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:56

OP我最近做Western 目的蛋白的分子量为76KD 配10%的分离胶，5%的浓缩胶跑胶还是很顺利的，Marker（预染蛋白质分子量标准---碧云天公司的）的条带非常清楚，只是在转膜的时候遇到麻烦了，我用的0.45UM的PVDF膜，恒流250mA，时间90分钟，但转完的时候膜和胶都一片空白。Marker找不到了，我疑问了好几天，好几天的心血都白费了，请问我到底哪个环节错了呀？希望楼主给我参考参考，我将会不胜感激。

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胶、膜的位置与电极的位置放反了

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:56

你好，我想问问，在做Western之前，提取蛋白样品时，将收的细胞放在-80度冰箱，等几天再定量可以吗？如果可以能放多久？蛋白样品在-20 度中能放多久？

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放在-80度过几天定量是可以的
在-20度不能放，冻了之后，融化，离心就会有沉淀

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:57

你好，请教一下：我前几天做WB还有结果，昨天把乙酸当甲醇配转膜缓冲液了，结果转膜不成功，今天注意了这个问题，结果marker还是没有怎么转过去，请问有什么情况会导致这种结果啊？谢谢

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什么转膜条件？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 10:58

版主您好，我用的ECL是碧云天的ECL Plus，前两天做的时候靶蛋白直接压片过夜了，第二天早上显影后条带还很暗，而且背景深。请教一下，300mA转膜2h后43kD的内参会转走吗？0.45的PVDF，谢谢您的解答！

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把内参图放上来

作者: avi317 时间: 2013-3-21 10:59

你好，我有个疑问。western blot转膜后maker上了PVDF膜，但用考马斯亮蓝染胶却发现所有样品蛋白带都在胶上，请问可能是什么原因？我用的210mA跑了2小时.

作者: is2011 时间: 2013-3-21 10:59

200mA,30min，以前这个条件也做过好久了，都行得通的啊

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-21 11:00

实验室或者个人的习惯
我们转膜习惯用恒流

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谢谢楼主解答，再请教一个问题，我刚开始做wb不久，每次内参都能曝出来，就是不见目的蛋白，那我的实验步骤是不是应该没问题，问题出在抗体上或者其他的方面，还请楼主指点一二

作者: yes4 时间: 2013-3-21 11:00

把内参图放上来

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版主，您好：
第一张图是内参β-actin的，第二张是我的目的蛋白（132kD）
条件：8%胶跑1h30min
转膜100mA，2h，5%进口奶粉封闭两小时
一抗santa cruze，推荐1:200，稀释范围1:100-1:1000，我用的β-actin按1:2000稀释，目的蛋白1:200稀释，室温摇动孵育2h
二抗碧云天，1:2000稀释，室温摇动孵育1.5h
ECL碧云天的
β-actin条带很好，压片两分钟，目的蛋白是压片过夜的，条带浅，背景深

请问版主：是哪个环节有问题呢？目的蛋白部分没转上？300mA，2h转的话会不会β-actin转掉？

谢谢版主的解答！

作者: qhyu 时间: 2013-3-21 11:01

老师！我最近跑31kb和21kb蛋白，没有什么结果，抗体是没有什么问题的！师姐能做得出，师姐说我的电转有问题，我的电转仪器是北京六一的，恒压100v 2h ，我用的PVDF膜，请问老师我的蛋白是不是转过了，所以才没有弄出来啊！请问老师我这种蛋白大小转膜的条件应该怎么修改！谢谢！老师！

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-21 11:02

你好！90KD的蛋白，博乐牌机器，20V，半干转多长时间差不多？谢谢解答！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:02

你好，我有个疑问。western blot转膜后maker上了PVDF膜，但用考马斯亮蓝染胶却发现所有样品蛋白带都在胶上，请问可能是什么原因？我用的210mA跑了2小时.

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电流不通

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:02

谢谢楼主解答，再请教一个问题，我刚开始做wb不久，每次内参都能曝出来，就是不见目的蛋白，那我的实验步骤是不是应该没问题，问题出在抗体上或者其他的方面，还请楼主指点一二

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目的蛋白是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:03

版主，您好：
第一张图是内参β-actin的，第二张是我的目的蛋白（132kD）
条件：8%胶跑1h30min
转膜100mA，2h，5%进口奶粉封闭两小时
一抗santa cruze，推荐1:200，稀释范围1:100-1:1000，我用的β-actin按1:2000稀释，目的蛋白1:200稀释，室温摇动孵育2h
二抗碧云天，1:2000稀释，室温摇动孵育1.5h
ECL碧云天的
β-actin条带很好，压片两分钟，目的蛋白是压片过夜的，条带浅，背景深

请问版主：是哪个环节有问题呢？目的蛋白部分没转上？300mA，2h转的话会不会β-actin转掉？

谢谢版主的解答！

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换ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:03

老师！我最近跑31kb和21kb蛋白，没有什么结果，抗体是没有什么问题的！师姐能做得出，师姐说我的电转有问题，我的电转仪器是北京六一的，恒压100v 2h ，我用的PVDF膜，请问老师我的蛋白是不是转过了，所以才没有弄出来啊！请问老师我这种蛋白大小转膜的条件应该怎么修改！谢谢！老师！

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转膜后：用丽春红S染膜

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:03

你好！90KD的蛋白，博乐牌机器，20V，半干转多长时间差不多？谢谢解答！

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1h20min左右

作者: zhezhe 时间: 2013-3-21 11:04

目的蛋白是什么？

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目的蛋白是53kd的核蛋白，电泳是10%的分离胶，电压是80v 40min，120v ，120min，用的是millpour 0.45um的pvdf膜，300mA恒流转1h，明显可见marker全部转到膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4度孵育过夜，曝光用的是碧云天的ECL。请问版主这实验过程有没有什么地方需要改进的，我想问一下一抗孵育真的要用小塑料袋封闭隔绝空气孵育吗，我现在是用一个小盒子装的液体完全覆盖膜这样孵育的，内参每次都做的挺好的，等待版主回音，谢谢！

作者: KGZ564 时间: 2013-3-21 11:04

老师我用丽春红染色了，没有见到明显的条带！最近我的转膜液是新配的，转膜过程中发热很厉害，转完膜的液体上面有很多泡泡，我转膜仍然用2h 100v ,不知道什么原因，很害怕对转膜有影响。请问老师这个是什么原因引起的呢？我的转移液配方是GLy14.5g, Tris29g, sds1.85g ,甲醇200ml,水定容至1000ml,不知道这样的配方对不对，配完摇匀后很多气泡很就都不去，请老师指点迷津！谢谢！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-21 11:04

能不能send一份你们实验室常用的wb的protocol给我，我想看一下是不是我的实验步骤出了问题，目的蛋白一直出不来，学生不尽感激

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:05

目的蛋白是53kd的核蛋白，电泳是10%的分离胶，电压是80v 40min，120v ，120min，用的是millpour 0.45um的pvdf膜，300mA恒流转1h，明显可见marker全部转到膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4度孵育过夜，曝光用的是碧云天的ECL。请问版主这实验过程有没有什么地方需要改进的，我想问一下一抗孵育真的要用小塑料袋封闭隔绝空气孵育吗，我现在是用一个小盒子装的液体完全覆盖膜这样孵育的，内参每次都做的挺好的，等待版主回音，谢谢！

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换ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:05

老师我用丽春红染色了，没有见到明显的条带！最近我的转膜液是新配的，转膜过程中发热很厉害，转完膜的液体上面有很多泡泡，我转膜仍然用2h 100v ,不知道什么原因，很害怕对转膜有影响。请问老师这个是什么原因引起的呢？我的转移液配方是GLy14.5g, Tris29g, sds1.85g ,甲醇200ml,水定容至1000ml,不知道这样的配方对不对，配完摇匀后很多气泡很就都不去，请老师指点迷津！谢谢！

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sds浓度调整至0.1%
glycine：192mM
tris：25mM
20%甲醇

作者: KGZ564 时间: 2013-3-21 11:06

老师，转膜后发现转移液有很多泡泡对结果有影响吗? 为什么发热比以前旧的转移液厉害？谢谢老师

作者: ending 时间: 2013-3-21 11:06

我想请问一下我显影每次都有黑的竖着的条纹有时候还有空泡
是膜没洗干净还是其他什么原因关键是黑的竖着的条纹莫名其妙的

作者: ending 时间: 2013-3-21 11:06

换ECL

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老师，能给个理由嘛，有没有什么好的推荐一下。我想问一下转膜液一定要加0.1%的SDS嘛

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:07

我想请问一下我显影每次都有黑的竖着的条纹有时候还有空泡
是膜没洗干净还是其他什么原因关键是黑的竖着的条纹莫名其妙的

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与胶有关

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:07

老师，能给个理由嘛，有没有什么好的推荐一下。我想问一下转膜液一定要加0.1%的SDS嘛

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ECL：WBKLS0100，Millipore

作者: 101010 时间: 2013-3-21 11:08

蛋白定量后，，是先加上样buffer变性再用裂解液稀释呢还是先用裂解液稀释再加上样buffer变性呢？？？

作者: hustwb 时间: 2013-3-21 11:08

大师，我来求助了！
我做的目的蛋白分子量是117，抗体abcam，1：2000；内参是actin，抗体santa，1：1000。
分离胶10％，浓缩胶4％，分界线大约梳子下一厘米！
湿转恒压100V，actin转一个半小时，目标蛋白转两个半小时，做了三次，出来一次结果，比较满意！
PVDF膜，5％牛奶封闭一个小时，一抗4℃过夜，二抗避光一个小时。

但是，最近最近，问题开始出现了，不知道是不是因为天气骤然变冷的原因……一夜之间，我有了以下的问题：
1，marker开始变得非常浅，几乎看不见，以前都没问题。
2，buffer也开始变浅了，我一直用2×的，以前没问题，一夜之间，开始变浅了。
3，恒压转膜时，电流持续在200多毫安的样子，但有时莫名奇妙的达到了490毫安。
4，恒流和恒压，您建议我选择哪个呢？具体又是多长时间？多大电流或电压的要求呢？求教…………
5，浓缩胶4％和5％的区别大吗？
6，像我这样的目标蛋白，和内参，用10％的分离胶，合适吗？
在线急等您的回复……快毕业了，又给我加了一个western，悲催，问题多多啊，呵呵！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:09

蛋白定量后，，是先加上样buffer变性再用裂解液稀释呢还是先用裂解液稀释再加上样buffer变性呢？？？

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先用裂解液
后用buffer

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:09

大师，我来求助了！
我做的目的蛋白分子量是117，抗体abcam，1：2000；内参是actin，抗体santa，1：1000。
分离胶10％，浓缩胶4％，分界线大约梳子下一厘米！
湿转恒压100V，actin转一个半小时，目标蛋白转两个半小时，做了三次，出来一次结果，比较满意！
PVDF膜，5％牛奶封闭一个小时，一抗4℃过夜，二抗避光一个小时。

但是，最近最近，问题开始出现了，不知道是不是因为天气骤然变冷的原因……一夜之间，我有了以下的问题：
1，marker开始变得非常浅，几乎看不见，以前都没问题。
2，buffer也开始变浅了，我一直用2×的，以前没问题，一夜之间，开始变浅了。
3，恒压转膜时，电流持续在200多毫安的样子，但有时莫名奇妙的达到了490毫安。
4，恒流和恒压，您建议我选择哪个呢？具体又是多长时间？多大电流或电压的要求呢？求教…………
5，浓缩胶4％和5％的区别大吗？
6，像我这样的目标蛋白，和内参，用10％的分离胶，合适吗？
在线急等您的回复……快毕业了，又给我加了一个western，悲催，问题多多啊，呵呵！

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中间换什么试剂了？

作者: hustwb 时间: 2013-3-21 11:10

中间换什么试剂了？

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什么也没换啊，就跟闹鬼似的，本打算大批量的做了，结果现在每次连个结果也不出了！
我准备用恒流200mA，2.5h试一试，或者换个实验室试一试！
我还怀疑我的胶配置时出了问题，下午准备去别的实验室配置看看！
哎，版主，我很蛋疼啊！

作者: plaa 时间: 2013-3-21 11:10

请教：刚做WB不久，这几次发现转膜的时候，胶上的maker转不干净，pvdf膜上可以见到maker，胶上也有。新配得转膜液，1L液体tirs5.8g，glycine2.9g，methanol200ml，SDS0.37g，PH调到8.3，也4℃遇冷了，280ma，2h(呃，还想问问，这么长得时间目的蛋白会不会跑过啊？)，目的蛋白43kd，一直低温进行，2块胶一起转的，一块转的干净，胶上没有maker，另一块仍有maker。先前出现这种情况，以为是转膜液不行，重新配后还是这个样子。不知道为什么~请给点指点吧

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-21 11:11

先用裂解液
后用buffer

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我用过先用buffer再用裂解液，，但是100以上分子的蛋白做出来了，，但是20几的一个也没做出来。。。不知为何？兄弟可有良方

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-21 11:13

想跟大虾们咨询一下，，AP10%的配好后能用多久？有人用过别的浓度的AP不？

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-21 11:15

260K的蛋白用10%的分离胶？
从你的描述来看样品出现问题的可能性较大

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能不能说明出现什么问题？？？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:16

什么也没换啊，就跟闹鬼似的，本打算大批量的做了，结果现在每次连个结果也不出了！
我准备用恒流200mA，2.5h试一试，或者换个实验室试一试！
我还怀疑我的胶配置时出了问题，下午准备去别的实验室配置看看！
哎，版主，我很蛋疼啊！

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这种问题不好找原因
只能从你实验室本身的系统来找了

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:16

请教：刚做WB不久，这几次发现转膜的时候，胶上的maker转不干净，pvdf膜上可以见到maker，胶上也有。新配得转膜液，1L液体tirs5.8g，glycine2.9g，methanol200ml，SDS0.37g，PH调到8.3，也4℃遇冷了，280ma，2h(呃，还想问问，这么长得时间目的蛋白会不会跑过啊？)，目的蛋白43kd，一直低温进行，2块胶一起转的，一块转的干净，胶上没有maker，另一块仍有maker。先前出现这种情况，以为是转膜液不行，重新配后还是这个样子。不知道为什么~请给点指点吧

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配制转缓的试剂是哪个公司的？
转膜：25mM tris，192mM glycine，0.01% SDS，20% methanol

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:16

我用过先用buffer再用裂解液，，但是100以上分子的蛋白做出来了，，但是20几的一个也没做出来。。。不知为何？兄弟可有良方

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20几的用0.22um的膜

作者: sunnyB 时间: 2013-3-21 11:17

配制转缓的试剂是哪个公司的？
转膜：25mM tris，192mM glycine，0.01% SDS，20% methanol

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固体试剂是Amresco的，甲醇是国药集团的。呃，问题貌似不是出在试剂上，我今天在转移槽里加了冰袋，结果就都转过去了。但是，我又有新问题了，如图。一抗是CST,1:1000,二抗，碧云天，1:1000.10孔1mm厚度，上样量10ul，浓度是3.47ug/ul.样品2和3能看见但是很细，样品1几乎看不出来，样品4就没有。这是为什么呀？？

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作者: 04906 时间: 2013-3-21 11:17

20几的用0.22um的膜

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一直用的就是0.22的，，，，

作者: 987789 时间: 2013-3-21 11:18

求助楼主：
我最近报目的蛋白时(p-GSK3β)时老是出现团状的信号或者类似纺锤状的信号，但是同一张膜爆出来的内参图还可以，请问可能是什么原因？
谢谢！

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-21 11:18

楼主您好，我最近在做western时遇到很奇怪的问题，我mark电泳时都很清楚，可是转膜后膜上的mark很淡，基本看不出，这是什么原因啊。我的目的条带在135和155处，电泳85V 30min,然后换120V，共1.5h,转膜条件85V 2小时。谢谢楼主!

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:19

固体试剂是Amresco的，甲醇是国药集团的。呃，问题貌似不是出在试剂上，我今天在转移槽里加了冰袋，结果就都转过去了。但是，我又有新问题了，如图。一抗是CST,1:1000,二抗，碧云天，1:1000.10孔1mm厚度，上样量10ul，浓度是3.47ug/ul.样品2和3能看见但是很细，样品1几乎看不出来，样品4就没有。这是为什么呀？？
***解答啊啊啊

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先把样品跑完电泳后染胶！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:19

求助楼主：
我最近报目的蛋白时(p-GSK3β)时老是出现团状的信号或者类似纺锤状的信号，但是同一张膜爆出来的内参图还可以，请问可能是什么原因？
谢谢！

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胶不太好

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:19

楼主您好，我最近在做western时遇到很奇怪的问题，我mark电泳时都很清楚，可是转膜后膜上的mark很淡，基本看不出，这是什么原因啊。我的目的条带在135和155处，电泳85V 30min,然后换120V，共1.5h,转膜条件85V 2小时。谢谢楼主!

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marker是什么位置不清楚？

作者: jkobn 时间: 2013-3-21 11:20

是的。mark不是有十个条带吗，在膜上都看不清楚，很淡很淡。师姐说mark应该是最清楚的，也不知道什么原因。楼主，请问这是什么原因啊?还有，我的转膜条件可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:22

是的。mark不是有十个条带吗，在膜上都看不清楚，很淡很淡。师姐说mark应该是最清楚的，也不知道什么原因。楼主，请问这是什么原因啊?还有，我的转膜条件可以吗？

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转膜后胶上如何？

作者: jkobn 时间: 2013-3-21 11:23

胶上也没有，滤纸上也没有。请问这是什么原因啊老师？我们用的是伯乐的系统，转膜的时候就在转膜槽中加冰块，温度会不会对这个有影响啊？

作者: ROSE李 时间: 2013-3-21 11:27

您好，我是新手，想请教几个问题：

我的目的蛋白石28kD的，用多少浓度的分离胶合适，还有因为是细胞提取的蛋白，蛋白量比较少，电泳时需要的蛋白浓度多少为宜，一般0.75mm，10孔上样多少ul，15孔的呢？
谢谢

作者: 04906 时间: 2013-3-21 11:27

老师你好，我最近连续做两次western，转膜的时候都没有转上，考马斯亮蓝染凝胶及丽春红染膜都没见到蛋白，PVDF膜也没见到有marker，转膜条件100V 90min。以为是电泳液转膜液的问题，后来重新配了液体，还是同样的问题，不知道什么原因。我的目的蛋白是大分子（250-300），看文献说如果是PVDF膜降低甲醇浓度或者不加甲醇及转膜液中加入SDS至终浓度0.1%更易促进大分子转出。转膜液中第一次没有加甲醇，第二次10%，不知是不是这个原因，请老师指教。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:28

胶上也没有，滤纸上也没有。请问这是什么原因啊老师？我们用的是伯乐的系统，转膜的时候就在转膜槽中加冰块，温度会不会对这个有影响啊？

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电极放反了吧

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:28

您好，我是新手，想请教几个问题：

我的目的蛋白石28kD的，用多少浓度的分离胶合适，还有因为是细胞提取的蛋白，蛋白量比较少，电泳时需要的蛋白浓度多少为宜，一般0.75mm，10孔上样多少ul，15孔的呢？
谢谢

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12%分离胶
10孔上样量15-20ul左右
15孔上样量10-15ul左右

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:28

老师你好，我最近连续做两次western，转膜的时候都没有转上，考马斯亮蓝染凝胶及丽春红染膜都没见到蛋白，PVDF膜也没见到有marker，转膜条件100V 90min。以为是电泳液转膜液的问题，后来重新配了液体，还是同样的问题，不知道什么原因。我的目的蛋白是大分子（250-300），看文献说如果是PVDF膜降低甲醇浓度或者不加甲醇及转膜液中加入SDS至终浓度0.1%更易促进大分子转出。转膜液中第一次没有加甲醇，第二次10%，不知是不是这个原因，请老师指教。谢谢！

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250-300KD的蛋白，我们经常做
用300mA 恒流，湿转，2h30min左右，效果不错
甲醇：20%
SDS：0.01%

作者: jkobn 时间: 2013-3-21 11:29

老师，电极没有放反哎。今天换了新的marker,130和170的marker条带看不见，是因为没转过去吗？我是85V，转2h

作者: 2541 时间: 2013-3-21 11:30

谢谢老师指点。请问一下你们经常跑的250-300KD的蛋白分离胶及浓缩胶分别用多少的？今天又做了一下，还是没转上，marker只有很淡的影，丽春红染色未见蛋白，郁闷中，今天用甲醇10%，SDS 0.05%，100V 90min，电流在300mA左右。。真不知道该从哪里找原因了。

作者: pengke1983 时间: 2013-3-21 11:31

您好，我是一名在读硕士，想请教您一个问题。我最近在做western blot的时候总在膜的左侧60KD到25KD的一块区域转膜不过去，换了电转槽也不行，我已确定转膜的时候没有气泡，孵育抗体的时候也是均匀的，而且marker也转过去了，已经连续出现这样的问题了，麻烦您帮我分析一下可能的原因，谢谢！~PS:实验室里其他人没有碰到我这样的问题，之前我转膜都是没有问题的

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:31

老师，电极没有放反哎。今天换了新的marker,130和170的marker条带看不见，是因为没转过去吗？我是85V，转2h

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湿转？
如果是湿转85V，2h转膜的话是没有问题的，130、170都能在膜上看见

作者: NBA 时间: 2013-3-21 11:32

谢谢老师指点。请问一下你们经常跑的250-300KD的蛋白分离胶及浓缩胶分别用多少的？今天又做了一下，还是没转上，marker只有很淡的影，丽春红染色未见蛋白，郁闷中，今天用甲醇10%，SDS 0.05%，100V 90min，电流在300mA左右。。真不知道该从哪里找原因了。

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在这个范围的蛋白已经比较少，丽春红染色未见蛋白不一定就说没有蛋白转上
100V转膜3h后，做预实验试试吧
你是整张膜转得嘛？

作者: 911 时间: 2013-3-21 11:32

楼主，我想问一下蛋白上样量一致是指体积一致还是质量一致啊？样品蛋白浓度不同如何计算使其上样量一致？

作者: kswl870 时间: 2013-3-21 11:38

前辈，您好，这是我今天显影出来的一张片子，看起来真的让人死的心都有了。我隔了大半年都没有做WB了，今天是重新第一次做，所以想请您帮我分析分析可能的原因，我的实验条件如下：
1，上样组成：2XSDS上样缓冲液20微升，蛋白16微升，DTT4微升，但是我有的泳道上的总体积多，有的上的总体积少；
2，电泳时电压为40-80伏；
3，转膜条件，湿转，四张小膜用了两个转膜仪，所以用800MA的电流，前面三张大小在40KD左右所以时间为一个半小时，后一张膜100KD所以时间为三个小时；这里想请问一下，在一个电泳仪中两个转膜仪一起转的话，要不要把电流加倍啊，您平时用的多少毫安的电流转膜？
4，封闭用的5%的脱脂牛奶，4-8度过夜；
5，一抗放在室外10度左右，三个小时，然后再30度半个小时；
6，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；
7，二抗1：4000一个小时，10度左右；
8，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；这里还想问一下这个TBST的PH有没有什么影响，多少比较好？
9，曝光时加底物后，荧光很强，感觉整张膜都亮
麻烦您了，万分感激！
我自己分析感觉是蛋白降解了，因为抗体是别人用的，没有问题的，

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作者: wmp1234 时间: 2013-3-21 14:27

我们实验室最近做Western，转印完（湿转）用丽春红染膜（NC）后发现，个别泳道在80KD以上染色就是空白，看不到条带（一般10个泳道会有2、3个泳道是这样），最后ECL显影那个地方就是没有条带！！！！
我们确定不是由于转印时气泡所引起的，而且以前没有出现过这样的情况。转印我们用的是湿转，120v 90min。以前没有任何问题！不知道现在怎么了,

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:28

楼主，我想问一下蛋白上样量一致是指体积一致还是质量一致啊？样品蛋白浓度不同如何计算使其上样量一致？

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体积与质量均一致

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:28

前辈，您好，这是我今天显影出来的一张片子，看起来真的让人死的心都有了。我隔了大半年都没有做WB了，今天是重新第一次做，所以想请您帮我分析分析可能的原因，我的实验条件如下：
1，上样组成：2XSDS上样缓冲液20微升，蛋白16微升，DTT4微升，但是我有的泳道上的总体积多，有的上的总体积少；
2，电泳时电压为40-80伏；
3，转膜条件，湿转，四张小膜用了两个转膜仪，所以用800MA的电流，前面三张大小在40KD左右所以时间为一个半小时，后一张膜100KD所以时间为三个小时；这里想请问一下，在一个电泳仪中两个转膜仪一起转的话，要不要把电流加倍啊，您平时用的多少毫安的电流转膜？
4，封闭用的5%的脱脂牛奶，4-8度过夜；
5，一抗放在室外10度左右，三个小时，然后再30度半个小时；
6，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；
7，二抗1：4000一个小时，10度左右；
8，洗膜PH8.3左右的TBST，5*8次；这里还想问一下这个TBST的PH有没有什么影响，多少比较好？
9，曝光时加底物后，荧光很强，感觉整张膜都亮
麻烦您了，万分感激！
我自己分析感觉是蛋白降解了，因为抗体是别人用的，没有问题的，

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样品保存多久了？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:29

我们实验室最近做Western，转印完（湿转）用丽春红染膜（NC）后发现，个别泳道在80KD以上染色就是空白，看不到条带（一般10个泳道会有2、3个泳道是这样），最后ECL显影那个地方就是没有条带！！！！
我们确定不是由于转印时气泡所引起的，而且以前没有出现过这样的情况。转印我们用的是湿转，120v 90min。以前没有任何问题！不知道现在怎么了,

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注意转印的夹子要夹好

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-21 14:29

其实以前都是这么夹的，3年而且一直没有出现过问题，就是最近实验室出现这个问题，而且实验室其他人也是如此，就是相当于做10次western有5次有问题，头都大了。

作者: mickeylin 时间: 2013-3-21 14:30

老师，小妹再次来求救！以前我一直是反复用抗体洗脱液后，膜可以重复4次也没有问题！最近不知为什么重复用第三次的时候就曝不出来东西了！条件一直没有变化，样品也是一样的，上样量也没有变化，最近就是转移液新配的，其他条件没有什么变化！请问老师这到底是怎么回事，怎么突然就不能重复用了呢？第1-2次曝光条带很好，到了第三次就看不到条带了为什么？时间比较紧迫，希望老师能回答！

作者: wu11998866 时间: 2013-3-21 14:30

老师你好！我是WB新手，
我的过程是：
1.电泳80v跑完浓缩胶，120v跑分离胶，（考马斯亮蓝染色有蛋白条带）
2.转膜用NC膜，270mv80分，膜上marker很清晰，但丽春红染色什么都没有，
3.5%脱脂奶粉（光明牌）封闭1小时，
4.一抗4度过夜
5.TBST洗膜4次，10分/次，二抗1小时
6.TBST洗膜4次，10分/次，ECL作用5分钟，曝光，
但什么都没有，actin也不出，麻烦给点建议

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:31

其实以前都是这么夹的，3年而且一直没有出现过问题，就是最近实验室出现这个问题，而且实验室其他人也是如此，就是相当于做10次western有5次有问题，头都大了。

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设计实验
排除试剂问题

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:33

老师，小妹再次来求救！以前我一直是反复用抗体洗脱液后，膜可以重复4次也没有问题！最近不知为什么重复用第三次的时候就曝不出来东西了！条件一直没有变化，样品也是一样的，上样量也没有变化，最近就是转移液新配的，其他条件没有什么变化！请问老师这到底是怎么回事，怎么突然就不能重复用了呢？第1-2次曝光条带很好，到了第三次就看不到条带了为什么？时间比较紧迫，希望老师能回答！

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与蛋白的表达量也有关系
你以前的重复4次于现在的第三次，检测的都是相同的蛋白？
我们一般不这么多次的stripping

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:42

老师你好！我是WB新手，
我的过程是：
1.电泳80v跑完浓缩胶，120v跑分离胶，（考马斯亮蓝染色有蛋白条带）
2.转膜用NC膜，270mv80分，膜上marker很清晰，但丽春红染色什么都没有，
3.5%脱脂奶粉（光明牌）封闭1小时，
4.一抗4度过夜
5.TBST洗膜4次，10分/次，二抗1小时
6.TBST洗膜4次，10分/次，ECL作用5分钟，曝光，
但什么都没有，actin也不出，麻烦给点建议

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用考马斯亮蓝染色过的胶再转膜？

作者: fei1226com 时间: 2013-3-21 14:43

与蛋白的表达量也有关系
你以前的重复4次于现在的第三次，检测的都是相同的蛋白？
我们一般不这么多次的stripping

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老师对啊！不过以前跑的是细胞的，现在跑得是组织的！老师可以介绍个温和点得strip吗？非常感谢！

作者: ukonptp 时间: 2013-3-21 14:45

我想请问您老师我做了两个指标，一个MMP-9和CD147，加的蛋白总量有40ug,然后配的1.5的胶，电泳先是80v然后120，转膜是235mv 1.5小时，丽春红可以看到条带，然后在封闭1小时后用一抗4度冰箱内过夜，第二天复温半个小时后，再TBST洗半个小时后再二抗一个小时，TBST洗半个小时后，加发光液后整张膜都发光，内参显影很明显，但我要的MMP-9和CD147的目的条带都看不到，就只有黑色的背景，。MMP-9用1:1000、1:500、1:200、1:800都试过，CD147用的1:1000、1：500，我想请问老师是不是蛋白上样量不够，我可以加到80ug吗？谢谢！

作者: october7 时间: 2013-3-21 14:46

样品我一直都放在负80度，也没有多久哦，就几个星期;煮过的放在-20度哦

作者: bs4665 时间: 2013-3-21 14:47

体积与质量均一致

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是不是说浓度不一致的先稀释成同等浓度先呢，假如是的话又用什么来稀释呢？比如一个浓度是17ug/ul,另一个是20ug/ul，怎样做才能做到体积与质量一致呢？能不能只是上样质量一致，比如都是20ug，但体积不一致呢，希望老师能替学生解答，谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:47

老师对啊！不过以前跑的是细胞的，现在跑得是组织的！老师可以介绍个温和点得strip吗？非常感谢！

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我只有一种stripping
温和点的没用过

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:49

是不是说浓度不一致的先稀释成同等浓度先呢，假如是的话又用什么来稀释呢？比如一个浓度是17ug/ul,另一个是20ug/ul，怎样做才能做到体积与质量一致呢？能不能只是上样质量一致，比如都是20ug，但体积不一致呢，希望老师能替学生解答，谢谢。

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用裂解液与loading buffer可以调整体积及质量一致

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:51

我想请问您老师我做了两个指标，一个MMP-9和CD147，加的蛋白总量有40ug,然后配的1.5的胶，电泳先是80v然后120，转膜是235mv 1.5小时，丽春红可以看到条带，然后在封闭1小时后用一抗4度冰箱内过夜，第二天复温半个小时后，再TBST洗半个小时后再二抗一个小时，TBST洗半个小时后，加发光液后整张膜都发光，内参显影很明显，但我要的MMP-9和CD147的目的条带都看不到，就只有黑色的背景，。MMP-9用1:1000、1:500、1:200、1:800都试过，CD147用的1:1000、1：500，我想请问老师是不是蛋白上样量不够，我可以加到80ug吗？谢谢！

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内参条带做的如何？

作者: october7 时间: 2013-3-21 14:52

内参条带做的如何？

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每次内参都做出来了，但是我要的目的条带就没出来

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-21 14:54

前辈，你好，我想请问一下蛋白marker为什么会在浓缩胶了就出现分离啊？可能是哪些方面出了问题，您可以帮我分析一下吗？

作者: lxh031 时间: 2013-3-21 14:54

老师：我做western 4个月了，一直没结果，但是内参能出来。我的内参是40KD的，目的是30KD，有时候可以见到目的条带，但很模糊，我想是不是转膜没有转完。我想请问一下转膜的时候预染的MAKER是不是应该完全转到膜上去啊，我的蛋白是30KD的，我转膜的时候至少55kd的maker应该完全转过去吧？

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作者: lxh031 时间: 2013-3-21 14:55

左边是我的内参，右边是目的。我有时候内参做的很漂亮，但就是目的出不来，都把人逼疯了，请各位专家帮帮忙啊

这是我跑得很漂亮的内参!

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作者: glass 时间: 2013-3-21 14:55

老师，你好，最近做的很不顺，跑电泳的时候溴酚蓝会弥散成片状，跑完了，烤染空白，转膜虽然marker可以转的很好，但丽春红染空白，而且转膜时产热现象很严重，以前做内参1.5h都不太热，现在不到1h就冒热气，跟以前的相比，就是甘氨酸是新的，以前的用完了，你说会不会跟这个有关啊？一连几次全这样。

作者: qqq111 时间: 2013-3-21 14:56

您好，我跑的目标蛋白大约是10KD左右，用15%的胶，转膜时用0.45的膜，200mA 电流转90分钟（60分钟，120分钟，105分钟）都试过，但是条带一直没有出来，不知道什么原因？
像这么小的蛋白，您一般是用什么条件跑出来的？
期盼回复！

作者: remenb 时间: 2013-3-21 14:57

建议重换洗膜、稀释抗体用的缓冲液
前几天有个战友也有类似情况
她的问题是这样的：同一个抗体
一个用抗血清、一个用纯化后的抗体
结果抗血清的片子干净，纯化后抗体的片子和你说的一样

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请教老师，我也碰到相似的情况，目的条带还算清晰，就是背景内有很多的麻点，那么洗膜后是稀释抗体还是稀释缓冲液？谢谢！

作者: remenb 时间: 2013-3-21 14:58

请教老师，我也碰到相似的情况，目的条带还算清晰，就是背景内有很多的麻点，那么洗膜后是稀释抗体还是稀释缓冲液？谢谢！

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忘记说了，内参一点没问题，背景很干净，条带清晰，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:59

每次内参都做出来了，但是我要的目的条带就没出来
目的蛋白是什么？那个公司的？

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内参的图片放上来看看

作者: NBA 时间: 2013-3-21 14:59

前辈，你好，我想请问一下蛋白marker为什么会在浓缩胶了就出现分离啊？可能是哪些方面出了问题，您可以帮我分析一下吗？

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pH不对

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:00

老师，你好，最近做的很不顺，跑电泳的时候溴酚蓝会弥散成片状，跑完了，烤染空白，转膜虽然marker可以转的很好，但丽春红染空白，而且转膜时产热现象很严重，以前做内参1.5h都不太热，现在不到1h就冒热气，跟以前的相比，就是甘氨酸是新的，以前的用完了，你说会不会跟这个有关啊？一连几次全这样。

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新甘氨酸是哪里的啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:02

您好，我跑的目标蛋白大约是10KD左右，用15%的胶，转膜时用0.45的膜，200mA 电流转90分钟（60分钟，120分钟，105分钟）都试过，但是条带一直没有出来，不知道什么原因？
像这么小的蛋白，您一般是用什么条件跑出来的？
期盼回复！

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转膜：200mA，20min，用0、22um孔径的膜

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:03

请教老师，我也碰到相似的情况，目的条带还算清晰，就是背景内有很多的麻点，那么洗膜后是稀释抗体还是稀释缓冲液？谢谢！

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抗体本身的问题

作者: DDD 时间: 2013-3-21 15:03

最近western一直跑不好，跟以前一样做的，就是做不好。具体情况是显完影后目的条带会显得有点虚，不那么黑，而且背景有点深，怎么回事啊，非常苦恼，以前都可以的哇

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:05

最近western一直跑不好，跟以前一样做的，就是做不好。具体情况是显完影后目的条带会显得有点虚，不那么黑，而且背景有点深，怎么回事啊，非常苦恼，以前都可以的哇

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调整二抗浓度，曝光条件

作者: DDD 时间: 2013-3-21 15:06

我用的是nc膜，我是直接用transfer buffer浸湿后就转了，目的条带虚，而且有点分散的感觉，是不是有转膜的原因？加上发光液后，整个背景都亮了，是不是一抗太浓？还是二抗？

作者: applebook=213 时间: 2013-3-21 15:07

老师您好，我的marker终于出来了，换了转膜配方，之前是：2.93g甘氨酸，5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇，加水至1000ml,现在换成了14.4g甘氨酸，3.03g Tris base,200ml甲醇，加水至1000ml.我的目的蛋白是130和155，老师，请问要加SDS吗？

作者: bring 时间: 2013-3-21 15:07

大家好，我今天刚学做western，显影后发现背景很脏而且目的带也很不清楚。
我的一抗是按照1:1000稀释的。如果把稀释倍数减少会不会好点啊？还有师姐说可以封闭时间长一点，
不知道大家有什么建议呢，感谢大家的帮助

作者: bring 时间: 2013-3-21 15:08

我想请问您老师我做了两个指标，一个MMP-9和CD147，加的蛋白总量有40ug,然后配的1.5的胶，电泳先是80v然后120，转膜是235mv 1.5小时，丽春红可以看到条带，然后在封闭1小时后用一抗4度冰箱内过夜，第二天复温半个小时后，再TBST洗半个小时后再二抗一个小时，TBST洗半个小时后，加发光液后整张膜都发光，内参显影很明显，但我要的MMP-9和CD147的目的条带都看不到，就只有黑色的背景，。MMP-9用1:1000、1:500、1:200、1:800都试过，CD147用的1:1000、1：500，我想请问老师是不是蛋白上样量不够，我可以加到80ug吗？谢谢！

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哎，，我今天发生了和你一样的事。。背景很脏，目的带也不清楚。。。师姐告诉我把TBST里面加了TWeen20后再加Triton 100 配好后再洗膜。。
再不行的话延长下封闭的时间

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:08

我用的是nc膜，我是直接用transfer buffer浸湿后就转了，目的条带虚，而且有点分散的感觉，是不是有转膜的原因？加上发光液后，整个背景都亮了，是不是一抗太浓？还是二抗？

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虚与胶有关
背景亮的话调整二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:09

老师您好，我的marker终于出来了，换了转膜配方，之前是：2.93g甘氨酸，5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇，加水至1000ml,现在换成了14.4g甘氨酸，3.03g Tris base,200ml甲醇，加水至1000ml.我的目的蛋白是130和155，老师，请问要加SDS吗？

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要价sds

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-21 15:10

老师，那还是用2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml这个配方还是用14.4g甘氨酸， 3.03g Tris base,加SDS，200ml甲醇,加水至1000ml这个配方呢？用后面那个配方的话，SDS的量应该加多少呢？谢谢了

作者: 2541 时间: 2013-3-21 15:12

老师你好！！我想请问一下我的一抗是细菌的某种原核表达的通过his-tag纯化的蛋白所制成的抗体，目前自制的多克隆抗体（一抗）效价是1:4，不知道这样的效价能不能采血了，因为我现在存在一个问题：我蛋白的量不多了，如果继续免疫的话后面就没有蛋白可用老。另外，请问自制的多克隆抗体（一抗）的效价一般要达到好多可以用来做WB。。。

作者: zhezhe 时间: 2013-3-21 15:15

我做western blot内参经常做不齐，我用的膜是NC膜，用之前在三蒸水中浸泡10min以上，然后在预冷的转膜液（14.4g甘氨酸，3g tris，200ml甲醇，加三蒸水至1000ml）中浸泡，220mA电流2h，封闭使用5%脱脂奶粉1h，GAPDH抗体稀释浓度为1:500，二抗稀释浓度为1:500，曝光用碧云天ECL发光液，曝光时间3min。
内参做出来如下图，转膜后使用丽春红染色每个条带都很清楚，做目的条带则没有出现类似的问题，条带很清晰，但是内参总是有一半能曝出来，有一半又曝不出来。
恳请予以指导，谢谢！

图片附件: 48222312.png (2013-3-21 15:15, 53.44 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15287

作者: H2O 时间: 2013-3-21 15:16

我有两个不是关于WB技术方面的问题：
1、我用western来测临床病人外周血中单核细胞（PBMC）中的Caspase-1,我的病人一共有44人，我想问，如果我不想比较病人组内的差异（即:不比较病人与病人间的差异，）那么我想问，我是否就不用跑44个样了？是否可以把这44份外周血单核细胞分成几份然后混起来跑？
2、按照您以往的经验，在投稿后，审稿人是否会索要Western的原始图片资料，比如说，我如果跑了44个样，他是否会叫我提供这44个样跑出来的原始胶片资料？
谢谢您。

作者: H2O 时间: 2013-3-21 15:19

哎，，我今天发生了和你一样的事。。背景很脏，目的带也不清楚。。。师姐告诉我把TBST里面加了TWeen20后再加Triton 100 配好后再洗膜。。
再不行的话延长下封闭的时间

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我已经在TBST里加了TWeen，但是没有加Triton，每次洗的时间我都延长了，但还是不行。

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:19

老师你好！！我想请问一下我的一抗是细菌的某种原核表达的通过his-tag纯化的蛋白所制成的抗体，目前自制的多克隆抗体（一抗）效价是1:4，不知道这样的效价能不能采血了，因为我现在存在一个问题：我蛋白的量不多了，如果继续免疫的话后面就没有蛋白可用老。另外，请问自制的多克隆抗体（一抗）的效价一般要达到好多可以用来做WB。。。

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这个1:4.。。。不行吧
不叫效价吧

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:20

我做western blot内参经常做不齐，我用的膜是NC膜，用之前在三蒸水中浸泡10min以上，然后在预冷的转膜液（14.4g甘氨酸，3g tris，200ml甲醇，加三蒸水至1000ml）中浸泡，220mA电流2h，封闭使用5%脱脂奶粉1h，GAPDH抗体稀释浓度为1:500，二抗稀释浓度为1:500，曝光用碧云天ECL发光液，曝光时间3min。
内参做出来如下图，转膜后使用丽春红染色每个条带都很清楚，做目的条带则没有出现类似的问题，条带很清晰，但是内参总是有一半能曝出来，有一半又曝不出来。
恳请予以指导，谢谢！

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抗体孵育不匀或者ECL加的不匀

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:21

1、我用western来测临床病人外周血中单核细胞（PBMC）中的Caspase-1,我的病人一共有44人，我想问，如果我不想比较病人组内的差异（即:不比较病人与病人间的差异，）那么我想问，我是否就不用跑44个样了？是否可以把这44份外周血单核细胞分成几份然后混起来跑？
2、按照您以往的经验，在投稿后，审稿人是否会索要Western的原始图片资料，比如说，我如果跑了44个样，他是否会叫我提供这44个样跑出来的原始胶片资料？
谢谢您。

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1、最好这些样品都检测一遍
2、论文附图不会附所有的图。但是国外期刊审稿的时候很多会要原始图片资料
3、不建议混合起来跑
4、多样品的WB的上样顺序需要设计

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:22

我已经在TBST里加了TWeen，但是没有加Triton，每次洗的时间我都延长了，但还是不行。

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triton的配方
我没用过

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-21 15:22

我已经在TBST里加了TWeen，但是没有加Triton，每次洗的时间我都延长了，但还是不行。

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要么你再加Trinton 试试看

作者: dog002 时间: 2013-3-21 15:23

老师你好，最近我要做一个蛋白大小54kd，然后我的内参大小55kd，我可以先做了目的蛋白，然后把膜洗了然后再做内参呢？如果可以这个洗膜是怎么洗呢，有专门的配方吗，会把我第二次做的蛋白洗掉吗？
还有个问题就是，做完第一个蛋白后，这个膜能放几天再来做第二个蛋白吗？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-21 15:24

首先确定二抗的稀释度
然后用不同的一抗稀释度来做预实验（因为二抗浓度已经确定，这会就不需要调整二抗浓度了）
另外你说的爆不出条带是什么意思

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不知道二抗的浓度应该怎么确定，有什么可以做为评判二抗浓度合适的标准？背景很干净？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-21 15:25

谢谢，在国外试验室，用的fisher的ECL，估计是TEMED没有完全混匀，搞的分离胶没有凝好。而且这个p53的一抗，是刚买的，周一order，周二就来了，所以效力可能太强了。说明书上推荐的一抗稀释度是1:100到1:1000，我已经用到1：1000了，那这个一抗是不是还可以再稀释一下啊。再就是连marker也显出条带来了，是一抗浓度高还是二抗浓度高的原因啊？谢谢高手回复，万分感激！

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我也是买的santa的抗体，做出来的效果也是不怎么样，想问问你最后做出来用的一抗稀释比例是多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:27

老师你好，最近我要做一个蛋白大小54kd，然后我的内参大小55kd，我可以先做了目的蛋白，然后把膜洗了然后再做内参呢？如果可以这个洗膜是怎么洗呢，有专门的配方吗，会把我第二次做的蛋白洗掉吗？
还有个问题就是，做完第一个蛋白后，这个膜能放几天再来做第二个蛋白吗？

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建议选择分子量有差别的内参
stripping我有配方，是我公司产品
不方便说

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:28

不知道二抗的浓度应该怎么确定，有什么可以做为评判二抗浓度合适的标准？背景很干净？

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参考二抗点膜实验
我的帖子中有

作者: tuuu2 时间: 2013-3-21 15:29

参考二抗点膜实验
我的帖子中有

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哈可不可以发个链接给我，谢谢！第一次听这种方法！

作者: avi317 时间: 2013-3-21 15:30

相关疾病：
肿瘤
我要做脑胶质瘤通路里的一个跨膜蛋白,文献上说在肿瘤细胞中，这个蛋白是被激活并磷酸化的，我在6孔板里收样，收样时没有加磷酸酶抑制剂，有加蛋白酶抑制剂，用200ul 裂解液（进口）裂解，找齐蛋白浓度后，加6*buffer后冻存，我要的蛋白分子量为86kd,用的博士德的配胶试剂盒，分离胶浓度为10%，上样量40ug,电泳约2小时，转膜1小时，然后封闭4°过夜，一抗(santa)摸了1:200/1:500/1:1000 37°孵育1小时，洗膜后，二抗以1:4000 孵育1小时37° ，而后洗膜后显色
可是我始终没有看到我要的条带，内参为ACTIN，出带了，还可以，麻烦你帮着分析一下，可能是技术的原因还是抗体的原因！
图如下：

1
这个是内参的条带

这个是要做的抗体的膜，从左到右抗体浓度分别为：1:200 1:500 1:1000 膜右侧的黑点为分子量90KD的marker
请教是什么原因没有出带呢？谢谢大家了！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15288

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:31

我要做脑胶质瘤通路里的一个跨膜蛋白,文献上说在肿瘤细胞中，这个蛋白是被激活并磷酸化的，我在6孔板里收样，收样时没有加磷酸酶抑制剂，有加蛋白酶抑制剂，用200ul 裂解液（进口）裂解，找齐蛋白浓度后，加6*buffer后冻存，我要的蛋白分子量为86kd,用的博士德的配胶试剂盒，分离胶浓度为10%，上样量40ug,电泳约2小时，转膜1小时，然后封闭4°过夜，一抗(santa)摸了1:200/1:500/1:1000 37°孵育1小时，洗膜后，二抗以1:4000 孵育1小时37° ，而后洗膜后显色
可是我始终没有看到我要的条带，内参为ACTIN，出带了，还可以，麻烦你帮着分析一下，可能是技术的原因还是抗体的原因！
图如下：
这个是内参的条带
这个是要做的抗体的膜，从左到右抗体浓度分别为：1:200 1:500 1:1000 膜右侧的黑点为分子量90KD的marker
请教是什么原因没有出带呢？谢谢大家了！

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目的蛋白名称是什么？

作者: wood533 时间: 2013-3-21 15:32

版主您好，最近做western 阴性对照，PBS代替一抗，再加二抗孵育，结果出的条带和加一抗二抗出的条带基本是一致的，都基本在我目的蛋白的位置。这种结果是怎么回事，该如何处理呢？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:34

版主您好，最近做western 阴性对照，PBS代替一抗，再加二抗孵育，结果出的条带和加一抗二抗出的条带基本是一致的，都基本在我目的蛋白的位置。这种结果是怎么回事，该如何处理呢？谢谢

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1、样品来源是什么种属？
2、二抗具体信息

作者: 131415 时间: 2013-3-21 15:36

1.样品来源种属：一抗是小鼠抗大鼠单抗，二抗是山羊抗小鼠。一抗同时可以抗小鼠和抗人
2.抗体都是santa的，二抗是santa公司的山羊抗小鼠，HRP结合的

作者: ending 时间: 2013-3-21 15:38

老师，那还是用2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml这个配方还是用14.4g甘氨酸， 3.03g Tris base,加SDS，200ml甲醇,加水至1000ml这个配方呢？用后面那个配方的话，SDS的量应该加多少呢？谢谢了

作者: ending 时间: 2013-3-21 15:43

版主您好，我用santa sc-22538R 兔多抗1:500检测小鼠的osx，转膜后丽春红染色转膜结果良好，
二抗是CST的 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 ，1:1000 压片后出现这中情况，请帮忙分析一下。

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:44

1.样品来源种属：一抗是小鼠抗大鼠单抗，二抗是山羊抗小鼠。一抗同时可以抗小鼠和抗人
2.抗体都是santa的，二抗是santa公司的山羊抗小鼠，HRP结合的

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这种情况下
需要排除每个试剂、抗体的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:44

老师，那还是用2.93g甘氨酸,5.82g Tris base,0.375gSDS,200ml甲醇,加水至1000ml这个配方还是用14.4g甘氨酸， 3.03g Tris base,加SDS，200ml甲醇,加水至1000ml这个配方呢？用后面那个配方的话，SDS的量应该加多少呢？谢谢了

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前面是半干
后面是湿转

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:44

版主您好，我用santa sc-22538R 兔多抗1:500检测小鼠的osx，转膜后丽春红染色转膜结果良好，
二抗是CST的 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 ，1:1000 压片后出现这中情况，请帮忙分析一下

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调整一抗浓度试试

作者: kewanqi2011 时间: 2013-3-21 15:45

这是之前做的，一抗1：1000，二抗1：6000,分子量21，第一道为marker25的线，5个样

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作者: kewanqi2011 时间: 2013-3-21 15:50

这是阴性对照的，二抗1:6000，marker没显出来，但位置基本不变。7个样，一个道未出。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15290

作者: kewanqi2011 时间: 2013-3-21 15:50

这是阴性对照的，二抗1:6000，marker没显出来，但位置基本不变。7个样，一个道未出。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15291

作者: kewanqi2011 时间: 2013-3-21 15:51

没做阴性对照以前一直认为做的可能就是目的条带，但总觉得条带很宽，发虚（上样10ul）。现在就很疑惑，这到底就是的结果还是假阳性？
这是另一个因子的，左边marker分别是100、70、55，目的蛋白分子量为72，还有65的另一种形式，位置均偏低，而且条带很粗大，虚，而且趋势性不明显吧。总也觉得不对。

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作者: yonger 时间: 2013-3-21 15:53

相关疾病：
胃癌肿瘤乳腺癌
版主您好，最近才开始做细胞蛋白的WB，不是很顺利，连续几次都没有目的条带，内参还不错。我的条件：12.5%分离胶，上样量20ug，80V 15min、110V电泳2h，100V恒压转膜1.5h，5%牛奶+PBST封闭0.5h，1%牛奶PBST 1：1000稀释MELK（75KD）多抗4°C摇床过夜，PBST洗3次，PBST 1：20000稀释GAPDH荧光二抗孵育45min，PBST洗两次，PBS洗一次，荧光检测。
请教几个问题：
1.我的目的蛋白为MELK（75KD），是一种激酶，能发生自身磷酸化，抽蛋白的时候是不是必须要加磷酸酶抑制剂？
2.第2次我改为10%的分离胶，在回收的一抗里面再加了一倍的一抗，把上样量加倍，目的条带仍然一片空白，请问我下一步应该如何改进？
3.我是在胃癌细胞中检测这个目的蛋白，目前没有一篇文献报道胃癌中这个蛋白，是不是此蛋白在胃癌细胞中表达极低的原因？（我觉得这个可能性很小，因为这个蛋白在许多肿瘤如肠癌、乳腺癌、脑瘤中均有表达，我在胃癌细胞中做定量PCR和半定量PCR也有明显的统计学差异）
期盼您的回答，谢谢。

作者: lgm 时间: 2013-3-21 15:54

老师你好，请问我在跑western时，出现了几条带，按理说应该只有一个，我的一抗是进口的abcam单抗，那到底是我的抗体非特异性呢还是蛋白讲解了呢？如何区别这二者呢？还有老师我的膜的最下面到底是条带呢还是边缘没有洗干净？好像正好被我剪掉了？谢谢！

作者: IAM007 时间: 2013-3-21 15:54

版主您好，我想做的分子的分子量很大，270KD，怎么办呢？
用多少的胶来跑呢？
谢谢您

作者: cocacola 时间: 2013-3-21 15:55

楼主你好刚做 Western，内参出来这样的结果，不知如何解释？请楼主帮忙解释谢谢

作者: XYZQ 时间: 2013-3-21 15:55

版主您好！又来请教啦！我最近做一个新分子出现些问题，显影后如图：
每个蛋白泳道都有深浅不同的背景。封闭，10%脱脂奶粉，2H；一抗（Sigma单抗）4度过夜，洗膜30min；二抗（Santa Cruz）室温1H，洗膜40min；ECL,1min；这是一张压了十秒后显影的片子。这种情况已出现两次啦。二抗浓度也在降，已从1：2000降到1:5000。
想问一下，是脱脂奶粉封闭的问题吗？需要改用BSA封闭吗？
这和一抗是单抗有关吗？因为我师姐的一个分子，一抗是Santa的单抗，二抗和我的一样，做出来基本也是这种情况。
问题有点多，麻烦版主啦！

[ 本帖最后由 XYZQ 于 2013-3-21 15:57 编辑 ]

图片附件: 86035810.snap.jpg (2013-3-21 15:57, 26.31 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15293

作者: 鹅鹅鹅 时间: 2013-3-21 15:57

楼主您好，打扰问您几个western 的问题
1、一个目的蛋白为膜蛋白，180kd，至今没有做出来，查文献有一部分是IP之后再电泳。我已经买了珠子，还没有来得及做，您觉得应该注意什么？
2、另一个目的蛋白，也是膜蛋白，abcam抗体，细胞免疫化学染色比较深，但是western就是做不出来，90kd左右。今天一位老师提醒我要用专门的膜蛋白裂解液，之前我用的是碧云天的中等强度的裂解液，您看是否要换。另外还要注意什么呢？
非常感谢

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:58

这是之前做的，一抗1：1000，二抗1：6000,分子量21，第一道为marker25的线，5个样

这是阴性对照的，二抗1:6000，marker没显出来，但位置基本不变。7个样，一个道未出。

换中杉二抗，加一抗二抗后，和第2张图同张膜。

没做阴性对照以前一直认为做的可能就是目的条带，但总觉得条带很宽，发虚（上样10ul）。现在就很疑惑，这到底就是的结果还是假阳性？
这是另一个因子的，左边marker分别是100、70、55，目的蛋白分子量为72，还有65的另一种形式，位置均偏低，而且条带很粗大，虚，而且趋势性不明显吧。总也觉得不对。

问题有点多，求解，谢谢版主！

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什么样品？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 15:59

版主您好，最近才开始做细胞蛋白的WB，不是很顺利，连续几次都没有目的条带，内参还不错。我的条件：12.5%分离胶，上样量20ug，80V 15min、110V电泳2h，100V恒压转膜1.5h，5%牛奶+PBST封闭0.5h，1%牛奶PBST 1：1000稀释MELK（75KD）多抗4°C摇床过夜，PBST洗3次，PBST 1：20000稀释GAPDH荧光二抗孵育45min，PBST洗两次，PBS洗一次，荧光检测。
请教几个问题：
1.我的目的蛋白为MELK（75KD），是一种激酶，能发生自身磷酸化，抽蛋白的时候是不是必须要加磷酸酶抑制剂？
2.第2次我改为10%的分离胶，在回收的一抗里面再加了一倍的一抗，把上样量加倍，目的条带仍然一片空白，请问我下一步应该如何改进？
3.我是在胃癌细胞中检测这个目的蛋白，目前没有一篇文献报道胃癌中这个蛋白，是不是此蛋白在胃癌细胞中表达极低的原因？（我觉得这个可能性很小，因为这个蛋白在许多肿瘤如肠癌、乳腺癌、脑瘤中均有表达，我在胃癌细胞中做定量PCR和半定量PCR也有明显的统计学差异）
期盼您的回答，谢谢。

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内参图片呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:00

楼主你好刚做 Western，内参出来这样的结果，不知如何解释？请楼主帮忙解释谢谢

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先跑胶，SDS-PAGE染胶
丽春红染膜

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:01

版主您好！又来请教啦！我最近做一个新分子出现些问题，显影后如图：
每个蛋白泳道都有深浅不同的背景。封闭，10%脱脂奶粉，2H；一抗（Sigma单抗）4度过夜，洗膜30min；二抗（Santa Cruz）室温1H，洗膜40min；ECL,1min；这是一张压了十秒后显影的片子。这种情况已出现两次啦。二抗浓度也在降，已从1：2000降到1:5000。
想问一下，是脱脂奶粉封闭的问题吗？需要改用BSA封闭吗？
这和一抗是单抗有关吗？因为我师姐的一个分子，一抗是Santa的单抗，二抗和我的一样，做出来基本也是这种情况。
问题有点多，麻烦版主啦！

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1、室温封闭15-30min足够
2、二抗室温不要太久，30-40min
3、一抗特异性不是很好
4、BSA会增加敏感性
5、二抗是哪里的？货号多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:01

楼主您好，打扰问您几个western 的问题
1、一个目的蛋白为膜蛋白，180kd，至今没有做出来，查文献有一部分是IP之后再电泳。我已经买了珠子，还没有来得及做，您觉得应该注意什么？
2、另一个目的蛋白，也是膜蛋白，abcam抗体，细胞免疫化学染色比较深，但是western就是做不出来，90kd左右。今天一位老师提醒我要用专门的膜蛋白裂解液，之前我用的是碧云天的中等强度的裂解液，您看是否要换。另外还要注意什么呢？
非常感谢

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1、IP可以随时问我
2、不需要专门的膜蛋白裂解液，用好的抽提试剂就行，我可以给你点试试。短信息联系
3、膜蛋白抽提试剂盒我用过pierce与merck的，不行
4、是什么蛋白？如果方便说的话
5、碧云天的试剂我认为是属于垃圾级别的

作者: birdfish 时间: 2013-3-21 16:02

marker？？？

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marker不能爆出来，位置对的就只有中间那条，其他的大小都不对

作者: XYZQ 时间: 2013-3-21 16:03

1、室温封闭15-30min足够
2、二抗室温不要太久，30-40min
3、一抗特异性不是很好
4、BSA会增加敏感性
5、二抗是哪里的？货号多少？

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二抗是Santa Cruz的(抗鼠二抗)，货号SC2005

作者: nn255 时间: 2013-3-21 16:04

你好，最近看文献发现，测量胰岛素受体底物-1酪氨酸磷酸化水平时，文献均用IB+IP：IRS-1抗体去拉匀浆液中的IRS-1蛋白，然后电泳转到膜上，再用IRS-1酪氨酸某位点磷酸化抗体去检测。我很困惑为什么要先做一个IB，既然已经买了IRS-1酪氨酸某磷酸化的抗体直接westen的话就可以检测蛋白量了，不是吗？
这两种方法检测结果有什么差别吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:04

marker不能爆出来，位置对的就只有中间那条，其他的大小都不对

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这个抗体的特异性不是很好

作者: zhenxin 时间: 2013-3-21 16:05

请问有没有人做大鼠RAC1蛋白WESTERN的！咨询一下啊！急急急！

作者: lxh031 时间: 2013-3-21 16:06

1.转膜用150mA 90分钟，膜上有marker条带，考染胶没有出现条带，丽春红染膜也没有出现条带，正负极没有问题，是转膜的条件不对吗？丽春红在转膜后染是否正确？
2.一抗中含0.02%的叠氮钠，孵育后洗膜10分钟3次，对二抗是否还有影响，二抗用辣根酶标记。

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:07

1.转膜用150mA 90分钟，膜上有marker条带，考染胶没有出现条带，丽春红染膜也没有出现条带，正负极没有问题，是转膜的条件不对吗？丽春红在转膜后染是否正确？
2.一抗中含0.02%的叠氮钠，孵育后洗膜10分钟3次，对二抗是否还有影响，二抗用辣根酶标记。

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1、我们转膜后都用丽春红染膜
2、孵育一抗的时候加叠氮钠？
我觉得是膜上没有蛋白的影响

作者: 49888 时间: 2013-3-21 16:08

1、我们转膜后都用丽春红染膜
2、孵育一抗的时候加叠氮钠？
我觉得是膜上没有蛋白的影响

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是一抗本身就有0.02%的叠氮钠，请问是否有影响呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:09

是一抗本身就有0.02%的叠氮钠，请问是否有影响呢？

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不会影响后续HRP标记的二抗

作者: memory 时间: 2013-3-21 16:10

谢谢老师的解答，
我做的蛋白是36，45，54kd。电泳70V,100V。转印用的200mA，1h。NC膜上能看到marker，但是用丽春红染色却几乎看不到条带。请问是什么原因。一个同学和我一起做的20多的蛋白，用的PVDF膜，能看出条带。

作者: hold住 时间: 2013-3-21 16:11

请教一下NBA，我做WB一抗浓度1:300，二抗是抗兔的，但我不小心错用抗小鼠的二抗1:5000孵育，曝光出来有条带，下面有杂带。
第二次我再做了一次WB，一抗1:500，二抗用抗兔的1:5000，曝光出来却什么都没有。
请问，这是什么原因？

作者: 3N4G 时间: 2013-3-21 16:12

我做western几个月了，我的一个目的基因去年做出来了，后来抗体用完了，买了另一个批次的抗体，就做不出来了，现在是加完ECL后膜上一片一片的亮光，没有条带，请问各位大侠这是怎么回事啊，试了很久都没试出来呀，着急

作者: mickeylin 时间: 2013-3-21 16:13

LC3B不太好做，CST的这个抗体我用过，效果一般

转膜时间缩短下，30min

内参出现杂带，以前出现过吗？

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请教下版主，我马上要做LC3B这个蛋白了，但是以前我在做分子量小于20的蛋白，如活化的Caspase-3，都检测不到蛋白，请问是不是我用的SDS-PAGE有问题？我用的是9%的AB液，29:1配制的。

作者: eric930 时间: 2013-3-21 16:14

请问楼主，我最近要做350kda的蛋白质，那需要配多少浓度的浓缩胶与分离，电泳是的电压以及时间，因为marker上没有这么大的条带，我应该怎么确定我要的条带跑出来了，还有转膜需要多大的电流以及时间。以及其他注意事项

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:15

谢谢老师的解答，
我做的蛋白是36，45，54kd。电泳70V,100V。转印用的200mA，1h。NC膜上能看到marker，但是用丽春红染色却几乎看不到条带。请问是什么原因。一个同学和我一起做的20多的蛋白，用的PVDF膜，能看出条带。

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1、SDS-PAGE跑完后（不转膜），染胶看看蛋白情况
2、PVDF膜活化了吗？
3、转膜：300mA，1h

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:17

请教一下fangweibin119 ，我做WB一抗浓度1:300，二抗是抗兔的，但我不小心错用抗小鼠的二抗1:5000孵育，曝光出来有条带，下面有杂带。
第二次我再做了一次WB，一抗1:500，二抗用抗兔的1:5000，曝光出来却什么都没有。
请问，这是什么原因？
说明两个问题

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1、一抗质量太次（非特异）
2、二抗非特异
3、建议你不加一抗：直接加抗小鼠的二抗曝光

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:18

我做western几个月了，我的一个目的基因去年做出来了，后来抗体用完了，买了另一个批次的抗体，就做不出来了，现在是加完ECL后膜上一片一片的亮光，没有条带，请问各位大侠这是怎么回事啊，试了很久都没试出来呀，着急

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1、相同的抗体？
2、二抗换了吗?

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:18

请教下版主，我马上要做LC3B这个蛋白了，但是以前我在做分子量小于20的蛋白，如活化的Caspase-3，都检测不到蛋白，请问是不是我用的SDS-PAGE有问题？我用的是9%的AB液，29:1配制的。

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分离胶浓度多少？
用12%的就可以
膜用0.22孔径的，最好选择NC膜，PVDF会有些背景

作者: NBA 时间: 2013-3-21 16:19

请问楼主，我最近要做350kda的蛋白质，那需要配多少浓度的浓缩胶与分离，电泳是的电压以及时间，因为marker上没有这么大的条带，我应该怎么确定我要的条带跑出来了，还有转膜需要多大的电流以及时间。以及其他注意事项

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8%分离胶，浓缩胶4%
有200多的marker

作者: 00无名指00 时间: 2013-3-21 16:20

1、SDS-PAGE跑完后（不转膜），染胶看看蛋白情况
2、PVDF膜活化了吗？
3、转膜：300mA，1h

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老师，
1.我染完胶后49kd以上能看到条带，但是很细很细，下面就没有了，只是一个个竖条淡淡的蓝色，是不是蛋白太少了，我测的蛋白浓度0.3-0.5mg/ml，如果是蛋白浓度低该怎么办呢，蛋白浓度多少合适。
2.另外NC膜和PVDF膜那个比较好啊。
3.我用的0.45的膜可以吗。(36,45,54的蛋白)

作者: biabiade 时间: 2013-3-22 10:22

我最近在做WB，但是老是做不好，所以就换一种提蛋白的方法，里面用到了甲酸，所以提出来的蛋白都是酸性的，本来实验室的方法提出的是碱性的，所以用的buffer是溴酚楠，现在变成酸性的，该用什么buffer比较好？

作者: kuaizige 时间: 2013-3-22 10:24

您好！我买的是SANTA的一抗，分子量是58KD，说明书上建议的Western一抗使用比例在1：100~1：1000，从1：200开始。我的实验如下：5%脱脂奶粉常温封闭1h,一抗1：200孵育过夜，TBST洗3次，10min/次，二抗1：4000（中杉）孵育1h，TBST洗3次，10min/次，使用ECL发光剂（A:B=1:1）在成像仪中成像。结果如图：

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作者: kuaizige 时间: 2013-3-22 10:26

（1）存在很多非特异性条带
（2）背景很脏，特别是Marker所在的地方。
第二次实验：延长封闭时间为4h,其它条件未变。结果如下图：

图片附件: 73955272.jpg (2013-3-22 10:26, 4.21 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15300

作者: kuaizige 时间: 2013-3-22 15:41

第三次：封闭过夜，一抗孵24h,其它条件未变。结果如图：

仍然是很多存在很多非特异性条带，并且条带不明显，背景很脏，黑白不均，特别是Marker。
希望能为我指点迷津，实在是没办法啊！

图片附件: 39129530.jpg (2013-3-22 15:41, 11.16 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15320

作者: NBA 时间: 2013-3-22 15:46

老师，
1.我染完胶后49kd以上能看到条带，但是很细很细，下面就没有了，只是一个个竖条淡淡的蓝色，是不是蛋白太少了，我测的蛋白浓度0.3-0.5mg/ml，如果是蛋白浓度低该怎么办呢，蛋白浓度多少合适。
2.另外NC膜和PVDF膜那个比较好啊。
3.我用的0.45的膜可以吗。(36,45,54的蛋白)

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1、可以用0.45um的膜，NC膜方便一些，PVDF膜结合能力强一些，但是需要甲醇活化，两种膜都可以选择
2、蛋白浓度太低
3、样品跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染胶，可以把图放上来我看看

作者: NBA 时间: 2013-3-22 15:46

我最近在做WB，但是老是做不好，所以就换一种提蛋白的方法，里面用到了甲酸，所以提出来的蛋白都是酸性的，本来实验室的方法提出的是碱性的，所以用的buffer是溴酚楠，现在变成酸性的，该用什么buffer比较好？

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这种方法我没试过
请问你从什么样品里面提取什么蛋白？
看看我们做过检测没有

作者: NBA 时间: 2013-3-22 15:47

我买的是SANTA的一抗，分子量是58KD，说明书上建议的Western一抗使用比例在1：100~1：1000，从1：200开始。我的实验如下：5%脱脂奶粉常温封闭1h,一抗1：200孵育过夜，TBST洗3次，10min/次，二抗1：4000（中杉）孵育1h，TBST洗3次，10min/次，使用ECL发光剂（A:B=1:1）在成像仪中成像。结果如图：

（1）存在很多非特异性条带
（2）背景很脏，特别是Marker所在的地方。
第二次实验：延长封闭时间为4h,其它条件未变。结果如下图：

第三次：封闭过夜，一抗孵24h,其它条件未变。结果如图：

仍然是很多存在很多非特异性条带，并且条带不明显，背景很脏，黑白不均，特别是Marker。
希望能为我指点迷津，实在是没办法啊！

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santa的羊多抗？

作者: 831226 时间: 2013-3-22 15:48

santa的羊多抗？

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用的是santa的兔多抗，货号SC-66971.明天想再重复一次，但不知道怎么变条件，等待您的回复哈。

作者: NBA 时间: 2013-3-22 16:13

先调整一下二抗浓度

作者: dog002 时间: 2013-3-22 16:19

先调整一下二抗浓度

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使用的二抗的浓度跟一抗有关吗，是不是一抗不同即使使用同一种二抗，二抗的浓度也会用的不一样？要用您前面提到的点膜实验吗？我们用的二抗是山羊抗兔（中杉金桥），调整二抗浓度是降低浓度还是升高呢？谢谢您的帮助！

作者: ero11 时间: 2013-3-22 16:34

这种方法我没试过
请问你从什么样品里面提取什么蛋白？
看看我们做过检测没有

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我是取得肠子，方法是老板建议的。我前几天跑了下，奇丑无比啊!把marker都带歪了。。。准备再试试其他的方法。谢谢了

作者: dog002 时间: 2013-3-23 09:02

santa的羊多抗？

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因为条带不明显，背景脏，感觉都是非特异性条带，无法辨认哪个是特异性条带。可不可以给我一点详细的建议，很想做出这个实验啊，谢谢哈！

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:04

因为条带不明显，背景脏，感觉都是非特异性条带，无法辨认哪个是特异性条带。可不可以给我一点详细的建议，很想做出这个实验啊，谢谢哈！

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非特异条带不好去除

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-23 09:04

您好，我又两个问题：
1、做WB时蛋白上样量是一致的，但是因为蛋白浓度不一致，所以上样的体积是不一致的，做出的结果有时候连内参都不太一致，如何解决？
2、要做的目的蛋白丰度低，所以想增加上样量，我用15泳道的小梳子，我的蛋白样浓度大约在2.5-3ug/ul左右，感觉最多就能上到80-90ug左右，还有什么办法能增加上样量么？如何提高蛋白样的浓度？减少裂解液的话就怕裂解不充分了啊！

作者: wood533 时间: 2013-3-23 09:18

我的目的蛋白是膜蛋白，分子量是228kd，6%分离胶跑的，湿转膜条件：恒流400mA，时间2.5小时，这个条件可以吗？变性后的蛋白在-20度半年了，内参b-actin能出来，目的条带出不来，不知道什么原因？

作者: hold住 时间: 2013-3-23 09:19

请问楼主，我之前跑电泳的胶用的是1mm的，想换用1.5mm的胶试试，不知道需要作哪些改变，转膜时间需要调整吗？怎么调呢？谢谢楼主！

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:20

您好，我又两个问题：
1、做WB时蛋白上样量是一致的，但是因为蛋白浓度不一致，所以上样的体积是不一致的，做出的结果有时候连内参都不太一致，如何解决？
2、要做的目的蛋白丰度低，所以想增加上样量，我用15泳道的小梳子，我的蛋白样浓度大约在2.5-3ug/ul左右，感觉最多就能上到80-90ug左右，还有什么办法能增加上样量么？如何提高蛋白样的浓度？减少裂解液的话就怕裂解不充分了啊！

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1、把蛋白调整至上样浓度、体积、蛋白量都一致
2、WB上样量20-40ug就足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:24

您好！我做的western的蛋白是170KD，转膜是半干式转膜仪，电压9V，转了2个小时，转完后膜上就有灰色的小块，同时转了两块，另外一块就没有，是糊了还是什么原因？有遇见类似的情况的吗？谢谢了！
超过100KD的蛋白不建议用半干转膜
用湿转

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这个灰色的小块我不太了解

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:31

我的目的蛋白是膜蛋白，分子量是228kd，6%分离胶跑的，湿转膜条件：恒流400mA，时间2.5小时，这个条件可以吗？变性后的蛋白在-20度半年了，内参b-actin能出来，目的条带出不来，不知道什么原因？

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变性后的蛋白在-20度最多3个月

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:34

请问楼主，我之前跑电泳的胶用的是1mm的，想换用1.5mm的胶试试，不知道需要作哪些改变，转膜时间需要调整吗？怎么调呢？谢谢楼主！

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延长转膜时间

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-23 09:39

我还有个问题，就是今天我做的western的结果是一个条带也没出，连内参都没出条带，我把转膜的胶染色了，在胶上有蛋白，但蛋白是分散在泳道两侧和中间的，全部分散开，没有聚集在一起，是浓缩胶的问题吗？我浓缩胶的宽度大约是1cm多点，宽度够吗？您懂的多，能帮我分析下吗？谢谢了！

作者: summerxx 时间: 2013-3-23 09:39

碧云天的10%分离胶，水封见到折线后15分钟灌浓缩胶，一小时后上样，或者制好胶放在四度冰箱第二天早上上样，但是最近很奇怪总是跑出来这种形状，各泳道不直，各孔上样体积也差不多，这是怎么回事呢？着急啊！！！

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作者: S6044 时间: 2013-3-23 09:41

非特异条带不好去除

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但我也没有看到目的条带，这个跟什么有关呢？该怎么处理呢？

作者: flower-201 时间: 2013-3-23 09:41

楼主好，我想问问半干转的以下问题：
（1）恒流和恒压的区别？
（2）恒流过程中电压上升与什么有关？
（3）恒流中电压上升过快或者基本不变（维持在20V以内）说明什么？
（4）恒流中电压的变化对于转膜效率有什么影响？
（5）如何选择最适合自己实验的转膜条件？

作者: flower-201 时间: 2013-3-23 09:41

还有楼主，我想问问为什么我的组织和细胞同时跑电泳，同时转膜，转完后用丽春红染色细胞的条带很清晰而组织的每次都是模糊的一条带呢？是不是组织上样量太多了啊？还有，记得半干转的电压和胶的大小有个公式的，是什么来着？多谢楼主啦~

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:42

碧云天的10%分离胶，水封见到折线后15分钟灌浓缩胶，一小时后上样，或者制好胶放在四度冰箱第二天早上上样，但是最近很奇怪总是跑出来这种形状，各泳道不直，各孔上样体积也差不多，这是怎么回事呢？着急啊！！！

===================================

1、分离胶、浓缩胶界面不平
2、浓缩胶的梳孔不平
3、胶底部，两块胶之间有气泡存在
4、相邻泳道间的上样体积不一致会有影响

作者: NBA 时间: 2013-3-23 09:55

但我也没有看到目的条带，这个跟什么有关呢？该怎么处理呢？

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1、调整稀释度
2、换一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:34

还有楼主，我想问问为什么我的组织和细胞同时跑电泳，同时转膜，转完后用丽春红染色细胞的条带很清晰而组织的每次都是模糊的一条带呢？是不是组织上样量太多了啊？还有，记得半干转的电压和胶的大小有个公式的，是什么来着？多谢楼主啦~

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没有公式
通过自己的几次实验摸索即可

作者: youyou99 时间: 2013-3-23 10:35

楼主好。我是WB新手。现在在做的是HSP（热休克蛋白），22KD：

现在做了两次WB，β-actin的条带倒是很好。可是，目的就是不见出，而且背景很浓，整张膜都在发光，压出片来目的的条带若隐若现，都不能肯定有没有。

我的具体步骤是：
1、电泳，80V，120V；（8%分离胶，胶厚度1.5mm，30ug蛋白上样量，体积20ul左右，5%浓缩胶）
2、湿转：（0.45uPVDF膜）120V，30min，能看到marker转到了膜上，但是颜色很浅；（实验室的条件只能恒压，湿转）
3、5%脱脂奶粉（伊利高钙脱脂）封闭，2h
4、孵育一抗（abcam）：1:1000（抗体说明书推荐浓度），4°C，过夜（大约有16个小时）
5、TBST洗膜：15min×1次，5min×3次
6、二抗（中杉金桥）：1:10000，RT，2h
7、TBST洗膜：15min×1次，5min×3次
8、暗室ECL发光液显色，压片。
（一抗二抗的稀释均使用碧云天的WB一二抗稀释液）
请问我的问题可能在哪里呢？谢谢指教。。。

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作者: youyou99 时间: 2013-3-23 10:39

楼主好，我已经把图片上传了，HSP那张图里面的白色箭头是显影后若隐若现的目的。麻烦指教，谢谢~~

作者: cocacola 时间: 2013-3-23 10:40

没有公式
通过自己的几次实验摸索即可
恩，多谢楼主~
还有一个问题呢楼主？组织的丽春红染色是不是都不如细胞的清晰啊？
上面还有几个问题的哦，关于半干转的~

作者: kulee 时间: 2013-3-23 10:45

1、分离胶、浓缩胶界面不平
2、浓缩胶的梳孔不平
3、胶底部，两块胶之间有气泡存在
4、相邻泳道间的上样体积不一致会有影响

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1、分离胶、浓缩胶界面不平
2、浓缩胶的梳孔不平
基本可以排除，我发现上样的时候有一定的漏液，是不是这个原因导致的呢？还有我发现我制好的胶最底部的玻璃板总有2-3mm的是空的，不知道为什么

作者: tianmei001 时间: 2013-3-23 10:45

非常不好意思
配方是公司的秘密
我也没办法告诉你
可以告诉你一点的就是这个产品很好用
如果你有兴趣我可以告诉是哪个公司的产品
用短消息吧

stripping的时间由产品来决定
一般是37度 30min或者室温 1h以内
good luck

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楼主，我也想知道哪个公司的strip比较好呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:46

楼主好，我已经把图片上传了，HSP那张图里面的白色箭头是显影后若隐若现的目的。麻烦指教，谢谢~~

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HSP这个蛋白相对来说是非常好做的一种蛋白，如同beta-actin
从你现在的结果来看，HSP的是什么来源的，用的什么二抗？

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:46

丽春红染色：组织与细胞是有些区别，但是条带都是很清晰的

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:47

楼主，我也想知道哪个公司的strip比较好呢？
pierce的我用过，还可以

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如果有需要，我自己也有配的，可以给你些试用

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:47

HSP这个蛋白相对来说是非常好做的一种蛋白，如同beta-actin
从你现在的结果来看，HSP的是什么来源的，用的什么二抗？

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HSP是兔来源的，蛋白提取的组织是小鼠的海马，二抗是中杉金桥抗兔的。
您觉得主要还是一抗和二抗的问题是么？

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:48

pierce的我用过，还可以

如果有需要，我自己也有配的，可以给你些试用

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哦，那真是十分感谢了，但是，您怎么给我呢？
我自己也想学着配一点，因为有同学使用了碧云天的洗脱液说效果不好。
如果不涉及私人秘方的话，能不能请您给我一个配方呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-23 10:48

哦，那真是十分感谢了，但是，您怎么给我呢？
我自己也想学着配一点，因为有同学使用了碧云天的洗脱液说效果不好。
如果不涉及私人秘方的话，能不能请您给我一个配方呢？

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呵呵
配方不适合，保密的

HSP做的是哪一种？从内参来看实验过程及样品没问题

作者: tianmei001 时间: 2013-3-23 10:54

呵呵
配方不适合，保密的
HSP做的是哪一种？从内参来看实验过程及样品没问题
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HSP是兔来源的多抗，蛋白提取的组织是小鼠的海马，二抗是中杉金桥抗兔的。
您觉得主要还是一抗和二抗的问题是么？

[ 本帖最后由 tianmei001 于 2013-3-25 14:35 编辑 ]

作者: kulee 时间: 2013-3-25 14:36

wb大师，我最近做erk，用1:10的裂解液提蛋白（匀浆机），加样15ul每孔，mark5ul，采用80v跑胶3h, 80v恒压转NC膜2.5h,百分之十封闭液封闭2小时，内参为GAPDH，用封闭液稀释，一抗为p-erk,用BSA稀释，都是1:1000，过夜。二抗1:1000孵育2。5小时。每次都是3*15min洗膜。第一次用低敏ECL，膜都好似整张发光，内参的曝光后一团黑，erk非常弱，改用高敏erk条带还是很弱，杂带明显，有些泳道没显出。
第二次做，延长封闭时间4h和洗膜时间3*18min。低敏ECL和第一次一样膜发光，但曝光内参基本显出，erk曝光一点反应都没有，改用高敏条带没有，只有两三点。看不出条带。
可能是组织用匀浆机提的蛋白损坏了？
二抗稀释溶度不对？但是同学以前也是这样做的都做出来了
望指点！非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-25 14:53

HSP是兔来源的多抗，蛋白提取的组织是小鼠的海马，二抗是中杉金桥抗兔的。
您觉得主要还是一抗和二抗的问题是么？

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HSP一抗的货号，厂家等信息给一下吧

作者: NBA 时间: 2013-3-25 14:55

我最近做erk，用1:10的裂解液提蛋白（匀浆机），加样15ul每孔，mark5ul，采用80v跑胶3h, 80v恒压转NC膜2.5h,百分之十封闭液封闭2小时，内参为GAPDH，用封闭液稀释，一抗为p-erk,用BSA稀释，都是1:1000，过夜。二抗1:1000孵育2。5小时。每次都是3*15min洗膜。第一次用低敏ECL，膜都好似整张发光，内参的曝光后一团黑，erk非常弱，改用高敏erk条带还是很弱，杂带明显，有些泳道没显出。
第二次做，延长封闭时间4h和洗膜时间3*18min。低敏ECL和第一次一样膜发光，但曝光内参基本显出，erk曝光一点反应都没有，改用高敏条带没有，只有两三点。看不出条带。
可能是组织用匀浆机提的蛋白损坏了？
二抗稀释溶度不对？但是同学以前也是这样做的都做出来了
望指点！非常感谢！

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1、样品定量浓度多少？
2、每孔加样15ul的话，有没有考染过胶？
3、转膜后丽春红染色了吗？
4、ERK如同内参，非常好出结果
5、匀浆的时候在冰水浴中进行
6、高敏的ecl是Pierce（Thermo）的？

作者: loli 时间: 2013-3-25 14:56

楼主您好我初接触WB 还没有实验经历有些问题想向您请教一下

具体是这样的我要检测的是多组分的纤维素酶

1、一抗的选择是怎么样的呢是不是有广谱性的抗体？有哪些呢？适用范围？

2、该酶是多组分酶有没有针对各个酶蛋白组分的一抗呢？

3、一抗确定后二抗是不是也就确定了？

4、关于WB的实验周期问题一轮大概要多久呢？

暂时就想到这么多因为没做呢吧呵呵有点咋也有点乱应该都是非常菜鸟的问题吧

请楼主指点指点谢谢啦

作者: mickeylin 时间: 2013-3-25 15:03

HSP一抗的货号，厂家等信息给一下吧

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哦，好的。是abcam ,ab79784
而且，做组化用的稀释度比WB的还高些，但是能做出阳性结果。
是不是能用于WB的抗体就能做组化，而组化能做出来结果的抗体不一定能用于WB呢？

作者: mickeylin 时间: 2013-3-25 15:04

楼主你好，我现在做一个53KD的蛋白，用12%的分离胶，电泳80mV,120mV,转膜120mA，2个半小时，10%脱脂奶粉封闭过夜，一抗用2%脱脂奶粉3小时，二抗1.5小时，dab显色没有出条带，内参出了，重复四次没有结果，要崩溃了。以前做出过结果，除了蛋白是新提的，电泳液可能一个月了，转膜液用了四五次了，其余没什么改变，原因可能是这些么？这次提蛋白，是贴壁细胞，先用PBS洗三遍，再用细胞裂解液加PMSF一共1ML，离心取的上清，然后测的浓度是19mg/ml，蛋白提取有问题吗？

作者: 987789 时间: 2013-3-25 15:04

1、样品定量浓度多少？
2、每孔加样15ul的话，有没有考染过胶？
3、转膜后丽春红染色了吗？
4、ERK如同内参，非常好出结果
5、匀浆的时候在冰水浴中进行
6、高敏的ecl是Pierce（Thermo）的？

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差不多80-90ug每孔吧，没考过胶，没立春红染膜，提单白不是在冰上进行，不过提完后后马上放冰上，高敏ECL是康为的，目前做改善，在做试验摸清楚原因再看看，谢谢斑竹。

作者: moonlight45 时间: 2013-3-25 15:21

老师向您请教一个关于电泳上样量的问题。根据上次的显影结果能不能重新调整个泳道上样量，为什么？谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:14

楼主您好我初接触WB 还没有实验经历有些问题想向您请教一下

具体是这样的我要检测的是多组分的纤维素酶

1、一抗的选择是怎么样的呢是不是有广谱性的抗体？有哪些呢？适用范围？

2、该酶是多组分酶有没有针对各个酶蛋白组分的一抗呢？

3、一抗确定后二抗是不是也就确定了？

4、关于WB的实验周期问题一轮大概要多久呢？

暂时就想到这么多因为没做呢吧呵呵有点咋也有点乱应该都是非常菜鸟的问题吧

请楼主指点指点谢谢啦

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1、一抗多查一些抗体公司做对比，多看文献。
2、有没有针对性的一抗需要查
3、二抗的话相对简单，只要对上种属、酶标记等就可以
4、如果做WB很熟练的话，进行检测是2天一个周期。提蛋白及蛋白变性处理等一般是一天。

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:15

哦，好的。是abcam ,ab79784
而且，做组化用的稀释度比WB的还高些，但是能做出阳性结果。
是不是能用于WB的抗体就能做组化，而组化能做出来结果的抗体不一定能用于WB呢？

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1、这支抗体写着可以进行WB检测
2、组化的稀释度比WB还高些，有点不可思议

重复实验了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:15

楼主你好，我现在做一个53KD的蛋白，用12%的分离胶，电泳80mV,120mV,转膜120mA，2个半小时，10%脱脂奶粉封闭过夜，一抗用2%脱脂奶粉3小时，二抗1.5小时，dab显色没有出条带，内参出了，重复四次没有结果，要崩溃了。以前做出过结果，除了蛋白是新提的，电泳液可能一个月了，转膜液用了四五次了，其余没什么改变，原因可能是这些么？这次提蛋白，是贴壁细胞，先用PBS洗三遍，再用细胞裂解液加PMSF一共1ML，离心取的上清，然后测的浓度是19mg/ml，蛋白提取有问题吗？

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细胞蛋白有19mg/ml啊？这么高！
转膜液用的次数太过了些，2次就可以换了。电泳液用新的
提取的过程没问题

一抗是那个公司的？货号多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:17

差不多80-90ug每孔吧，没考过胶，没立春红染膜，提单白不是在冰上进行，不过提完后后马上放冰上，高敏ECL是康为的，目前做改善，在做试验摸清楚原因再看看，谢谢斑竹。

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把ECL换掉
康为的ECL我很清楚，我以前就是康为的蛋白主管，都是我配的
一年前我已离职。ECL不怎么样

把胶考染与膜丽春红染色都做起来

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:17

老师向您请教一个关于电泳上样量的问题。根据上次的显影结果能不能重新调整个泳道上样量，为什么？谢谢。

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可以调整啊

目前的研究都认为：内参的表达量是基本不变的
呵呵

作者: JK.jon 时间: 2013-3-25 16:23

细胞蛋白有19mg/ml啊？这么高！
转膜液用的次数太过了些，2次就可以换了。电泳液用新的
提取的过程没问题

一抗是那个公司的？货号多少？

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我分析来分析去就是觉得是提蛋白的问题，可是又说不出哪里有问题，19肯定是总蛋白吧！我需要的蛋白不知道有多少啊，但是按道理以前做出来过啊。现在的细胞代数在20代以内，以前做出来那次都快接近40代了，是HCT116细胞。
用的抗体是中杉分装的santa的货号是ZS-7974，还做过一个abcam公司的，也没出结果。

作者: greenbee 时间: 2013-3-25 16:23

您好，我是新手，问个超级弱的问题，大牛不要介意哈。
测完蛋白的OD值后，如后用机器算出加样量，如何用笔算算出加样量？需要细节公式，和推算。万谢！！

作者: JK.jon 时间: 2013-3-25 16:35

还有一个问题，每次考马斯亮蓝染色，感觉分子量大的比较清楚，分子量小的比较模糊，看不清楚条带，但是也能感觉到有蛋白，我是需要提高胶浓度还是其他的原因呢？
我现在用的SDS-PAGE凝胶试剂盒是碧云天的，已经用完了，对于这种试剂盒的牌子，楼主有好的建议吗？还有丽春红染色液和marker，marker彩色的和普通的有区别吗？

作者: any333 时间: 2013-3-25 16:37

17kd用什么mark呢，我们用的formentas的，但是跑不出来17，我用百分之12的分离胶胶，百分之4压缩胶

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:38

我分析来分析去就是觉得是提蛋白的问题，可是又说不出哪里有问题，19肯定是总蛋白吧！我需要的蛋白不知道有多少啊，但是按道理以前做出来过啊。现在的细胞代数在20代以内，以前做出来那次都快接近40代了，是HCT116细胞。
用的抗体是中杉分装的santa的货号是ZS-7974，还做过一个abcam公司的，也没出结果。

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样品处理好后跑SDS-PAGE，染色，把胶扫描或者照相放上来

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:39

17kd用什么mark呢，我们用的formentas的，但是跑不出来17，我用百分之12的分离胶胶，百分之4压缩胶

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fermentas的就可以啊

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-25 16:39

请问怎么鉴定一抗行不行呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 16:42

请问怎么鉴定一抗行不行呢？

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进行预实验检测啊

作者: DNA 时间: 2013-3-25 16:43

请问老师，我做的WB显影后目的条带位置蛋白量很少，有很明显的拖尾，电泳时就能看到加样孔里有一些浅黄色的絮状物质，很像脂质，影响溴酚蓝的电泳，第一阶段电泳结束时无法跑成一条窄线。请问这是什么缘故呢？

作者: ending 时间: 2013-3-25 16:44

请问楼主，我最近要做110KDa的蛋白质，那需要配多少浓度的浓缩胶与分离胶呢？

作者: JK.jon 时间: 2013-3-25 16:44

谢谢，再请问楼主，不是有一种方法把一抗和二抗直接滴到膜上来检测抗体的吗？请问这种方法具体要怎么做呢？

作者: zranqi_1 时间: 2013-3-25 16:55

版主，你好。我的待测蛋白是snail，CST公司的一抗，分子量是29kDa，跑了好几次western，这个snail蛋白就是不显示条带，好郁闷。
我是条件：下层胶是12%，上层胶是5%，溶液都是新鲜配制的。加样量为每孔20μg，蛋白样品是人肝癌细胞HepG2细胞。恒压70V跑电泳，一直跑到底，大约180min。转膜是恒流330mA，100min。用5%脱脂牛奶封闭1h，snail一抗浓度是1:500，4℃摇床过夜。荧光兔二抗浓度是1:5000，洗膜是用PBST，每次10min，洗3次。最后显影。

我还测试一个蛋白Vimentin，也是CST公司的一抗，分子量是57kDa，同样条件下这个蛋白就有条带的。请版主指点，snail蛋白条带就是没有，这是什么原因呢？谢谢。

作者: 33号 时间: 2013-3-25 17:02

请问下目的蛋白是细胞核,线粒体蛋白 ,内参可以用actin 吗?还是需要用到其他的内参. 我的目的蛋白是DJ-1蛋白 21kd.

作者: dog002 时间: 2013-3-25 17:06

做enos和 p-enos。用碧云天配胶试剂盒，胶浓度为说明书推荐的6%，
转膜液用一到两次，测转膜液ph值8.3，其中含0.1%sds、10%甲醇。
转膜用恒流350mA，2.5小时。
今天转膜后膜上可见marker72、95KD，marker130、170KD未见，两张膜用丽春红染色后空白。

昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两种丽春红染色空白。
请问膜空白的可能原因。谢谢！！

作者: 831226 时间: 2013-3-25 17:06

请问老师，我做的WB显影后目的条带位置蛋白量很少，有很明显的拖尾，电泳时就能看到加样孔里有一些浅黄色的絮状物质，很像脂质，影响溴酚蓝的电泳，第一阶段电泳结束时无法跑成一条窄线。请问这是什么缘故呢？

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1、是什么样品？组织还是细胞？提取蛋白的时候在最上面是否有油脂？
2、可能上样量有点大

作者: 831226 时间: 2013-3-25 17:07

请问楼主，我最近要做110KDa的蛋白质，那需要配多少浓度的浓缩胶与分离胶呢？

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10%分离胶
4% or 5%浓缩胶均可

作者: 831226 时间: 2013-3-25 17:08

谢谢，再请问楼主，不是有一种方法把一抗和二抗直接滴到膜上来检测抗体的吗？请问这种方法具体要怎么做呢？

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这种方法没试过
你是想检测一抗还是二抗？

作者: 831226 时间: 2013-3-25 17:08

版主，你好。我的待测蛋白是snail，CST公司的一抗，分子量是29kDa，跑了好几次western，这个snail蛋白就是不显示条带，好郁闷。
我是条件：下层胶是12%，上层胶是5%，溶液都是新鲜配制的。加样量为每孔20μg，蛋白样品是人肝癌细胞HepG2细胞。恒压70V跑电泳，一直跑到底，大约180min。转膜是恒流330mA，100min。用5%脱脂牛奶封闭1h，snail一抗浓度是1:500，4℃摇床过夜。荧光兔二抗浓度是1:5000，洗膜是用PBST，每次10min，洗3次。最后显影。

我还测试一个蛋白Vimentin，也是CST公司的一抗，分子量是57kDa，同样条件下这个蛋白就有条带的。请版主指点，snail蛋白条带就是没有，这是什么原因呢？谢谢。

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用BSA封闭及稀释一抗试试

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:08

版主，你好。我的待测蛋白是snail，CST公司的一抗，分子量是29kDa，跑了好几次western，这个snail蛋白就是不显示条带，好郁闷。
我是条件：下层胶是12%，上层胶是5%，溶液都是新鲜配制的。加样量为每孔20μg，蛋白样品是人肝癌细胞HepG2细胞。恒压70V跑电泳，一直跑到底，大约180min。转膜是恒流330mA，100min。用5%脱脂牛奶封闭1h，snail一抗浓度是1:500，4℃摇床过夜。荧光兔二抗浓度是1:5000，洗膜是用PBST，每次10min，洗3次。最后显影。

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我还测试一个蛋白Vimentin，也是CST公司的一抗，分子量是57kDa，同样条件下这个蛋白就有条带的。请版主指点，snail蛋白条带就是没有，这是什么原因呢？谢谢。
用BSA封闭及稀释一抗试试

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:09

请问下目的蛋白是细胞核,线粒体蛋白 ,内参可以用actin 吗?还是需要用到其他的内参. 我的目的蛋白是DJ-1蛋白 21kd.

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可以用actin

提取的是总蛋白进行检测吗/

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:09

做enos和 p-enos。用碧云天配胶试剂盒，胶浓度为说明书推荐的6%，
转膜液用一到两次，测转膜液ph值8.3，其中含0.1%sds、10%甲醇。
转膜用恒流350mA，2.5小时。
今天转膜后膜上可见marker72、95KD，marker130、170KD未见，两张膜用丽春红染色后空白。

昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两种丽春红染色空白。
请问膜空白的可能原因。谢谢！！

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是整块胶转膜的吗？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-25 17:10

做enos和 p-enos。用碧云天配胶试剂盒，胶浓度为说明书推荐的6%，
转膜液用一到两次，测转膜液ph值8.3，其中含0.1%sds、10%甲醇。
转膜用恒流350mA，2.5小时。
今天转膜后膜上可见marker72、95KD，marker130、170KD未见，两张膜用丽春红染色后空白。

昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两种丽春红染色空白。
请问膜空白的可能原因。谢谢！！

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是整块胶转膜的吗？

不是整块胶转膜，是从电泳胶上切下包括目的蛋白的一小块胶转的膜。（昨天转膜用恒流300mA，2.5小时，四张膜一张可见170KD、一张在140KD处可见清晰p-enos（曝光后），其余两张丽春红染色空白。其中这四张小膜是从两块电泳胶上切下来的，一块转的膜）。谢谢！！

作者: summerxx 时间: 2013-3-25 17:10

你好，版主，我需要检测的是一抗。以前师姐有买过这个一抗，但是我做不出来就有买了另一家公司的相同的抗体，但是还是做不出来，我想是不是这个一抗的问题呢，所以想检测一下这个新买的一抗，请问有什么好方法吗？

作者: bling 时间: 2013-3-25 17:11

用BSA封闭及稀释一抗试试

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版主，我想问一下BSA跟脱脂奶粉封闭或孵一抗有什么不同吗？

作者: ffooll 时间: 2013-3-25 17:11

提取的是总蛋白进行检测吗/

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谢谢阿. 我提的是细胞核浆蛋白,和线粒体蛋白. actin 是也在细胞核与线粒体里面表达吗?

作者: ukonptp 时间: 2013-3-25 17:12

ERK检测完成后用stripping buffer洗去一抗与二抗
然后封闭
再用beta-actin来孵育
很好的

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最近做western发现小分子量的蛋白的第一次曝的时候还有，用一抗二抗去除液之后就曝不出来了····不知道是不是蛋白被洗掉了，用丽春红染色膜上看不到条带

作者: vera+ 时间: 2013-3-25 17:12

我想问下为什么电泳后胶上的MARK 成斜的了，不在水平线上

作者: yapuyapu 时间: 2013-3-25 17:13

楼主，你好，我的蛋白分子量分别是21,35kd，电泳80v，100v，转膜120mA，70min，但显影后什么都没出，不过内参做出来很漂亮，不懂怎么回事，请指教，谢谢。。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:13

你好，版主，我需要检测的是一抗。以前师姐有买过这个一抗，但是我做不出来就有买了另一家公司的相同的抗体，但是还是做不出来，我想是不是这个一抗的问题呢，所以想检测一下这个新买的一抗，请问有什么好方法吗？

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检测什么蛋白？
内参做的怎样？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:13

谢谢阿. 我提的是细胞核浆蛋白,和线粒体蛋白. actin 是也在细胞核与线粒体里面表达吗?

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检测核、浆蛋白的时候用actin做内参的文献我看过

线粒体蛋白是否用actin我不清楚

如果提取全蛋白进行检测的话，actin是可以用的

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:14

楼主，你好，我的蛋白分子量分别是21,35kd，电泳80v，100v，转膜120mA，70min，但显影后什么都没出，不过内参做出来很漂亮，不懂怎么回事，请指教，谢谢。。。。

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什么蛋白？

作者: kswl870 时间: 2013-3-25 17:15

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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楼主你好。我做WB也有几个月了，是我师姐没做出来遗留给我的，蛋白分子量是84KD的，文献上说也有110多，90多。60多，50多KD的前体蛋白及裂解蛋白，但主带应是84左右。先用RD公司的，做的是肺癌组织，没有结果，
后换成santa的，在55KD左右显示清晰条带，反复做几组蛋白，都是在55KD左右，而且癌组织和配对的正常肺组织之间没有趋势，甚至正常组织表达高于癌组织，这与预期结果完全相反。
条件：8-10%的浓缩胶，4%分离胶，电泳恒压80伏，至浓缩胶后改为105伏左右，转膜条件为55伏-60伏，2小时，5%脱脂奶粉封闭1小时，一抗4度过夜，1:500-1000，二抗室温2小时，1:5000-10000，ECL显像，所有中间步骤都是TBST洗10min,3次。
santa说明书上印着很清楚的带，84KD,是用hela细胞做的，后找来hela细胞做，始终不出结果，看到有人用胰腺癌细胞做过，显出110、84、55等多条条带，也用的同一种抗体，所以也找来胰腺癌细胞做，但是仍然没有结果。
后来又换成sigma抗体，新的发光液，条件同上，结果差不多也在55KD 左右，sigma的说明书上也说主带在84，有110多的，也可降解为50KD 及30多KD左右的。现在迷茫了，不知道问题出来哪里，这个始终出来的50-55KD蛋白是什么？是不是降解的目的蛋白？要是是的话为什么总是正常组织高于癌组织？为什么细胞总是做不出结果？这个问题怎么解决？
整个过程中，做内参GAPDH总能恒定的出结果。
期待答复，谢谢

图片附件: 47822762.jpg (2013-3-25 17:15, 55.84 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15328

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:15

QUOTE:

原帖由 kswl870 于 2013-3-25 17:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

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组织来源是人的？
如果是人来源的组织，容易在55K处有非特异性，且特别清晰的条带
需要注意二抗

作者: ffooll 时间: 2013-3-25 17:16

什么蛋白？

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楼主你好，我的蛋白时smac 21kd 和caspase-3 35kd，转膜120ma 70min ，用丽春红染色后，发现21kd出没有蛋白，但17以下有蛋白出现，不懂怎么回事。谢谢指导。。。。

作者: zranqi_1 时间: 2013-3-25 17:17

组织来源是人的？
如果是人来源的组织，容易在55K处有非特异性，且特别清晰的条带
需要注意二抗

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版主您好，是人来源的组织，可是别人做的人来源组织也没有见到如此规律的非特异性带啊？
如果这个是非特异性条带，我该怎么注意二抗？我的实验步骤中哪些是需要改进的？

急求，麻烦版主能给些详细的指导

作者: INK 时间: 2013-3-25 17:17

老师您好，看了您给别人的解答获益良深，我最近遇到一个问题，就是我配的8%的胶跑出来就像是10%的胶，另外我电泳的时候，溴酚蓝经常晕开很宽的样子，而不是以前很细的一条，配胶的东西都试过了没问题。请问还可能是什么问题。急求！！！！

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:18

楼主你好，我的蛋白时smac 21kd 和caspase-3 35kd，转膜120ma 70min ，用丽春红染色后，发现21kd出没有蛋白，但17以下有蛋白出现，不懂怎么回事。谢谢指导。。。。

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丽春红染色只是一种看转膜效果如何的方法
不能说：发现21kd出没有蛋白，但17以下有蛋白出现，那么21K就没有蛋白
最终需要用抗体来进行免疫反应确定

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:18

版主您好，是人来源的组织，可是别人做的人来源组织也没有见到如此规律的非特异性带啊？
如果这个是非特异性条带，我该怎么注意二抗？我的实验步骤中哪些是需要改进的？

急求，麻烦版主能给些详细的指导

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二抗选择用人IgG吸收后（与人基本无交叉的）

我也碰到过这样的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:18

老师您好，看了您给别人的解答获益良深，我最近遇到一个问题，就是我配的8%的胶跑出来就像是10%的胶，另外我电泳的时候，溴酚蓝经常晕开很宽的样子，而不是以前很细的一条，配胶的东西都试过了没问题。请问还可能是什么问题。急求！！！！

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检查配胶缓冲液的pH

作者: hyuu 时间: 2013-3-25 17:20

楼主您好，刚刚接触WB，请教一个比较初级的问题，上样的时候要求样品同体积，那么marker呢，是否也要同样体积？比如说我上样量40ul，marker10ul，是否还需要用PSMF补充到40ul呢，还是就用10ul。如果体积与样品不同是否会影响预染marker的条带？先谢过

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:21

楼主您好，刚刚接触WB，请教一个比较初级的问题，上样的时候要求样品同体积，那么marker呢，是否也要同样体积？比如说我上样量40ul，marker10ul，是否还需要用PSMF补充到40ul呢，还是就用10ul。如果体积与样品不同是否会影响预染marker的条带？先谢过

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marker一般不用等体积上

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-25 17:21

老师您好！我最近在摸索CASP3这个蛋白WB的条件。不知道多大浓度的分离胶比较合适呢？我用13%和13.5%的分离胶做出来条带都是连成一条线的，电泳条件是恒流9mA,1h，这是否与浓缩胶高度有关？我们的浓缩胶1.7cm.

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:23

老师您好！我最近在摸索CASP3这个蛋白WB的条件。不知道多大浓度的分离胶比较合适呢？我用13%和13.5%的分离胶做出来条带都是连成一条线的，电泳条件是恒流9mA,1h，这是否与浓缩胶高度有关？我们的浓缩胶1.7cm.

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蛋白上样量多少？
应该是上样量太大的问题

作者: 00无名指00 时间: 2013-3-25 17:24

蛋白上样量多少？
应该是上样量太大的问题

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是用阿霉素处理24h的293T细胞，上了一个15,25,35ug的梯度。有时做的beta-actin上5ug细胞蛋白都会有点连起来的样子。除了上样量的原因还可能是什么原因？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:24

是用阿霉素处理24h的293T细胞，上了一个15,25,35ug的梯度。有时做的beta-actin上5ug细胞蛋白都会有点连起来的样子。除了上样量的原因还可能是什么原因？

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请把样品跑一个SDS-PAGE，考染后挂上图来

作者: wood533 时间: 2013-3-25 17:25

用BSA封闭及稀释一抗试试

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谢谢楼主的指点。我还有一个问题，我想做135kD大小的E-cadherin蛋白，请问上层胶下层胶的浓度，跑电泳的条件，和转膜的条件分别是什么？有什么需要注意的东西吗?

作者: one 时间: 2013-3-25 17:26

版主你好！我想问一下

1.内参B-actin，43kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
2.tlr3,117kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
3.两个蛋白能否一起转，时间是多少?
谢谢版主

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:29

谢谢楼主的指点。我还有一个问题，我想做135kD大小的E-cadherin蛋白，请问上层胶下层胶的浓度，跑电泳的条件，和转膜的条件分别是什么？有什么需要注意的东西吗?

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浓缩胶：5%
分离胶：10%
转膜：恒流，300mA ，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:31

版主你好！我想问一下

1.内参B-actin，43kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
2.tlr3,117kd，80V恒压转膜应该转多少时间，期间电流应该保证多大？
3.两个蛋白能否一起转，时间是多少?
谢谢版主

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1、300mA 恒流，40min
2、300mA 恒流，2h
不建议一起转

作者: 831226 时间: 2013-3-25 17:31

版主你好
我的分子原来用SANTA CRUZ的抗体做做出来了但是条带不好好几个条带粘一块不好分析
然后我换成了ABCOM的新抗体
新抗体用点杂做出了黑点应该证明我的抗体是好的
但是用WESTERN BLOT就是做不出条带
ABCOM的新抗体是只能做WB的单克隆抗体推荐比例是1:10000-1:50000
我试了1:5000 10000 20000 40000 点杂都可以做出来
但是WB都做不出来
急死了
我下一步到底该怎么办
快急哭了

作者: 小糖块 时间: 2013-3-25 17:33

楼主，你好
我最近买了一个抗体是ELISA单克隆的，应用里面只写了ELISA，现在我想知道能不能用它来做WB？
谢谢~~~

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:35

版主你好
我的分子原来用SANTA CRUZ的抗体做做出来了但是条带不好好几个条带粘一块不好分析
然后我换成了ABCOM的新抗体
新抗体用点杂做出了黑点应该证明我的抗体是好的
但是用WESTERN BLOT就是做不出条带
ABCOM的新抗体是只能做WB的单克隆抗体推荐比例是1:10000-1:50000
我试了1:5000 10000 20000 40000 点杂都可以做出来
但是WB都做不出来
急死了
我下一步到底该怎么办
快急哭了

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内参呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-25 17:35

楼主，你好
我最近买了一个抗体是ELISA单克隆的，应用里面只写了ELISA，现在我想知道能不能用它来做WB？
谢谢~~~

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可以试试

作者: u234 时间: 2013-3-26 09:43

内参呢？

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我们实验室的内参只有GAPDH 但是我的分子和GAPDH很近所以没有做内参

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:44

我们实验室的内参只有GAPDH 但是我的分子和GAPDH很近所以没有做内参

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用内参先摸索好条件

作者: nut6694 时间: 2013-3-26 09:46

楼主，想请问下不同组织提取的蛋白做actin，大小会不一样吗？

作者: ending 时间: 2013-3-26 09:46

您好，我用小鼠的脾淋巴细胞做磷酸化WB，分离细胞完成后分别刺激0,10,20,30,60min和6h，到时间后就收集细胞于冰上预冷的EP管，3000rpm/5min后弃上清，没洗涤，直接涡旋后加裂解液（已加入蛋白酶磷酸酶抑制剂，是根据园子里那个很火的磷酸化WB帖子上的配方），大约5*106个细胞加50ul。冰上作用30min，12000rpm/15min，取上清+1/4体积5*SDS-buffer，100‘C/5min，常规WB步骤，其余样本冻存-80。
因为之前普通WB已经做的比较熟练，也挺有信心，刚开始磷酸化WB，比较担心样本收集的问题。目前已经做了三四次，收集样本也重复了两次，但是都没有做出条带。我要做的是p-p38和p-JNK以及总蛋白，但是曝光出来一片空白。前两次的那批样本做的还有点高背景，p-p38出现了非常细的条带，我觉得不可用，感觉是不是样本收集时细胞量太少，于是又重新收集的样本，结果这次直接什么都没有。我提蛋白之后未定量，但是这次用的1*10 7个细胞，加150ul裂解液，作用后离心后发现管底有很大一团细胞沉淀，难道裂解的非常不充分吗？因为细胞量太大了？
之前普通WB都是用5*10 6个细胞，加50ul裂解液，没有问题的。这次怎么会一片空白什么都没有啊，非常想知道到底怎么解决。不尽感激~

作者: ending 时间: 2013-3-26 09:47

离心都是用的4度离心机，操作也是在冰上的

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-26 09:48

老师您好，请问我用公司的浆-核蛋白提取试剂盒做核蛋白NF-kB p65表达（我做的是腹腔脏器肾脏、肾上腺等器官），
1）文献中有的用的是actin做内参不正确吧？那么应该用lamin还是Histone呢？
2）lamin有A/B/C，Histone也有H1/2/3/4。那么，我该怎么选择呢？
急盼回复，十分感谢！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-26 09:49

用内参先摸索好条件

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我之前内参一直做得可以的
还要用内参摸什么条件呢

作者: DONT 时间: 2013-3-26 09:49

最近做perk，总是做不出来，或者背景深条带浅，但是总蛋白做的很好，有些疑问：
1、蛋白裂解后要马上变性吗？我因为BCA法测总蛋白，配平总蛋白需要时间，不能马上变性。
2、变性后不要室温冷却而是直接放冰箱吗？我们实验室好像都是室温冷却再放-20.
3、封闭用10%的脱脂牛奶有问题吗？网上都说用5%的
4、二抗用5%牛奶稀释，还是5%BSA,还是TBST?
5‘条带不明显是抗体（CST）原因还是蛋白不够多呀（加样总蛋白估计有60ug）？
急求楼主回答，我现在做了不下七次了，劳心劳力，很纠结。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:49

楼主，想请问下不同组织提取的蛋白做actin，大小会不一样吗？

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相同种属的大小应该是一致的
不同种属大小事不同的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:50

您好，我用小鼠的脾淋巴细胞做磷酸化WB，分离细胞完成后分别刺激0,10,20,30,60min和6h，到时间后就收集细胞于冰上预冷的EP管，3000rpm/5min后弃上清，没洗涤，直接涡旋后加裂解液（已加入蛋白酶磷酸酶抑制剂，是根据园子里那个很火的磷酸化WB帖子上的配方），大约5*106个细胞加50ul。冰上作用30min，12000rpm/15min，取上清+1/4体积5*SDS-buffer，100‘C/5min，常规WB步骤，其余样本冻存-80。
因为之前普通WB已经做的比较熟练，也挺有信心，刚开始磷酸化WB，比较担心样本收集的问题。目前已经做了三四次，收集样本也重复了两次，但是都没有做出条带。我要做的是p-p38和p-JNK以及总蛋白，但是曝光出来一片空白。前两次的那批样本做的还有点高背景，p-p38出现了非常细的条带，我觉得不可用，感觉是不是样本收集时细胞量太少，于是又重新收集的样本，结果这次直接什么都没有。我提蛋白之后未定量，但是这次用的1*10 7个细胞，加150ul裂解液，作用后离心后发现管底有很大一团细胞沉淀，难道裂解的非常不充分吗？因为细胞量太大了？
之前普通WB都是用5*10 6个细胞，加50ul裂解液，没有问题的。这次怎么会一片空白什么都没有啊，非常想知道到底怎么解决。不尽感激~

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一抗哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:50

老师您好，请问我用公司的浆-核蛋白提取试剂盒做核蛋白NF-kB p65表达（我做的是腹腔脏器肾脏、肾上腺等器官），
1）文献中有的用的是actin做内参不正确吧？那么应该用lamin还是Histone呢？
2）lamin有A/B/C，Histone也有H1/2/3/4。那么，我该怎么选择呢？
急盼回复，十分感谢！

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你说的lamin B，histone都可以作为核内参

actin也有做核内参的文献

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:52

suiyuanjiuzhu wrote:
我之前内参一直做得可以的
还要用内参摸什么条件呢

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稳定WB系统

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:52

最近做perk，总是做不出来，或者背景深条带浅，但是总蛋白做的很好，有些疑问：
1、蛋白裂解后要马上变性吗？我因为BCA法测总蛋白，配平总蛋白需要时间，不能马上变性。
2、变性后不要室温冷却而是直接放冰箱吗？我们实验室好像都是室温冷却再放-20.
3、封闭用10%的脱脂牛奶有问题吗？网上都说用5%的
4、二抗用5%牛奶稀释，还是5%BSA,还是TBST?
5‘条带不明显是抗体（CST）原因还是蛋白不够多呀（加样总蛋白估计有60ug）？
急求楼主回答，我现在做了不下七次了，劳心劳力，很纠结。

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封闭、稀释一抗用3%BSA-TBST
二抗5%奶粉-TBST

perk做起来如同marker一样好做

作者: tuuu2 时间: 2013-3-26 09:53

楼主，为何我最近做的指标条带都出现在55KD以下一点的地方，特异性强，不同的指标位置是一样的，如果认为是目的条带的话就和指标大小差多啦。这是什么原因呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 09:53

楼主，为何我最近做的指标条带都出现在55KD以下一点的地方，特异性强，不同的指标位置是一样的，如果认为是目的条带的话就和指标大小差多啦。这是什么原因呢？

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样品来源是什么？
一抗货号，公司
二抗货号，公司

作者: one 时间: 2013-3-26 09:54

样品是人肾脏。一抗有abcam的，也有axxora的，二抗是bioworld

作者: tuuu2 时间: 2013-3-26 10:05

你说的lamin B，histone都可以作为核内参

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actin也有做核内参的文献
版内不是有很多帖子说实际上用actin做核蛋白内参是不准确的吗？
Histone不是有很多型吗？用Histone H1、Histone H2、Histone H3 or Histone H4呢？
Histone系列相对lamin系列，更难做出来些吗？
可否推荐什么公司的一抗比较好的？我做的是大鼠。

作者: 831226 时间: 2013-3-26 10:06

一抗巴傲德的。跟卖试剂的挺熟，她说这个用着挺好，就买了。进口的用不起。
我昨天又把那两条膜洗脱之后一条孵育了巴傲德的JNK总蛋白抗体，另一条孵育了actin，想看看巴傲德的一抗有没有问题，还有我的蛋白量够不够。结果今天曝光时actin那个亮啊~JNK总蛋白也曝出来来，虽然不是很好看，但起码有条带，我还没有仔细比对marker，但是这个一抗应该是没有问题吧，背景也挺干净的。现在就是特别困惑为什么磷酸化的蛋白就是死活曝不出来。。难道压根就没有磷酸化的蛋白？可我看别人文献上相同的东西刺激，就是细胞不同，刺激浓度也跟我一样，时间点也一样，怎么回事呢到底。。我是不是应该找个阳参做做看。。

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-26 10:07

稳定WB系统

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内参和原来的抗体依旧可以做出来

作者: zzzz 时间: 2013-3-26 10:07

楼主好:
我最近一直在压磷酸化的IRS，但是一直都没有压出条带。做的是原代培养的肝原代细胞，细胞裂解液是用的碧云天的，也加了蛋白酶抑制剂。上样50微克和100微克都试过，封闭用5%脱脂奶粉和BSA均试过。一抗用的是CST的，5%脱脂奶粉和BSA都试过。1:1000和1:2000都试过了，一抗是4度过夜。二抗也是CST，1:1000和1:2000都试过，5%脱脂奶粉和BSA也都试过。洗膜都是用TBST，洗四遍，每次5min。显影是用的Thermo的ECL显影。压片一般是压15min，再久的我也试过，可就是没有条带。很多paper上是用IP做的，可我们这里没有人会，所以一直在western。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:08

样品是人肾脏。一抗有abcam的，也有axxora的，二抗是bioworld

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是样品中IgG重链非特异条带的可能性非常大

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:08

版内不是有很多帖子说实际上用actin做核蛋白内参是不准确的吗？
Histone不是有很多型吗？用Histone H1、Histone H2、Histone H3 or Histone H4呢？
Histone系列相对lamin系列，更难做出来些吗？
可否推荐什么公司的一抗比较好的？我做的是大鼠。

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我用过lamin B

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:08

一抗巴傲德的。跟卖试剂的挺熟，她说这个用着挺好，就买了。进口的用不起。
我昨天又把那两条膜洗脱之后一条孵育了巴傲德的JNK总蛋白抗体，另一条孵育了actin，想看看巴傲德的一抗有没有问题，还有我的蛋白量够不够。结果今天曝光时actin那个亮啊~JNK总蛋白也曝出来来，虽然不是很好看，但起码有条带，我还没有仔细比对marker，但是这个一抗应该是没有问题吧，背景也挺干净的。现在就是特别困惑为什么磷酸化的蛋白就是死活曝不出来。。难道压根就没有磷酸化的蛋白？可我看别人文献上相同的东西刺激，就是细胞不同，刺激浓度也跟我一样，时间点也一样，怎么回事呢到底。。我是不是应该找个阳参做做看。。

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磷酸化的JNK也很好出
p-jnk抗体是？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:09

内参和原来的抗体依旧可以做出来

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那这么说问题就出在了新换的一抗

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:09

楼主好:
我最近一直在压磷酸化的IRS，但是一直都没有压出条带。做的是原代培养的肝原代细胞，细胞裂解液是用的碧云天的，也加了蛋白酶抑制剂。上样50微克和100微克都试过，封闭用5%脱脂奶粉和BSA均试过。一抗用的是CST的，5%脱脂奶粉和BSA都试过。1:1000和1:2000都试过了，一抗是4度过夜。二抗也是CST，1:1000和1:2000都试过，5%脱脂奶粉和BSA也都试过。洗膜都是用TBST，洗四遍，每次5min。显影是用的Thermo的ECL显影。压片一般是压15min，再久的我也试过，可就是没有条带。很多paper上是用IP做的，可我们这里没有人会，所以一直在western。

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IP简单啦

作者: memory 时间: 2013-3-26 10:09

那这么说问题就出在了新换的一抗

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新换的抗体是ABCOM的
周围的人都说ABCOM的应该不会有问题的弄得不自信了
哎有没有可能我一抗的比例用的太高了

作者: yonger 时间: 2013-3-26 10:10

p/t-JNP和 p/t-MAPK都是巴傲德的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:11

新换的抗体是ABCOM的
周围的人都说ABCOM的应该不会有问题的弄得不自信了
哎有没有可能我一抗的比例用的太高了

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Abcam公司的抗体也有效果不好的
不要迷信
我们经常投诉Abcam

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:11

p/t-JNP和 p/t-MAPK都是巴傲德的

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没有别的辙
换抗体吧

作者: yonger 时间: 2013-3-26 10:12

那国产抗体你能给推荐个吗？进口的买不起也等不起啊。。

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-26 10:12

楼主，本人原来都是用NC膜，这次用PVDF膜做actin发现有两条带，特异性也强，一条带与说明书上actin的大小更相近,较另一条带更细，哪一条才是目的条带呢？
用NC膜做相同的标本，试剂，就只有一条带，什么原因呢？

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-26 10:12

是样品中IgG重链非特异条带的可能性非常大

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那要怎么解决这个问题呢？求赐教！！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:13

那国产抗体你能给推荐个吗？进口的买不起也等不起啊。。

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这个真没有

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:13

楼主，本人原来都是用NC膜，这次用PVDF膜做actin发现有两条带，特异性也强，一条带与说明书上actin的大小更相近,较另一条带更细，哪一条才是目的条带呢？
用NC膜做相同的标本，试剂，就只有一条带，什么原因呢？

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actin有两条带？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:46

那要怎么解决这个问题呢？求赐教！！

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用与人IgG没有交叉的二抗（就是说用人IgG吸收后的二抗）

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:46

actin有两条带？

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是啊。等周一回单位后发张图片上来。

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:48

用与人IgG没有交叉的二抗（就是说用人IgG吸收后的二抗）

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就是用人抗什么这种的抗体吗？

作者: lxh031 时间: 2013-3-26 10:49

IP简单啦

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楼主说的简单啊，可是我们这里没有人做的啊！

作者: ffooll 时间: 2013-3-26 10:51

我用过lamin B

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请问版主用的什么公司的？分子量多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:52

就是用人抗什么这种的抗体吗？

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不是用人抗什么
是用人IgG吸收后的
是不是说的有点晕？
完了我再点资料上来

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:52

楼主说的简单啊，可是我们这里没有人做的啊！

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呵呵
好吧
那你想问什么？
IP的问题随便问

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:52

请问版主用的什么公司的？分子量多少？

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用的是Santa的
分子量好像在50多K
记不清楚了

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:53

不是用人抗什么
是用人IgG吸收后的
是不是说的有点晕？
完了我再点资料上来

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是挺晕的。就是要换二抗吗？换哪种的呢？

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:54

actin有两条带？

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下面是两种膜做actin的图片，actin大小是42KD

图片附件: 42946472.snap.jpg (2013-3-26 10:54, 35.6 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15336

图片附件: 99281089.snap.jpg (2013-3-26 10:54, 28.8 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15337

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:54

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-3-26 10:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不是用人抗什么
是用人IgG吸收后的
是不是说的有点晕？
完了我再点资料上来

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是挺晕的。就是要换二抗吗？换哪种的呢？ ...

呵呵
你用的是什么二抗？
把详细信息放到帖子上来

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:55

QUOTE:

原帖由 utt0989 于 2013-3-26 10:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
actin有两条带？

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下面是两种膜做actin的图片，actin大小是42KD

PVDF膜这张
调整一抗稀释度
用的都是相同样品啊？

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:55

PVDF膜这张
调整一抗稀释度
用的都是相同样品啊？

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是大部分样品相同，都来自人肾脏。PVDF膜您觉得哪个带是目的条带？

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 10:56

我感觉pvDF膜这张背景还好啊，和Nc膜这张一抗浓度都是一样，为什么需要调整浓度呢？之前我不是问过为什么我做不同指标时候为什么带都在55K偏下一点的地方么，我想是不是这个原因才导致PVDF膜有两条带，其中稍大的是非特异性条带，稍小的细一些的才是目的条带。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 10:56

我感觉pvDF膜这张背景还好啊，和Nc膜这张一抗浓度都是一样，为什么需要调整浓度呢？之前我不是问过为什么我做不同指标时候为什么带都在55K偏下一点的地方么，我想是不是这个原因才导致PVDF膜有两条带，其中稍大的是非特异性条带，稍小的细一些的才是目的条带。
非常奇怪，有意思
这个实验重复过吗？

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从原理上来说：只能是不同的两种膜对抗体（也是一种蛋白哈）的非特异吸附不同

作者: 831226 时间: 2013-3-26 10:59

老师你好，我现在做gapdh和bcl-2，因为听我们这儿实验室有人做过的，所以用的bio-rad的80mA湿转40分钟，转完之后胶上和膜上基本都看不到marker，胶染色之后发现还残留有蛋白，今天显影时只发现gapdh显影了，bcl-2的胶片一点都没显影，检查了一下电极应该没错，短路的可能性也不大，电转液也是新配的，想咨询一下哪里可能出问题了。

作者: PCR 时间: 2013-3-26 10:59

老师您好我才做wb实验很多都不大明白这次做了一次发现洗出片子上什么也没有连marker 都没有。pvdf 膜上都还有的。分析原因怀疑是pbs里的磷酸二氢钠称错了试剂有结晶水我按没结晶水称的但ph调到的就是7.4 请问老师是不是pbs的问题

作者: mimili_901 时间: 2013-3-26 11:00

求教抗体交叉反应的问题。
现要检测某一植物蛋白，没有现成的的抗体，请问用其同源人类蛋白的多抗可不可以，成功的可能性有多大？
谢谢回复。
by the way. Genescript 的抗体怎么样？有谁用过吗？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 11:00

老师请教一下，western做actin总是有问题。目的条带17k，actin43k，上样30ug，用15％的胶，100v两小时，后湿转膜100mA，90分钟，一抗1:1000，二抗1:5000，出现的actin哑铃状且细。希望能指点一下。

图片附件: 82963987.snap.jpg (2013-3-26 11:00, 47.86 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15339

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:01

二抗说明书

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这个二抗不行
应该用这种
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Ms, Rat Sr Prot)，HRP标记（Jackson、Abcam等都有卖的）

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:01

老师你好，我现在做gapdh和bcl-2，因为听我们这儿实验室有人做过的，所以用的bio-rad的80mA湿转40分钟，转完之后胶上和膜上基本都看不到marker，胶染色之后发现还残留有蛋白，今天显影时只发现gapdh显影了，bcl-2的胶片一点都没显影，检查了一下电极应该没错，短路的可能性也不大，电转液也是新配的，想咨询一下哪里可能出问题了。

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残留蛋白是在大分子量还是小分子量？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:02

老师您好我才做wb实验很多都不大明白这次做了一次发现洗出片子上什么也没有连marker 都没有。pvdf 膜上都还有的。分析原因怀疑是pbs里的磷酸二氢钠称错了试剂有结晶水我按没结晶水称的但ph调到的就是7.4 请问老师是不是pbs的问题

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pH最关键

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:02

求教抗体交叉反应的问题。
现要检测某一植物蛋白，没有现成的的抗体，请问用其同源人类蛋白的多抗可不可以，成功的可能性有多大？
谢谢回复。
by the way. Genescript 的抗体怎么样？有谁用过吗？

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1、用免疫原进行抗体检测
2、用阳性样品
3、没有现成的抗体可以自己制备。
4、Genescript抗体不太了解，没用过
这个公司有你的抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:03

老师请教一下，western做actin总是有问题。目的条带17k，actin43k，上样30ug，用15％的胶，100v两小时，后湿转膜100mA，90分钟，一抗1:1000，二抗1:5000，出现的actin哑铃状且细。希望能指点一下。

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这是电泳的问题

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 11:05

残留蛋白是在大分子量还是小分子量？

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gapdh和bcl-2两者都有残留，但是gapdh最终显影有影像，bcl-2没有影像，可能是转膜时间不对吗？

作者: utt0989 时间: 2013-3-26 11:06

最近转膜后膜上的预染marker只有72KD 55KD两条带清楚，其他带都很淡，用考马斯亮蓝染胶，胶上没有条带。转膜条件是350mA 1h.这是什么原因呢？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-26 11:07

版主您好！我最近做western blot 遇到了一个问题。用的是BIO-RED的电泳仪。加完样，开始跑胶大概十分钟后，会有一个甬道的样本漏入浓缩胶和分离胶之间。这样就导致这个孔的内参与别的孔不一致，而且会影响别的样本的最终结果。最近一直出现这个问题。我想请教一下，这可能是什么问题引起的？

作者: star#room 时间: 2013-3-26 11:08

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！
哈还有就是1*电泳液要配多少合适呢，以前六一的500ml足够了，但我看了这个电泳槽挺大的。还有电转液大致配多少合适，谢谢您的指导！感激不尽！

作者: star#room 时间: 2013-3-26 11:08

哈不好意思，是十个梳孔的那种

作者: 了了 时间: 2013-3-26 11:09

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！
哈还有就是1*电泳液要配多少合适呢，以前六一的500ml足够了，但我看了这个电泳槽挺大的。还有电转液大致配多少合适，谢谢您的指导！感激不尽！

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分离胶大约3.5ml，浓缩胶1ml多点就可以了。

作者: star#room 时间: 2013-3-26 11:10

分离胶大约3.5ml，浓缩胶1ml多点就可以了。

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哈谢谢你的解答，我们应该用的不是同一种的电泳槽吧

作者: xue258 时间: 2013-3-26 11:11

版主您好！我最近做western blot 遇到了一个问题。用的是BIO-RED的电泳仪。加完样，开始跑胶大概十分钟后，会有一个甬道的样本漏入浓缩胶和分离胶之间。这样就导致这个孔的内参与别的孔不一致，而且会影响别的样本的最终结果。最近一直出现这个问题。我想请教一下，这可能是什么问题引起的？

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我也遇到过，可能是梳子上有水的原因，上层胶配好后多放一会，半个小时以上吧，下层胶最好用酒精压，倒完酒精后，吸干酒精，等酒精干了再加上层胶。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:11

那如何改进呢？电压？有没有转膜不充分的问题？

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1、跑完SDS-PAGE后，先染色看效果
2、电泳时电压不要太高

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:12

gapdh和bcl-2两者都有残留，但是gapdh最终显影有影像，bcl-2没有影像，可能是转膜时间不对吗？

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转膜不充分啦

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:12

最近转膜后膜上的预染marker只有72KD 55KD两条带清楚，其他带都很淡，用考马斯亮蓝染胶，胶上没有条带。转膜条件是350mA 1h.这是什么原因呢？

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转膜后，膜用丽春红染色了吗/

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:12

版主您好！我最近做western blot 遇到了一个问题。用的是BIO-RED的电泳仪。加完样，开始跑胶大概十分钟后，会有一个甬道的样本漏入浓缩胶和分离胶之间。这样就导致这个孔的内参与别的孔不一致，而且会影响别的样本的最终结果。最近一直出现这个问题。我想请教一下，这可能是什么问题引起的？

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胶本身的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:13

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！
哈还有就是1*电泳液要配多少合适呢，以前六一的500ml足够了，但我看了这个电泳槽挺大的。还有电转液大致配多少合适，谢谢您的指导！感激不尽！

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内槽要全部淹没过
外操，一半的高度

作者: star#room 时间: 2013-3-26 11:18

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:18

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！

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这个必须自己摸索
不同厚度的玻璃板要求的数量是不同的

作者: lxh031 时间: 2013-3-26 11:19

实验室以前用的都是六一的电泳槽做western, 最近全部换成了伯乐的，以前没有用过，所以想咨询一下，在灌胶的时候分离胶要多少ml,浓缩胶要多少ml ，可不可以给个具体的数值，哈这样就不用摸索了，时间有效，毕业在即啊！

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分离胶10ml，浓缩胶5ml都会剩余很多，两块则不够。
建议你装好板子灌点水实施就知道啦

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 11:20

前辈你好我是新手刚进实验室弱弱问个特简单的问题就是组织提取蛋白样品的步骤是怎样的具体点稍微因为我看的都是细胞提取蛋白的过程

作者: wmp1234 时间: 2013-3-26 11:21

前辈你好我是新手刚进实验室弱弱问个特简单的问题就是组织提取蛋白样品的步骤是怎样的具体点稍微因为我看的都是细胞提取蛋白的过程

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什么组织？提取什么蛋白，膜蛋白、总蛋白。。。
以心脏总为例：
1、取材，PBS洗涤，洗去血迹。
2、液氮冻存，或者过一下液氮
3、加入裂解液以及蛋白酶抑制剂，冰上匀浆
4、相应转速离心，吸取上清，分装。

作者: mamamiya 时间: 2013-3-26 11:22

谢谢前辈指点，我的是裸鼠皮下移植瘤，我自己想的是一部分免疫组化，一部分wb，一部分rt pcr 所以想先问一下
第一，我留取部分组织，一般都是留取多少克？留的组织就pbs清洗过后直接放入液氮？以后做WB时候再取出用。？或者我能不能清洗完直接放入--80 冰箱?待以后用。我们实验室液氮罐满了，所以条件限制，唉……
第二，我做RT PCR 也是，能不能也是预留组织直接冻存等需要做实验时再取出（这部分冻的组织要不要加一些什么冻存保护液或者 RNA酶抑制剂呢？）
前辈，我的是研究总蛋白的表达，那么内参的设定需要吗？

作者: mamamiya 时间: 2013-3-26 11:22

什么组织？提取什么蛋白，膜蛋白、总蛋白。。。
以心脏总为例：
1、取材，PBS洗涤，洗去血迹。
2、液氮冻存，或者过一下液氮
3、加入裂解液以及蛋白酶抑制剂，冰上匀浆
4、相应转速离心，吸取上清，分装。

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谢谢前辈指点，我的是裸鼠皮下移植瘤，我自己想的是一部分免疫组化，一部分wb，一部分rt pcr 所以想先问一下第一，我留取部分组织，一般都是留取多少克？留的组织就pbs清洗过后直接放入液氮？以后做WB时候再取出用。？或者我能不能清洗完直接放入--80 冰箱?待以后用。我们实验室液氮罐满了，所以条件限制，唉……第二，我做RT PCR 也是，能不能也是预留组织直接冻存等需要做实验时再取出（这部分冻的组织要不要加一些什么冻存保护液或者 RNA酶抑制剂呢？）前辈，我的是研究总蛋白的表达，那么内参的设定需要吗？

作者: lxh031 时间: 2013-3-26 11:23

谢谢前辈指点，我的是裸鼠皮下移植瘤，我自己想的是一部分免疫组化，一部分wb，一部分rt pcr 所以想先问一下第一，我留取部分组织，一般都是留取多少克？留的组织就pbs清洗过后直接放入液氮？以后做WB时候再取出用。？或者我能不能清洗完直接放入--80 冰箱?待以后用。我们实验室液氮罐满了，所以条件限制，唉……第二，我做RT PCR 也是，能不能也是预留组织直接冻存等需要做实验时再取出（这部分冻的组织要不要加一些什么冻存保护液或者 RNA酶抑制剂呢？）前辈，我的是研究总蛋白的表达，那么内参的设定需要吗？

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1、0.1g足够，直接放在—80可以，但最好在液氮里速冻一下，再放到冰箱，可以暖瓶或者小液氮罐盛取一点用作速冻。
2、可以，同上，不要加抑制剂。
3、需要内参，具体看看参考文献，你的移植瘤里表达什么内参，有无GAPDH等等。

作者: remenb 时间: 2013-3-26 11:24

前辈你好，我刚开始做western blot，跑了三次，没有条带，内参都没有条带，提取蛋白用微量测量仪测了蛋白含量3.18mg/ml,上样量为25ul每孔，我的目的蛋白是30-60KD,用的是0.22的PVDF膜，电泳条件是35mA,时间约1小时，中间有漏液（停下补加电泳液），Mark条带清晰，转膜条件为100mV,75分钟，转膜后可以看到膜上有清晰的Mark条带，5%脱脂牛奶封闭，一抗4度过夜（一抗稀释液稀释），二抗孵育2小时（牛奶封闭），洗膜用的是PBS，ECL发光，曝光1分钟，5分钟，30分钟都没有条带出现。不知要考虑什么原因，请前辈指点。已经排除二抗，ECL,显影液，定影液没有问题。望前辈有时间指点。我想下次转完膜后胶用考马斯染色看看，不知还要考虑哪些因素及以上条件是否需要改正。谢谢。

作者: gmjghh 时间: 2013-3-26 11:24

相关疾病：
肝癌
你好，我是第一次做WB，要做人肝癌的p16，p16蛋白分子量是16KD，想问问有做过的么，选用什么一抗比较好？内参选什么？非常感谢

作者: zranqi_1 时间: 2013-3-26 11:25

请问为什么我的内参会跑成这样呢？蛋白上样40ug，10%分离胶，5%浓缩胶，80v，110v电泳，电泳液新配的。谢谢！

图片附件: 42796015.jpg (2013-3-26 11:25, 9.42 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15340

作者: wood533 时间: 2013-3-26 11:25

老师，我们做未知大小蛋白的western blot，预测大小在160kd-220kd之间，老师可以提供电泳和转膜的电压，时间条件么，师姐师兄们说大蛋白不好跑的，需要注意些什么呢？使用设备是北京六一的

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:26

请问，多次重复western blot如下步骤，除了内参，其余指标均无任何成像，漆黑一片。请问到底哪里出问题了？急需大家帮助，谢谢！我做的是SD大鼠脑组织
1）12%+5%的sds-page胶，组织上样50ug。
2）电泳60V至彩虹maker条带初步分离，改100V至样本跑至底部。
2）转膜：采用湿转。70KD以下小分子量蛋白转膜58分钟，70KD以上大分子量蛋白转膜88分钟。转膜中散热良好。转膜后用考马斯亮蓝染page胶，仅剩少量蛋白。
3）封闭：用碧云天封闭液室温摇床封闭2.5-3小时。
4）一抗孵育（没有剪PVDF膜）：所有抗体均为cell signaling technology公司进口原装产品，用碧云天一抗稀释液或者脱脂奶粉1:500—1:1000稀释一抗（NF-KB、IKB、p-IKB、TLR4，抗兔），4℃摇床孵育过夜（约12h）。
5）洗涤：TBST洗涤三次，时间均为10分钟。
6）二抗：BioRad公司进口原装，二抗室温孵育50分钟。
7）洗涤：TBST洗涤三次，时间分别为10分钟、10分钟、15分钟。
8）成像：碧云天显影液A+B显影，强曝12分钟。
9）结果：4个指标均无任何条带显示。
10) 用丽春红染料染pvdf膜，无论大分子还是小分子蛋白，膜上条带清晰。

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:29

前辈你好，我刚开始做western blot，跑了三次，没有条带，内参都没有条带，提取蛋白用微量测量仪测了蛋白含量3.18mg/ml,上样量为25ul每孔，我的目的蛋白是30-60KD,用的是0.22的PVDF膜，电泳条件是35mA,时间约1小时，中间有漏液（停下补加电泳液），Mark条带清晰，转膜条件为100mV,75分钟，转膜后可以看到膜上有清晰的Mark条带，5%脱脂牛奶封闭，一抗4度过夜（一抗稀释液稀释），二抗孵育2小时（牛奶封闭），洗膜用的是PBS，ECL发光，曝光1分钟，5分钟，30分钟都没有条带出现。不知要考虑什么原因，请前辈指点。已经排除二抗，ECL,显影液，定影液没有问题。望前辈有时间指点。我想下次转完膜后胶用考马斯染色看看，不知还要考虑哪些因素及以上条件是否需要改正。谢谢。

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转膜后用丽春红染色了吗

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:29

你好，我是第一次做WB，要做人肝癌的p16，p16蛋白分子量是16KD，想问问有做过的么，选用什么一抗比较好？内参选什么？非常感谢

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一抗进口还是所谓国产（or 国内分装）？
内参选择beta-actin，GAPDH等都可以

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:30

请问为什么我的内参会跑成这样呢？蛋白上样40ug，10%分离胶，5%浓缩胶，80v，110v电泳，电泳液新配的。谢谢！

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把你跑完SDS——PAGE后考染的胶图放上来看看

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:31

老师，我们做未知大小蛋白的western blot，预测大小在160kd-220kd之间，老师可以提供电泳和转膜的电压，时间条件么，师姐师兄们说大蛋白不好跑的，需要注意些什么呢？使用设备是北京六一的

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转膜：300mA 恒流，2h至2h30min

作者: owanaka 时间: 2013-3-26 11:31

请问，多次重复western blot如下步骤，除了内参，其余指标均无任何成像，漆黑一片。请问到底哪里出问题了？急需大家帮助，谢谢！我做的是SD大鼠脑组织
1）12%+5%的sds-page胶，组织上样50ug。
2）电泳60V至彩虹maker条带初步分离，改100V至样本跑至底部。
2）转膜：采用湿转。70KD以下小分子量蛋白转膜58分钟，70KD以上大分子量蛋白转膜88分钟。转膜中散热良好。转膜后用考马斯亮蓝染page胶，仅剩少量蛋白。
3）封闭：用碧云天封闭液室温摇床封闭2.5-3小时。
4）一抗孵育（没有剪PVDF膜）：所有抗体均为cell signaling technology公司进口原装产品，用碧云天一抗稀释液或者脱脂奶粉1:500—1:1000稀释一抗（NF-KB、IKB、p-IKB、TLR4，抗兔），4℃摇床孵育过夜（约12h）。
5）洗涤：TBST洗涤三次，时间均为10分钟。
6）二抗：BioRad公司进口原装，二抗室温孵育50分钟。
7）洗涤：TBST洗涤三次，时间分别为10分钟、10分钟、15分钟。
8）成像：碧云天显影液A+B显影，强曝12分钟。
9）结果：4个指标均无任何条带显示。
10) 用丽春红染料染pvdf膜，无论大分子还是小分子蛋白，膜上条带清晰。

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1、弃用碧云天的一抗稀释液，自己配制封闭及一抗稀释液
2、TBST是你自己配制的还是买现成的？
3、把你的内参图放上来看看

作者: bring 时间: 2013-3-26 11:32

前辈，实验有进展了，电泳及转膜都没有问题，内参跑出来了。但是背景有些高，二抗用了开始用的1：5000，改为1：7500还是有些高。另外做了一个目的蛋白但不知为什么同样条件下目的蛋白背景更高，似乎有了目的条带，但背景太高，不好区别，不知道是什么原因。望老师指点。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 11:32

前辈，实验有进展了，电泳及转膜都没有问题，内参跑出来了。但是背景有些高，二抗用了开始用的1：5000，改为1：7500还是有些高。另外做了一个目的蛋白但不知为什么同样条件下目的蛋白背景更高，似乎有了目的条带，但背景太高，不好区别，不知道是什么原因。望老师指点。

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二抗改用1:10000及1:20000试试
ECL用的是什么公司的？

作者: xue258 时间: 2013-3-26 11:32

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

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楼主你好！最近换了个二抗，结果就很不好看了~看了楼主的帖子，我也打算摸一下现在的二抗。我用的是PVDF膜，那如楼主所说要做二抗梯度的话，PVDF膜要预先泡过甲醇活化了之后再加稀释好的二抗，然后室温干燥之后再加发光剂吗？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:26

请教一个问题：我做电泳，电泳缓冲液新配，配方如下：

10 X 电泳液（pH8.3）

Tris-Base 30g，Glycine 144g, 溶于700 ml 蒸馏水，调pH 至8.3；

加入10% SDS 146 ml，蒸馏水定容至 1000 ml。
稀释之后电泳时，感觉电流很大，120V恒压时达到70mA左右，前几天做的时候，电流才15mA左右，请问高手这是否有问题？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:26

版主你好，我有如下问题：
1 “HRP比AP的灵敏度高”，这个说法有根据么？
2 western blot HRP和AP的灵敏度可以检测到哪个级别？（ng？pg？）
3 我使用biorad的半干转仪，25v恒压，电流在200mA左右，30min，观察到Fermentas预染marker上红色条带（70kDa）完全转过去了（在胶上没有条带了，而且在最下面的滤纸上有清晰的红色条带），我需要的目的位置是48kDa，我这种转膜方式是转膜正常么？
抱歉，现在图片不在手边，没法上图了。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:27

楼主你好！最近换了个二抗，结果就很不好看了~看了楼主的帖子，我也打算摸一下现在的二抗。我用的是PVDF膜，那如楼主所说要做二抗梯度的话，PVDF膜要预先泡过甲醇活化了之后再加稀释好的二抗，然后室温干燥之后再加发光剂吗？谢谢！

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用NC做点膜
PVDF没做过
我觉得做不了
你可以尝试下，完了把结果放上来

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:29

请教一个问题：我做电泳，电泳缓冲液新配，配方如下：

10 X 电泳液（pH8.3）

Tris-Base 30g，Glycine 144g, 溶于700 ml 蒸馏水，调pH 至8.3；

加入10% SDS 146 ml，蒸馏水定容至 1000 ml。
稀释之后电泳时，感觉电流很大，120V恒压时达到70mA左右，前几天做的时候，电流才15mA左右，请问高手这是否有问题？谢谢！

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电泳缓冲液不需要调整pH！！！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:29

版主你好，我有如下问题：
1 “HRP比AP的灵敏度高”，这个说法有根据么？
2 western blot HRP和AP的灵敏度可以检测到哪个级别？（ng？pg？）
3 我使用biorad的半干转仪，25v恒压，电流在200mA左右，30min，观察到Fermentas预染marker上红色条带（70kDa）完全转过去了（在胶上没有条带了，而且在最下面的滤纸上有清晰的红色条带），我需要的目的位置是48kDa，我这种转膜方式是转膜正常么？
抱歉，现在图片不在手边，没法上图了。

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1、从实验本身的角度可以说明书第一个问题，HRP效果要好一些
2、HRP可以检测到pg，fg级
3、丽春红染膜了吗？

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:35

电泳缓冲液不需要调整pH！！！

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您好，谢谢您的答疑！我之前也有按过TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配制过，但电流一直都是在十几mA，跑的很慢，所以又问以前的朋友要的配方，但那个上面写着要调PH8.3，所以就调了！没想到一电泳，那场面如此吓人，内槽几乎全是冒出的泡泡！
想再问一下版主，能不能提供一个配方？或者按照TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配方就可以？缓冲液PH会造成什么样的影响？谢谢！

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:36

再请教一个问题：丽春红的敏感度是多少？如果转膜之后丽春红染膜未出现条带，还有必要接着做下去没有？谢谢！

作者: 987789 时间: 2013-3-26 12:36

楼主你好，我最近在做大鼠肝组织的WB，做的是HO-1和caspase3，同样的过程，HO-1和GAPDH内参都出的不错，可caspase3却没出，我的一抗是ABCAM的，用的是他推荐的浓度1:5000.不知道问题出在哪。望老师指点

作者: TAT 时间: 2013-3-26 12:38

你好，我是新手。最近做wb做不出来。愁死我了啊。。。。
先前上样量是20ug，90V恒压90min，湿转，200mA恒流60min，丽春红染色有条带，内参是GADPH(1:1500),二抗1:15000，扫膜就只见marker的条带，其他什么都没有。后来加大上样量（50ug），条件如上，还是只有marker的条带，再后来50ug用的内参一抗GADPH换成1:1000，内参还是没出来。每次转膜后丽春红染色都有条带的，请问可能是什么原因，帮忙分析分析吧，可以从哪些方面改进？
麻烦了，先谢谢啊。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:38

您好，谢谢您的答疑！我之前也有按过TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配制过，但电流一直都是在十几mA，跑的很慢，所以又问以前的朋友要的配方，但那个上面写着要调PH8.3，所以就调了！没想到一电泳，那场面如此吓人，内槽几乎全是冒出的泡泡！
想再问一下版主，能不能提供一个配方？或者按照TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配方就可以？缓冲液PH会造成什么样的影响？谢谢！

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25mM Tris
192mM Glycine
0.1%SDS

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:39

再请教一个问题：丽春红的敏感度是多少？如果转膜之后丽春红染膜未出现条带，还有必要接着做下去没有？谢谢！

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敏感度比考染要差一些
可以试试内参

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:40

楼主你好，我最近在做大鼠肝组织的WB，做的是HO-1和caspase3，同样的过程，HO-1和GAPDH内参都出的不错，可caspase3却没出，我的一抗是ABCAM的，用的是他推荐的浓度1:5000.不知道问题出在哪。望老师指点。

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caspase 3是做active还是pro形式？货号多少？

作者: mimili_901 时间: 2013-3-26 12:41

楼主你好，我想做个膜蛋白的WB，不知道，内参如何选择，能否帮忙解答下，看了园子里很多的帖子，没有好的回答

作者: memory 时间: 2013-3-26 12:44

感谢楼主的无私付出，再次请教问题
我要跑一个分子量14kDa的蛋白 15%的胶跑用0.22的膜转可是一抗1:8000 二抗1:50000 能看到条带背景仍很张二抗再稀释的话就会暴不出条带来请问可能的原因？
您说我能不能用0.45的膜转会不会好一点？您有没有这方面的经验可以传授？
万分感谢！

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:45

1、从实验本身的角度可以说明书第一个问题，HRP效果要好一些
2、HRP可以检测到pg，fg级
3、丽春红染膜了吗？

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没有用丽春红染膜，这个，难道WB不能通过预染marker的转膜的情况来判断转膜的程度么?
我先查查去。

作者: jrwyyplt 时间: 2013-3-26 12:46

感谢前辈在百忙之中的解答，我的ECL买的是碧云天的，最近跑了三次western，内参都跑出来了，一抗1：200，二抗改为1：10000后没有目的条带出现，今天又用了1：7500的二抗，内参很好，背景不是很高，但目的蛋白的背景有些花，隐约可以看到目地条带，是不是一抗浓度太高了，一抗是STAN公司的，说明书建议1：100-1：1000，我又怕一抗二抗稀释的浓度太低目的蛋白曝不出来，我该怎么办内前辈。

作者: qhyu 时间: 2013-3-26 12:47

caspase 3是做active还是pro形式？货号多少？

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货号：Anti-Caspase 3 antibody [E87] (ab32351)
“This antibody is specific for the pro form and the p17 cleaved form of human Capase 3.”
难道我们买的抗体不对？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:47

版主，你好。我最近提取SD大鼠的大脑皮质层做WB，检测不同实验组蛋白激酶C的某个亚类的表达变化。
以前做的时候都能跑出很清楚的条带，但是在没有人为改变任何条件的情况下，突然出现了白板。
以下是我的实验条件：
上样量30ug/cm，目的蛋白55kd
（一）电泳
浓缩胶60V，分离胶120V,
（二）转膜
100V恒压1.5h
（三）封闭
5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉加入100ml0.1%TBST中）常温封闭2h
(四)孵抗体
一抗4℃过夜（Abcam,1:1000）,洗膜，15min,4次（由于我预实验跑出来的背景较深）
二抗常温1.5h(1:15000 jackson),洗膜，15min,4次。
（五）发光
发光液用的是thermo 的supersignal west pico,pico可以跑出很清晰的条带，用west dura时会出现很脏的背景。
最近几次跑WB,都是白板，后来又继续跑了两次，把电泳液，转膜液，TBST都重新配置，把胶转膜前和转膜都做了考染，发现转膜和蛋白样品都不存在问题，于是又换了一款灵敏度高的发光液dura，刚孵上的前十几秒可以肉眼都可以看到目的蛋白和内参的英冠，但很快就淬灭了，估计前几次白板可能是淬灭的原因，请教版主，您觉得可能是哪里出问题？谢谢

本来继续把其他样品跑完，WB部分就接近尾声了，可是这个星期接连跑了六块胶，全部是白板，连内参都没看到。我的实验条件没有任何变化，可是就是跑不出任何结果来，我都快愁死了，**各位高手指点迷津。。。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:48

您好，谢谢您的答疑！我之前也有按过TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配制过，但电流一直都是在十几mA，跑的很慢，所以又问以前的朋友要的配方，但那个上面写着要调PH8.3，所以就调了！没想到一电泳，那场面如此吓人，内槽几乎全是冒出的泡泡！
想再问一下版主，能不能提供一个配方？或者按照TaKaRa商品目录后的电泳缓冲液配方就可以？缓冲液PH会造成什么样的影响？谢谢！

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我正好昨天刚配完电泳液，这是我们实验室的配方
10 X 电泳液
Glycine 144g
tris 30g
SDS 10g
加水至1L

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:49

我正好昨天刚配完电泳液，这是我们实验室的配方
10 X 电泳液
Glycine 144g
tris 30g
SDS 10g
加水至1L

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我前面两个是一样的，然后SDS是14.6g，调了一下PH8.3，结果跑起来我都有点怕，电流达到70多，以前的实验室印象中也是这么做的，从来没有因为电泳液犯过愁，搞的莫名其妙，呵呵

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:49

我正好昨天刚配完电泳液，这是我们实验室的配方
10 X 电泳液
Glycine 144g
tris 30g
SDS 10g
加水至1L

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有的说要调PH，有的说不要，我记忆中以前做都是调ph8.3的，电泳跑的很漂亮，WB DAB显色也很好，可是换了一个实验室就是找不着以前的感觉了，总觉得哪里怪怪的

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:51

有的说要调PH，有的说不要，我记忆中以前做都是调ph8.3的，电泳跑的很漂亮，WB DAB显色也很好，可是换了一个实验室就是找不着以前的感觉了，总觉得哪里怪怪的

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电泳液不用调PH,转膜液才需要调PH到8.3

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:52

我前面两个是一样的，然后SDS是14.6g，调了一下PH8.3，结果跑起来我都有点怕，电流达到70多，以前的实验室印象中也是这么做的，从来没有因为电泳液犯过愁，搞的莫名其妙，呵呵

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呵呵，我用这个配方配的昨天刚跑完，两块胶，在浓缩胶时60V,电流似乎是25，分离胶的时候120V,电流好像是三十多

作者: fox_79 时间: 2013-3-26 12:55

电泳液不用调PH,转膜液才需要调PH到8.3

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转膜液不用调PH吧？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 12:56

转膜液不用调PH吧？

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我们实验室的是电泳液不调PH,一般要求电泳液PH在8以上就可以，配完后基本就满足这个条件了，转膜液要调到8.3

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:56

感谢楼主的无私付出，再次请教问题
我要跑一个分子量14kDa的蛋白 15%的胶跑用0.22的膜转可是一抗1:8000 二抗1:50000 能看到条带背景仍很张二抗再稀释的话就会暴不出条带来请问可能的原因？
您说我能不能用0.45的膜转会不会好一点？您有没有这方面的经验可以传授？
万分感谢！

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用0.22um的膜
你用的是Millipore的0.22um PVDF膜吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 12:57

没有用丽春红染膜，这个，难道WB不能通过预染marker的转膜的情况来判断转膜的程度么?
我先查查去。

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不能用预染marker来判断

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:09

感谢前辈在百忙之中的解答，我的ECL买的是碧云天的，最近跑了三次western，内参都跑出来了，一抗1：200，二抗改为1：10000后没有目的条带出现，今天又用了1：7500的二抗，内参很好，背景不是很高，但目的蛋白的背景有些花，隐约可以看到目地条带，是不是一抗浓度太高了，一抗是STAN公司的，说明书建议1：100-1：1000，我又怕一抗二抗稀释的浓度太低目的蛋白曝不出来，我该怎么办内前辈。

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一抗本身的问题造成的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:09

货号：Anti-Caspase 3 antibody [E87] (ab32351)
“This antibody is specific for the pro form and the p17 cleaved form of human Capase 3.”
难道我们买的抗体不对？

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cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:10

我正好昨天刚配完电泳液，这是我们实验室的配方
10 X 电泳液
Glycine 144g
tris 30g
SDS 10g
加水至1L

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转膜后，膜染色了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:10

转膜液不用调PH吧？

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电泳，转膜缓冲液都不需要调pH

作者: lgm 时间: 2013-3-26 13:10

cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到

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做了蛮长时间了都没出，都快愁死了，不知道提高一抗浓度和加大上样量会不会出，如果不行就真不知道咋办了

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:11

QUOTE:

原帖由 lgm 于 2013-3-26 13:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
cleaved片段不太好做
pro form 应该可以检测到

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做了蛮长时间了都没出，都快愁死了，不知道提高一抗浓度和加大上样量会不会 ...

一抗不同浓度你还没试？
先试试吧

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 13:11

转膜后，膜染色了吗？

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实验室没有立春红，我将相同上样蛋白电泳后的一块胶分成两部分，一部分考染，一部分转膜后考染，发现转膜之前的胶可以看到清楚的蛋白条带而转膜之后的胶只有少量蛋白。我买的是pierce的发光液，按照说明需要孵育5min，每次孵完五分钟后压片，都是白板，今天我将膜孵上发光液后放到凝胶成像系统里看，前面可以看到荧光，大概五六分钟后荧光就消失了，换了实验室其他人的试剂也是一样，实验室老师说可能不是发光液的问题，是实验过程中某个试剂出了问题，但是因为接连的没有结果，我已经把能换的试剂都换了一遍了，实在想不出还有什么能改进的啦。。。请版主指点一二啊。。。谢谢

作者: duoduo 时间: 2013-3-26 13:12

用0.22um的膜
你用的是Millipore的0.22um PVDF膜吗？

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是Millipore的0.22 PVDF
不知道是不是二抗的问题我用的是国产的二抗 SIGMA的一抗
这个二抗跑其他的蛋白一直用的挺好的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:14

实验室没有立春红，我将相同上样蛋白电泳后的一块胶分成两部分，一部分考染，一部分转膜后考染，发现转膜之前的胶可以看到清楚的蛋白条带而转膜之后的胶只有少量蛋白。我买的是pierce的发光液，按照说明需要孵育5min，每次孵完五分钟后压片，都是白板，今天我将膜孵上发光液后放到凝胶成像系统里看，前面可以看到荧光，大概五六分钟后荧光就消失了，换了实验室其他人的试剂也是一样，实验室老师说可能不是发光液的问题，是实验过程中某个试剂出了问题，但是因为接连的没有结果，我已经把能换的试剂都换了一遍了，实在想不出还有什么能改进的啦。。。请版主指点一二啊。。。谢谢

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1、建议你丽春红染一下膜
2、二抗做一下点膜检测
3、内参抗体及二抗是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:14

是Millipore的0.22 PVDF
不知道是不是二抗的问题我用的是国产的二抗 SIGMA的一抗
这个二抗跑其他的蛋白一直用的挺好的

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Millipore的0.22 PVDF本身就有一定的背景
试用一下PALL的NC膜
国产的二抗是哪个公司的？

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-26 13:15

Millipore的0.22 PVDF本身就有一定的背景
试用一下PALL的NC膜
国产的二抗是哪个公司的？

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中杉金桥的二抗
我再换换NC膜试试
谢谢

作者: glass 时间: 2013-3-26 13:15

请问楼主，牛奶用水稀释会对结果有什么影响？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:16

请问楼主，牛奶用水稀释会对结果有什么影响？

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这个不可以哦
抗体会失活

作者: abc816 时间: 2013-3-26 13:17

这个不可以哦
抗体会失活

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但是我前面跑过几个western，还马马虎虎，就是觉得band很淡，朦朦胧胧的，是不是跟加水有关，附图是跑caspase3的，一抗1:3000, 感觉条带有点散，中间有个band好像弯了，请帮忙诊断一下，谢谢！

图片附件: 47817969.snap.jpg (2013-3-26 13:17, 110.73 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15341

作者: yonger 时间: 2013-3-26 13:17

Western blotting新手，想请教楼主：
准备做人肝癌细胞和人肝癌组织HBx(乙肝病毒X蛋白)的表达，分子量17kd，
1.抗体不知买哪家的好，查了很多文献，多数使用abcam和chemicon的，看了下abcam的抗体，比较贵，有ab39716\ab2741\ab235，似乎能够既做免疫组化又WB的只有ab39716,可是只有50ug，不知是否够用呢？ab39716在cross ractivity 写到React with Hepatitis B Virus,不知是什么意思，而另外两个ab235和ab2741都没有写。另外好像ab235公司推荐是做免疫组化，但是网页上的文献也有做了WB的，不知是什么原因，我问了别人似乎说ab2741也可以，因为推荐用途IP,别人似乎说做免疫沉淀的也可以做免疫组化，不知到这种说法是否正确。
chemicon的抗体MAB8419 用于ELISA, WB, IC（Immunocytochemistry）是否是指用于免疫组化，cuturl('http://www.millipore.com/catalogue/item/mab8419abcam')的抗体
ab39716
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-ab39716.htmlab235')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-3F6-G10-ab235.htmlab2741')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-X36C-ab2741.html')因为实验时间比较紧张，所以很着急，真的不知该选哪个抗体好，还请高手指教
2.HBx是用半干转还是湿转法好，准备用0.22um的PVDF膜
谢谢！

作者: abc816 时间: 2013-3-26 13:18

请帮我看一下，我的内参actin跑成这样，是什么缘故？7.5%SDS-PAGE，120v电压跑胶。

图片附件: 19970191.snap.jpg (2013-3-26 13:18, 103.13 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15342

作者: xingyi08 时间: 2013-3-26 13:18

请教两个问题
1. 一抗和二抗都用多克隆抗体，有影响吗
2. 对于所用的一抗，其效价和灵敏度有要求吗，这个希望详细点解释，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:19

但是我前面跑过几个western，还马马虎虎，就是觉得band很淡，朦朦胧胧的，是不是跟加水有关，附图是跑caspase3的，一抗1:3000, 感觉条带有点散，中间有个band好像弯了，请帮忙诊断一下，谢谢！

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肯定会有影响

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:19

Western blotting新手，想请教楼主：
准备做人肝癌细胞和人肝癌组织HBx(乙肝病毒X蛋白)的表达，分子量17kd，
1.抗体不知买哪家的好，查了很多文献，多数使用abcam和chemicon的，看了下abcam的抗体，比较贵，有ab39716\ab2741\ab235，似乎能够既做免疫组化又WB的只有ab39716,可是只有50ug，不知是否够用呢？ab39716在cross ractivity 写到React with Hepatitis B Virus,不知是什么意思，而另外两个ab235和ab2741都没有写。另外好像ab235公司推荐是做免疫组化，但是网页上的文献也有做了WB的，不知是什么原因，我问了别人似乎说ab2741也可以，因为推荐用途IP,别人似乎说做免疫沉淀的也可以做免疫组化，不知到这种说法是否正确。
chemicon的抗体MAB8419 用于ELISA, WB, IC（Immunocytochemistry）是否是指用于免疫组化，cuturl('http://www.millipore.com/catalogue/item/mab8419abcam')的抗体
ab39716
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-ab39716.htmlab235')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-3F6-G10-ab235.htmlab2741')
cuturl('http://www.abcam.com/Hepatitis-B-Virus-X-antigen-antibody-X36C-ab2741.html')因为实验时间比较紧张，所以很着急，真的不知该选哪个抗体好，还请高手指教
2.HBx是用半干转还是湿转法好，准备用0.22um的PVDF膜
谢谢！

===============================================

正在做这个蛋白，用了一个是abcam的抗体，没有检测到
现在正在做转染后的检测
下周能出结果

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:20

请教两个问题
1. 一抗和二抗都用多克隆抗体，有影响吗
2. 对于所用的一抗，其效价和灵敏度有要求吗，这个希望详细点解释，谢谢

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1、没有影响
2、效价和灵敏度要求？？？？

作者: bamboo16 时间: 2013-3-26 13:21

我最近几次做胶，发现样品进入分离胶后在最前方出现0.5CM的油状区域，会滞留一部分蛋白，是哪里出问题了啊？？

图片附件: 49727791.snap.jpg (2013-3-26 13:21, 67.17 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15343

图片附件: 38566756.snap.jpg (2013-3-26 13:21, 62.38 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15344

作者: u234 时间: 2013-3-26 13:21

楼主你好，有几个问题想请教一下：
1、提细胞核内的蛋白用PIRA强裂解液+PMSF可以吗，还是一定要用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒？
2、磷酸化蛋白一抗用BSA+1XTBST稀释比5%脱脂牛奶好对吗？这里的BSA是指(BSA) Fraction V 吗？
3、知道做P-JNK有什么注意事项或是经验总结吗，做了一个月了还没有结果，急啊！
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:22

我最近几次做胶，发现样品进入分离胶后在最前方出现0.5CM的油状区域，会滞留一部分蛋白，是哪里出问题了啊？？

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这种情况基本正常

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:22

楼主你好，有几个问题想请教一下：
1、提细胞核内的蛋白用PIRA强裂解液+PMSF可以吗，还是一定要用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒？
2、磷酸化蛋白一抗用BSA+1XTBST稀释比5%脱脂牛奶好对吗？这里的BSA是指(BSA) Fraction V 吗？
3、知道做P-JNK有什么注意事项或是经验总结吗，做了一个月了还没有结果，急啊！
谢谢！

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用什么裂解液？
哪个公司的？

作者: yes4 时间: 2013-3-26 13:22

样品进入分离胶后在最前方出现0.5CM的油状区域不会影响实验结果么？电泳后小蛋白比大分子量蛋白模糊。

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-26 13:23

转膜后，膜染色了吗？

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版主，你好。我最近提取SD大鼠的大脑皮质层做WB，突然出现了白板。
以下是我的实验条件：
上样量30ug/cm，目的蛋白55kd
（一）电泳
浓缩胶60V，分离胶120V,
（二）转膜
100V恒压1.5h
（三）封闭
5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉加入100ml0.1%TBST中）常温封闭2h
(四)孵抗体
一抗4℃过夜（Abcam,1:1000）,洗膜，15min,4次（由于我预实验跑出来的背景较深）
二抗常温1.5h(1:15000 jackson),洗膜，15min,4次。
（五）发光
发光液用的是thermo 的supersignal west pico,pico可以跑出很清晰的条带，用west dura时会出现很脏的背景。
最近几次跑WB,都是白板，后来又继续跑了两次，把电泳液，转膜液，TBST都重新配置，把胶转膜前和转膜都做了考染，发现转膜和蛋白样品都不存在问题，于是又换了一款灵敏度高的发光液dura，刚孵上的前十几秒可以肉眼都可以看到目的蛋白和内参的英冠，但很快就淬灭了，估计前几次白板可能是淬灭的原因。前几天重新做了一次，跑了两张膜，因担心PVDF膜有问题，到旁边实验室借了一张膜，另一张膜用实验室的，结果两张膜都出了结果，只是借来的膜荧光大概持续约半小时就淬灭了，实验室的膜大概10分钟就淬灭了。今天又重新跑胶，但是又开始出现白板，这次直接连荧光都没看到。这是后来将膜用丽春红染色的图片。看不到什么明显的蛋白，难道是转膜过度吗？或者还PVDF膜的原因？

图片附件: 96233074.snap.jpg (2013-3-26 13:23, 64.39 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15345

作者: tuomu45 时间: 2013-3-26 13:23

楼主帮看看我跑的电泳

溴酚蓝怎么跑成这样了，在浓缩胶里还是一条细线，进入到分离胶就变成这样了，我的目的蛋白是16Kd左右，15%分离胶，浓缩胶电压50V，分离胶100V，用的5×Loading Buffer　　

组份浓度：250mM Tris-HCl（pH6.8），10％（W/V） SDS 　，　0.5％（W/V）溴酚蓝，　30％（V/V）甘油， 5%（W/V） β-巯基乙醇，

5%浓缩胶配方

15%分离胶配方

作者: tuomu45 时间: 2013-3-26 13:24

还有就是我按文献上说的条件转膜时（100V 2小时），转膜时电流达到380mA，我们实验室其他人都是定流转膜，电流定在120mA，我这样转有问题吗？请指导一下，谢谢

图片附件: 61636470.snap.jpg (2013-3-26 13:24, 85.92 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15346

作者: standbyme 时间: 2013-3-26 13:25

正在做这个蛋白，用了一个是abcam的抗体，没有检测到
现在正在做转染后的检测
下周能出结果

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您好，不知HBx蛋白您做出来了吗？如果可以的话，能否推荐是哪个公司的抗体呢

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-26 13:25

请问版主，我的蛋白用nano drop2000测得蛋白含量为24mg/ml,我前几次上样量为20ul,是不是上样量太多了，不知上样量多少比较合适。谢谢。

作者: is2011 时间: 2013-3-26 13:25

您好，

我是新手，最近跑WB，我的蛋白是40kD的糖蛋白，我采用的半干转膜，20V，25min；可是老得不到目的条带，请问是转膜时间短还是糖蛋白会影响转膜效率呢，请angweibin119老师解答。谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:26

样品进入分离胶后在最前方出现0.5CM的油状区域不会影响实验结果么？电泳后小蛋白比大分子量蛋白模糊。

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不影响

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:26

您好，不知HBx蛋白您做出来了吗？如果可以的话，能否推荐是哪个公司的抗体呢

==========

明天曝光
周四

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:26

请问版主，我的蛋白用nano drop2000测得蛋白含量为24mg/ml,我前几次上样量为20ul,是不是上样量太多了，不知上样量多少比较合适。谢谢。

===========

组织样品？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:27

您好，

我是新手，最近跑WB，我的蛋白是40kD的糖蛋白，我采用的半干转膜，20V，25min；可是老得不到目的条带，请问是转膜时间短还是糖蛋白会影响转膜效率呢，请angweibin119老师解答。谢谢！

===============

蛋白名称？
内参做的如何？

作者: kuohao17 时间: 2013-3-26 13:27

内参和阳性对照都出来了，蛋白是自己构建的HIV-1AE亚型V4环382/388之间的短肽，l裸肽段是11kD，经糖基化修饰后达到了40kD。

作者: loli 时间: 2013-3-26 13:27

版主，我取的PC12细胞总蛋白，我的目的蛋白是Nrf2,HO-1,不知上样多少蛋白合适。蛋白太多会导致不出结果吗。

作者: moonlight45 时间: 2013-3-26 13:28

1、弃用碧云天的一抗稀释液，自己配制封闭及一抗稀释液
2、TBST是你自己配制的还是买现成的？
3、把你的内参图放上来看看

=======================================================

会不会是一抗问题？tbst也是自己配的。重复近10次了，还是啥都没有。

作者: birdfish 时间: 2013-3-26 13:28

版主，您好
今天我们跑得胶怎么有几个孔成水滴状呢，这次我们上样的体积是37.5ug，然后所有的样本都用1xbuffer补足到了相同的体积。
会不会出现这种可能，上样体积小的那个孔，由于加的补足的loading buffer 的体积要大很多，然后比重就要大，在跑的过程中，速度较慢。因为，我看了一下，那两个成水滴状的孔，刚好就是我补足的loading buffer 体积最小的那个孔。
还有，今天我的片子曝光成空泡状，是不是因为底物信号太强，速度消耗底物造成的空泡状呢。
期待您的回复，谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:29

内参和阳性对照都出来了，蛋白是自己构建的HIV-1AE亚型V4环382/388之间的短肽，l裸肽段是11kD，经糖基化修饰后达到了40kD。
自己制备的抗体就不好说了

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是不是这个蛋白在样品中没有表达？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:29

版主，我取的PC12细胞总蛋白，我的目的蛋白是Nrf2,HO-1,不知上样多少蛋白合适。蛋白太多会导致不出结果吗。

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我们做细胞样品上样量是10-15ug
组织样品是20-40ug

作者: NBA 时间: 2013-3-26 13:29

会不会是一抗问题？tbst也是自己配的。重复近10次了，还是啥都没有。

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这个完全有可能

另外现在国内做WB的试剂参差不齐
问题很大

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:17

版主，您好
今天我们跑得胶怎么有几个孔成水滴状呢，这次我们上样的体积是37.5ug，然后所有的样本都用1xbuffer补足到了相同的体积。
会不会出现这种可能，上样体积小的那个孔，由于加的补足的loading buffer 的体积要大很多，然后比重就要大，在跑的过程中，速度较慢。因为，我看了一下，那两个成水滴状的孔，刚好就是我补足的loading buffer 体积最小的那个孔。
还有，今天我的片子曝光成空泡状，是不是因为底物信号太强，速度消耗底物造成的空泡状呢。
期待您的回复，谢谢

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1、上样体积可能太大了
2、上样体积是多少？
3、二抗浓度太高会造成这样的空泡状

作者: ROSE李 时间: 2013-3-26 14:18

楼主好，我提得是组织蛋白，测浓度蛮高的大概在10ug/ul，每孔上样是30ng
内结果内参条带很好，但是目的很模糊，糊糊的。怎么样才能清楚呢？

作者: plaa 时间: 2013-3-26 14:18

楼主好，想请教一个问题，最近做western 跑胶，转膜后分别孵内参和目的蛋白的抗体，显影时内参条带很清晰，但目的蛋白条带总是出不来，试着调整抗体浓度，一抗用的是santa cruz 以1:500稀释时，显影时全片发亮，以1:1000稀释时，无任何条带。二抗用的是进口分装的，跟内参用的是一个品牌，均以1:4000比例稀释。请问是否是因为抗体浓度不合适，该如何调整，还是因为别的原因。谢谢！

作者: mamamiya 时间: 2013-3-26 14:24

老师：我这是内参GAPD曝光后的图片，图片中有的条带出的很不均匀，有的出的蛮好的，膜都重新孵育一抗、二抗两次了，条带还是出的不完整，不知道是什么原因造成的，该怎么改进？

作者: loli 时间: 2013-3-26 14:25

请问版主，您的做的HBx蛋白出结果了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:26

楼主好，想请教一个问题，最近做western 跑胶，转膜后分别孵内参和目的蛋白的抗体，显影时内参条带很清晰，但目的蛋白条带总是出不来，试着调整抗体浓度，一抗用的是santa cruz 以1:500稀释时，显影时全片发亮，以1:1000稀释时，无任何条带。二抗用的是进口分装的，跟内参用的是一个品牌，均以1:4000比例稀释。请问是否是因为抗体浓度不合适，该如何调整，还是因为别的原因。谢谢！

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1、一抗本身特异性等不太好
2、二抗稀释度试试1:10000,1:20000

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:26

老师：我这是内参GAPD曝光后的图片，图片中有的条带出的很不均匀，有的出的蛮好的，膜都重新孵育一抗、二抗两次了，条带还是出的不完整，不知道是什么原因造成的，该怎么改进？

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1、上样孔不齐
2、上样的体积太大，电泳时压不齐
3、转膜后请用丽春红染色检查

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:27

请问版主，您的做的HBx蛋白出结果了吗？

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不好意思啊
转染后的样品依旧没有检测到HBx

作者: kswl870 时间: 2013-3-26 14:28

楼主好，我提得是组织蛋白，测浓度蛮高的大概在10ug/ul，每孔上样是30ng
内结果内参条带很好，但是目的很模糊，糊糊的。怎么样才能清楚呢？

作者: moonlight45 时间: 2013-3-26 14:29

版主，你好！
我用的NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒提取的鼠肝脏组织核内蛋白PPAR，分子量52kda,一抗买的abcam公司，内参LaminＢ１及二抗用的novus公司，Pierce® BCA Protein Assay Kit蛋白定量，上样量40微升总计20微克的蛋白，积层胶60V40min，分离胶110v,120minn，300mA恒流PVDF转膜1小时，均用5%的脱脂奶粉TBST室温1小时封闭，一抗均以1:1000及1:2000 二个梯度5%的脱脂奶粉TBST 稀释，4℃摇匀过夜，TBST3×10分钟洗涤，二抗均以1:2000的5%的脱脂奶粉TBST 稀释，室温摇床孵浴1小时，TBST3×10分钟洗涤，PierceECL显色液，经曝光后，内参的两个稀释度均可见条带，但目标蛋白的两个稀释度曝光10分钟仍无任何信号，第一次做weston，不知道什么原因，还望楼主帮忙分析，谢谢！
我从abcam公司网站上发现已有人用该抗体从大鼠及小鼠肝内、脂肪等相关组织及细胞均试验成功，但他们有用脱脂奶粉封闭，有用BSA封闭的，抗体稀释有的用TBST，有的用PBS-吐温，版主你好，你觉得是这方面的问题吗？急盼你的解答，谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-26 14:29

版主，你好，我western跑的目标蛋白是170KD的核蛋白，我想请教以下几个问题:
1.用pierce的M-PER全蛋白裂解液提取核蛋白可行嘛，比提胞浆蛋白是否需要时间长一点，之前用这个提，目标蛋白的条带一直都比较弱，药物刺激后目标蛋白的泛素化条带一直跑不出来
2.转膜液中需要加SDS嘛，之前一直在用300mA 1h转膜貌似效果不是很好，我们实验室用的电泳仪是六一的，楼主能不能推荐一个方案
3.电泳液跟转膜液中的甘氨酸、tris碱含量是相同的吗？
急盼版主的解答，谢谢

作者: kswl870 时间: 2013-3-26 14:29

SDS分离胶与浓缩胶储存液PH值分别是多少？配胶时要调吗？

作者: pengke1983 时间: 2013-3-26 14:30

你好，我的目的蛋白139KD，请问转膜时，湿转需要多大的电压？多长时间呢？谢谢

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-26 14:31

求助楼主，今天跑western，一块12%，一块7.5%，电泳结束marker条带很清晰，但是转膜后全部条带变成很模糊的，转膜液新配，-20度预冷3小时，恒压400mA， 1个小时，转膜结束后就成这样了，转膜液应该没有问题，请问还有什么其他可能，谢谢！

图片附件: 91062125.snap.jpg (2013-3-26 14:31, 69.67 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15347

作者: minran_1980 时间: 2013-3-26 14:32

一抗进口还是所谓国产（or 国内分装）？
内参选择beta-actin，GAPDH等都可以

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恩，一抗用的是进口分装的，内参用的actin，谢谢楼主~~以为我的问题不会被回答了呢，以后有问题还得像楼主请教

作者: am10 时间: 2013-3-26 14:32

今天染了actin，发现两边的band都smear了，淡中间的还好，突然想起一个细节，昨天为了降低转膜液的温度，放到-20度冻了3小时以后再转膜，今天不去冻就好了，不知道是不是这个问题？

图片附件: 32423421.jpg (2013-3-26 14:32, 10.21 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15348

作者: yjf1026 时间: 2013-3-26 14:34

想问版主，是不是有的抗体可以做出western,但是做不出荧光啊？

作者: mimili_901 时间: 2013-3-26 14:34

老师您好！
我最近开始跑WB，分子量106kd，用了8%的分离胶，转膜用湿转恒压100v2个小时，5%的脱脂奶粉RT封膜1小时候RT孵育一抗1小时，用的是santa的，试了1:100,1:200稀释度，二抗1:5000,RT孵育1小时，显影后发现背景很深，而且杂带非常多，目标条带处未见明显的条带出现，现在上样量已经上到90ug了，这是怎么回事啊？下一步做的话应该从哪里着手更改条件？

作者: xue258 时间: 2013-3-26 14:34

本人我新手，请问楼主我想做心肌的eNOS和p-eNOS，请问您觉得那家公司的抗体比较好，还有园子里说转膜特难，给个建议的条件吧！谢谢！

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-26 14:35

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

请大家在我的信息里查看QQ号与邮箱等联系方式
可以在线解答

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你好！我最近一批WB时几乎都是actin能出条带，但是目的蛋白从来都是干干净净，一丝条带也没有。转完的膜上可以看到marker，蛋白应该也有转上去吧。一抗4度过夜，然后TBS-T洗三次，每次10分钟；二抗37度孵育一小时，TBS-T洗六次，每次5分钟。然后ECL发光。为什么同样的过程actin可以但是目的蛋白没有呢？

作者: 羊咩咩 时间: 2013-3-26 14:38

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

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f你好，我刚做WB，做二抗的稀释度是直接用稀释的二抗点在新的NC膜是吗？
还有上边所说的RT干燥是什么意思？谢谢！

作者: 33号 时间: 2013-3-26 14:39

您好！我的目的蛋白有200KD左右请问一下跑胶的条件是什么？还有应该选择多大浓度的分离胶啊？还有转膜的条件？？没做过这么大的蛋白，还请指教，谢谢

作者: xue258 时间: 2013-3-26 14:39

楼主您好
我在设计重组质粒pcDNA3.1-myc-his(B)-目的基因转染HEK293T细胞后用western blot检测表达量的实验，可是不知道如何设立阳性和阴性对照。一抗是c-myc单抗。
我这样想：阳性对照是转染空载体pcDNA3.1-myc-his(B)的细胞，阴性对照是不转染质粒的细胞。请问对吗？

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:40

你好！我最近一批WB时几乎都是actin能出条带，但是目的蛋白从来都是干干净净，一丝条带也没有。转完的膜上可以看到marker，蛋白应该也有转上去吧。一抗4度过夜，然后TBS-T洗三次，每次10分钟；二抗37度孵育一小时，TBS-T洗六次，每次5分钟。然后ECL发光。为什么同样的过程actin可以但是目的蛋白没有呢？

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:41

老师您好！
我最近开始跑WB，分子量106kd，用了8%的分离胶，转膜用湿转恒压100v2个小时，5%的脱脂奶粉RT封膜1小时候RT孵育一抗1小时，用的是santa的，试了1:100,1:200稀释度，二抗1:5000,RT孵育1小时，显影后发现背景很深，而且杂带非常多，目标条带处未见明显的条带出现，现在上样量已经上到90ug了，这是怎么回事啊？下一步做的话应该从哪里着手更改条件？

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:41

你好，我的目的蛋白139KD，请问转膜时，湿转需要多大的电压？多长时间呢？谢谢

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100 V 75-90 minutes

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:42

版主，你好！
我用的NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒提取的鼠肝脏组织核内蛋白PPAR，分子量52kda,一抗买的abcam公司，内参LaminＢ１及二抗用的novus公司，Pierce® BCA Protein Assay Kit蛋白定量，上样量40微升总计20微克的蛋白，积层胶60V40min，分离胶110v,120minn，300mA恒流PVDF转膜1小时，均用5%的脱脂奶粉TBST室温1小时封闭，一抗均以1:1000及1:2000 二个梯度5%的脱脂奶粉TBST 稀释，4℃摇匀过夜，TBST3×10分钟洗涤，二抗均以1:2000的5%的脱脂奶粉TBST 稀释，室温摇床孵浴1小时，TBST3×10分钟洗涤，PierceECL显色液，经曝光后，内参的两个稀释度均可见条带，但目标蛋白的两个稀释度曝光10分钟仍无任何信号，第一次做weston，不知道什么原因，还望楼主帮忙分析，谢谢！
我从abcam公司网站上发现已有人用该抗体从大鼠及小鼠肝内、脂肪等相关组织及细胞均试验成功，但他们有用脱脂奶粉封闭，有用BSA封闭的，抗体稀释有的用TBST，有的用PBS-吐温，版主你好，你觉得是这方面的问题吗？急盼你的解答，谢谢！

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:42

楼主你好，有几个问题想请教一下：
1、提细胞核内的蛋白用PIRA强裂解液+PMSF可以吗，还是一定要用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒？
2、磷酸化蛋白一抗用BSA+1XTBST稀释比5%脱脂牛奶好对吗？这里的BSA是指(BSA) Fraction V 吗？
3、知道做P-JNK有什么注意事项或是经验总结吗，做了一个月了还没有结果，急啊！
谢谢！

作者: 婴儿脸 时间: 2013-3-26 14:43

版主，你好。我最近提取SD大鼠的大脑皮质层做WB，检测不同实验组蛋白激酶C的某个亚类的表达变化。
以前做的时候都能跑出很清楚的条带，但是在没有人为改变任何条件的情况下，突然出现了白板。
以下是我的实验条件：
上样量30ug/cm，目的蛋白55kd
（一）电泳
浓缩胶60V，分离胶120V,
（二）转膜
100V恒压1.5h
（三）封闭
5%脱脂奶粉（5g脱脂奶粉加入100ml0.1%TBST中）常温封闭2h
(四)孵抗体
一抗4℃过夜（Abcam,1:1000）,洗膜，15min,4次（由于我预实验跑出来的背景较深）
二抗常温1.5h(1:15000 jackson),洗膜，15min,4次。
（五）发光
发光液用的是thermo 的supersignal west pico,pico可以跑出很清晰的条带，用west dura时会出现很脏的背景。
最近几次跑WB,都是白板，后来又继续跑了两次，把电泳液，转膜液，TBST都重新配置，把胶转膜前和转膜都做了考染，发现转膜和蛋白样品都不存在问题，于是又换了一款灵敏度高的发光液dura，刚孵上的前十几秒可以肉眼都可以看到目的蛋白和内参的英冠，但很快就淬灭了，估计前几次白板可能是淬灭的原因，请教版主，您觉得可能是哪里出问题？谢谢

本来继续把其他样品跑完，WB部分就接近尾声了，可是这个星期接连跑了六块胶，全部是白板，连内参都没看到。我的实验条件没有任何变化，可是就是跑不出任何结果来，我都快愁死了，**各位高手指点迷津。。。

作者: kswl870 时间: 2013-3-26 14:43

7.5% gel. Run to the end, transfer for longer time than usual (like 1.5 hour vs. 1.0 hour).

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那要多大的电压或者电流呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:44

那要多大的电压或者电流呢？

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100 V is fine

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:45

翔鹰 wrote:
版主，你好！
我用的NE-PER® Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents试剂盒提取的鼠肝脏组织核内蛋白PPAR，分子量52kda,一抗买的abcam公司，内参LaminＢ１及二抗用的novus公司，Pierce® BCA Protein Assay Kit蛋白定量，上样量40微升总计20微克的蛋白，积层胶60V40min，分离胶110v,120minn，300mA恒流PVDF转膜1小时，均用5%的脱脂奶粉TBST室温1小时封闭，一抗均以1:1000及1:2000 二个梯度5%的脱脂奶粉TBST 稀释，4℃摇匀过夜，TBST3×10分钟洗涤，二抗均以1:2000的5%的脱脂奶粉TBST 稀释，室温摇床孵浴1小时，TBST3×10分钟洗涤，PierceECL显色液，经曝光后，内参的两个稀释度均可见条带，但目标蛋白的两个稀释度曝光10分钟仍无任何信号，第一次做weston，不知道什么原因，还望楼主帮忙分析，谢谢！
我从abcam公司网站上发现已有人用该抗体从大鼠及小鼠肝内、脂肪等相关组织及细胞均试验成功，但他们有用脱脂奶粉封闭，有用BSA封闭的，抗体稀释有的用TBST，有的用PBS-吐温，版主你好，你觉得是这方面的问题吗？急盼你的解答，谢谢！
附件是内参LaminＢ１的曝光１.５分钟的图片

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内参做的很好？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:46

版主，你好，我western跑的目标蛋白是170KD的核蛋白，我想请教以下几个问题:
1.用pierce的M-PER全蛋白裂解液提取核蛋白可行嘛，比提胞浆蛋白是否需要时间长一点，之前用这个提，目标蛋白的条带一直都比较弱，药物刺激后目标蛋白的泛素化条带一直跑不出来
2.转膜液中需要加SDS嘛，之前一直在用300mA 1h转膜貌似效果不是很好，我们实验室用的电泳仪是六一的，楼主能不能推荐一个方案
3.电泳液跟转膜液中的甘氨酸、tris碱含量是相同的吗？
急盼版主的解答，谢谢

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1、说明书是否提示可以提取出核蛋白？
2、转膜液要加0.01% SDS，300mA恒流 2h30min
3、不一样

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:47

SDS分离胶与浓缩胶储存液PH值分别是多少？配胶时要调吗？

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分离胶：8.8
浓缩胶：6.8

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:47

你好，我的目的蛋白139KD，请问转膜时，湿转需要多大的电压？多长时间呢？谢谢

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300mA 湿转，恒流，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:47

求助楼主，今天跑western，一块12%，一块7.5%，电泳结束marker条带很清晰，但是转膜后全部条带变成很模糊的，转膜液新配，-20度预冷3小时，恒压400mA， 1个小时，转膜结束后就成这样了，转膜液应该没有问题，请问还有什么其他可能，谢谢！

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转膜前的胶图呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:48

想问版主，是不是有的抗体可以做出western,但是做不出荧光啊？

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不会
如果可以做出WB
但是做不出荧光
那是荧光抗体的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:49

老师您好！
我最近开始跑WB，分子量106kd，用了8%的分离胶，转膜用湿转恒压100v2个小时，5%的脱脂奶粉RT封膜1小时候RT孵育一抗1小时，用的是santa的，试了1:100,1:200稀释度，二抗1:5000,RT孵育1小时，显影后发现背景很深，而且杂带非常多，目标条带处未见明显的条带出现，现在上样量已经上到90ug了，这是怎么回事啊？下一步做的话应该从哪里着手更改条件？

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1、内参做的怎么样？
2、别用santa的垃圾抗体

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:50

本人我新手，请问楼主我想做心肌的eNOS和p-eNOS，请问您觉得那家公司的抗体比较好，还有园子里说转膜特难，给个建议的条件吧！谢谢！

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我用过的有Abcam与Millipore的
有具体的货号
转膜简单
300mA，恒流，湿转，2h

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:52

你好！我最近一批WB时几乎都是actin能出条带，但是目的蛋白从来都是干干净净，一丝条带也没有。转完的膜上可以看到marker，蛋白应该也有转上去吧。一抗4度过夜，然后TBS-T洗三次，每次10分钟；二抗37度孵育一小时，TBS-T洗六次，每次5分钟。然后ECL发光。为什么同样的过程actin可以但是目的蛋白没有呢？

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目的蛋白抗体用的是什么公司的/

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:52

您好！我的目的蛋白有200KD左右请问一下跑胶的条件是什么？还有应该选择多大浓度的分离胶啊？还有转膜的条件？？没做过这么大的蛋白，还请指教，谢谢

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8%分离胶
300mA 恒流，湿转，2h30min
加入0.01% SDS

作者: 张先生 时间: 2013-3-26 14:53

10%的胶，上样50ng蛋白，25ul体系，跑出来GAPDH很丑，想起请问下可能什么原因

同一张膜，p65条带很细，有可能什么原因，谢谢！

图片附件: 99302037.jpg (2013-3-26 14:53, 33.6 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15350

作者: duoduo 时间: 2013-3-26 14:54

1、内参做的怎么样？
2、别用santa的垃圾抗体

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内参做出来很均一，还有一个问题就是，内参虽然很均一，但是条带相对比较细，90ug的上样量还没有别人30ug的上样量粗，这是什么原因啊，我内参用actin和GAPDH都做过，条带都是偏细。最近还在跑另外一个蛋白，做出来条带，但是比预计分子量小不少，5-7kd左右，也是用的santa的抗体，跑了两三个月了，没什么好结果，多谢解答。

作者: wood533 时间: 2013-3-26 14:54

WB电泳时溴酚蓝为什么不在一个平面上（如下图）？最后加发光剂后呈现片状荧光，曝光后一片黑。谢谢！

作者: qiangren789 时间: 2013-3-26 14:54

请问有谁跑过SFRP1和5的抗体没，跑出来怎么样，是什么公司的抗体，电泳转膜的条件是什么
跑了好几个月了结果什么都没有

作者: am10 时间: 2013-3-26 14:56

请教楼主一个问题，也看到了老师的一些关于WB的精彩解答，近来做WB遇到一个抗体IL-8，样品来源是老鼠的子宫，做的时候很棘手，一抗是abcom的货号是ab7747，一开始就用了16%的SDS-PAGE胶，但是重复过几次，也加大上样量，也提高抗体浓度到1：50，但是曝光还是一片空白，想请问老师这个指标该怎么做会好些，已经做了2个多月了

作者: NBA 时间: 2013-3-26 14:58

10%的胶，上样50ng蛋白，25ul体系，跑出来GAPDH很丑，想起请问下可能什么原因

同一张膜，p65条带很细，有可能什么原因，谢谢！

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把上样量减少至1/3试试

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:00

请教楼主一个问题，也看到了老师的一些关于WB的精彩解答，近来做WB遇到一个抗体IL-8，样品来源是老鼠的子宫，做的时候很棘手，一抗是abcom的货号是ab7747，一开始就用了16%的SDS-PAGE胶，但是重复过几次，也加大上样量，也提高抗体浓度到1：50，但是曝光还是一片空白，想请问老师这个指标该怎么做会好些，已经做了2个多月了，

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IL-8不适合进行WB检测

作者: kuaizige 时间: 2013-3-26 15:02

老师您好，我做ER alpha，条件没有任何变化的情况下，去年能做出的条带今年做不出来。今年阳性对照能做出来目标条带，去年能做出来的细胞今年做出来的条带比目的条带要低，大概是什么问题啊，我用的是santa的一抗。蛋白都是今年新提的，应该不是蛋白降解的原因。谢谢！

作者: finger 时间: 2013-3-26 15:02

想请问下楼主，心肌的eNOS和p-eNOS，我用的半干转，选择什么样的转膜条件比较好呢？
PVDF膜，先行谢过。

作者: H2O 时间: 2013-3-26 15:03

1、说明书是否提示可以提取出核蛋白？
2、转膜液要加0.01% SDS，300mA恒流 2h30min
3、不一样

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我看bio-rad推荐的电泳缓冲液跟转膜缓冲液都是25mM Tris，192mM glycine，版主能给个电泳缓冲液跟转膜缓冲液的配方吗？我用核蛋白裂解液提了一次蛋白，转膜没加SDS用300mA 1h做了一次，目的蛋白的两条带做出来了，上样量不太一致，大概是30ug。

版主能不能帮我看看图，是否需要在做些调整
还有一个问题就是我用的内参是GAPDH、还有我的另一个目标蛋白是56KD，假如加了SDS的话对这两个蛋白的转膜会不会有影响呢，如果有该怎么解决，能不能给一个方案，谢谢！！！

图片附件: 14711898.jpg (2013-3-26 15:03, 8.38 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15354

作者: langlang 时间: 2013-3-26 15:03

我做WB，三个样本，怎么只能跑出来一个条带？

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-26 15:04

再次**有谁做过SFRP1或者SFRP5的抗体没，结果怎么样，抗体购自什么公司。。。万分感谢。。。

作者: 04906 时间: 2013-3-26 15:05

老师您好，我想问一下一般情况下小分子蛋白转膜的时候会不会转过？我有一个是100kd左右，另外一个是20kd,想剪开来分开做，这样的话省时间，请问转摸的条件应该怎么设置？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:05

老师您好，我做ER alpha，条件没有任何变化的情况下，去年能做出的条带今年做不出来。今年阳性对照能做出来目标条带，去年能做出来的细胞今年做出来的条带比目的条带要低，大概是什么问题啊，我用的是santa的一抗。蛋白都是今年新提的，应该不是蛋白降解的原因。谢谢！

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找系统的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:08

想请问下楼主，心肌的eNOS和p-eNOS，我用的半干转，选择什么样的转膜条件比较好呢？
PVDF膜，先行谢过。

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最好用湿转

如果半干
1.2mA 每平方厘米膜面积，恒流，转膜1h30min

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:09

我看bio-rad推荐的电泳缓冲液跟转膜缓冲液都是25mM Tris，192mM glycine，版主能给个电泳缓冲液跟转膜缓冲液的配方吗？我用核蛋白裂解液提了一次蛋白，转膜没加SDS用300mA 1h做了一次，目的蛋白的两条带做出来了，上样量不太一致，大概是30ug。

版主能不能帮我看看图，是否需要在做些调整
还有一个问题就是我用的内参是GAPDH、还有我的另一个目标蛋白是56KD，假如加了SDS的话对这两个蛋白的转膜会不会有影响呢，如果有该怎么解决，能不能给一个方案，谢谢！！！

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有电泳后SDS-PAGE 考马斯亮蓝染色的图片吗

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:10

老师您好，我想问一下一般情况下小分子蛋白转膜的时候会不会转过？我有一个是100kd左右，另外一个是20kd,想剪开来分开做，这样的话省时间，请问转摸的条件应该怎么设置？

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湿转的话
中间可以停

作者: okhaha 时间: 2013-3-26 15:12

湿转的话
中间可以停

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我的意思是同一张膜，想剪开孵两个蛋白，但是两个蛋白分子量相差较大，要保证大分子完全转成的话，怕小分子蛋白转过了。

作者: 火树银花nm 时间: 2013-3-26 15:12

老师，我想问一下，我转膜的时候，电流、时间跟以前一样，就是转出来后，发现胶变形了，有的地方转的不完全，是怎么回事呢？谢谢

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-26 15:13

老师好，请教个问题，最近在做MMp-9的Western，配的8%的胶，一抗已经加大到1:50了，推荐的最大浓度是1:100，上样量也加到100微克，0.45的转膜，电流250mA，时间95分钟到2小时都试过，二抗是1:10000，抗山羊的，ECL显影，但就做不出来，内参是有的，是因为是分泌型蛋白太少了，提蛋白就分解了?还是转膜时间有问题？还是什么其他的问题？最近整的恼火的很，怎么才能出来呢？谢谢谢谢，给点意见吧

作者: biabiade 时间: 2013-3-26 15:13

老师你好，我是刚从临床下来做实验的菜鸟，这里有个问题请教。
分别从组织中和细胞中提取目标蛋白，都有用内参，但是组织中提取的蛋白可见两条条带（两条带相隔较远，杂带相对于目标蛋白信号弱），而细胞提取的蛋白则只显示一条，这是为什么？是不是可以认为是从组织提取蛋白的时候使用的胶原酶使这种蛋白发生降解，以至于在细胞培养之后再提取蛋白而无法表达？

作者: BUK 时间: 2013-3-26 15:14

老师你好，我想请教一个问题：我要做P16蛋白，分子量是16KD，我能用一般的SDS-PAGE胶么？如果能用分离胶配15%的可以么？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:16

我的意思是同一张膜，想剪开孵两个蛋白，但是两个蛋白分子量相差较大，要保证大分子完全转成的话，怕小分子蛋白转过了。

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用0.22um孔径的膜
把胶切开转膜

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:16

老师好，请教个问题，最近在做MMp-9的Western，配的8%的胶，一抗已经加大到1:50了，推荐的最大浓度是1:100，上样量也加到100微克，0.45的转膜，电流250mA，时间95分钟到2小时都试过，二抗是1:10000，抗山羊的，ECL显影，但就做不出来，内参是有的，是因为是分泌型蛋白太少了，提蛋白就分解了?还是转膜时间有问题？还是什么其他的问题？最近整的恼火的很，怎么才能出来呢？谢谢谢谢，给点意见吧

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这个蛋白不存在做不出来的问题吧
应该做出来多条带才对
用的一抗是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:16

老师你好，我是刚从临床下来做实验的菜鸟，这里有个问题请教。
分别从组织中和细胞中提取目标蛋白，都有用内参，但是组织中提取的蛋白可见两条条带（两条带相隔较远，杂带相对于目标蛋白信号弱），而细胞提取的蛋白则只显示一条，这是为什么？是不是可以认为是从组织提取蛋白的时候使用的胶原酶使这种蛋白发生降解，以至于在细胞培养之后再提取蛋白而无法表达？

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细胞与组织中蛋白表达是有所不同的
试一试调整一抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:16

老师你好，我想请教一个问题：我要做P16蛋白，分子量是16KD，我能用一般的SDS-PAGE胶么？如果能用分离胶配15%的可以么？

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用12%或者15%的均可
没问题

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-26 15:17

我想请教一个问题，我的蛋白是从细胞里面提取，指标是P-smad3（CST# 9520)，提取的时候加了磷酸化蛋白酶抑制剂，提取蛋白浓度大概是2ug/ul，上样量20ul，转膜200mA 2h，5%BSA室温封闭2h，一抗1：500 ，4°C过夜，
二抗1：10000，室温1h，但是现在做出来的结果是白片，请教楼主该怎么调整。

作者: 131415 时间: 2013-3-26 15:18

请问在WB曝光结束后，会再胶片上存在很多黑色的点点，我怀疑是二抗不够纯净，里面存在某种杂质。不知道我说的对不对，还请楼主帮忙解答。因为二抗是我们自己做的，一开始认为是封闭时候牛奶里面存在不溶的物质导致粘到PVDF膜上了，但是后来换用BSA，还是存在很多黑点点。请问楼主是否遇到过，有什么好的方法解决呢？

作者: orangecake 时间: 2013-3-26 15:18

版主您好，最近做western出了点问题。加了sigma的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，可是老也不出点，总是一片。目的蛋白分子量120kd，半干转150ma 90min，5%bsa block 2h，调整了抗体浓度及稀释液，怎么也不出来漂亮的点。请教版主。

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作者: PINK 时间: 2013-3-26 15:19

请问楼主有没有用过Santa的抗体啊，我最近用Santa的抗体做，前几次跑出很多杂带，现在压根什么都没有了，恳请楼主指点一二，谢谢！

作者: koook5695 时间: 2013-3-26 15:20

老师，您好！请教，在转膜的时候有哪些因素能够导致转膜不均匀，即我用的15孔梳，1-6泳道转膜后丽春红染色能看见条带，7-13泳道个别泳道能看见条带（有的有，有的没有，但均不如1-6泳道）。

请问老师
1、对于这种各泳道转膜不均匀，两边转膜效率高，中间转膜效率低的情况我应该从哪些方面着手考虑调整呢？
2、还有就是我两张膜放在一个夹子里，若恒流的话，电流需要提高1倍吗？谢谢老师！
以下是我的转膜条件。
目的蛋白：内参β-actin（42kda）
电转液：新鲜配制
PVDF膜
转膜恒流：湿转，100mA（我们的电源是六一的DYY-8C，电流最高只能上到200mA）
转膜时间：50min，转膜期间电压在145V-140V之间变动
制作转膜夹心时有用玻璃棒赶过气泡，每放一层都赶，但是否全部赶走从结果看还真不好判断，转膜完后没有用考马斯亮蓝染胶，曝光出来的条带趋势和丽春红染色的一致。

作者: purrr 时间: 2013-3-26 15:21

版主，你好，第一次加了发光液后压片曝光40分钟，目的有曝出来，但不是很好看，又曝了一遍稍微好一点，之后还想重新曝，又怕荧光猝灭，所以在TBST里放了2分钟，没有摇，再加发光液就曝不出来了。。。不知道是什么原因，纠结中，希望能帮我解惑，谢谢！另外，如果把膜洗了重新封闭孵一抗，会不会影响膜上的目的蛋白含量啊？以至于曝不出来。。。

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-26 15:21

求楼主分析一下我的胶图，10% SDSPAGE， transfer完用考蓝染色，条带还可以，但是用抗体develope后，出现条带只有一半的现象，不知道何解？请楼主指教！

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作者: 49888 时间: 2013-3-26 15:22

我做western blot时为什么有些蛋白在目的位置会分出两条离得很近的带，应该不是方法的原因，因为有些是一条带！一直没搞清楚原因，希望得到指点！！！谢谢……

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作者: ququer787 时间: 2013-3-26 15:23

这个蛋白不存在做不出来的问题吧
应该做出来多条带才对
用的一抗是哪里的？

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老师好，用的一抗是santa的，还有一次用丽春红染色有泳道，那就说明蛋白转上去了，但显影发现图像很模糊，不集中，不知道是什么原因呢？与电流有关吗？我用的是350mA,谢谢

作者: lgm 时间: 2013-3-26 15:23

我的实验动物分两组，假手术与模型组，每组10个样本。Western blot法检测某蛋白，得到了目的蛋白与β-action的灰度比值，但我想这种比值是没有单位的，这种数据可以用独立样本t检验来统计吗？还是需要非参数检验？求各位高手指点。如果能告诉我为什么就更好了。
ps：我的数据方差不齐。

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:25

我想请教一个问题，我的蛋白是从细胞里面提取，指标是P-smad3（CST# 9520)，提取的时候加了磷酸化蛋白酶抑制剂，提取蛋白浓度大概是2ug/ul，上样量20ul，转膜200mA 2h，5%BSA室温封闭2h，一抗1：500 ，4°C过夜，
二抗1：10000，室温1h，但是现在做出来的结果是白片，请教楼主该怎么调整。

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内参做的怎么样

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:29

请问在WB曝光结束后，会再胶片上存在很多黑色的点点，我怀疑是二抗不够纯净，里面存在某种杂质。不知道我说的对不对，还请楼主帮忙解答。因为二抗是我们自己做的，一开始认为是封闭时候牛奶里面存在不溶的物质导致粘到PVDF膜上了，但是后来换用BSA，还是存在很多黑点点。请问楼主是否遇到过，有什么好的方法解决呢？

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这种情况一般出现在一抗质量、膜污染、一抗重复使用等
二抗不会造成黑点点

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:33

版主您好，最近做western出了点问题。加了sigma的蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂，可是老也不出点，总是一片。目的蛋白分子量120kd，半干转150ma 90min，5%bsa block 2h，调整了抗体浓度及稀释液，怎么也不出来漂亮的点。请教版主。

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检测的是糖蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:33

请问楼主有没有用过Santa的抗体啊，我最近用Santa的抗体做，前几次跑出很多杂带，现在压根什么都没有了，恳请楼主指点一二，谢谢！

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santa抗体坑爷爷
我自己很少订购
除非万不得已

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:33

老师，您好！请教，在转膜的时候有哪些因素能够导致转膜不均匀，即我用的15孔梳，1-6泳道转膜后丽春红染色能看见条带，7-13泳道个别泳道能看见条带（有的有，有的没有，但均不如1-6泳道）。
请问老师
1、对于这种各泳道转膜不均匀，两边转膜效率高，中间转膜效率低的情况我应该从哪些方面着手考虑调整呢？
2、还有就是我两张膜放在一个夹子里，若恒流的话，电流需要提高1倍吗？谢谢老师！
以下是我的转膜条件。
目的蛋白：内参β-actin（42kda）
电转液：新鲜配制
PVDF膜
转膜恒流：湿转，100mA（我们的电源是六一的DYY-8C，电流最高只能上到200mA）
转膜时间：50min，转膜期间电压在145V-140V之间变动
制作转膜夹心时有用玻璃棒赶过气泡，每放一层都赶，但是否全部赶走从结果看还真不好判断，转膜完后没有用考马斯亮蓝染胶，曝光出来的条带趋势和丽春红染色的一致。

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膜与胶没有压平整
膜与胶必须在一块压好了
多放点滤纸
夹紧

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:34

版主，你好，第一次加了发光液后压片曝光40分钟，目的有曝出来，但不是很好看，又曝了一遍稍微好一点，之后还想重新曝，又怕荧光猝灭，所以在TBST里放了2分钟，没有摇，再加发光液就曝不出来了。。。不知道是什么原因，纠结中，希望能帮我解惑，谢谢！另外，如果把膜洗了重新封闭孵一抗，会不会影响膜上的目的蛋白含量啊？以至于曝不出来。。。

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曝光40min才能曝出来
这已经不好了
一般WB的曝光时间超过5min就不好

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:34

求楼主分析一下我的胶图，10% SDSPAGE， transfer完用考蓝染色，条带还可以，但是用抗体develope后，出现条带只有一半的现象，不知道何解？请楼主指教！

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转膜的问题
注意转膜气泡、夹紧胶与膜等
孵育抗体要重复覆盖膜

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:35

我做western blot时为什么有些蛋白在目的位置会分出两条离得很近的带，应该不是方法的原因，因为有些是一条带！一直没搞清楚原因，希望得到指点！！！谢谢……

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一抗的问题可能性最大

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:35

老师好，用的一抗是santa的，还有一次用丽春红染色有泳道，那就说明蛋白转上去了，但显影发现图像很模糊，不集中，不知道是什么原因呢？与电流有关吗？我用的是350mA,谢谢

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santa的一抗就好理解了

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:35

我的实验动物分两组，假手术与模型组，每组10个样本。Western blot法检测某蛋白，得到了目的蛋白与β-action的灰度比值，但我想这种比值是没有单位的，这种数据可以用独立样本t检验来统计吗？还是需要非参数检验？求各位高手指点。如果能告诉我为什么就更好了。
ps：我的数据方差不齐。

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是没有单位的
最后是比值
可以进行统计

作者: u234 时间: 2013-3-26 15:36

我做的内参是GAPDH，做的还比较齐的，内参条带曝光的时候条带很亮，就是P-smad做不出来，

作者: dog002 时间: 2013-3-26 15:36

请教楼主，10% SDS-PAGE 转膜400mA 1h，用考染显示仍有很多蛋白没有过，而且marker中间会有一个条带？似乎不同样本之间的pattern也不同，这是为什么？最浓的那条是不是actin之类的？

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作者: cj_mondy 时间: 2013-3-26 15:37

bd 公司推荐的湿转方案，可我们平时做的好像只有一半，请问楼主怎么评价？还有一个tank里面如果放一张膜和放多张膜的转膜条件是不是不一样，我是指恒流的情况，谢谢！

PROTEIN BLOTTING

Wet Transfer

Transfer Buffer: 25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% MeOH, pH adjusted to 8.0.

Note: Since extra negative charges are needed to reach 1 Amp in a wet transfer system, adjust the pH of the transfer buffer to approximately pH 8.0 using NaOH.

For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250 mAmp for 3 hours or 500 mAmp for 90 minutes) in transfer buffer.
For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour or equivalent (250 mAmp for 4 hours or 500 mAmp for 2 hours) in transfer buffer.
For proteins larger than 120 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250 mAmp for 6 hours or 500 mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS.
For Proteins larger than 250 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500 mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS.

* To ensure complete transfer of large molecular weight proteins (as in 3 and 4 above), 0.05% SDS can be added to the transfer buffer.

作者: greenbee 时间: 2013-3-26 15:38

请教楼主：最近在跑LC3蛋白。按理说应该出现两个条带，结果只有一条…LC3一型和二型的分子量分别是14和16KD，请问用什么方法可以使它们分开呢？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:38

请教楼主，10% SDS-PAGE 转膜400mA 1h，用考染显示仍有很多蛋白没有过，而且marker中间会有一个条带？似乎不同样本之间的pattern也不同，这是为什么？最浓的那条是不是actin之类的？

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这个转膜效果够差的哈

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:38

bd 公司推荐的湿转方案，可我们平时做的好像只有一半，请问楼主怎么评价？还有一个tank里面如果放一张膜和放多张膜的转膜条件是不是不一样，我是指恒流的情况，谢谢！

PROTEIN BLOTTING

Wet Transfer

Transfer Buffer: 25 mM Tris, 190 mM glycine, 20% MeOH, pH adjusted to 8.0.

Note: Since extra negative charges are needed to reach 1 Amp in a wet transfer system, adjust the pH of the transfer buffer to approximately pH 8.0 using NaOH.

For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250 mAmp for 3 hours or 500 mAmp for 90 minutes) in transfer buffer.
For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour or equivalent (250 mAmp for 4 hours or 500 mAmp for 2 hours) in transfer buffer.
For proteins larger than 120 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250 mAmp for 6 hours or 500 mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS.
For Proteins larger than 250 kDa, transfer to PVDF membrane at 1 Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500 mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS.

* To ensure complete transfer of large molecular weight proteins (as in 3 and 4 above), 0.05% SDS can be added to the transfer buffer.

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tris，glycine试剂用的是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:39

请教楼主：最近在跑LC3蛋白。按理说应该出现两个条带，结果只有一条…LC3一型和二型的分子量分别是14和16KD，请问用什么方法可以使它们分开呢？谢谢！

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这个不好说
我最近也做了
样品不同而已，相同抗体
有一批样品就是两条带
另一批就是只有一条带
灰常奇怪

作者: S6044 时间: 2013-3-26 15:39

这个不好说
我最近也做了
样品不同而已，相同抗体
有一批样品就是两条带
另一批就是只有一条带
灰常奇怪

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请问版主用的哪个公司的LC3抗体货号能说一下吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:40

请问版主用的哪个公司的LC3抗体货号能说一下吗？

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CST 4108

作者: xue258 时间: 2013-3-26 15:40

我看到有人用tricine胶跑LC3，两条带分得挺开的，准备试试

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-26 15:41

老师：这是我做的caspase-3,一抗用的是H-277 ，浓度是1：500，第一次在marker中做出一清晰条带（右边第一个箭头），而且位于35KD处，我不知道是不是marker中也有caspase-3？它下面一条弱的条带算是什么？杂带？中间两个箭头是样本的条带，位置略高一点，它算不算目的条带？左边箭头的条带与marker的弱条带同一水平，是激活的
caspase-3？但位置太高了。是杂带？还有组织蛋白2ug的上样量用于做caspase-3够么？

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作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-26 15:42

请教楼主：最近在跑LC3蛋白。按理说应该出现两个条带，结果只有一条…LC3一型和二型的分子量分别是14和16KD，请问用什么方法可以使它们分开呢？谢谢！

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我也在做lc3，是组织的，但是一直没有条带，请问转膜条件是多少。
目的蛋白：LC3
电转液：新鲜配制
PVDF膜 0.22
转膜恒流：湿转，我们的电源是六一的转膜仪是百晶的
在这同问版主，谢谢！

作者: 雪山飞鹿 时间: 2013-3-26 15:43

检测的是糖蛋白？

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是膜蛋白，我一共检测3个，有一个还可以，另外2个总是如图那样的模糊，像是分解了，可我抑制剂都加了啊。求教。

作者: wsll 时间: 2013-3-26 15:44

我也在做lc3，是组织的，但是一直没有条带，请问转膜条件是多少。
目的蛋白：L...

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我的转膜条件是290mA 100min
用的是bio rad转的…

作者: 2541 时间: 2013-3-26 15:44

楼主，你好，请教一个问题，我需要检测p-IRS-1(170KD),P-AKT(60KD),GLUT4(43~55KD),Tublin，可以在一张胶上检测这些蛋白吗？用多少浓度的胶合适呢？需要把胶分开转膜吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:46

我做的内参是GAPDH，做的还比较齐的，内参条带曝光的时候条带很亮，就是P-smad做不出来

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在做p-smad之前，检测smad没有？
p-smad在部分情况下可能存在表达弱或者不表达的情况
与检测敏感性等也会有关系

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:46

老师：这是我做的caspase-3,一抗用的是H-277 ，浓度是1：500，第一次在marker中做出一清晰条带（右边第一个箭头），而且位于35KD处，我不知道是不是marker中也有caspase-3？它下面一条弱的条带算是什么？杂带？中间两个箭头是样本的条带，位置略高一点，它算不算目的条带？左边箭头的条带与marker的弱条带同一水平，是激活的
caspase-3？但位置太高了。是杂带？还有组织蛋白2ug的上样量用于做caspase-3够么？

======================================

我们一般组织上样量是15-20ug
marker中有时候会有杂带等出现
caspase-3的具体位置从你的图片中不好判断

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:47

是膜蛋白，我一共检测3个，有一个还可以，另外2个总是如图那样的模糊，像是分解了，可我抑制剂都加了啊。求教。

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膜蛋白有可能会有拖尾，模糊等情况呢

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:47

楼主，你好，请教一个问题，我需要检测p-IRS-1(170KD),P-AKT(60KD),GLUT4(43~55KD),Tublin，可以在一张胶上检测这些蛋白吗？用多少浓度的胶合适呢？需要把胶分开转膜吗？

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一块胶检测这些指标不太好
分两到三次做吧

作者: wu11998866 时间: 2013-3-26 15:48

相关疾病：
头痛

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我们一般组织上样量是15-20ug
marker中有时候会有杂带等出现
caspase-3的具体位置从你的图片中不好判断

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下面是做caspase-3胶片，左边第一个箭头是marker 34的位置，另外3个箭头是让我头疼的条带，出的特别漂亮，特别亮，可就是位置不对，都在marker的顶端，我不知道你们做WB时，杂带有出的这么漂亮的么？有可能是目的条带么？不止一张膜出现这样的条带，我不知道如何解释。

图片附件: 30775533.jpg (2013-3-26 15:48, 21.23 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15362

作者: zwsyrt 时间: 2013-3-26 15:49

以前不这样，最近跑western，为什么跑到分离胶压成一条线后，溴酚蓝立即开始弥散了，这是为什么啊？急求大师知道啊？？？经常这样现在

作者: DNA 时间: 2013-3-26 15:49

你好，我现在遇到的问题很困惑，
1.我的样品处理之后离心取上清，上清加buffer煮了之后再离心会离下来很多白色的沉淀，量很大，不知道是什么啊，以前做的都没有
2.最近突然western做不出来了，我各种原因都排除了一下，只有奶粉的不好确定，我的抗体稀释都是用5%的脱脂奶粉稀释的，奶粉还没有过期，不过快过期了，会不会有影响？

作者: one 时间: 2013-3-26 15:50

老师你好！
我一直都有楼上那样的问题，loading完以后离心完都有沉淀，

但这次我改用玻璃匀浆器提的，组织很少，只加了400vl的裂解液，4vl的PMSF，加loading煮沸10min后，离心5min，电泳时加样孔底有蓝斯沉淀，一会儿就跑没了，考马斯染胶后有纵型的竖道，
我想问一下会不会是细胞没裂解完全的原因
想提高蛋白浓度，要是想在用超声超一下好不好，肝脏组织，300vl用超声怎么超呀

作者: ero11 时间: 2013-3-26 15:50

楼主您好，我最近做磷酸化ERK，一直做不出来，一抗是CST货号#9106，说明书建议1:2000稀释,。我1:1000,1:500都试过了，可就是没有条带，条带处背景很深，二抗稀释比例也调节了，还是做不出来。但一起做的P-AKT就能做出来，磷酸化水平肯定是有的。用5%BSA稀释抗体试过（封闭是5%脱脂牛奶），偶尔能模糊的看到条带，但背景很深，恳请楼主分析原因，谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:51

下面是做caspase-3胶片，左边第一个箭头是marker 34的位置，另外3个箭头是让我头疼的条带，出的特别漂亮，特别亮，可就是位置不对，都在marker的顶端，我不知道你们做WB时，杂带有出的这么漂亮的么？有可能是目的条带么？不止一张膜出现这样的条带，我不知道如何解释。

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杂带很漂亮
这种情况我们也经常出
二抗是哪里的？
二抗也会带出杂带的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:51

以前不这样，最近跑western，为什么跑到分离胶压成一条线后，溴酚蓝立即开始弥散了，这是为什么啊？急求大师知道啊？？？经常这样现在

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注意配胶Tris-HCl的pH

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:51

你好，我现在遇到的问题很困惑，
1.我的样品处理之后离心取上清，上清加buffer煮了之后再离心会离下来很多白色的沉淀，量很大，不知道是什么啊，以前做的都没有
2.最近突然western做不出来了，我各种原因都排除了一下，只有奶粉的不好确定，我的抗体稀释都是用5%的脱脂奶粉稀释的，奶粉还没有过期，不过快过期了，会不会有影响？

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1、蛋白浓度太高，调整至8mg/ml以下
2、loading buffer是自己配制的吗？
3、离心的时候温度多少？需要排除是否为SDS的结晶影响（Amresco现在的SDS就是容易结晶）
4、奶粉不会有影响，注意各种缓冲液的pH吧，检查是否换过某些试剂

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:52

老师你好！
我一直都有楼上那样的问题，loading完以后离心完都有沉淀，

但这次我改用玻璃匀浆器提的，组织很少，只加了400vl的裂解液，4vl的PMSF，加loading煮沸10min后，离心5min，电泳时加样孔底有蓝斯沉淀，一会儿就跑没了，考马斯染胶后有纵型的竖道，
我想问一下会不会是细胞没裂解完全的原因
想提高蛋白浓度，要是想在用超声超一下好不好，肝脏组织，300vl用超声怎么超呀

===================================

1、蛋白浓度太高会造成
2、这种提取蛋白的方法要不得
3、300ul当然可以超声，小超声头就可以
我们的可以超100ul

作者: NBA 时间: 2013-3-26 15:52

楼主您好，我最近做磷酸化ERK，一直做不出来，一抗是CST货号#9106，说明书建议1:2000稀释,。我1:1000,1:500都试过了，可就是没有条带，条带处背景很深，二抗稀释比例也调节了，还是做不出来。但一起做的P-AKT就能做出来，磷酸化水平肯定是有的。用5%BSA稀释抗体试过（封闭是5%脱脂牛奶），偶尔能模糊的看到条带，但背景很深，恳请楼主分析原因，谢谢！

=================================

这个蛋白还是比较容易做的
在正常情况下也有表达
p-akt能做出来，但是p-erk做不出来？
奇怪哦，这个原因。。。
两者的二抗用的相同吗？

作者: remenb 时间: 2013-3-26 15:53

这个蛋白还是比较容易做的
在正常情况下也有表达
p-akt能做出来，但是p-erk做不出来？
奇怪哦，这个原因。。。
两者的二抗用的相同吗？

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二抗相同，都是鼠二抗，我也不知道什么原因。我现在怀疑会不会抗体有问题，可CST的信号通路抗体不是很好吗？而且抗体不像假的

作者: 3N4G 时间: 2013-3-26 15:53

1、蛋白浓度太高，调整至8mg/ml以下
2、loading buffer是自己配制的吗？
3、离心的时候温度多少？需要排除是否为SDS的结晶影响（Amresco现在的SDS就是容易结晶）
4、奶粉不会有影响，注意各种缓冲液的pH吧，检查是否换过某些试剂

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loading buffer是自己配的，离心是4度离心的，25min，1000rpm

作者: 3N4G 时间: 2013-3-26 15:58

对了，我还想问用PBS和PBST有区别吗？

作者: pencil菲 时间: 2013-3-26 15:59

你好，我的目的蛋白，108kd，转膜200ma，2h。从左到右，sample1-3，阳性对照（公司提供的）。
0

问题:
1, 为什么公司的阳性对照（其实就是一种细胞的裂解液）只有一条，我的sample有两条带呢？那我算灰度是只算上面的一条还是两条加起来？

2, 很郁闷的情况，内参没有曝出来。内参为GAPDH，一抗是CST的，1:1000稀释，二抗是CST的，1:1000稀释。排除一二抗问题（我的一抗最近借过给别人用，别人能曝出来，二抗跟别人合用也正常曝光）。至于信号太强淬灭应该不会，因为我加了发光液就没看到膜上有光，上样量也不大（25ug）。求解答！

3，这个问题跟前两个没有关系，我还做过一次整张膜都发光的（另外的蛋白），很强，带都基本看不出来了，想问楼主这种下次改进应该是先降低抗体浓度还是其他好一点呢？（曝完光发现整张发光我又TBST洗了3x10min后重新加发光液还是差不多，是否能说明洗膜的问题不大）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15363

作者: 66+77 时间: 2013-3-26 16:00

1、蛋白浓度太高会造成
2、这种提取蛋白的方法要不得
3、300ul当然可以超声，小超声头就可以
我们的可以超100ul

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请问老师我提蛋白的方法那个地方有错误啊？

作者: Ao7 时间: 2013-3-26 16:01

注意配胶Tris-HCl的pH

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买的现成的啊，碧云天的，新的刚开的一瓶

作者: Ao7 时间: 2013-3-26 16:02

版主，看，溴酚蓝弥散就是这样，不知道为什么，以前做都是好好地，不知道从那一天开始，跑胶就跑成这样了，所有的配胶的都是买的碧云天现成的

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15364

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-26 16:02

学习做WB，缺少经验。请教一下：
我看到一个1*GLB细胞裂解液配制方法：SDS 0.4g，甘油2ml，1.0M Tris ,PH6.8，1ml，加双蒸水至20ml，常温保存。配制起来较为方便。如果用来提培养细胞的细胞总蛋白，效果怎样？我要测蛋白表达。
如果效果可以，可以免去购买RIPA的花费了。

作者: 剪刀手520 时间: 2013-3-26 16:03

今天跑胶的时候marker挺清楚的，是沿着泳道下来的平直条带，但转膜后marker有的条带歪了，偏向一个方向，如图所示，而且中间有的条带几乎看不见。这是为什么？不止一次出现这个问题了。以为是转膜时夹的不够紧，但多加了几层滤纸还是会出现这种情况。另外今天转了两块胶

一块没问题，一块就是这个样子。。。。求高手指点。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15365

作者: youyou99 时间: 2013-3-26 16:04

为何蛋白条带的位置总是不对，有时是β-actin跑到55kD（应该是43kD），有时是目的条带跑到170kD以上（应该是150kD）

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:05

你好，我的目的蛋白，108kd，转膜200ma，2h。从左到右，sample1-3，阳性对照（公司提供的）。

问题:
1, 为什么公司的阳性对照（其实就是一种细胞的裂解液）只有一条，我的sample有两条带呢？那我算灰度是只算上面的一条还是两条加起来？

2, 很郁闷的情况，内参没有曝出来。内参为GAPDH，一抗是CST的，1:1000稀释，二抗是CST的，1:1000稀释。排除一二抗问题（我的一抗最近借过给别人用，别人能曝出来，二抗跟别人合用也正常曝光）。至于信号太强淬灭应该不会，因为我加了发光液就没看到膜上有光，上样量也不大（25ug）。求解答！

3，这个问题跟前两个没有关系，我还做过一次整张膜都发光的（另外的蛋白），很强，带都基本看不出来了，想问楼主这种下次改进应该是先降低抗体浓度还是其他好一点呢？（曝完光发现整张发光我又TBST洗了3x10min后重新加发光液还是差不多，是否能说明洗膜的问题不大）

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1、阳性对照这个问题不好说
2、内参没有曝出来需要检查一下WB系统
3、二抗浓度调整一下试试

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:05

请问老师我提蛋白的方法那个地方有错误啊？

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匀浆后为啥直接加loading 煮？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:05

买的现成的啊，碧云天的，新的刚开的一瓶

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换用别人实验室的没有问题的Tris-HCl试试

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:06

学习做WB，缺少经验。请教一下：
我看到一个1*GLB细胞裂解液配制方法：SDS 0.4g，甘油2ml，1.0M Tris ,PH6.8，1ml，加双蒸水至20ml，常温保存。配制起来较为方便。如果用来提培养细胞的细胞总蛋白，效果怎样？我要测蛋白表达。
如果效果可以，可以免去购买RIPA的花费了。

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如果用量少的话
还是建议买点靠谱的

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:06

今天跑胶的时候marker挺清楚的，是沿着泳道下来的平直条带，但转膜后marker有的条带歪了，偏向一个方向，如图所示，而且中间有的条带几乎看不见。这是为什么？不止一次出现这个问题了。以为是转膜时夹的不够紧，但多加了几层滤纸还是会出现这种情况。另外今天转了两块胶

，一块没问题，一块就是这个样子。。。。求高手指点。

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1、可能夹的不紧
2、转了两块胶是什么意思？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:06

为何蛋白条带的位置总是不对，有时是β-actin跑到55kD（应该是43kD），有时是目的条带跑到170kD以上（应该是150kD）
检查一下胶浓度是否正确

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胶浓度不同，蛋白表观分子量是不同的

作者: langlang 时间: 2013-3-26 16:07

匀浆后为啥直接加loading 煮？

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这就是有些不怎么做这方面的人在那里乱搞，之前也有听说这样：直接把loading当成裂解液裂解，匀浆加煮沸相当于一个破碎的过程，而煮沸相当于增溶的过程，这样可以大大缩短时间，可以尽量低的减少蛋白的降解~~
我觉得他的目的是这样，事实我个人觉得这种方法是不靠谱的~~

作者: IAM007 时间: 2013-3-26 16:07

相关疾病：
肿瘤
老师，您好！请教下，我的western blot结果重复性不好。我的结果是用目的蛋白条带灰度值比上内参actin条带灰度值，每次做出来的条带都很好，非常清晰。上样之前蛋白都定量。但是做出来的结果很多时候不一样。比如我的肿瘤细胞在正常状态下，没有经过处理，直接检测目的蛋白表达。前一次做出来的结果是0.2，后一次就变为0.4。我将减少蛋白上样量，前一次结果为0.3，后一次为0.8左右，请问是什么原因？

作者: junhun 时间: 2013-3-26 16:08

你好，我现在在做Ace的，我们实验室公认的这个不好做。我的是细胞的，请问做这个蛋白有没有什么特别要注意的。

我现在是用300的mark，8%的胶，电泳的条件是电压110电流最大时间110，转膜电压最大，电流200.时间240分。牛奶封闭2小时，一抗1:400过夜，洗4个10分，加二抗1:4000孵育1小时，洗膜4个10分，加显影液，用uvp拍照。

但是几乎没做出来过？

作者: kuaizige 时间: 2013-3-26 16:08

你好，请帮我看下这几张片子，我要测的是histon H2A.X,买的是巴傲德公司的抗体，按照说明书1：500稀释，可是到今天为止我做了四次了，每次背景都是有星星点点状，我从这家公司同时还购进了NFKB以及actin，都没有这种情况，我想知道这其中可能的原因？

[ 本帖最后由 kuaizige 于 2013-3-26 16:09 编辑 ]

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作者: jkobn 时间: 2013-3-26 16:09

匀浆后为啥直接加loading 煮

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中间过程没写上
匀浆后放置30min左右，再离心，取上清，定量以后加的loading煮沸的。

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-26 16:10

匀浆后为啥直接加loading 煮？

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上面的帖子是我发的
中间不走我没写
匀浆后，放置30min，离心取上清，定量后按所需量定容后煮沸的。

作者: 周伯通pp 时间: 2013-3-26 16:10

蛋白：SD大鼠新生小鼠脑组织；一抗：GAPDH 是 bioworld公司的ap0063 ；二抗：是兔抗，一共做了四次了，都没显出条带来，不知道到底是什么原因，求各位大神给予指导，小女不胜感激！

作者: flyxx05 时间: 2013-3-26 16:11

你好！我想请教下254KD的蛋白，在电泳和电转时各需要注意什么？
以下是我的条件：6%分离胶，5%浓缩胶，电泳：70V，90V
电转：湿转290mA，3h，中间换了次冰，换了次电转液。
5%牛奶封闭室温1h，一抗4度冰箱过夜，敷完二抗TBST洗10min*4次。
marker终于转上了，发光后却仍是白板，立春红染膜之后没有发现蛋白条带。

作者: qhyu 时间: 2013-3-26 16:11

师哥，你好们，我想请问一下大分子蛋白的问题，我们电泳条件：浓缩胶80V，分离胶120V。转膜300mA 湿转3小时。
大分子一直做不出来，有的时候个别泳道会出现条带，但是很难看。
有的时候直接就是白板，想请教一下师哥，提蛋白，电泳，转膜，或者是别的方面，哪儿出错了
谢谢您的指教！

作者: wu11998866 时间: 2013-3-26 16:12

你好，我现在再跑pNR2B和pNR1的WB，分子量分别是190KD和120KD，8%的分离胶和5%浓缩胶，电泳是浓缩胶40V 1h，分离胶80v2.5h,转膜液加了SDS，湿转2h和1.5h,5%牛奶或5%的BSA封闭2h，一抗是CST的，4度孵育16h，洗3次，各10分钟，二抗室温2h，然后爆光，都没有条带，现在不知道怎么调整实验条件，还有转膜液中加了SDS，对转膜时间影响多大，不太明白啊，求指导，急!!!

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-26 16:12

检查一下胶浓度是否正确
胶浓度不同，蛋白表观分子量是不同的

=====================================================================

那150kD的目的蛋白，43kD的内参，应该用怎样的胶浓度呢，我们用的是10%的分离胶

作者: memory 时间: 2013-3-26 16:13

1、可能夹的不紧
2、转了两块胶是什么意思？

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就是在转印槽内同时转印两块胶，相同的转印条件，一块胶上的marker很清楚且条带平直，另一块就是那个样子，像没转过去。。。我是按200mA恒流转印的，两块胶同时转印，这个电流回路是分流吗？。。。物理不好。。

是说局部夹的不紧？可是感觉不出来啊，觉得把夹板扣上时挺紧的。。。怎么能避免这种情况呢？

作者: shenkunjie 时间: 2013-3-26 16:13

老师你好，最近想从小鼠肺提取蛋白质，请问从小鼠肺提取蛋白和从其他组织提取蛋白有什么不一样嘛？因为小鼠肺的蛋白量可能会比较低，请问提取蛋白时要用多大的组织块，需要整一个肺用上吗？

作者: laughing妹 时间: 2013-3-26 16:14

楼主帮忙给鉴别下电泳跑成这样有没有什么问题，我刚开始做，实验室没人指导。我最后出来的条带总是拉宽，接近于连成一条线

图片附件: 23946464.snap.jpg (2013-3-26 16:14, 45.66 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15370

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:14

这就是有些不怎么做这方面的人在那里乱搞，之前也有听说这样：直接把loading当成裂解液裂解，匀浆加煮沸相当于一个破碎的过程，而煮沸相当于增溶的过程，这样可以大大缩短时间，可以尽量低的减少蛋白的降解~~
我觉得他的目的是这样，事实我个人觉得这种方法是不靠谱的~~

==========================

如果是做定性的话
这种方法可以用
如果做定量也不能说不可以用
调起内参来就相当麻烦了
一般新手做不了

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:14

老师，您好！请教下，我的western blot结果重复性不好。我的结果是用目的蛋白条带灰度值比上内参actin条带灰度值，每次做出来的条带都很好，非常清晰。上样之前蛋白都定量。但是做出来的结果很多时候不一样。比如我的肿瘤细胞在正常状态下，没有经过处理，直接检测目的蛋白表达。前一次做出来的结果是0.2，后一次就变为0.4。我将减少蛋白上样量，前一次结果为0.3，后一次为0.8左右，请问是什么原因？

=========================================

这个比值您是如何处理的？
不同的膜之间不能直接这么做处理
需要有一个共同的样品作为不同膜之间的公用对照

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:15

你好，我现在在做Ace的，我们实验室公认的这个不好做。我的是细胞的，请问做这个蛋白有没有什么特别要注意的。

我现在是用300的mark，8%的胶，电泳的条件是电压110电流最大时间110，转膜电压最大，电流200.时间240分。牛奶封闭2小时，一抗1:400过夜，洗4个10分，加二抗1:4000孵育1小时，洗膜4个10分，加显影液，用uvp拍照。

但是几乎没做出来过？？？？？

=================================

这个蛋白在细胞中有表达吗？
整个操作过程从你描述的来看并无问题

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:15

你好，请帮我看下这几张片子，我要测的是histon H2A.X,买的是巴傲德公司的抗体，按照说明书1：500稀释，可是到今天为止我做了四次了，每次背景都是有星星点点状，我从这家公司同时还购进了NFKB以及actin，都没有这种情况，我想知道这其中可能的原因？

===========================

有些抗体我们也会碰到这种情况
请与公司联系

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:15

蛋白：SD大鼠新生小鼠脑组织；一抗：GAPDH 是 bioworld公司的ap0063 ；二抗：是兔抗，一共做了四次了，都没显出条带来，不知道到底是什么原因，求各位大神给予指导，小女不胜感激！

======================================

1、蛋白跑完电泳后进行考马斯亮蓝染胶了吗？
2、转膜后，用丽春红染膜了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:16

你好！我想请教下254KD的蛋白，在电泳和电转时各需要注意什么？
以下是我的条件：6%分离胶，5%浓缩胶，电泳：70V，90V
电转：湿转290mA，3h，中间换了次冰，换了次电转液。
5%牛奶封闭室温1h，一抗4度冰箱过夜，敷完二抗TBST洗10min*4次。
marker终于转上了，发光后却仍是白板，立春红染膜之后没有发现蛋白条带。

=================

做别的蛋白如何？
比如内参？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:16

师哥，你好们，我想请问一下大分子蛋白的问题，我们电泳条件：浓缩胶80V，分离胶120V。转膜300mA 湿转3小时。
大分子一直做不出来，有的时候个别泳道会出现条带，但是很难看。
有的时候直接就是白板，想请教一下师哥，提蛋白，电泳，转膜，或者是别的方面，哪儿出错了
谢谢您的指教！

==========================

大分子量本身量就比较少
难度比一般的还是要大一些
20-100K的蛋白做的怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:31

那150kD的目的蛋白，43kD的内参，应该用怎样的胶浓度呢，我们用的是10%的分离胶

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如果有条件
用5-15%的梯度胶

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:31

weirui1987 wrote:
就是在转印槽内同时转印两块胶，相同的转印条件，一块胶上的marker很清楚且条带平直，另一块就是那个样子，像没转过去。。。我是按200mA恒流转印的，两块胶同时转印，这个电流回路是分流吗？。。。物理不好。。

是说局部夹的不紧？可是感觉不出来啊，觉得把夹板扣上时挺紧的。。。怎么能避免这种情况呢？

==================

另一块是否放反了？

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:32

老师你好，最近想从小鼠肺提取蛋白质，请问从小鼠肺提取蛋白和从其他组织提取蛋白有什么不一样嘛？因为小鼠肺的蛋白量可能会比较低，请问提取蛋白时要用多大的组织块，需要整一个肺用上吗？

===================

要检测多少蛋白？
一般10个左右的蛋白
50mg肺组织足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:33

楼主帮忙给鉴别下电泳跑成这样有没有什么问题，我刚开始做，实验室没人指导。我最后出来的条带总是拉宽，接近于连成一条线

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考马斯亮蓝染胶结果呢？

作者: flower-201 时间: 2013-3-26 16:34

如果是做定性的话
这种方法可以用
如果做定量也不能说不可以用
调起内参来就相当麻烦了
一般新手做不了

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当时有人给我建议这么做的时候最大的初衷就是认为可以尽量缩短时间，不用再后续加loading变性，我自己也有做了，但事实上并没有缩短多少时间~~
就算是定性，也很盲目，由于加完loading，基本上是不能测浓度了，所以做起电泳来，基本上是属于盲上样，尤其是对于微量蛋白需要银染定性的，更是盲目，做出来电泳图很恐怖~~
理论上来讲，这的确是行得通的，但是我觉得会误导好些人，所以不推荐~~

作者: ritou1985 时间: 2013-3-26 16:34

老师好，请您指点迷津……
1. 我的实验室检测蚯蚓组织中的HSP70，之前做不出来，怀疑是蛋白浓度太低，现在我的蛋白浓度提高到5-8mg/ml，上样量达到100ug，但是还是在70kd出没有条带，在40KD处有条带，但是同一个样加在不同的加样孔，一个有条带一个没有条带，阳性对照在70KD有很明显的条带，这是怎么回事呢？

2. 在做转膜时，多次发现有一块胶上的溴酚蓝已经没有了，胶是完全透明的，膜上有marker；
另一块胶上却还有溴酚蓝，有时胶上的MARKER的70kd以上的条带在胶上还有残留，所以胶不是完全透明的，虽然膜上有完整的maker。
这个关系大吗？

3.
我的转膜条件是：
110mA
120min

电转移缓冲液是：
配制1L转移缓冲液，2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至总量为1L，PH9.2

浓缩胶是3%，分离胶10%

期待老师的回复！

作者: xingyi08 时间: 2013-3-26 16:35

大分子量本身量就比较少
难度比一般的还是要大一些
20-100K的蛋白做的怎么样？

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55的目的蛋白做的比较好，就是大分子做的不好，怀疑电泳，转膜甚至是提取哪儿出问题了。
师哥，有什么需要注意的吗

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:35

55的目的蛋白做的比较好，就是大分子做的不好，怀疑电泳，转膜甚至是提取哪儿出问题了。
师哥，有什么需要注意的吗

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应该都没啥大问题
转膜300mA 恒流，湿转，2h30min左右足够了

作者: jkobn 时间: 2013-3-26 16:36

另一块是否放反了？

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没有放反，还是转印过去了，只是效果不好

作者: DDD 时间: 2013-3-26 16:37

应该都没啥大问题
转膜300mA 恒流，湿转，2h30min左右足够了

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大师，我们转膜300mA 恒流，湿转，3h，唉，啥也没有，或者是偶尔出现几条带，还很难看。
求解！

作者: NBA 时间: 2013-3-26 16:38

大师，我们转膜300mA 恒流，湿转，3h，唉，啥也没有，或者是偶尔出现几条带，还很难看。
求解！

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多大浓度分离胶？
条带很难看是因为胶不好

作者: pengke1983 时间: 2013-3-26 16:38

做别的蛋白如何？
比如内参？

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还没有做内参，感觉膜上都没有转上蛋白。你的大分子电泳和电转条件如何？电泳液和电转液是怎么个配方啊？

作者: remenb 时间: 2013-3-26 16:39

请问条带跑成这样是什么原因啊，条带内粗细不均，同一个孔的带，部分亮，而部分较淡，以下是我不同曝光时间的内参条带。

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作者: 8princess8 时间: 2013-3-26 16:40

能帮我分析一下我这结果的原因吗
如图所示：这是我做出来的WB图片，目的蛋白分子是30KB，左侧的两个白点下面的是26分子量的位置，上面的是34的分子量的位置，一共有9个泳道，第五个泳道是加了正常细胞的蛋白（因为做的是组织杂带交多所以用细胞蛋白点了一个孔做阳性对照指示目的条带的位置），其他的泳道都是动物组织蛋白。我想问问两个白点之间的条带是不是就是我的目的条带？另外，如果是的话为什么条带是一条线呢，而且一点趋势都没有，请各为高手帮我分析分析啊。内参做出来没问题。一抗稀释比1:150（1:200,1:400都是白板)4度过夜，二抗稀释比1:5000室温1小时，5%脱脂奶粉室温封闭1小时12%的分离胶。

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作者: kulee 时间: 2013-3-26 16:41

多大浓度分离胶？
条带很难看是因为胶不好
分离胶是6%，浓缩胶是5%，还试过三层胶

作者: jujuba 时间: 2013-3-26 16:41

你好，我有一个在大家看似很菜的问题：二抗有没有特异性？比如说：我提蛋白后，想检测几种抗原的表达，一抗彼此都不一样，二抗是不是用一种就可以？谢谢，希望楼主不要见笑

作者: fsdd817 时间: 2013-3-26 16:42

样品跑离点样孔以后就发现了如图所示的漏样问题，因为要做WB ，导致最后的结果没有意义~

浓缩胶5% 分离胶12%，均是按着宝生物的配方所配置~

希望得到相应的解决，再次谢过了~

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作者: KGZ564 时间: 2013-3-26 16:44

考马斯亮蓝染胶结果呢？

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楼主你好：
我没有用考马斯染胶，这是我用dab显色做出来的目的蛋白的结果，marker很短但较粗，而条带却又细又长，这样的图能用么？另外，我的实验重复性很差，我先做的内参，出来后开始做目的蛋白，现在目的蛋白出来了，内参又不出了，在一板胶上跑的，转膜也在一起，有什么原因会导致这种情况么？抗体和别的条件都没有变~~~

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作者: bs4665 时间: 2013-3-26 16:44

请问，为什么杂出来的条带只有一条，但是是杂带，比目的带大几十kD

作者: lgm 时间: 2013-3-28 10:55

匀浆后为啥直接加loading 煮？

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上面的帖子是我发的
中间不走我没写
匀浆后，放置30min，离心取上清，定量后按所需量定容后煮沸的。

作者: DONT 时间: 2013-3-28 11:06

蛋白：SD大鼠新生小鼠脑组织；一抗：GAPDH 是 bioworld公司的ap0063 ；二抗：是兔抗，一共做了四次了，都没显出条带来，不知道到底是什么原因，求各位大神给予指导，小女不胜感激！

作者: is2011 时间: 2013-3-28 11:07

你好！我想请教下254KD的蛋白，在电泳和电转时各需要注意什么？
以下是我的条件：6%分离胶，5%浓缩胶，电泳：70V，90V
电转：湿转290mA，3h，中间换了次冰，换了次电转液。
5%牛奶封闭室温1h，一抗4度冰箱过夜，敷完二抗TBST洗10min*4次。
marker终于转上了，发光后却仍是白板，立春红染膜之后没有发现蛋白条带。

作者: wood533 时间: 2013-3-28 11:07

师哥，你好们，我想请问一下大分子蛋白的问题，我们电泳条件：浓缩胶80V，分离胶120V。转膜300mA 湿转3小时。
大分子一直做不出来，有的时候个别泳道会出现条带，但是很难看。
有的时候直接就是白板，想请教一下师哥，提蛋白，电泳，转膜，或者是别的方面，哪儿出错了
谢谢您的指教！

作者: langlang 时间: 2013-3-28 11:08

你好，我现在再跑pNR2B和pNR1的WB，分子量分别是190KD和120KD，8%的分离胶和5%浓缩胶，电泳是浓缩胶40V 1h，分离胶80v2.5h,转膜液加了SDS，湿转2h和1.5h,5%牛奶或5%的BSA封闭2h，一抗是CST的，4度孵育16h，洗3次，各10分钟，二抗室温2h，然后爆光，都没有条带，现在不知道怎么调整实验条件，还有转膜液中加了SDS，对转膜时间影响多大，不太明白啊，求指导，急!!!

作者: yes4 时间: 2013-3-28 11:08

检查一下胶浓度是否正确
胶浓度不同，蛋白表观分子量是不同的

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那150kD的目的蛋白，43kD的内参，应该用怎样的胶浓度呢，我们用的是10%的分离胶

作者: remenb 时间: 2013-3-28 11:09

1、可能夹的不紧
2、转了两块胶是什么意思？

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就是在转印槽内同时转印两块胶，相同的转印条件，一块胶上的marker很清楚且条带平直，另一块就是那个样子，像没转过去。。。我是按200mA恒流转印的，两块胶同时转印，这个电流回路是分流吗？。。。物理不好。。

是说局部夹的不紧？可是感觉不出来啊，觉得把夹板扣上时挺紧的。。。怎么能避免这种情况呢？

作者: okhaha 时间: 2013-3-28 11:10

老师你好，最近想从小鼠肺提取蛋白质，请问从小鼠肺提取蛋白和从其他组织提取蛋白有什么不一样嘛？因为小鼠肺的蛋白量可能会比较低，请问提取蛋白时要用多大的组织块，需要整一个肺用上吗？

作者: loli 时间: 2013-3-28 11:11

楼主帮忙给鉴别下电泳跑成这样有没有什么问题，我刚开始做，实验室没人指导。我最后出来的条带总是拉宽，接近于连成一条线

[ 本帖最后由 loli 于 2013-3-28 11:14 编辑 ]

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作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:16

这就是有些不怎么做这方面的人在那里乱搞，之前也有听说这样：直接把loading当成裂解液裂解，匀浆加煮沸相当于一个破碎的过程，而煮沸相当于增溶的过程，这样可以大大缩短时间，可以尽量低的减少蛋白的降解~~
我觉得他的目的是这样，事实我个人觉得这种方法是不靠谱的~~

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如果是做定性的话
这种方法可以用
如果做定量也不能说不可以用
调起内参来就相当麻烦了
一般新手做不了

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:16

老师，您好！请教下，我的western blot结果重复性不好。我的结果是用目的蛋白条带灰度值比上内参actin条带灰度值，每次做出来的条带都很好，非常清晰。上样之前蛋白都定量。但是做出来的结果很多时候不一样。比如我的肿瘤细胞在正常状态下，没有经过处理，直接检测目的蛋白表达。前一次做出来的结果是0.2，后一次就变为0.4。我将减少蛋白上样量，前一次结果为0.3，后一次为0.8左右，请问是什么原因？

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这个比值您是如何处理的？
不同的膜之间不能直接这么做处理
需要有一个共同的样品作为不同膜之间的公用对照

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:17

你好，我现在在做Ace的，我们实验室公认的这个不好做。我的是细胞的，请问做这个蛋白有没有什么特别要注意的。

我现在是用300的mark，8%的胶，电泳的条件是电压110电流最大时间110，转膜电压最大，电流200.时间240分。牛奶封闭2小时，一抗1:400过夜，洗4个10分，加二抗1:4000孵育1小时，洗膜4个10分，加显影液，用uvp拍照。

但是几乎没做出来过？？？？？

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这个蛋白在细胞中有表达吗？
整个操作过程从你描述的来看并无问题

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:18

你好，请帮我看下这几张片子，我要测的是histon H2A.X,买的是巴傲德公司的抗体，按照说明书1：500稀释，可是到今天为止我做了四次了，每次背景都是有星星点点状，我从这家公司同时还购进了NFKB以及actin，都没有这种情况，我想知道这其中可能的原因？

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有些抗体我们也会碰到这种情况
请与公司联系

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:18

蛋白：SD大鼠新生小鼠脑组织；一抗：GAPDH 是 bioworld公司的ap0063 ；二抗：是兔抗，一共做了四次了，都没显出条带来，不知道到底是什么原因，求各位大神给予指导，小女不胜感激！

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1、蛋白跑完电泳后进行考马斯亮蓝染胶了吗？
2、转膜后，用丽春红染膜了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:18

你好！我想请教下254KD的蛋白，在电泳和电转时各需要注意什么？
以下是我的条件：6%分离胶，5%浓缩胶，电泳：70V，90V
电转：湿转290mA，3h，中间换了次冰，换了次电转液。
5%牛奶封闭室温1h，一抗4度冰箱过夜，敷完二抗TBST洗10min*4次。
marker终于转上了，发光后却仍是白板，立春红染膜之后没有发现蛋白条带。

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做别的蛋白如何？
比如内参？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:19

师哥，你好们，我想请问一下大分子蛋白的问题，我们电泳条件：浓缩胶80V，分离胶120V。转膜300mA 湿转3小时。
大分子一直做不出来，有的时候个别泳道会出现条带，但是很难看。
有的时候直接就是白板，想请教一下师哥，提蛋白，电泳，转膜，或者是别的方面，哪儿出错了
谢谢您的指教！

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大分子量本身量就比较少
难度比一般的还是要大一些
20-100K的蛋白做的怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:19

那150kD的目的蛋白，43kD的内参，应该用怎样的胶浓度呢，我们用的是10%的分离胶

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如果有条件
用5-15%的梯度胶

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:20

就是在转印槽内同时转印两块胶，相同的转印条件，一块胶上的marker很清楚且条带平直，另一块就是那个样子，像没转过去。。。我是按200mA恒流转印的，两块胶同时转印，这个电流回路是分流吗？。。。物理不好。。

是说局部夹的不紧？可是感觉不出来啊，觉得把夹板扣上时挺紧的。。。怎么能避免这种情况呢？

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另一块是否放反了？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:20

老师你好，最近想从小鼠肺提取蛋白质，请问从小鼠肺提取蛋白和从其他组织提取蛋白有什么不一样嘛？因为小鼠肺的蛋白量可能会比较低，请问提取蛋白时要用多大的组织块，需要整一个肺用上吗？

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要检测多少蛋白？
一般10个左右的蛋白
50mg肺组织足够了

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:41

楼主帮忙给鉴别下电泳跑成这样有没有什么问题，我刚开始做，实验室没人指导。我最后出来的条带总是拉宽，接近于连成一条线

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考马斯亮蓝染胶结果呢？

作者: 小野花 时间: 2013-3-28 11:43

如果是做定性的话
这种方法可以用
如果做定量也不能说不可以用
调起内参来就相当麻烦了
一般新手做不了

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当时有人给我建议这么做的时候最大的初衷就是认为可以尽量缩短时间，不用再后续加loading变性，我自己也有做了，但事实上并没有缩短多少时间~~
就算是定性，也很盲目，由于加完loading，基本上是不能测浓度了，所以做起电泳来，基本上是属于盲上样，尤其是对于微量蛋白需要银染定性的，更是盲目，做出来电泳图很恐怖~~
理论上来讲，这的确是行得通的，但是我觉得会误导好些人，所以不推荐~~

作者: ffooll 时间: 2013-3-28 11:44

老师好，请您指点迷津……
1. 我的实验室检测蚯蚓组织中的HSP70，之前做不出来，怀疑是蛋白浓度太低，现在我的蛋白浓度提高到5-8mg/ml，上样量达到100ug，但是还是在70kd出没有条带，在40KD处有条带，但是同一个样加在不同的加样孔，一个有条带一个没有条带，阳性对照在70KD有很明显的条带，这是怎么回事呢？

2. 在做转膜时，多次发现有一块胶上的溴酚蓝已经没有了，胶是完全透明的，膜上有marker；
另一块胶上却还有溴酚蓝，有时胶上的MARKER的70kd以上的条带在胶上还有残留，所以胶不是完全透明的，虽然膜上有完整的maker。
这个关系大吗？

3.
我的转膜条件是：
110mA
120min

电转移缓冲液是：
配制1L转移缓冲液，2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200mL甲醇，加水至总量为1L，PH9.2

浓缩胶是3%，分离胶10%

期待老师的回复！

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-28 11:44

大分子量本身量就比较少
难度比一般的还是要大一些
20-100K的蛋白做的怎么样？

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55的目的蛋白做的比较好，就是大分子做的不好，怀疑电泳，转膜甚至是提取哪儿出问题了。
师哥，有什么需要注意的吗

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:45

55的目的蛋白做的比较好，就是大分子做的不好，怀疑电泳，转膜甚至是提取哪儿出问题了。
师哥，有什么需要注意的吗

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应该都没啥大问题
转膜300mA 恒流，湿转，2h30min左右足够了

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-28 11:46

另一块是否放反了？

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没有放反，还是转印过去了，只是效果不好

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-28 11:47

应该都没啥大问题
转膜300mA 恒流，湿转，2h30min左右足够了

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大师，我们转膜300mA 恒流，湿转，3h，唉，啥也没有，或者是偶尔出现几条带，还很难看。
求解！

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:48

大师，我们转膜300mA 恒流，湿转，3h，唉，啥也没有，或者是偶尔出现几条带，还很难看。
求解！

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多大浓度分离胶？
条带很难看是因为胶不好

作者: Ao7 时间: 2013-3-28 11:49

做别的蛋白如何？
比如内参？

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还没有做内参，感觉膜上都没有转上蛋白。你的大分子电泳和电转条件如何？电泳液和电转液是怎么个配方啊？

作者: www.1 时间: 2013-3-28 11:49

请问条带跑成这样是什么原因啊，条带内粗细不均，同一个孔的带，部分亮，而部分较淡，以下是我不同曝光时间的内参条带。

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作者: kulee 时间: 2013-3-28 11:51

能帮我分析一下我这结果的原因吗
如图所示：这是我做出来的WB图片，目的蛋白分子是30KB，左侧的两个白点下面的是26分子量的位置，上面的是34的分子量的位置，一共有9个泳道，第五个泳道是加了正常细胞的蛋白（因为做的是组织杂带交多所以用细胞蛋白点了一个孔做阳性对照指示目的条带的位置），其他的泳道都是动物组织蛋白。我想问问两个白点之间的条带是不是就是我的目的条带？另外，如果是的话为什么条带是一条线呢，而且一点趋势都没有，请各为高手帮我分析分析啊。内参做出来没问题。一抗稀释比1:150（1:200,1:400都是白板)4度过夜，二抗稀释比1:5000室温1小时，5%脱脂奶粉室温封闭1小时12%的分离胶。

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作者: lgm 时间: 2013-3-28 11:51

多大浓度分离胶？
条带很难看是因为胶不好

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分离胶是6%，浓缩胶是5%，还试过三层胶

作者: wsll 时间: 2013-3-28 11:52

你好，我有一个在大家看似很菜的问题：二抗有没有特异性？比如说：我提蛋白后，想检测几种抗原的表达，一抗彼此都不一样，二抗是不是用一种就可以？谢谢，希望楼主不要见笑

作者: xue258 时间: 2013-3-28 11:53

样品跑离点样孔以后就发现了如图所示的漏样问题，因为要做WB ，导致最后的结果没有意义~

浓缩胶5% 分离胶12%，均是按着宝生物的配方所配置~

希望得到相应的解决，再次谢过了~

图片附件: 82252866.snap.jpg (2013-3-28 11:53, 45.14 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15382

作者: 49888 时间: 2013-3-28 11:53

考马斯亮蓝染胶结果呢？

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楼主你好：
我没有用考马斯染胶，这是我用dab显色做出来的目的蛋白的结果，marker很短但较粗，而条带却又细又长，这样的图能用么？另外，我的实验重复性很差，我先做的内参，出来后开始做目的蛋白，现在目的蛋白出来了，内参又不出了，在一板胶上跑的，转膜也在一起，有什么原因会导致这种情况么？抗体和别的条件都没有变~~~

图片附件: 74419097.snap (1).jpg (2013-3-28 11:53, 69.11 KB) / 该附件被下载次数 1
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作者: u234 时间: 2013-3-28 11:54

请问，为什么杂出来的条带只有一条，但是是杂带，比目的带大几十kD

作者: 穿越时空 时间: 2013-3-28 11:55

今天配了两块胶，一块浓缩胶配好后40分钟拔的梳子，另一块一个多小时后拔的梳子，结果拔梳子后孔道就变形了而且孔道里有碎胶。以前配胶也时常会遇到这个问题，请问是何原因，需要注意点什么？

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-28 11:56

最近在做6kd的小分子蛋白，用的是tricine-SDS-PAGE系统，试了两种配方，跑出来的条带都很奇怪，上样缓冲液的指示剂在分离胶中出现拖带现象，跑到最后仍然在10kd附近。

正极、负极、凝胶缓冲液（3*）的均按常用的方法配

第一种：（含尿素）
分离胶（3ml）夹层胶（1.5ml）浓缩胶（1.8ml）
丙烯酰胺贮存液/ m1 1 （5C） 0.5（3C） 0.125（3C）
凝胶缓冲液（3*）/ml 1 0.5 0.6
尿素/g 1.08 —— ——
ddH2O /ml 补充到3ml 补充到1.5ml 补充到1.8ml
10%AP/ u1 10ul 10ul 10ul
TEMED/ul 1ul 1ul 1ul

第二种：（含甘油）
分离胶（30ml）浓缩胶（10ml）
丙烯酰胺贮存液/ m1 10 （6C） 0.8（3C）
凝胶缓冲液（3*）/ml 10 2.5
甘油/ml 3.1 ——
ddH2O /ml 6.9 6.7
10%AP/ u1 100ul 50ul
TEMED/ul 20ul 10ul

跑浓缩胶一般用30V，跑分离胶一般在20MA（约100V）左右。右边marker黄色的条带是10kd，可见到指示剂是拖起的，我用的是武汉博士德公司购买的2*小分子蛋白上样缓冲液。1：1与蛋白样品混合。将胶染色后，右边两条10kd一下的蛋白条带根本就看不到，请教各位亲，这是咋回事呢，上样缓冲液为啥一直都是拖带呢？

作者: orangecake 时间: 2013-3-28 11:56

问个问题，我最近做Western曝出来的片子都为黑色，背景特别高，有时透过日光能从黑色背景中看到隐约的条带。谁能告诉我这是为什么？

作者: duoduo 时间: 2013-3-28 11:57

您好，请教您一下，上面为102KD的蛋白，下面为135KD蛋白，每孔上样量300ug，电泳100V，2小时；转膜半干转，恒压20V，1小时30分钟；封闭5%脱脂奶粉；4度过夜，一抗1：500稀释，cell signal technology，TBST洗膜，10分钟，3次；二抗凯基1：2000稀释，TBST洗膜，20分钟，3次；ECL显色。转膜液配方：TRIS：3克，甘氨酸14.4克，SDS1克，定容800ml，未加甲醇。

多次重复，始终是这个情况，望您能给出宝贵意见。

作者: zhezhe 时间: 2013-3-28 11:57

转膜使用PVDF膜时，转膜液加甲醇有什么作用

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:58

请问条带跑成这样是什么原因啊，条带内粗细不均，同一个孔的带，部分亮，而部分较淡，以下是我不同曝光时间的内参条带。

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转膜有气泡
没有孵育好抗体等都可能造成

作者: jujuba 时间: 2013-3-28 11:59

我做P-ASK1，第一次二抗1：3000稀释，出现白色条带，黑色背景的反影现象，然后我就降低了二抗的浓度（1:5000），结果是白板了，怎么解决呢

作者: NBA 时间: 2013-3-28 11:59

你好，我有一个在大家看似很菜的问题：二抗有没有特异性？比如说：我提蛋白后，想检测几种抗原的表达，一抗彼此都不一样，二抗是不是用一种就可以？谢谢，希望楼主不要见笑

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相同来源的一抗就可以用相同的二抗
比如都是兔来源的一抗
那么都可以用某某抗兔的二抗
是通用的

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:00

样品跑离点样孔以后就发现了如图所示的漏样问题，因为要做WB ，导致最后的结果没有意义~

浓缩胶5% 分离胶12%，均是按着宝生物的配方所配置~

希望得到相应的解决，再次谢过了~

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1、上样量太大了
2、溴酚蓝浓度太高会造成这种现象

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:00

楼主你好：
我没有用考马斯染胶，这是我用dab显色做出来的目的蛋白的结果，marker很短但较粗，而条带却又细又长，这样的图能用么？另外，我的实验重复性很差，我先做的内参，出来后开始做目的蛋白，现在目的蛋白出来了，内参又不出了，在一板胶上跑的，转膜也在一起，有什么原因会导致这种情况么？抗体和别的条件都没有变~~~

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TBST或者PBST是你自己配制的？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:00

请问，为什么杂出来的条带只有一条，但是是杂带，比目的带大几十kD

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二聚体或者是别的
请参考抗体说明书

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:01

今天配了两块胶，一块浓缩胶配好后40分钟拔的梳子，另一块一个多小时后拔的梳子，结果拔梳子后孔道就变形了而且孔道里有碎胶。以前配胶也时常会遇到这个问题，请问是何原因，需要注意点什么？

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碎胶的多数原因是因为胶没有凝好
请调整APS与TEMED用量

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:02

最近在做6kd的小分子蛋白，用的是tricine-SDS-PAGE系统，试了两种配方，跑出来的条带都很奇怪，上样缓冲液的指示剂在分离胶中出现拖带现象，跑到最后仍然在10kd附近。

正极、负极、凝胶缓冲液（3*）的均按常用的方法配

第一种：（含尿素）
分离胶（3ml）夹层胶（1.5ml）浓缩胶（1.8ml）
丙烯酰胺贮存液/ m1 1 （5C） 0.5（3C） 0.125（3C）
凝胶缓冲液（3*）/ml 1 0.5 0.6
尿素/g 1.08 —— ——
ddH2O /ml 补充到3ml 补充到1.5ml 补充到1.8ml
10%AP/ u1 10ul 10ul 10ul
TEMED/ul 1ul 1ul 1ul

第二种：（含甘油）
分离胶（30ml）浓缩胶（10ml）
丙烯酰胺贮存液/ m1 10 （6C） 0.8（3C）
凝胶缓冲液（3*）/ml 10 2.5
甘油/ml 3.1 ——
ddH2O /ml 6.9 6.7
10%AP/ u1 100ul 50ul
TEMED/ul 20ul 10ul

跑浓缩胶一般用30V，跑分离胶一般在20MA（约100V）左右。右边marker黄色的条带是10kd，可见到指示剂是拖起的，我用的是武汉博士德公司购买的2*小分子蛋白上样缓冲液。1：1与蛋白样品混合。将胶染色后，右边两条10kd一下的蛋白条带根本就看不到，请教各位亲，这是咋回事呢，上样缓冲液为啥一直都是拖带呢？

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我也得到过类似的结果
目前我还不清楚是什么原因
小分子量的胶不好整

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:02

问个问题，我最近做Western曝出来的片子都为黑色，背景特别高，有时透过日光能从黑色背景中看到隐约的条带。谁能告诉我这是为什么？

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调整一抗、二抗浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:03

您好，请教您一下，上面为102KD的蛋白，下面为135KD蛋白，每孔上样量300ug，电泳100V，2小时；转膜半干转，恒压20V，1小时30分钟；封闭5%脱脂奶粉；4度过夜，一抗1：500稀释，cell signal technology，TBST洗膜，10分钟，3次；二抗凯基1：2000稀释，TBST洗膜，20分钟，3次；ECL显色。转膜液配方：TRIS：3克，甘氨酸14.4克，SDS1克，定容800ml，未加甲醇。

多次重复，始终是这个情况，望您能给出宝贵意见。

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什么蛋白啊？
转膜后用丽春红染色了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:03

转膜使用PVDF膜时，转膜液加甲醇有什么作用

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固定胶

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:03

我做P-ASK1，第一次二抗1：3000稀释，出现白色条带，黑色背景的反影现象，然后我就降低了二抗的浓度（1:5000），结果是白板了，怎么解决呢

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不是吧。。。
pbst或者tbst是自己配制的还是买的？
如果是买的用的是哪里的？

作者: huifeng0516 时间: 2013-3-28 12:04

什么蛋白啊？
转膜后用丽春红染色了吗？

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E-cadherin 135KD
N-cadherin 102KD
CST抗体，用丽春红染过，可见泳道，条带不明显

作者: qiangren789 时间: 2013-3-28 12:04

请教前辈,
1、看到论坛上说，上样量不是越大越好，我现在组织的蛋白，上样量100ug，是不是有点大啊？
2、抗体买回来后做预实验，abcam的一抗1:250 4℃过夜，二抗1:1000，结果未出，就提高一抗浓度，结果出来很多杂带，且背景很脏，不知道该怎么办了？是不是二抗也需要摸浓度啊？
3、abcam的一抗，按说明书浓度1:200稀释，结果背景特别脏，条带却很浅，我是上样量100ug,二抗1:1000，应该怎么办啊？

作者: DNA 时间: 2013-3-28 12:05

不是吧。。。
pbst或者tbst是自己配制的还是买的？
如果是买的用的是哪里的？

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都是自己配的，而且前后两次是连着做的，内参也都出了，应该没什么问题

作者: 阿k 时间: 2013-3-28 12:05

自己配的。但是actin条带就清啊

作者: toy 时间: 2013-3-28 12:06

TBST或者PBST是你自己配制的？

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TBST是我自己配置的，现配现用

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:07

E-cadherin 135KD
N-cadherin 102KD
CST抗体，用丽春红染过，可见泳道，条带不明显

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检测样品是什么？
细胞吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:07

请教前辈,
1、看到论坛上说，上样量不是越大越好，我现在组织的蛋白，上样量100ug，是不是有点大啊？
2、抗体买回来后做预实验，abcam的一抗1:250 4℃过夜，二抗1:1000，结果未出，就提高一抗浓度，结果出来很多杂带，且背景很脏，不知道该怎么办了？是不是二抗也需要摸浓度啊？
3、abcam的一抗，按说明书浓度1:200稀释，结果背景特别脏，条带却很浅，我是上样量100ug,二抗1:1000，应该怎么办啊？

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1、组织的上样量我们一般是20ug，最多40ug
2、这个抗体本身IgG浓度多少？
3、背景脏，考虑稀释一下二抗

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:08

都是自己配的，而且前后两次是连着做的，内参也都出了，应该没什么问题

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恩
我是怀疑你的体系有问题
另外转膜后
都用丽春红染色检查了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:08

TBST是我自己配置的，现配现用

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pH值调整了吗？

作者: mickeylin 时间: 2013-3-28 12:09

各位大侠，我用的碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒，96孔板，标准品8孔的吸光值分别是：0.122,0.143,0.152,0.190，0.282,0.344,0.419,0.487。对应的蛋白含量分别是0,0.5,1,2,4,6,8,10。我有几个蛋白样品的吸光值远远高于0.487，达到1以上，超出了有效范围之外，我是不是该稀释后再测定，用什么稀释？我担心稀释后蛋白浓度又低于自己的期望值，影响western的上样，该如何把握？

作者: DONT 时间: 2013-3-28 12:09

pH值调整了吗？

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这个还真没有，还以为只要按着比例配置就行了呢。可是以前用这个体系出过的，后来突然就不出了，但是目的蛋白是可以出来的，就是上样量大了就连成一条线，不见条带变宽，会不会是胶配置的问题？十分感谢楼主的热心、及时回复

作者: 小野花 时间: 2013-3-28 12:10

最近在做食管癌的WB，目的蛋白是B A G 4、C A R D 6，但是无论怎样做，都还是没结果。
条件：电泳80V、110V，转膜：湿转、300mA 120min，洗脱3*10min，5%脱脂奶，封闭1h，一抗过夜，洗脱3*10min，二抗50min，洗脱4*10min，ECL压片，没有目的条带

老师有那两个蛋白的信息么？是不是我提取蛋白的时候出错了？望老师帮忙分析

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:11

各位大侠，我用的碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒，96孔板，标准品8孔的吸光值分别是：0.122,0.143,0.152,0.190，0.282,0.344,0.419,0.487。对应的蛋白含量分别是0,0.5,1,2,4,6,8,10。我有几个蛋白样品的吸光值远远高于0.487，达到1以上，超出了有效范围之外，我是不是该稀释后再测定，用什么稀释？我担心稀释后蛋白浓度又低于自己的期望值，影响western的上样，该如何把握？

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这个曲线有很大的问题哦
你说的0,0.5,1.。。。。是标准品的浓度？浓度单位是多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:11

最近在做食管癌的WB，目的蛋白是B A G 4、C A R D 6，但是无论怎样做，都还是没结果。
条件：电泳80V、110V，转膜：湿转、300mA 120min，洗脱3*10min，5%脱脂奶，封闭1h，一抗过夜，洗脱3*10min，二抗50min，洗脱4*10min，ECL压片，没有目的条带

老师有那两个蛋白的信息么？是不是我提取蛋白的时候出错了？望老师帮忙分析

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哪里的抗体？

作者: 小野花 时间: 2013-3-28 12:12

哪里的抗体？

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abcam的抗体

作者: 小野花 时间: 2013-3-28 12:12

最近在做食管癌的WB，目的蛋白是B A G 4、C A R D 6，但是无论怎样做，都还是没结果。
条件：电泳80V、110V，转膜：湿转、300mA 120min，洗脱3*10min，5%脱脂奶，封闭1h，一抗过夜，洗脱3*10min，二抗50min，洗脱4*10min，ECL压片，没有目的条带

老师有那两个蛋白的信息么？是不是我提取蛋白的时候出错了？望老师帮忙分析

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1、内参条带如何？
2、电泳完了之后SDS-PAGE考染过吗？

作者: 小野花 时间: 2013-3-28 12:13

1、内参条带如何？
2、电泳完了之后SDS-PAGE考染过吗？

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内参条带非常好
有用考马斯染过一次（9个样品），脱色后看起来正常

作者: moonlight45 时间: 2013-3-28 12:13

你好，最近WB老跑出“哑铃型”的条带不知是什么原因，请老师指教该如何改进？不胜感激！

作者: XYZQ 时间: 2013-3-28 12:14

检测样品是什么？
细胞吗？

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细胞

作者: jujuba 时间: 2013-3-28 12:14

什么actin的条带会有两条？

图片附件: 38323486.jpg (2013-3-28 12:14, 26.71 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15384

作者: summerxx 时间: 2013-3-28 12:15

我做WB做的太痛苦了，差不多半年了，基本什么都没做出来，每次跑电泳，加完样开始跑不了十分钟，加样孔的底部就开始漏蓝色的loading buffer,当然应该蛋白样也漏了，经常漏成网状，但都只限于浓缩胶的范围，这样上样量就减少了，结果也就不准了，请问这是为什么啊？我是按照步骤来了，没什么不妥的。还有，内外的电泳液如果相通的话，会有什么影响？请知道的战友帮忙解答一下，这是我最后的实验了，真想快点结束。

作者: caihong 时间: 2013-3-28 12:15

本人是新手，在学习western blot的过程中一直关注您的该话题，受益匪浅，首先表达诚挚的感谢！
最近我遇到了些问题，想向老师请教，望能于百忙之中予以帮助，不胜感谢！
分子量分别是130,60的蛋白，及中山的action为内参，图片中进行了4次重复，其中上方为一张膜，下方为一张膜，左右进行了重复。130一抗为cst，60为santa，80-120V电泳，PVDF200mA电转3h，封闭2h，一抗过夜，二抗孵育1h，碧云天ECL显影。我重复了数次总是出现条带断裂现象，用GAPDH做内参亦同样，而用丽春红染膜可见相应规整的蛋白条带，原以为可能与一抗孵育不充分、ECL不充分有关，采用增加一抗孵育时间、增加ECL用量均无改善，烦请予以赐教！

作者: 白白的 时间: 2013-3-28 12:16

我做WB做的太痛苦了，差不多半年了，基本什么都没做出来，每次跑电泳，加完样开始跑不了十分钟，加样孔的底部就开始漏蓝色的loading buffer,当然应该蛋白样也漏了，经常漏成网状，但都只限于浓缩胶的范围，这样上样量就减少了，结果也就不准了，请问这是为什么啊？我是按照步骤来了，没什么不妥的。还有，内外的电泳液如果相通的话，会有什么影响？请知道的战友帮忙解答一下，这是我最后的实验了，真想快点结束。

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是不是丙烯酰胺或者哪种配胶的东西出了问题啊？你们那里没有其他人做WB么，跟人家要一点试剂重新配个胶试一下？有米就直接买个预制胶也行。。。

作者: 北风那个吹 时间: 2013-3-28 12:16

我做WB做的太痛苦了，差不多半年了，基本什么都没做出来，每次跑电泳，加完样开始跑不了十分钟，加样孔的底部就开始漏蓝色的loading buffer,当然应该蛋白样也漏了，经常漏成网状，但都只限于浓缩胶的范围，这样上样量就减少了，结果也就不准了，请问这是为什么啊？我是按照步骤来了，没什么不妥的。还有，内外的电泳液如果相通的话，会有什么影响？请知道的战友帮忙解答一下，这是我最后的实验了，真想快点结束。

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你这个明显是玻璃板与胶之间有缝隙啊,你每次都是现用现制的胶吗??你稍稍少加一点那个气味最浓烈的,那个叫什么来着?我们现在都用预制胶,忘了叫什么来着,凝胶的时候,盯着点,内外液肯定不能联通,直接联通了,电流都从短路的地方过去了,就不从胶里走了,还跑什么啊

作者: 北风那个吹 时间: 2013-3-28 12:17

你好，最近WB老跑出“哑铃型”的条带不知是什么原因，请老师指教该如何改进？不胜感激！

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你试试少加点蛋白,跑胶的时候,电压小点,放在碎冰里跑,制样要充分混匀,上扬之前也混匀,尽量把样品都加到孔的底部

作者: 北风那个吹 时间: 2013-3-28 12:17

1、组织的上样量我们一般是20ug，最多40ug
2、这个抗体本身IgG浓度多少？
3、背景脏，考虑稀释一下二抗

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我们也这么认为,现在跑胶动不动就上百ug,有点可怕,我们5ug都经常做,....

作者: @STAR@ 时间: 2013-3-28 12:18

转膜有气泡
没有孵育好抗体等都可能造成

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转膜完后染丽春红，没看到有气泡，条带也有。孵育抗体时也都是没过整张膜的，请问还有其他可能的原因吗？胶有没有可能？

作者: abc816 时间: 2013-3-28 12:18

abcam的抗体

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这几个指标不是很好做

作者: abc816 时间: 2013-3-28 12:18

内参条带非常好
有用考马斯染过一次（9个样品），脱色后看起来正常

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如果是这样的话
需要考虑这个一抗是否能识别的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:19

你好，最近WB老跑出“哑铃型”的条带不知是什么原因，请老师指教该如何改进？不胜感激！

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1、检查胶孔
2、电泳时电压调小
3、电泳时上样体积不能太大

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:19

细胞

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细胞收集的时候用细胞刮子或者裂解液
不用胰酶消化

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:20

为什么actin的条带会有两条？

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1、抗体特异性不好
2、样品降解
3、曝光的时候是否有挪动？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:20

我做WB做的太痛苦了，差不多半年了，基本什么都没做出来，每次跑电泳，加完样开始跑不了十分钟，加样孔的底部就开始漏蓝色的loading buffer,当然应该蛋白样也漏了，经常漏成网状，但都只限于浓缩胶的范围，这样上样量就减少了，结果也就不准了，请问这是为什么啊？我是按照步骤来了，没什么不妥的。还有，内外的电泳液如果相通的话，会有什么影响？请知道的战友帮忙解答一下，这是我最后的实验了，真想快点结束。

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漏样的情况我没碰到过
不知道怎么解决
内外电泳液最好不通

作者: 笑弯了腰 时间: 2013-3-28 12:21

你试试少加点蛋白,跑胶的时候,电压小点,放在碎冰里跑,制样要充分混匀,上扬之前也混匀,尽量把样品都加到孔的底部

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非常感谢，下次调整一下看看。

作者: bohe221 时间: 2013-3-28 12:21

楼主您好，我最近一直在做western，认真阅读了您的帖子，非常受益，但是我做出来的最后结果总是白板。我变换过上样量的浓度、封闭液（脱脂奶粉和BSA，由于没有gelatin，所以就用了前面两种）、一抗的孵育时间等均无用，现在都不知道问题出在哪里了，很是困惑，还望前辈赐教。我将我的大概过程归纳如下：
1.我用的内参β-actin是santa的，另一个是cellsignal的；2.转完膜后用丽春红染色可见蛋白条带；3.封闭液用的5%脱脂奶粉或0.3%BSA，室温封闭30-60min不等；4.一抗内参1:200，孵育2h（室温）或过夜（4℃）；5.二抗1:5000、1:8000和1:1000，孵育1-1.5h（室温）；6.ECL发光1-5min，有时可见荧光，有时看不见；7.暗夹内曝光1-5min不等（胶片是新买的）；8.显影1min，定影5min（显影液和定影液均为之前师兄师姐用剩的，在室温放置1年多了，不知显影液和定影液对后面的结果影响大不大？）；9.结果——白板。

作者: KGZ564 时间: 2013-3-28 12:22

是不是丙烯酰胺或者哪种配胶的东西出了问题啊？你们那里没有其他人做WB么，跟人家要一点试剂重新配个胶试一下？有米就直接买个预制胶也行。。。

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关键别人也用这些东西，人家的都不漏。。。而且现在我发现，如果只做细胞的话就不漏，做组织的话就漏。

作者: zhenxin 时间: 2013-3-28 12:22

相关疾病：
宫颈癌
最近做WB 时提取宫颈癌组织蛋白，按说明书裂解离心后上清液为鸡蛋清样，拉丝状，是怎么回事呢？这样的蛋白可以用来做WB 吗，测浓度时因为枪头太小吸不到需要的量，这样会不会影响蛋白浓度的测量呢，请帮我指教指教。

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:23

楼主您好，我最近一直在做western，认真阅读了您的帖子，非常受益，但是我做出来的最后结果总是白板。我变换过上样量的浓度、封闭液（脱脂奶粉和BSA，由于没有gelatin，所以就用了前面两种）、一抗的孵育时间等均无用，现在都不知道问题出在哪里了，很是困惑，还望前辈赐教。我将我的大概过程归纳如下：
1.我用的内参β-actin是santa的，另一个是cellsignal的；2.转完膜后用丽春红染色可见蛋白条带；3.封闭液用的5%脱脂奶粉或0.3%BSA，室温封闭30-60min不等；4.一抗内参1:200，孵育2h（室温）或过夜（4℃）；5.二抗1:5000、1:8000和1:1000，孵育1-1.5h（室温）；6.ECL发光1-5min，有时可见荧光，有时看不见；7.暗夹内曝光1-5min不等（胶片是新买的）；8.显影1min，定影5min（显影液和定影液均为之前师兄师姐用剩的，在室温放置1年多了，不知显影液和定影液对后面的结果影响大不大？）；9.结果——白板。

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如果能见荧光的话
那就是胶片曝光了或者显影失效了

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:24

最近做WB 时提取宫颈癌组织蛋白，按说明书裂解离心后上清液为鸡蛋清样，拉丝状，是怎么回事呢？这样的蛋白可以用来做WB 吗，测浓度时因为枪头太小吸不到需要的量，这样会不会影响蛋白浓度的测量呢，请帮我指教指教。

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是DNA影响

作者: pengke1983 时间: 2013-3-28 12:25

最近做WB 时提取宫颈癌组织蛋白，按说明书裂解离心后上清液为鸡蛋清样，拉丝状，是怎么回事呢？这样的蛋白可以用来做WB 吗，测浓度时因为枪头太小吸不到需要的量，这样会不会影响蛋白浓度的测量呢，请帮我指教指教。

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DNA的影响，有什么办法可以解决这个影响吗？

作者: 分子式 时间: 2013-3-28 12:25

我做一个定位在膜上的蛋白，170kd，转运使20v，2h，半干转，每次marker都转的挺好，但是丽春红染色后都看不到条带，想问一下，这是什么原因，还有，有没有更好的提膜蛋白的方法呀，是不是提的膜蛋白不纯，目的蛋白表达丰度低，所以做不出来，先谢谢老师了

作者: 987789 时间: 2013-3-28 12:26

您好，楼主。
从园子里搬出一个困扰着我的问题，为什么最后对条带进行图像分析的时候，不用平均OD值，而是用int od呢？
劳驾回答下。

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:27

您好，楼主。
从园子里搬出一个困扰着我的问题，为什么最后对条带进行图像分析的时候，不用平均OD值，而是用int od呢？
劳驾回答下。

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IOD（积分光密度值）

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:28

我做一个定位在膜上的蛋白，170kd，转运使20v，2h，半干转，每次marker都转的挺好，但是丽春红染色后都看不到条带，想问一下，这是什么原因，还有，有没有更好的提膜蛋白的方法呀，是不是提的膜蛋白不纯，目的蛋白表达丰度低，所以做不出来，先谢谢老师了

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1、我们检测膜蛋白都是用提取总蛋白来进行的
2、建议湿转，300mA 恒流，2h30min
3、大分子量的蛋白本来就较少，丽春红肯定然不出来

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:28

DNA的影响，有什么办法可以解决这个影响吗？

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加DNase或者短暂超声

作者: 薄荷侠 时间: 2013-3-28 12:29

请教楼主一个困扰我多天的问题：做WB时到底用总蛋白还是核蛋白？比如我先来拿来练手的P16抗体。“P16基因编码产物是16KD的蛋白，即P16蛋白，定位于细胞核内”，这样的话，是不是我就要提核蛋白来做？之前一直没做出来，我总在怀疑是不是因为我提取的核蛋白量太少（蛋白定量为1ug/ul）。谢谢楼主~~~

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:29

请教楼主一个困扰我多天的问题：做WB时到底用总蛋白还是核蛋白？比如我先来拿来练手的P16抗体。“P16基因编码产物是16KD的蛋白，即P16蛋白，定位于细胞核内”，这样的话，是不是我就要提核蛋白来做？之前一直没做出来，我总在怀疑是不是因为我提取的核蛋白量太少（蛋白定量为1ug/ul）。谢谢楼主~~~

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我们一般都用总蛋白来做
您用的是哪里的裂解液？

作者: bring 时间: 2013-3-28 12:30

版主，你好。我最近做完了一批WB，现在正在做分析，用的是image j 软件。我实验目的是想比较不同实验组之间蛋白的表达差异。实验结果内参基本一致，我以前直接用软件测了目的蛋白的表达灰度，后用两独立样本的T检验，昨天一个同学告诉我，应该将目的蛋白的灰度除以相应内参的灰度后在统计？我有点糊涂了，请版主指点。谢谢

作者: dog002 时间: 2013-3-28 12:31

转膜条件基本可以
一抗与二抗浓度均较高
建议：先做二抗的稀释度（同时不同的ECL均需检测）
用点杂交
用1倍TBS或PBS稀释二抗
做不同的梯度
比如1：1000，1：2000，1：4000
稀释好后各取1ul点在NC膜上
RT干燥
加发光液
曝光
确定二抗的合适稀释度

下一步
做一抗的稀释度
一抗也可以做几个不同的稀释度来摸条件
转膜后把膜剪成小条，加不同的稀释度的一抗
孵育进行后续步骤

good luck

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老师，你好，关于上面这点，我有一些小疑问，求指教：
1、二抗浓度是不是要依据一抗浓度来摸索？我们实验室最近都在摸条件，因为我们是新手，不清楚怎样调整一抗与二抗的稀释浓度，所以，希望老师给与指导。
2、我们实验室使用BSA封闭液稀释一抗和二抗浓度的。
3、您上面所讲的做二抗浓度摸索的前提是在转膜完？还是加完一抗洗脱后？

作者: 泡泡 时间: 2013-3-28 12:31

您好'我现在遇到一个问题'原来用10 %的胶做actin'300mA转1.5，2，2.5h都有明显条带'现在换8%的胶'就怎么也做不出来了'请教是什么原因呢？

作者: XYZQ 时间: 2013-3-28 12:32

如果能见荧光的话
那就是胶片曝光了或者显影失效了

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谢谢，我再换个显影液试试。

作者: hulu呼噜 时间: 2013-3-28 12:32

我们一般都用总蛋白来做
您用的是哪里的裂解液？

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我用的是碧云天的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽屉试剂盒。我原来有一瓶RIPA裂解液，但是觉得那是抽提总蛋白的，就又买了一瓶专门提核蛋白的。核蛋白浓度太低了，我两瓶细胞才提了1ug/ul，70ul。这里一个师姐做WB，她也讲都是用总蛋白做。是不是不管蛋白在哪表达，都能用总蛋白做呢？像我的这种P16，定位表达于核。也能用总蛋白做么？

作者: wsll 时间: 2013-3-28 12:32

请问我提取胰腺组织蛋白，有目标蛋白，但是总是见不到内参GAPDH的条带，这是为什么呢？求解跑了很多次一直都这样子。烦恼啊！同时跑的细胞提取的蛋白有，很明显。

作者: 西子 时间: 2013-3-28 12:33

请问我做出的蛋白电泳条带显色时是白色的是怎么回事呢？我是用化学发光法检测，如果有条带应该是黑色的条带，但是我最近的实验内参条带没有问题，但是目的蛋白条带是白色。我用5%脱脂奶粉37°封闭2小时，santa一抗 1：500用脱脂奶粉稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）37°1小时。都是TBST洗膜3*10min。发光剂是碧云天ECL PLUS。我以前用同样的实验条件可以做出正常条带，但最近目的条带不知怎么了，总是反色，我把抗体浓度降低也不行，请专家帮我分析一下是什么原因啊？谢谢

作者: tie8 时间: 2013-3-28 12:34

请问我做出的蛋白电泳条带显色时是白色的是怎么回事呢？我是用化学发光法检测，如果有条带应该是黑色的条带，但是我最近的实验内参条带没有问题，但是目的蛋白条带是白色。我用5%脱脂奶粉37°封闭2小时，santa一抗 1：500用脱脂奶粉稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）37°1小时。都是TBST洗膜3*10min。发光剂是碧云天ECL PLUS。我以前用同样的实验条件可以做出正常条带，但最近目的条带不知怎么了，总是反色，我把抗体浓度降低也不行，请专家帮我分析一下是什么原因啊？谢谢

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我觉得是显色底物太强了,消耗干净了,

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:34

版主，你好。我最近做完了一批WB，现在正在做分析，用的是image j 软件。我实验目的是想比较不同实验组之间蛋白的表达差异。实验结果内参基本一致，我以前直接用软件测了目的蛋白的表达灰度，后用两独立样本的T检验，昨天一个同学告诉我，应该将目的蛋白的灰度除以相应内参的灰度后在统计？我有点糊涂了，请版主指点。谢谢

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我用TotalLab quant或者ImageQuant 读取IOD值

要将目的蛋白的IOD除以相应内参的IOD后再统计

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:35

老师，你好，关于上面这点，我有一些小疑问，求指教：
1、二抗浓度是不是要依据一抗浓度来摸索？我们实验室最近都在摸条件，因为我们是新手，不清楚怎样调整一抗与二抗的稀释浓度，所以，希望老师给与指导。
2、我们实验室使用BSA封闭液稀释一抗和二抗浓度的。
3、您上面所讲的做二抗浓度摸索的前提是在转膜完？还是加完一抗洗脱后？

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先确定二抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:35

我用的是碧云天的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽屉试剂盒。我原来有一瓶RIPA裂解液，但是觉得那是抽提总蛋白的，就又买了一瓶专门提核蛋白的。核蛋白浓度太低了，我两瓶细胞才提了1ug/ul，70ul。这里一个师姐做WB，她也讲都是用总蛋白做。是不是不管蛋白在哪表达，都能用总蛋白做呢？像我的这种P16，定位表达于核。也能用总蛋白做么？

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我们都是用总蛋白来做的
p16可以用总蛋白来做
另外想让核蛋白提取的好一点的话，可以用短时间的超声处理一下

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:35

请问我提取胰腺组织蛋白，有目标蛋白，但是总是见不到内参GAPDH的条带，这是为什么呢？求解跑了很多次一直都这样子。烦恼啊！同时跑的细胞提取的蛋白有，很明显。

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1、GAPDH在这个组织中没有表达？这种情况很少
2、GAPDH抗体不识别您做的这个种属？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:36

请问我做出的蛋白电泳条带显色时是白色的是怎么回事呢？我是用化学发光法检测，如果有条带应该是黑色的条带，但是我最近的实验内参条带没有问题，但是目的蛋白条带是白色。我用5%脱脂奶粉37°封闭2小时，santa一抗 1：500用脱脂奶粉稀释（推荐1：100-1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：2000TBST稀释（推荐1：2000-1：5000）37°1小时。都是TBST洗膜3*10min。发光剂是碧云天ECL PLUS。我以前用同样的实验条件可以做出正常条带，但最近目的条带不知怎么了，总是反色，我把抗体浓度降低也不行，请专家帮我分析一下是什么原因啊？谢谢

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您说的白色是哪一步有白色？？？

作者: 9900 时间: 2013-3-28 12:36

你好，刚开始做WB，先开始跑内参，开始没有条带出来，最近两次做出来均在action位置出现3-4个条带，一条一条的，
背景很干净，我是从组织提的全蛋白，上样量150ug，90v，110v电泳，300mA 70分钟湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，
一抗 1：1000TBST稀释4°C孵过夜，国产二抗1：1000TBST稀释室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。DAB液显色，
是我的action抗体有问题吗？还有想问一下：一抗和二抗可以回收4℃保存继续用吗？十分感谢，救救我吧，
做了半个月内参都没做出来的。都快疯了

作者: 969 时间: 2013-3-28 12:37

您好，老师
兔二抗用1:50000做某个指标可以做出很好的结果，有条带无背景。换做另外一个指标，仍然是用兔二抗，结果ECL发光时整张膜发亮，这样肯定是曝不出光，是不是应该降低一抗的浓度？需要针对这个指标调整二抗的浓度吗？

作者: www.1 时间: 2013-3-28 12:37

先确定二抗的稀释度

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谢谢老师的回复，我们实验室所用的抗兔与抗鼠的二抗对WB的推荐浓度都是1：10000——1：200000，我不大明白怎样确定二抗的稀释度。
什么是点杂交？
还有如果先确定二抗的稀释度的话，一抗浓度应该怎样的？或者是我理解错了，您说的意思是：确定二抗稀释度的过程不需要转膜、封闭、加一抗的前步骤？
这个暑假憋在实验室很痛苦，像没头苍蝇似的在调浓度，看到您的这个帖子，像是抓到了救命稻草似的。谢谢您，望指教。

作者: loli 时间: 2013-3-28 12:38

您说的白色是哪一步有白色？？？

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是在wb最后一步显影的时候，请问是怎么回事呢？（我附了一张显影的图片）

图片附件: 56380168.jpg (2013-3-28 12:38, 12.07 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15385

作者: kulee 时间: 2013-3-28 12:38

我觉得是显色底物太强了,消耗干净了,

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您是指我的显影剂太敏感了么？我应该换一个灵敏度稍微低点的？

作者: hold住 时间: 2013-3-28 12:39

请教：western 制胶后拔出齿梳的时候，胶孔里总有残余胶，这样会影响上样量，请问有什么好办法可以去除胶孔里的胶吗？（我试过1.用加样器的针头去除但好像没有效果。 2.将胶提前一晚上制备好在电泳槽中4度过夜。孔里还是有胶）。
先谢谢楼主。

作者: bring 时间: 2013-3-28 12:39

最近做WB 遇到以下几个问题，望老师指点：
1.浓缩胶花了45min不凝（有一个槽的胶没了，其他槽都凝的很好，所以损失了一个槽）
2。显影出来结果有两个条带是变形的，其他都好
3.显影出来有白色片状斑块，估计是气泡所致，如何可以避免
4。有张膜显影时间很长，也没将全部条带显出来，只有部分，是上样量是15微克，是上样量太少了吗？还是抗体浓度太小了？
5。只做标准曲线调蛋白时，曲线老是个指数曲线，弯的，浓度时0,1,2,4,8,16，这样回归系数太小了，怎么样改善呢，或者这样下去对所调蛋白浓度一致性的影响大不大，可以这么做吗？
多谢！

作者: douding66 时间: 2013-3-28 12:40

最近准备跑WB，看了一些文献，发现一些问题请请教。
为什么说两种种属来源不同的抗体可以同时孵育?另外请看下图

文章中2个不同种属来源的一抗是混在一起同时孵育的，那么他们2抗之间用了“或”这个字眼是什么意思？也是同时孵育？还是其他什么方法？

请指教。

图片附件: 75051737.png (2013-3-28 12:40, 5.23 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15386

作者: yysr238 时间: 2013-3-28 12:41

你好，我想请教一下能否用牛奶封闭过夜啊？我用牛奶封闭过夜后，曝光的时候发现孵育了发光液后膜上没有一点发光的地方，不知道是不是因为牛奶封闭的太死了

作者: yysr238 时间: 2013-3-28 12:41

你好，我还想问一个问题就是我的目的蛋白是23kD的，湿转的话转一个小时会不会有点久？

作者: october7 时间: 2013-3-28 12:42

十分谢谢楼主的回答，我的上样量是15μL(用loading处理后的总上样量)，我蛋白的浓度是10μg/μl左右，总量大概是120μg。胶都没有什么问题，分离胶的时间也是90分钟.
我试试减小上样量！若有问题在向楼主请教！

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上样量好大啊！

作者: october7 时间: 2013-3-28 12:42

我做的是大鼠脊髓挫伤，检测caspase-3的WB,摸一抗，二抗浓度，做了好几个月也没出结果，一抗是Santa的，技术应该是没什么问题，现在可以把内参显得很漂亮，就是不出目的条带，强烈怀疑santa的抗体不稳定（在论坛上也听到sabta抗体不好用的声音），我们是90次，300多元钱的，建议xdjm,如果实在不出结果，应该考虑下抗体的稳定性，不要为省钱买太便宜的抗体，否则费时费力！

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同感！用进口分装的一抗，浪费了一个多月的时间！

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:43

好，刚开始做WB，先开始跑内参，开始没有条带出来，最近两次做出来均在action位置出现3-4个条带，一条一条的，
背景很干净，我是从组织提的全蛋白，上样量150ug，90v，110v电泳，300mA 70分钟湿转，5%脱脂奶粉室温封闭2小时，
一抗 1：1000TBST稀释4°C孵过夜，国产二抗1：1000TBST稀释室温2+小时。都是TBST洗膜3*10min。DAB液显色，
是我的action抗体有问题吗？还有想问一下：一抗和二抗可以回收4℃保存继续用吗？十分感谢，救救我吧，
做了半个月内参都没做出来的。都快疯了

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1、上样量太大
2、有图片吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:44

您好，老师
兔二抗用1:50000做某个指标可以做出很好的结果，有条带无背景。换做另外一个指标，仍然是用兔二抗，结果ECL发光时整张膜发亮，这样肯定是曝不出光，是不是应该降低一抗的浓度？需要针对这个指标调整二抗的浓度吗？

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不需要调整二抗浓度
调整一抗的试试

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:45

谢谢老师的回复，我们实验室所用的抗兔与抗鼠的二抗对WB的推荐浓度都是1：10000——1：200000，我不大明白怎样确定二抗的稀释度。
什么是点杂交？
还有如果先确定二抗的稀释度的话，一抗浓度应该怎样的？或者是我理解错了，您说的意思是：确定二抗稀释度的过程不需要转膜、封闭、加一抗的前步骤？
这个暑假憋在实验室很痛苦，像没头苍蝇似的在调浓度，看到您的这个帖子，像是抓到了救命稻草似的。谢谢您，望指教。

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把二抗按照不同的稀释度稀释好后
取1ul点在NC膜上
等干燥后
加ECL发光，曝光

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:45

是在wb最后一步显影的时候，请问是怎么回事呢？（我附了一张显影的图片）

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这是彩色图片吗？
还是CCD照相的结果？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:46

最近做WB 遇到以下几个问题，望老师指点：
1.浓缩胶花了45min不凝（有一个槽的胶没了，其他槽都凝的很好，所以损失了一个槽）
2。显影出来结果有两个条带是变形的，其他都好
3.显影出来有白色片状斑块，估计是气泡所致，如何可以避免
4。有张膜显影时间很长，也没将全部条带显出来，只有部分，是上样量是15微克，是上样量太少了吗？还是抗体浓度太小了？
5。只做标准曲线调蛋白时，曲线老是个指数曲线，弯的，浓度时0,1,2,4,8,16，这样回归系数太小了，怎么样改善呢，或者这样下去对所调蛋白浓度一致性的影响大不大，可以这么做吗？
多谢！

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调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:46

最近准备跑WB，看了一些文献，发现一些问题请请教。
为什么说两种种属来源不同的抗体可以同时孵育?另外请看下图

文章中2个不同种属来源的一抗是混在一起同时孵育的，那么他们2抗之间用了“或”这个字眼是什么意思？也是同时孵育？还是其他什么方法？

请指教。

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这个只是论文中实验方法的描述
不够详细吧

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:47

你好，我想请教一下能否用牛奶封闭过夜啊？我用牛奶封闭过夜后，曝光的时候发现孵育了发光液后膜上没有一点发光的地方，不知道是不是因为牛奶封闭的太死了，可以加QQ2545597724聊吗

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你做什么指标？
内参？

作者: xingyi08 时间: 2013-3-28 12:48

调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

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谢谢您的答复！

1.昨天又做了，胶没出现那种状况，都凝的很好，老师分析的很有道理，我以后注意点量的问题。

2.两个条带变形，看图，如下：（这是GAPDH图）

3.通常PVDF用甲醇激活要激活多久啊，激活后需要再用转膜液洗吗？不知道气泡多和这有没有关系。

4.单位是微克/微升

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:48

QUOTE:

原帖由 xingyi08 于 2013-3-28 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
调整APS与TEMED的量（最大的可能性是APS失效了，重新配制）
有两个条带变形：应该是胶孔的问题
气泡要赶干净，没有别的方法
浓度0,1,2，。。。。这个浓度单位是多少？

========================================================= ...

1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

作者: HPLC使者 时间: 2013-3-28 12:49

1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

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谢谢您的关注！单位是微克/微升，也就是毫克/毫升啊，应该没错吧。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:49

QUOTE:

原帖由 HPLC使者 于 2013-3-28 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、你说的这个单位是错的
2、中间两个条带的带型是由于胶的原因引起的

===========================================================

谢谢您的关注！单位是微克/微升，也就是毫克/毫升啊，应该没错吧。。。 ...

单位有误

作者: HPLC使者 时间: 2013-3-28 12:50

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-28 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

单位有误

那单位应该是多少呢？我用BSA配的，称取32微克BSA,用三蒸水溶解，震荡，离心得32微克/微升的BSA溶液，再倍比稀释得，16,8,4,2,1（ug/ul,即mg/ml）的BSA液，再加一个单纯三蒸水的0，作为空白对照，我不知道这样做对不对，不知道正确的单位应该是什么，老师能告诉我吗？

作者: 彼岸花opp 时间: 2013-3-28 12:50

老师你好，我在预实验的时候用完成了如下一个结果，30μg蛋白的上样量，BSA封闭RT 1H,1:500的abcam一抗，1:10000的碧云天二抗，一抗孵育过夜，二抗RT 1H52KDa蛋白300mA恒流转膜75min左右,电压在75V左右，一抗和二抗出来后，0.1%TBST漂洗7到8次，每次7min左右

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15387

作者: 彼岸花opp 时间: 2013-3-28 12:51

但在正式实验时却怎么也重复不出这个结果。现在这个结果如下：

条件是用了40μg混样蛋白上样量，一抗浓度没变，二抗前四个是1:20000的，后四个是1:10000的，封闭同样，一抗二抗孵育 RT 1H,100V恒压转膜75min左右，电流在270mA左右，洗涤同样, 压片7min

我的问题是：1.为何条带怎么都做不出像预实验那种又粗又黑的条带？包括孵育过夜我之前也试过
2.同样浓度，背景怎么差异这么大？应当如何改进呢?

谢谢老师！

图片附件: 35783012.snap.jpg (2013-3-28 12:51, 21.23 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15388

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:51

那单位应该是多少呢？我用BSA配的，称取32微克BSA,用三蒸水溶解，震荡，离心得32微克/微升的BSA溶液，再倍比稀释得，16,8,4,2,1（ug/ul,即mg/ml）的BSA液，再加一个单纯三蒸水的0，作为空白对照，我不知道这样做对不对，不知道正确的单位应该是什么，老师能告诉我吗？

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BCA的线性范围在2mg/ml以内
你说的32ug/ul换算后就是32mg/ml
后续的计算或者测试肯定是不准确的

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:51

QUOTE:

原帖由 彼岸花opp 于 2013-3-28 12:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
但在正式实验时却怎么也重复不出这个结果。现在这个结果如下：

条件是用了40μg混样蛋白上样量，一抗浓度没变，二抗前四个是1:20000的，后四个是1:10000的，封闭同样，一抗二抗孵育 RT 1H,100V恒压转膜75min左右，电流在270mA左 ...

二抗浓度减低

作者: 彼岸花opp 时间: 2013-3-28 12:52

二抗浓度减低

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问题是，我上图是1:10000的二抗，下图前四个也是1:10000的二抗，后四个是1:20000的二抗，但是背景差异都很大，而且下图始终无法达到上图的效果

其次，为何再也得不到如上图般又粗又黑成椭圆状的条带了？

作者: HPLC使者 时间: 2013-3-28 12:53

BCA的线性范围在2mg/ml以内
你说的32ug/ul换算后就是32mg/ml
后续的计算或者测试肯定是不准确的

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我做的蛋白通常都是10mg/ml左右，要是BSA线性范围这么低的话，我该咋办，换成别的什么做标准曲线呢？上次我做动物蛋白，裂解液和动物组织比例没做好，测出来的最低浓度是2点多，被老板批评了。。。她说通常要10mg/ml。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2013-3-28 12:53

今天做的western ECL发光，内参的图很好，而目的基因曝光1分钟时什么也没有，延长曝光时间至5分钟，可看到模糊的条带，感觉条带宽度可以，就只整体上模模糊糊，只能看到轮廓。目的基因一抗是santa的，4度保存，分装后已近两年，按1:100稀释的；内参b-actin，按1:1000稀释，二抗是按1:4500稀释的。求帮忙分析一下是什么原因导致这样的结果，是一抗时间太长吗？？

作者: mimili_901 时间: 2013-3-28 12:54

1、上样量太大
2、有图片吗？
谢谢你的答复，我又重复了两次，图片如下，是什么原因呢，我真的无从分析，怎么办才能找出我的错误之处呢，因为一直重复都是一样的趋势啊，再次表示感谢
??

图片附件: 61386142.jpg (2013-3-28 12:54, 64.54 KB) / 该附件被下载次数 0
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作者: whitesheep 时间: 2013-3-28 12:55

请教一下：做WB一段时间了，但好看的结果一直没有。请指教。
目的蛋白：91kd，内参actin 43kd。用碧云天RIPA（强）裂解液提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液变性，保存。
10%分离胶，5%堆积胶。上样量10ul，75v30分钟，90v60分钟，此时溴酚蓝已到达胶的底部。转膜用0.45umpvdf膜，条件
：100v，120分钟（目的），60分钟（actin).丽春红染膜，见蛋白条带为淡淡的红色，此时胶上的marker条带全部被转移。5%脱脂奶粉的PBST溶液室温封闭1小时；PBST洗膜，5min*2次；一抗目的（1:300），内参（1；5000）孵育，4度过夜+室温分钟；PBST洗膜，5min*3次：二抗HRP标记，（1:5000），孵育，室温1小时；PBST洗膜，5min*3次；ECL曝光。
结果目的有条带出来，而内参竟不出条带。重复多次仍一样结果，重显等法仍不能出现条带。
疑惑不已。

作者: whitesheep 时间: 2013-3-28 12:56

上贴忘了说明：我是湿转的。bio-rad的仪器。
还有一个问题，蛋白不会转过吧？我看到靠膜滤纸有marker条带显示的。但有人说不会转过的。
还有说法：说两边滤纸不要接触，会造成短路，疑惑；切后的胶及用来转的膜没有滤纸大啊，两边滤纸肯定要接触的啊。

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:56

问题是，我上图是1:10000的二抗，下图前四个也是1:10000的二抗，后四个是1:20000的二抗，但是背景差异都很大，而且下图始终无法达到上图的效果

其次，为何再也得不到如上图般又粗又黑成椭圆状的条带了？

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缓冲液有所改变？
二抗孵育体系多大？
是否因为您的体系太小而影响了稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:57

我做的蛋白通常都是10mg/ml左右，要是BSA线性范围这么低的话，我该咋办，换成别的什么做标准曲线呢？上次我做动物蛋白，裂解液和动物组织比例没做好，测出来的最低浓度是2点多，被老板批评了。。。她说通常要10mg/ml。

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你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:57

今天做的western ECL发光，内参的图很好，而目的基因曝光1分钟时什么也没有，延长曝光时间至5分钟，可看到模糊的条带，感觉条带宽度可以，就只整体上模模糊糊，只能看到轮廓。目的基因一抗是santa的，4度保存，分装后已近两年，按1:100稀释的；内参b-actin，按1:1000稀释，二抗是按1:4500稀释的。求帮忙分析一下是什么原因导致这样的结果，是一抗时间太长吗？？

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用什么公司的ECL？
货号多少？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:58

谢谢你的答复，我又重复了两次，图片如下，是什么原因呢，我真的无从分析，怎么办才能找出我的错误之处呢，因为一直重复都是一样的趋势啊，再次表示感谢
??

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40ug的时候条带不是还不错吗？
另外降低一抗的浓度，加大一抗稀释度试试

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:58

请教一下：做WB一段时间了，但好看的结果一直没有。请指教。
目的蛋白：91kd，内参actin 43kd。用碧云天RIPA（强）裂解液提取细胞总蛋白，加入上样缓冲液变性，保存。
10%分离胶，5%堆积胶。上样量10ul，75v30分钟，90v60分钟，此时溴酚蓝已到达胶的底部。转膜用0.45umpvdf膜，条件
：100v，120分钟（目的），60分钟（actin).丽春红染膜，见蛋白条带为淡淡的红色，此时胶上的marker条带全部被转移。5%脱脂奶粉的PBST溶液室温封闭1小时；PBST洗膜，5min*2次；一抗目的（1:300），内参（1；5000）孵育，4度过夜+室温分钟；PBST洗膜，5min*3次：二抗HRP标记，（1:5000），孵育，室温1小时；PBST洗膜，5min*3次；ECL曝光。
结果目的有条带出来，而内参竟不出条带。重复多次仍一样结果，重显等法仍不能出现条带。
疑惑不已。

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1、操作没有问题
2、所有试剂的质量需要考虑

作者: NBA 时间: 2013-3-28 12:58

上贴忘了说明：我是湿转的。bio-rad的仪器。
还有一个问题，蛋白不会转过吧？我看到靠膜滤纸有marker条带显示的。但有人说不会转过的。
还有说法：说两边滤纸不要接触，会造成短路，疑惑；切后的胶及用来转的膜没有滤纸大啊，两边滤纸肯定要接触的啊。

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湿转没关系的，不会短路

作者: pengke1983 时间: 2013-3-28 13:00

最近实验我有个问题，其一是所有膜的背景很深。我想问会不会和TBST有关系，TBST的PH7.4 关系会有很大吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:01

最近实验我有个问题，其一是所有膜的背景很深。我想问会不会和TBST有关系，TBST的PH7.4 关系会有很大吗？

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膜的孔径是多少？
二抗稀释度调整过吗？

作者: 彼岸花opp 时间: 2013-3-28 13:02

缓冲液有所改变？
二抗孵育体系多大？
是否因为您的体系太小而影响了稀释度

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谢谢您的回复。
缓冲液一直是碧云天的二抗稀释液
所谓的孵育体系是指？稀释度是1:10000，但是重复性很差，同样情况（包括时间和稀释度）下两次出现的背景都相当不同。如果是指容量，我用的是一个塑封袋，根据膜的大小用枪头注入适当的稀释二抗进行孵育。
体系太小影响稀释度是指？

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-28 13:02

用什么公司的ECL？
货号多少？

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谢谢你的回复，发光液的牌子和货号我没太注意，但肯定是实验室常见的，我看到同实验室的其他人也用这个牌子的。。而且，我用这个发光液发的内参图很好，所以我想应该不是发光液的原因吧。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-28 13:03

另外还想问一下，跑出的内参图条带宽窄不一是不是一定是因为上样量不一样？

作者: HPLC使者 时间: 2013-3-28 13:03

你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？
多谢老师回复!

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今天我又做了一批蛋白，平均浓度时6——8mg/ml的样子，今天做的标准曲线R方是0.9826 还差那么一大截！
开始我说的是用BSA配制溶液做标准曲线，可是老师说的是BCA定量，我查BCA他是个试剂盒，不知老师说的BSA线性范围是我的BSA的线性范围吗？
老师真智慧，我咋没想到用稀释呢...

作者: HPLC使者 时间: 2013-3-28 13:04

你老板批评是有一定道理的
动物组织一般裂解出来是在10-20mg/ml
进行BCA定量的时候
样品用PBS进行10倍稀释不久在BCA的线性范围了？？？

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还有个问题想请教，细胞的通常都是2-5mg/ml的样子，为什么动物组织通常都要做到10-20mg/ml呢？差别这么大，我想大的浓度早晚也要调低的呀，如果把动物的组织按细胞的2-5mg/ml，会有什么不良后果吗？究竟是什么道理呢？因为有时候会有些动物标本组织块比较小，比较珍贵，能不能这么做呢？

作者: vivian4123 时间: 2013-3-28 13:04

1、操作没有问题
2、所有试剂的质量需要考虑

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谢谢老师。
我目的蛋白可出来条带，说明系统还可以。应该主要是内参抗体出问题啦。我再稀释内参抗体看一下。
为省点膜，我把胶切开，目的蛋白部分和内参部分分别转吧。请问一下，目的91kd，内参43kd，湿转的话，最好的转膜条件应该是怎样的？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:05

谢谢您的回复。
缓冲液一直是碧云天的二抗稀释液

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所谓的孵育体系是指？稀释度是1:10000，但是重复性很差，同样情况（包括时间和稀释度）下两次出现的背景都相当不同。如果是指容量，我用的是一个塑封袋，根据膜的大小用枪头注入适当的稀释二抗进行孵育。
体系太小影响稀释度是指？
一抗、二抗重复回收使用？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:05

另外还想问一下，跑出的内参图条带宽窄不一是不是一定是因为上样量不一样？

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1、上样量总蛋白、上样体积不一致
2、梳孔大小不同
3、转膜的影响

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:06

还有个问题想请教，细胞的通常都是2-5mg/ml的样子，为什么动物组织通常都要做到10-20mg/ml呢？差别这么大，我想大的浓度早晚也要调低的呀，如果把动物的组织按细胞的2-5mg/ml，会有什么不良后果吗？究竟是什么道理呢？因为有时候会有些动物标本组织块比较小，比较珍贵，能不能这么做呢？

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可以

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:07

谢谢老师。
我目的蛋白可出来条带，说明系统还可以。应该主要是内参抗体出问题啦。我再稀释内参抗体看一下。
为省点膜，我把胶切开，目的蛋白部分和内参部分分别转吧。请问一下，目的91kd，内参43kd，湿转的话，最好的转膜条件应该是怎样的？

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湿转，300mA恒流，90min

作者: +小生怕怕+ 时间: 2013-3-28 13:07

刚刚开始做western，电泳的每个样品条带总是呈现“U”型，重新配置了电泳液，丙烯酰胺，配胶的时候也挺注意的，但是每次加完样后，胶柱两边就会有残留，跑成这个样子。希望高人能帮我解答，无比感激！！！

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作者: ero11 时间: 2013-3-28 13:08

今天做的western ECL发光，内参的图很好，而目的基因曝光1分钟时什么也没有，延长曝光时间至5分钟，可看到模糊的条带，感觉条带宽度可以，就只整体上模模糊糊，只能看到轮廓。目的基因一抗是santa的，4度保存，分装后已近两年，按1:100稀释的；内参b-actin，按1:1000稀释，二抗是按1:4500稀释的。求帮忙分析一下是什么原因导致这样的结果，是一抗时间太长吗？？

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我也遇到同样的问题，有时洗膜洗的剧烈点连个影都曝不出来，试过加大上样量也解决不了问题，我的抗体也是santa的，已经用了8个月了，突然就出现上述的问题，ECL是PIERCE的supersignal，蛋白提取了大概一个月左右，有时是抗体效价下降还是蛋白降解或者其他什么原因呢，望老师能够帮忙解答，谢谢

作者: qhyu 时间: 2013-3-28 13:09

湿转，300mA恒流，90min

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谢谢老师。目的91kd，内参43kd，不需要分别转吗？我可以跑一块胶，电泳后切开胶，省点样品。蛋白Marker是170kd，130kd，110kd，75kd,55kd,45kd,35kd......，可以在75kd（红色）和55kd（蓝色）之间切开胶的。
另外，再请教一下。我要检测8个样本，可分为4对，我用一块胶（10加样孔）电泳，,样品加在中间8个孔里，不会因为膜太长而导致两边的两个样品与中间的出现偏差吗？或者我用两块胶，每一块跑4个样品。哪种方法更好呢？

作者: 131415 时间: 2013-3-28 13:09

版主好，我现在有个小问题转膜条件不知道这么调整蛋白分子量两百左右我的转膜条件是：恒流350mA，80min 电压在100到130之间，丽春红染时，单飞资粮的蛋白还是基本没有转到PVDF膜上

作者: gogo 时间: 2013-3-28 13:10

终于看到高手啦希望帮我解决几个问题呗？？ 1.我的内参都稳定的出，就说明我的样没错吧? 但是目的蛋白出的就是没有趋势，要不就不出？？请帮我总结下都会有什么原因吗？？因为急于想要结果 2.如果是因为样的原因？是不就得重做动物实验啊？？我是用脑缺血模型取脑组织请帮帮我吧

作者: 火树银花nm 时间: 2013-3-28 13:10

楼主你好！
我们用fermentas的maker。10-250kda的那种。湿转。
用SDS-PAGE胶10%，80V大概要2h10min跑好胶。maker分离良好。
用PVDF膜045um的转，使用前用100%甲醇浸润1min。
转膜缓冲液用tris-base30.3 glycine 144.0 20%/v甲醇ddH2O 1L
用80V 、60V转膜2h，发觉36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

然后昨天用新配TB，跑完胶上架后发现TB不够，用了大概20min配TB，期间膜有一半泡在TB里，然后用80V2h转膜，结果发现36、28、17、10kda都转得好漂亮，但是以上的50 70kda的转了一半，分子量再大的就没转上。
之后重夹补甲醇浸润，再80V追加半小时。结果一样。

之后重跑，用新的用过两次的TB转，结果跟之前的一样36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

湿转的话温度控制在多少最佳？
磁转子搅拌加外置碎冰控温，水槽上下温度均衡维持在8C。
磁转子搅拌加外置碎冰控温加内置冰袋，水槽上下温度均衡维持在4C。

转膜滤纸可以重复使用吗？

PVDF膜需要比滤纸大么。即使是比滤纸大，marker一样转得不清晰。

求教，转膜的电压/电流，时间，转膜缓冲液，转膜缓冲液的温度。

作者: 四福晋 时间: 2013-3-28 13:11

老师您好，有两个问题需要咨询：
（1）两张NC膜，转膜后，一张上面是大鼠腓肠肌蛋白样，另一张是大鼠比目鱼肌蛋白样，进行封闭时，两张膜是否可以一起封闭？
（2）进行小分子量指标的wb测试，分子量为15-20kD，我们实验室是半干转，20V，请问，转膜时间设定为多少较为理想？我试过40、50、60min，都有条带出现，但是我不知道，是不是转膜完全了，我想知道一般情况下这种分子量的蛋白半干转转膜时间是多少？

作者: yhz1973 时间: 2013-3-28 13:11

请问楼主，western blot能检测出至少什么质量级别的蛋白，是多少毫克急别还是多少微克？ELISA呢？

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-28 13:12

请问，若目的蛋白的浓度差异在1-4倍左右，能否直观观察到条带之间的差异呢？用的是thermo的ECL显色液，化学发光仪拍照。目前重复的结果是看不到明显的差异，不知道是操作问题还是检测限的问题。1-4倍是依据Q-PCR的结果，样品有定量，并且有beta-actin做内参。

作者: bongte 时间: 2013-3-28 13:13

楼主你好，我有个问题想请教下，如胶片所示，最近一段时间我压片总是出现这个问题，1.处，出现如同哑铃一样的条带，有时候中间的连着的，有时候中间连不上，甚至只压出一半，第二个问题，2处。这个是GAPDH，应该是很好压出来的，但是最近也出现条带部分压不出的情况如绿圈所示应该是有条带的，应该是显色到压片这部分出了问题，但是因为我做挺长时间了，所以自己根本就不觉得有什么操作的问题，但是应该肯定有一个我已经形成习惯的步骤出现了问题，请楼主帮忙分析下

步骤，二抗下来，TBST 5X6min，铺在保鲜膜上，GE 的ECL。4度冷藏，拿出来，1比1.两毫升混匀，立即滴加在膜上,膜上TBST没有完全吸干（怀疑这有问题，此处求问，膜上tbst完全干掉再加底物可行否？），几分钟之后，关灯隐隐可见条带，吸干ECL，覆新保鲜膜，剪好大小，放进X射线夹，显影，若干分钟，显影定影，OVER。。

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作者: woshituzhu 时间: 2013-3-28 13:13

我买的抗体（膜蛋白）是santa的，如果总蛋白在上样前煮沸的话就没有条带，但不煮的话就有条带，用的5*Buffer就是一般的，含有DDT的。santa说明书上说是此抗体可以做IP。今天试了一下，孵育一抗4度过夜，再加入protein G 孵育4度4h后离心后却没有看到沉淀。具体如下：
1.提取蛋白，方法就是一般的提蛋白的方法
2.因本次只是预实验，没有蛋白定量，但总蛋白量大约有1mg
3.加入25ul（5ug抗体）抗体，于旋转摇床上4度过夜。
4.加入20ul protein G,于旋转摇床上4度,4h。
5.离心：于4度离心机，3000g/min,离心5min,没有看到沉淀，改为5000g/min,离心5min，还是没有看到沉淀。这是为什么呢？

作者: taoshengyijiu 时间: 2013-3-28 13:14

这个条件没问题

需要注意抗体识别的是还原型的还是非还原型的胶原蛋白

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您好，我的是非还原的，还不能煮沸，该怎么做啊，完全不懂啊。。。。

作者: 彼岸花opp 时间: 2013-3-28 13:14

一抗、二抗重复回收使用？

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不是这个的问题，因为我已经换过新的一抗和二抗试过了。

会不会是一抗反复冻融导致活性降低了？以及如果抗体过了使用期限？
另外有两个问题：1.TBST洗涤究竟会不会将一抗或者二抗的结合洗掉？TBST洗涤去背景的原理是什么呢？
2.一抗的反复冻融究竟会对抗体造成怎么的损害。做到现在我的抗体应该反复冻融了5,6次了，这个有影响吗？

作者: avi317 时间: 2013-3-28 13:15

材料：大鼠海马蛋白 SR-2A，蛋白分子量55
方法：转膜后封闭过夜，一抗3小时（稀释200倍），洗膜15‘、10’、10‘；二抗1小时（稀释200倍），洗膜5’、5‘、5’。直接显影，曝光时间14‘
第一次成了黑板：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15393

作者: avi317 时间: 2013-3-28 13:16

此后纯水洗膜5h30'，再次显影，又成了这个样子

不知道问题出在哪，应该如何调整条件呢？？

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作者: ffooll 时间: 2013-3-28 13:16

我就用了一个抗体，条带是出了，可是上下各一条。想请教这个的原因！不胜感激

作者: 穿越时空 时间: 2013-3-28 13:17

请问组织蛋白做western blot 有没有特别需要注意的事项？做WB两个月了还没有结果，蛋白分子量85KD,ECL显色后结果如下，可见一些蛋白质印迹，为什么会这样？谢谢！转膜250mA 1h

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作者: memory 时间: 2013-3-28 13:17

老师，您好：我做的目的蛋白KD，内参42KD。最近换的新抗体做的，上样量已达110ug。
结果：背景很干净，内参是b-actiin 也很好，带有目的蛋白的阳性标本有目的带，但是在目的蛋白处阴性对照也有目的条带（阴性对照是空的K562细胞），之前做也出现这种情况，这次在阳性孔道后连着做了四个阴性对照，结果都有表达，而且很亮，能否帮忙分析下原因，我是新手做了将近三个月了，很是郁闷！

作者: memory 时间: 2013-3-28 13:18

目的蛋白是73KD

作者: memory 时间: 2013-3-28 13:19

老师，您好：我做的目的蛋白73KD，内参42KD。最近换的新抗体做的，上样量已达110ug。
结果：背景很干净，内参是b-actiin 也很好，带有目的蛋白的阳性标本有目的带，但是在目的蛋白处阴性对照也有目的条带（阴性对照是空的K562细胞），之前做也出现这种情况，这次在阳性孔道后连着做了四个阴性对照，结果都有表达，而且很亮，能否帮忙分析下原因，我是新手做了将近三个月了，很是郁闷！

作者: 131415 时间: 2013-3-28 13:19

最主要是背景很深……差不多整张膜都是黑的，GAPDH 压了四张片子，3-5分钟都是黑黒的……一样的二抗其中有两个抗体还不错，但有背景这个问题也存在没有GAPDH这么严重

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:19

刚刚开始做western，电泳的每个样品条带总是呈现“U”型，重新配置了电泳液，丙烯酰胺，配胶的时候也挺注意的，但是每次加完样后，胶柱两边就会有残留，跑成这个样子。希望高人能帮我解答，无比感激！！！

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这个不是胶的问题
我觉得是loading buffer

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:21

终于看到高手啦希望帮我解决几个问题呗？？ 1.我的内参都稳定的出，就说明我的样没错吧? 但是目的蛋白出的就是没有趋势，要不就不出？？请帮我总结下都会有什么原因吗？？因为急于想要结果 2.如果是因为样的原因？是不就得重做动物实验啊？？我是用脑缺血模型取脑组织请帮帮我吧

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动物实验一般不会有显著性的趋势

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:21

楼主你好！
我们用fermentas的maker。10-250kda的那种。湿转。
用SDS-PAGE胶10%，80V大概要2h10min跑好胶。maker分离良好。
用PVDF膜045um的转，使用前用100%甲醇浸润1min。
转膜缓冲液用tris-base30.3 glycine 144.0 20%/v甲醇ddH2O 1L
用80V 、60V转膜2h，发觉36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

然后昨天用新配TB，跑完胶上架后发现TB不够，用了大概20min配TB，期间膜有一半泡在TB里，然后用80V2h转膜，结果发现36、28、17、10kda都转得好漂亮，但是以上的50 70kda的转了一半，分子量再大的就没转上。
之后重夹补甲醇浸润，再80V追加半小时。结果一样。

之后重跑，用新的用过两次的TB转，结果跟之前的一样36、28、17、10kda的条带转膜很淡，基本看不到。大分子的还好。

湿转的话温度控制在多少最佳？
磁转子搅拌加外置碎冰控温，水槽上下温度均衡维持在8C。
磁转子搅拌加外置碎冰控温加内置冰袋，水槽上下温度均衡维持在4C。

转膜滤纸可以重复使用吗？

PVDF膜需要比滤纸大么。即使是比滤纸大，marker一样转得不清晰。

求教，转膜的电压/电流，时间，转膜缓冲液，转膜缓冲液的温度。

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1、湿转不需要控制温度，只是电压与电流不要太高就行
2、滤纸可以重复使用

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:22

老师您好，有两个问题需要咨询：
（1）两张NC膜，转膜后，一张上面是大鼠腓肠肌蛋白样，另一张是大鼠比目鱼肌蛋白样，进行封闭时，两张膜是否可以一起封闭？
（2）进行小分子量指标的wb测试，分子量为15-20kD，我们实验室是半干转，20V，请问，转膜时间设定为多少较为理想？我试过40、50、60min，都有条带出现，但是我不知道，是不是转膜完全了，我想知道一般情况下这种分子量的蛋白半干转转膜时间是多少？

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1、为什么要一起封闭呢？
当然也可以一起封闭，不过建议分开进行
2、半干我用过1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，15-20K的蛋白转膜20min，0.22um孔径膜

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:23

请问楼主，western blot能检测出至少什么质量级别的蛋白，是多少毫克急别还是多少微克？ELISA呢？

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WB可以检测到fg级别
ELISA我不太清楚

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:24

请问，若目的蛋白的浓度差异在1-4倍左右，能否直观观察到条带之间的差异呢？用的是thermo的ECL显色液，化学发光仪拍照。目前重复的结果是看不到明显的差异，不知道是操作问题还是检测限的问题。1-4倍是依据Q-PCR的结果，样品有定量，并且有beta-actin做内参。

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这个蛋白浓度指？？？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:25

楼主你好，我有个问题想请教下，如胶片所示，最近一段时间我压片总是出现这个问题，1.处，出现如同哑铃一样的条带，有时候中间的连着的，有时候中间连不上，甚至只压出一半，第二个问题，2处。这个是GAPDH，应该是很好压出来的，但是最近也出现条带部分压不出的情况如绿圈所示应该是有条带的，应该是显色到压片这部分出了问题，但是因为我做挺长时间了，所以自己根本就不觉得有什么操作的问题，但是应该肯定有一个我已经形成习惯的步骤出现了问题，请楼主帮忙分析下

步骤，二抗下来，TBST 5X6min，铺在保鲜膜上，GE 的ECL。4度冷藏，拿出来，1比1.两毫升混匀，立即滴加在膜上,膜上TBST没有完全吸干（怀疑这有问题，此处求问，膜上tbst完全干掉再加底物可行否？），几分钟之后，关灯隐隐可见条带，吸干ECL，覆新保鲜膜，剪好大小，放进X射线夹，显影，若干分钟，显影定影，OVER。。

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1、上样体积多大？
2、孵育ECL要混匀，同时不能完全干掉

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:29

我买的抗体（膜蛋白）是santa的，如果总蛋白在上样前煮沸的话就没有条带，但不煮的话就有条带，用的5*Buffer就是一般的，含有DDT的。santa说明书上说是此抗体可以做IP。今天试了一下，孵育一抗4度过夜，再加入protein G 孵育4度4h后离心后却没有看到沉淀。具体如下：
1.提取蛋白，方法就是一般的提蛋白的方法
2.因本次只是预实验，没有蛋白定量，但总蛋白量大约有1mg
3.加入25ul（5ug抗体）抗体，于旋转摇床上4度过夜。
4.加入20ul protein G,于旋转摇床上4度,4h。
5.离心：于4度离心机，3000g/min,离心5min,没有看到沉淀，改为5000g/min,离心5min，还是没有看到沉淀。这是为什么呢？

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1、这个样品你在加入loading的时候煮沸变性了？
2、没有看到沉淀。。。这个protein G你确定加进去了？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:29

您好，我的是非还原的，还不能煮沸，该怎么做啊，完全不懂啊。。。。

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请看《蛋白质技术手册》汪家政，范明编的

非还原：不能有DTT及beta-巯基乙醇等还原剂

可以有SDS

不能加热变性

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:30

不是这个的问题，因为我已经换过新的一抗和二抗试过了。

会不会是一抗反复冻融导致活性降低了？以及如果抗体过了使用期限？
另外有两个问题：1.TBST洗涤究竟会不会将一抗或者二抗的结合洗掉？TBST洗涤去背景的原理是什么呢？
2.一抗的反复冻融究竟会对抗体造成怎么的损害。做到现在我的抗体应该反复冻融了5,6次了，这个有影响吗？

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反复冻融对抗体是个大忌

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:30

我就用了一个抗体，条带是出了，可是上下各一条。想请教这个的原因！不胜感激

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这个有杂带的情况很正常

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:31

请问组织蛋白做western blot 有没有特别需要注意的事项？做WB两个月了还没有结果，蛋白分子量85KD,ECL显色后结果如下，可见一些蛋白质印迹，为什么会这样？谢谢！转膜250mA 1h

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组织蛋白没有什么特别需要注意的
我觉得电泳就没跑好

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:31

老师，您好：我做的目的蛋白KD，内参42KD。最近换的新抗体做的，上样量已达110ug。
结果：背景很干净，内参是b-actiin 也很好，带有目的蛋白的阳性标本有目的带，但是在目的蛋白处阴性对照也有目的条带（阴性对照是空的K562细胞），之前做也出现这种情况，这次在阳性孔道后连着做了四个阴性对照，结果都有表达，而且很亮，能否帮忙分析下原因，我是新手做了将近三个月了，很是郁闷！

======================================

这个阴性对照K562完全没有这个蛋白表达吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 13:32

最主要是背景很深……差不多整张膜都是黑的，GAPDH 压了四张片子，3-5分钟都是黑黒的……一样的二抗其中有两个抗体还不错，但有背景这个问题也存在没有GAPDH这么严重

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1、二抗调整一下
2、是否胶片被走光了

作者: abc816 时间: 2013-3-28 13:32

1、上样体积多大？
2、孵育ECL要混匀，同时不能完全干掉

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体积才10ul。完全混匀，没有干掉

作者: yonger 时间: 2013-3-28 15:19

新手弱弱的问一句
蛋白定量后加buffer 变性后没有冻存
还能用么

作者: junhun 时间: 2013-3-28 15:23

1、这个样品你在加入loading的时候煮沸变性了？
2、没有看到沉淀。。。这个protein G你确定加进去了？

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因为离心两次都没有看到protein G的沉淀，所以只有加大proteinG的量，再加入40ul，即共60ul protein G,继续旋转4度过夜。确定protein G是加进去了的。

作者: junhun 时间: 2013-3-28 15:30

1、这个样品你在加入loading的时候煮沸变性了？
2、没有看到沉淀。。。这个protein G你确定加进去了？

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没有看到沉淀，所以当时没有做接下来的离心，洗脱加Buffer这几步。我的这个蛋白做一般的Western的时候不煮蛋白才可以做出条带，所以这次做IP就没打算100度煮沸，煮沸变性应该也是做不出来的。准备加甘氨酸和Tris中和。请高手多多指教。我听别人讲说proteinG 是球状的，很容易粘在枪头上，并且如果枪头来回吹打的话也容易把protein G打散，所以我是把200ul的枪头剪了大概5mm再吸的。但我确定是把它加进去了。期待您的回复，谢谢啦哈

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:35

新手弱弱的问一句
蛋白定量后加buffer 变性后没有冻存
还能用么

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多久？
一两天后就不行了

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:35

体积才10ul。完全混匀，没有干掉

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转膜后丽春红染过膜吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:35

没有看到沉淀，所以当时没有做接下来的离心，洗脱加Buffer这几步。我的这个蛋白做一般的Western的时候不煮蛋白才可以做出条带，所以这次做IP就没打算100度煮沸，煮沸变性应该也是做不出来的。准备加甘氨酸和Tris中和。请高手多多指教。我听别人讲说proteinG 是球状的，很容易粘在枪头上，并且如果枪头来回吹打的话也容易把protein G打散，所以我是把200ul的枪头剪了大概5mm再吸的。但我确定是把它加进去了。期待您的回复，谢谢啦哈

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要把protein G充分吹打混匀了才能加

作者: ritou1985 时间: 2013-3-28 15:36

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

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前辈，你好，
小弟正准备做western，新手上路，遇到了很多问题，在这里向你请教几个：
1. 小弟用原代细胞提取的蛋白，含量不怎么高，大概在1-1.3mg/ml左右，而检测的指标蛋白表达量都不怎么高，怎么加样为宜，蛋白质量多少，体积多少？
2. 小弟检测的蛋白分子量均在30-50之间，10%的胶行否？应该选择什么内参？

作者: H2O 时间: 2013-3-28 15:37

你好，我最近WB的结果总是会出现如图所示的亮条扭曲的情况，有时候很严重到几乎看不到亮条的。
我确认过做gel的方法，用的12.5%的胶，特意等了2个小时以确保凝固。
染色，wash的时候我也有注意不碰触表面。请问为什么还会不同程度的出现这样的问题。
非常感谢。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15396

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:37

前辈，你好，
小弟正准备做western，新手上路，遇到了很多问题，在这里向你请教几个：
1. 小弟用原代细胞提取的蛋白，含量不怎么高，大概在1-1.3mg/ml左右，而检测的指标蛋白表达量都不怎么高，怎么加样为宜，蛋白质量多少，体积多少？
2. 小弟检测的蛋白分子量均在30-50之间，10%的胶行否？应该选择什么内参？

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1、细胞蛋白浓度1-1.3也可以了
我们检测的时候上样一般是10-15ug
2、12%的就可以
内参可以选择beta-actin
不同的样品对内参有不同的要求

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:38

你好，我最近WB的结果总是会出现如图所示的亮条扭曲的情况，有时候很严重到几乎看不到亮条的。
我确认过做gel的方法，用的12.5%的胶，特意等了2个小时以确保凝固。
染色，wash的时候我也有注意不碰触表面。请问为什么还会不同程度的出现这样的问题。
非常感谢。

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应该是胶凝的不好

作者: jujuba 时间: 2013-3-28 15:39

非常感谢您的回答。请问凝胶的时候需要注意些什么吗。凝胶液我有votex混均匀，然后加入凝胶剂，上下晃动10次后倒入模具中。在上层加水等待凝胶。我尝试很多次都这样。以前没出现过这些问题，最近连连出错，请问可能是什么原因。

作者: kulee 时间: 2013-3-28 15:46

1、为什么要一起封闭呢？
当然也可以一起封闭，不过建议分开进行
2、半干我用过1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，15-20K的蛋白转膜20min，0.22um孔径膜

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谢谢老师回复。
1、我们的大师兄让我们一起封闭，原因是可以节省封闭液，我们每次封闭需要5ml封闭液，BSA与TBST混合制成的封闭液。
2、半干转实验室一直用20V恒压转膜，而且不管是什么指标，师兄建议都是转膜1.5h，我们是0.22um孔径的膜，师兄给的原因是：虽然分子量小，但是胶浓度已经限制过分子量大小的问题了，所以运用一致的转膜时间。老师，您的看法是什么？
3、老师，还有一个问题：我们做小分子量的蛋白WB时，怎么跑内参呢？是分两板跑吗？我的小分子蛋白跑时用15%的胶，而内参用10%的胶跑较合适，这种情况下，是不是只能分两版胶跑？对于大分子的蛋白呢？我分别有一个15-20kd的指标和一个240—260kd的指标，这两个指标的内参是不是只能分两版跑？
4、关于曝光时压片时间的问题：是不是做同一个指标的不同老鼠时，在曝光时，曝光时间（压片时间）要一致？压片时间会影响灰度值？
劳您费神，非常感谢老师指导。

作者: kulee 时间: 2013-3-28 15:47

啊呀，想起来了，还有一个问题。
我最近在做大鼠骨骼肌的4EBP1的蛋白表达和磷酸化表达，其磷酸化表达的抗体是针对两个磷酸化位点的，我做出来的条带都是双条带，而且，磷酸化和蛋白表达都是双条带，无背景，我感觉很奇怪，我想知道这个双条带到底是因为4EBP1的磷酸化位点造成的，还是它自己还有不同的亚基造成的？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:47

非常感谢您的回答。请问凝胶的时候需要注意些什么吗。凝胶液我有votex混均匀，然后加入凝胶剂，上下晃动10次后倒入模具中。在上层加水等待凝胶。我尝试很多次都这样。以前没出现过这些问题，最近连连出错，请问可能是什么原因。

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用的配胶的试剂是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:48

谢谢老师回复。
1、我们的大师兄让我们一起封闭，原因是可以节省封闭液，我们每次封闭需要5ml封闭液，BSA与TBST混合制成的封闭液。
2、半干转实验室一直用20V恒压转膜，而且不管是什么指标，师兄建议都是转膜1.5h，我们是0.22um孔径的膜，师兄给的原因是：虽然分子量小，但是胶浓度已经限制过分子量大小的问题了，所以运用一致的转膜时间。老师，您的看法是什么？
3、老师，还有一个问题：我们做小分子量的蛋白WB时，怎么跑内参呢？是分两板跑吗？我的小分子蛋白跑时用15%的胶，而内参用10%的胶跑较合适，这种情况下，是不是只能分两版胶跑？对于大分子的蛋白呢？我分别有一个15-20kd的指标和一个240—260kd的指标，这两个指标的内参是不是只能分两版跑？
4、关于曝光时压片时间的问题：是不是做同一个指标的不同老鼠时，在曝光时，曝光时间（压片时间）要一致？压片时间会影响灰度值？
劳您费神，非常感谢老师指导。

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1、封闭液可以回收使用，但是次数不要太多
2、不是吧，不同分子量蛋白转膜当然不能用一致的条件
3、如果想在一块做的话，用梯度胶
4、曝光时间等不可能做到一致，只能在不同胶上设置一个相同的样品做对照，这个样品用各组混合后样品

作者: NBA 时间: 2013-3-28 15:49

啊呀，想起来了，还有一个问题。
我最近在做大鼠骨骼肌的4EBP1的蛋白表达和磷酸化表达，其磷酸化表达的抗体是针对两个磷酸化位点的，我做出来的条带都是双条带，而且，磷酸化和蛋白表达都是双条带，无背景，我感觉很奇怪，我想知道这个双条带到底是因为4EBP1的磷酸化位点造成的，还是它自己还有不同的亚基造成的？

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这个蛋白本身就是有多条带呢
正常的

作者: 9900 时间: 2013-3-28 15:52

用的配胶的试剂是什么？

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这个配方我用了几年了，虽然做的次数不多，可没有太大的问题，就是最近一个月，不知道怎么了。。。。。。。。。非常感谢。

图片附件: 97101211.jpg (2013-3-28 15:52, 32.9 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15397

作者: duoduo 时间: 2013-3-28 15:52

老师
您好，有个问题请教，不胜感激。
WB条件：8%的胶，上样量50ug左右，电泳1小时50分，80-100V电压，marker跑的很清楚。
之后转膜，湿转，大、小分子量分开转的，200mA，内参50分钟，大分子量110kD，时间1小时50分。
抗体santa的，一抗1:200，4度过夜，洗完，二抗1:1000，2小时，洗完，显色，曝光。
问题是：1.每次小分子量的出的还行，但大分子显色整片膜都是亮的，背景很高，竟有一次连marker也压出来了，亮亮的，其余是黑的。很困惑。
2.今天又做了一次，用丽春红染膜后小分子量可以看见条带，但大分子量的就一片，没有明显条带，像上图中上面那个（借用别人的图，呵呵），难道是电泳没跑开，但是marker跑开了，望老师指导，非常感谢！

作者: 831226 时间: 2013-3-28 15:54

你好，我最近做25KD大小的蛋白，上样量20ug，12%的胶。80V、120V恒压电泳，100V恒压转膜35分钟，5%脱脂奶粉封闭，β-Actin 内参蛋白分子量是45KD，β-Actin pAb 是Bioworld technology提供的，使用浓度1:5000。二抗浓度1:10000。HRP-DAB显色。可是每次内参结果都不理想，经常出现两条带，而且靠近72、55条带附近。很是苦恼啊，望高手指点！

作者: glass 时间: 2013-3-28 15:55

K562细胞株做过RT-PCR这个基因是没有表达的

作者: DNA 时间: 2013-3-28 16:12

小白请教前辈：
1、做289KD 的p-mTOR WB时怎么选择分离胶和浓缩胶的浓度？还是用梯度胶？另外电泳和转膜的电流、时间设定该怎么定？
2、有没有这么大的marker可供选择呢？
3、内参相比之下都较小，能够在一张胶上跑么？如果能，是不是要分开来转膜？

谢谢！

作者: DNA 时间: 2013-3-28 16:12

老师，您好！最近做β-ACTIN，调齐了的蛋白量，每次上样量都一样，可是两次都各有一孔条带非常浅。回顾一下实验，可能是加样前从-20度拿出然后冰上冻融的，加样的时候可能有的吸得浅有的吸得深。如果加样前煮沸是不是加样的时候粘稠度均质些，结果能好点？因为之前已经煮沸锅一次了，再次煮沸会不会对蛋白不大好啊？

谢谢啦！

作者: yonger 时间: 2013-3-28 16:13

你好！我最近几次做的western 只有内参有条带，目的基因无条带，不知什么原因？望不吝赐教，多谢了！我去年做出来过，我做的事p-ERK,p-p38MAPK蛋白，分子量分别是42,44,43kD，机器曝光后，仅见有膜的影子，上面啥也没有，我用的事cell signaling 的磷酸化一抗，因为已经三次结果都这样了，所以想请教一下师兄，多谢了！

作者: 2541 时间: 2013-3-28 16:14

老师，您好，我的目的蛋白为40kD的糖肽，我采用半干转膜，恒压，20V，20min，但是多次重复检测不到，请您指点

作者: wmp1234 时间: 2013-3-28 16:16

大神好，我是个新手，想检测成纤维细胞在实验前后生成I型胶原蛋白的量的变化，我能用WB检测吗？有的说用PCR检测，有的说用WB。我该怎么设计实验，迷茫了，请大神指教

作者: nut6694 时间: 2013-3-28 16:41

版主，你好。我做了一批WB的结果，最近在用Image J 软件进行分析，在群里搜到了很多关于使用的帖子，有的是把所有条带放在一个矩形框内分析，cuturl('http://d.dxy.cn/preview/4259987') 有的又是把每一的条带放在不同的框内分析，cuturl('http://d.dxy.cn/preview/1523143')我有点迷茫啦。请版主指点迷津。

作者: 831226 时间: 2013-3-28 16:41

求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃摇1.5h。显色。（一抗，二抗都按1:5000稀释）

但是结果是膜非常干净，目的条带和杂带也没有。我的阳性对照也没有条带。

因为我是新手，自己也找不出原因，求各位大神帮帮忙。

作者: NBA 时间: 2013-3-28 17:00

QUOTE:

原帖由 831226 于 2013-3-28 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃ ...

你的试剂盒说明书上，12%的胶适合跑大小为66kd的蛋白么？还有我们一般孵一抗是4℃过夜

作者: NBA 时间: 2013-3-28 17:01

求各位大神帮帮忙。最近在做western，做了三次一直都没有做出条带来。

我的目的蛋白约66KD，12%SDS-PAGE跑胶以后用18v恒压转膜一个半小时。然后37℃，用5%脱脂奶粉封闭1小时。4℃过夜封闭。第二天加一抗37℃摇2h，二抗37℃摇1.5h。显色。（一抗，二抗都按1:5000稀释）

但是结果是膜非常干净，目的条带和杂带也没有。我的阳性对照也没有条带。

因为我是新手，自己也找不出原因，求各位大神帮帮忙。

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还有抗体稀释的问题，如果前几次按同样的稀释比例都没有的话可以考虑把滴度加大试试。

作者: finger 时间: 2013-3-28 17:02

还有抗体稀释的问题，如果前几次按同样的稀释比例都没有的话可以考虑把滴度加大试试。

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之前师兄也做过，是差不多大小的蛋白，也能做出来。我就是根据之前师兄的方法做的。我在想会不会封闭时间太长了？

作者: remenb 时间: 2013-3-28 17:03

你好~我想请教一下！我做的western内参很好，可是目的蛋白整条带都是荧光，尝试着降浓度什么的，都没效果，条带都看不清，要是降的很淡了还是看不清条带，谢谢~

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15398

作者: gogo 时间: 2013-3-28 17:05

老师好。我做WB也有几个月了，蛋白分子量是56KD的，，做的是肺癌组织，
条件：10%的浓缩胶，4%分离胶，电泳上层120伏，下层是180V。转膜条件为20伏，15分钟。5%脱脂奶粉封闭6小时，一抗4度过夜，1:2000，二抗室温1小时，1:2500，ECL显像，所有中间步骤都是TBST洗10min,3次。
显色很模糊，一团团的呀，总是这样的没有办法半定量。现在迷茫了，不知道问题出来哪里，期待答复，谢谢

图片附件: 50293456.snap.jpg (2013-3-28 17:05, 79.92 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15400

作者: wood533 时间: 2013-3-28 17:09

用小肠组织提蛋白应该用什么方法可靠？

作者: ha111 时间: 2013-3-28 17:10

刚学western，有几个问题想问一下。
1、转膜后用考马斯兰染胶，mark栏没有条带了，但加样栏还有条带，膜上mark转得比较成功，但封闭抗体孵育后曝光却什么也没有，接着我就用考马斯兰染了膜，发现膜上是有条带的，这说明还是有蛋白转到膜上了的，我的问题是：是不是胶上样品栏没有条带才证明转膜比较成功和充分呢？电转液可以重复使用吗？如果可以，一般能重复使用几次或多长时间需要重新配制？
2、我的二抗浓度稀释按1:1000的比例，是不死浓度太高了，因为在我加上ECL后发现膜上出现一条白色沉淀，没过多久（30秒）就消失了，是不是HRP把底物迅速消耗掉了，导致曝光什么也没有呢？
谢谢！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-28 17:10

这个蛋白浓度指？？？

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我用蛋白浓度这个表述不准确，1-4倍是根据QPCR结果作出的柱状图。我做的western是检测蛋白表达的差异，如果A样品表达1份目的蛋白，B蛋白表达多少份蛋白能在显色的条带上看出差异呢？我打算用beta-actin来试验下，将样品分别稀释1倍，2倍，3倍，4倍，看看是否能在条带上有所差别，但这个方案事实上也不严谨，beta-actin在细胞里的表达量比其他检测的蛋白样品高许多，

[ 本帖最后由 ROSE李于 2013-3-28 17:18 编辑 ]

作者: ROSE李 时间: 2013-3-28 17:21

老师好。我做WB也有几个月了，蛋白分子量是56KD的，，做的是肺癌组织，
条件：10%的浓缩胶，4%分离胶，电泳上层120伏，下层是180V。转膜条件为20伏，15分钟。5%脱脂奶粉封闭6小时，一抗4度过夜，1:2000，二抗室温1小时，1:2500，ECL显像，所有中间步骤都是TBST洗10min,3次。
显色很模糊，一团团的呀，总是这样的没有办法半定量。现在迷茫了，不知道问题出来哪里，期待答复，谢谢

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我根据我的经验分析下，可能是你的电压太高了，条带都弥散了，建议用90V跑 2小时，分离胶浓度可以高些。

作者: fei1226com 时间: 2013-3-29 10:44

楼主好，我是新手，刚开始学习WB，内参一直做不好，怀疑是丙烯酰胺的原因呢。如果丙烯酰胺不是分析纯的，会导致什么样的结果！

作者: dog002 时间: 2013-3-29 10:44

请问冲洗X光片的时候显影和定影的容器有材质要求吗？可不可以用平时装器材的搪瓷托盘，或者是塑料盒子？

作者: abc816 时间: 2013-3-29 10:45

这个蛋白用裂解的上清直接进行WB的时候能检测到吗？

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也检测不到，着急呢！

作者: 羊咩咩 时间: 2013-3-29 10:45

版主，您好，想问下您做western电转之后电转液会变成淡蓝色是怎么回事

作者: NBA 时间: 2013-3-29 10:46

建议预实验检测的时候不要剪膜
这个内参看着还行

作者: NBA 时间: 2013-3-29 10:47

楼主好，我是新手，刚开始学习WB，内参一直做不好，怀疑是丙烯酰胺的原因呢。如果丙烯酰胺不是分析纯的，会导致什么样的结果！

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丙烯酰胺会影响电泳分离效果

作者: NBA 时间: 2013-3-29 10:47

请问冲洗X光片的时候显影和定影的容器有材质要求吗？可不可以用平时装器材的搪瓷托盘，或者是塑料盒子？

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塑料饭盒即可

作者: NBA 时间: 2013-3-29 10:47

也检测不到，着急呢！

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那问题就大了
不知道是过程有问题还是别的问题
因为input如果检测不到的话
后续检测都不可信呢

作者: NBA 时间: 2013-3-29 10:48

版主，您好，想问下您做western电转之后电转液会变成淡蓝色是怎么回事

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是不是有很多溴酚蓝？
另外是否回收使用了电转液？

作者: am10 时间: 2013-3-29 10:49

那问题就大了
不知道是过程有问题还是别的问题
因为input如果检测不到的话
后续检测都不可信呢

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弱弱问一句，什么叫“input检测不到”？一般检测蛋白不都是用的裂解的上清做的么

作者: 3N4G 时间: 2013-3-29 10:49

我同时将4块胶（loading的蛋白都是一样的）用bio-rad半干转膜仪转膜20V 1.5h，转膜后marker在膜上都很清晰，胶上也看不到残留，但是显影后发现只有两张膜有目的条带，另外两张膜上什么都没有，非常非常干净，什么也看不到（似乎一般的膜上了显影液，多压一会儿都会看到影子），每次转几块膜时都会出现这种情况，请问这是什么问题啊？
困扰我很久了，感谢您的回复！

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:11

弱弱问一句，什么叫“input检测不到”？一般检测蛋白不都是用的裂解的上清做的么

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input就是进行IP之前裂解的样品，把样品进行变性处理WB检测用

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:11

我同时将4块胶（loading的蛋白都是一样的）用bio-rad半干转膜仪转膜20V 1.5h，转膜后marker在膜上都很清晰，胶上也看不到残留，但是显影后发现只有两张膜有目的条带，另外两张膜上什么都没有，非常非常干净，什么也看不到（似乎一般的膜上了显影液，多压一会儿都会看到影子），每次转几块膜时都会出现这种情况，请问这是什么问题啊？
困扰我很久了，感谢您的回复！

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转膜后用丽春红染色看看

作者: kuohao17 时间: 2013-3-29 12:12

请问楼主，我现在在CHO细胞做融合蛋白表达（即A－连接肽－B），单独A或B在CHO中表达都可以通过WB检测到，且表达量比较大，但是融合蛋白表达量较低，也只能检测到A，死活都检测不到B，但是分子量的大小就是融合蛋白的大小，请问是什么原因？

作者: eric930 时间: 2013-3-29 12:12

请教老师做免疫共沉淀的问题，这个实验刚开始做，有些不明白的地方，我用的是BECN（santa. sc11427.60kd）沉淀蛋白，检测BCL-2的变化，我的实验步骤是

1. 细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
2.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约200微克至1毫克，加20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2h。

3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

4. 用BECN沉淀蛋白（BECN抗体为santa的货号为sc-11427，60kd）
C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1个小时
C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，
C4.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心
C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，SDS-PAGE电泳，
5、转膜，封闭都按照做WB的要求，一抗孵育的是BCL-2(26KD),

左边的条带为沉淀后的蛋白，右边的是提取细胞上清 SDS-PAGE染色后

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作者: eric930 时间: 2013-3-29 12:31

曝光后的图片，条带很亮，有些拖尾，在55kd左右和26kd左右都有条带

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作者: eric930 时间: 2013-3-29 12:33

老师帮忙解答啊，这个沉淀后的蛋白是出现在55kd左右（BECN的条带），我孵育了BCL-2之后是不是条带也应该出现在55kd左右，我该看那条带的变化啊，，该怎么改进，求解答。。。。

作者: popo520 时间: 2013-3-29 12:35

您好！western新手有问题想请教下老师:
1.分子量43的蛋白，制样时应该多大浓度？上样量多少合适？
2.跑胶时跑至分离胶下缘时，溴酚蓝呈波浪形，继续跑了十几分钟，居然变成了一条黄色。。。是什么原因导致的呢？如何避免？
请赐教！谢谢！

作者: TAT 时间: 2013-3-29 12:36

请问老师，我想要测血管内皮细胞的一种分泌性蛋白的变化情况，查了下相关的文献发现有的文献里有做内参蛋白，有的没有，这是怎么回事啊？像这种情况下到底用不用做内参蛋白？

作者: IAM007 时间: 2013-3-29 12:39

版主，我想问下，我这几天做了个WB，backgroud还是挺干净的，但是每个well所在那一条，偏黑，这是什么原因？还有，我有个well 下了个positive control， beta-action是有band的，但是没有显示positive control的band，这是因为primary antibody的问题，还是sample的问题，我的 blocking buffer是： washing buferr 10x 10ml, tween 20 100ul, milk 5g, DDW 90ml,但是我只加了很少的milk，所以这样的solution对primary antibody有影响吗？

作者: @花开花落@ 时间: 2013-3-29 12:42

请教版主：
两个问题：
1、我的目的条带看起来毛毛糙糙的或者说是黑色不均匀是怎么回事呢？不像文献上的那么漂亮。
图片如下(箭头所指为目的条带)：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15406

作者: @花开花落@ 时间: 2013-3-29 12:42

2、有时杂带和目的条带难以区分。

图片附件: 40569892.snap.jpg (2013-3-29 12:42, 15.57 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15407

作者: @花开花落@ 时间: 2013-3-29 12:43

我的实验试剂及条件如下：
提取组织蛋白（-70°冻存标本，RIPA+PMSF，超声粉碎，冰上裂解1h），目的蛋白分子量34KD，BSA法总蛋白浓度约5ug/ul，上样量10ul；
12%凝胶电泳，积层胶80V,分离胶100V;
半干转膜；
5%蛋白封闭干粉摇床封闭1h（博士德，室温）；
一抗，santa 1:800，多克隆羊抗，封口袋内4°过夜；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*3次；
二抗，中杉金桥，1:5000，摇床室温1h；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*6次；
碧云天ECL发光液，1min或2min；
结果重复性也不好，请教版主，谢谢！

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-29 12:44

新手求助~~
弄不明白增感屏要怎么用。。。看说明的意思应该是把胶片夹在增感屏之间，光源应该是在增感屏外侧的，可是把增感屏粘到暗盒上之后，NC膜要放哪啊？是和胶片一起夹在增感屏之间？还是不粘增感屏，把胶片放在增感屏内侧，把膜放在外侧啊？谢谢~~

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:44

请问楼主，我现在在CHO细胞做融合蛋白表达（即A－连接肽－B），单独A或B在CHO中表达都可以通过WB检测到，且表达量比较大，但是融合蛋白表达量较低，也只能检测到A，死活都检测不到B，但是分子量的大小就是融合蛋白的大小，请问是什么原因？

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表达这一块我就不太懂了

A与B单独存在的情况下能检测到吗？
可能B的抗体不能识别B

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:45

请教老师做免疫共沉淀的问题，这个实验刚开始做，有些不明白的地方，我用的是BECN（santa. sc11427.60kd）沉淀蛋白，检测BCL-2的变化，我的实验步骤是

1. 细胞培养皿中的贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次，然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。
2.取200微升至1毫升蛋白样品，蛋白量约200微克至1毫克，加20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动30分钟至2h。

3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，取上清用于后续的免疫沉淀。

4. 用BECN沉淀蛋白（BECN抗体为santa的货号为sc-11427，60kd）
C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4℃缓慢摇动过夜。

C2.再加入20微升充分重悬的Protein A+G Agarose，4℃缓慢摇动1个小时
C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟，或瞬时高速离心，小心吸除上清，
C4.完成最后一次洗涤后，去除上清，加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀，瞬时高速离心
C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟，SDS-PAGE电泳，
5、转膜，封闭都按照做WB的要求，一抗孵育的是BCL-2(26KD),

左边的条带为沉淀后的蛋白，右边的是提取细胞上清 SDS-PAGE染色后

曝光后的图片，条带很亮，有些拖尾，在55kd左右和26kd左右都有条带

老师帮忙解答啊，这个沉淀后的蛋白是出现在55kd左右（BECN的条带），我孵育了BCL-2之后是不是条带也应该出现在55kd左右，我该看那条带的变化啊，，该怎么改进，求解答。。。。

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上样量减小

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:45

您好！western新手有问题想请教下老师:
1.分子量43的蛋白，制样时应该多大浓度？上样量多少合适？
2.跑胶时跑至分离胶下缘时，溴酚蓝呈波浪形，继续跑了十几分钟，居然变成了一条黄色。。。是什么原因导致的呢？如何避免？
请赐教！谢谢！

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细胞样品：1-2ug/ul，上样10-20ug
组织样品：2-4ug/ul，上样20-40ug
跑到底才成黄色吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:46

请问老师，我想要测血管内皮细胞的一种分泌性蛋白的变化情况，查了下相关的文献发现有的文献里有做内参蛋白，有的没有，这是怎么回事啊？像这种情况下到底用不用做内参蛋白？

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什么蛋白？
你看做内参与不做内参是什么情况下采用的

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:47

版主，我想问下，我这几天做了个WB，backgroud还是挺干净的，但是每个well所在那一条，偏黑，这是什么原因？还有，我有个well 下了个positive control， beta-action是有band的，但是没有显示positive control的band，这是因为primary antibody的问题，还是sample的问题，我的 blocking buffer是： washing buferr 10x 10ml, tween 20 100ul, milk 5g, DDW 90ml,但是我只加了很少的milk，所以这样的solution对primary antibody有影响吗？

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positive control是什么样品？
如果是纯化后的纯蛋白，那么你做beta-actin不应该有条带。。。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:47

请教版主：
两个问题：
1、我的目的条带看起来毛毛糙糙的或者说是黑色不均匀是怎么回事呢？不像文献上的那么漂亮。
图片如下(箭头所指为目的条带)：

2、有时杂带和目的条带难以区分。

我的实验试剂及条件如下：
提取组织蛋白（-70°冻存标本，RIPA+PMSF，超声粉碎，冰上裂解1h），目的蛋白分子量34KD，BSA法总蛋白浓度约5ug/ul，上样量10ul；
12%凝胶电泳，积层胶80V,分离胶100V;
半干转膜；
5%蛋白封闭干粉摇床封闭1h（博士德，室温）；
一抗，santa 1:800，多克隆羊抗，封口袋内4°过夜；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*3次；
二抗，中杉金桥，1:5000，摇床室温1h；
TBST(TWEEN浓度0.1%，PH值7.5)清洗5min*6次；
碧云天ECL发光液，1min或2min；
结果重复性也不好，请教版主，谢谢！

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调整二抗稀释度
一抗为羊来源的，基本就是这样的结果了

作者: mamamiya 时间: 2013-3-29 12:48

楼主您好，看到帖子里之前您做过脑的BDNF（santa，14KD）、CREB（CST，43KD）及p-CREB（CST,43KD），本人新手做了三次，内参已经做出来了，但是目的蛋白一直做不出来。我的实验条件如下：
5%的浓缩胶（70V，30min）、15%的分离胶（120V，2h20min）；根据mark将胶分成两部分，BDNF恒流（300mA）转膜15——20min，CREB及P-CREB转膜50min；丽春红染色可以看到明显的条带43KD,但BDNF的条带看不到（第一次跑电泳时用考马斯亮蓝结合凝胶成像分析系统可以看到预期的条带；将转膜后的胶再次用考马斯亮蓝染色，可以看到相应的条带）；脱脂奶粉封闭2小时后，一抗孵育；其中BDNF采用1:200稀释，CREB采用1:1000稀释（根据抗体说明书进行稀释，看帖子内说磷酸化蛋白不太容易做，暂时未做），4度过夜（约16小时），漂洗后，采用公司送的二抗（在该公司订购大量抗体馈赠，二抗不会有问题吧？）室温孵育2h，之后漂洗显色，加过发光液后，目的蛋白条带上不能看到荧光（内参的荧光可以看到），压片后什么都没有。每孔加样量保证60微克蛋白，蛋白浓度平均在12微克每微升。望版主指正。

作者: owanaka 时间: 2013-3-29 12:50

版主，我想问下，我这几天做了个WB，backgroud还是挺干净的，但是每个well所在那一条，偏黑，这是什么原因？还有，我有个well 下了个positive control， beta-action是有band的，但是没有显示positive control的band，这是因为primary antibody的问题，还是sample的问题，我的 blocking buffer是： washing buferr 10x 10ml, tween 20 100ul, milk 5g, DDW 90ml,但是我只加了很少的milk，所以这样的solution对primary antibody有影响吗？

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positive control是什么样品？
如果是纯化后的纯蛋白，那么你做beta-actin不应该有条带。。。

一个positive control是runx2是骨髓里提出来的，一个klotho，是从肾里提出来的，应该不是纯化的，我是看着老板把肾碾碎，加lysis buffer 保存的，runx2也是~

作者: owanaka 时间: 2013-3-29 12:50

input就是进行IP之前裂解的样品，把样品进行变性处理WB检测用

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楼主好，之前一直检测不到的目的膜蛋白在胎肝中可以看到明显的条带了，因为该蛋白在胎肝中是高表达的，因此考虑整个WB过程没有问题，主要可能是在我检测的骨髓细胞中表达量太低，那么有什么好的方法可以提高蛋白浓度（我的上样量为20ul，不能再加量），又或者是应该改用其他方法对该蛋白进行检测呢？谢谢

作者: am10 时间: 2013-3-29 12:50

谢谢指教！
溴酚蓝是差不多快跑到底才变成黄色的~~~

作者: am10 时间: 2013-3-29 12:51

细胞样品：1-2ug/ul，上样10-20ug
组织样品：2-4ug/ul，上样20-40ug
跑到底才成黄色吗？

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谢谢指教！
是差不多快跑到底才成黄色的~~~是什么原因导致的呢？谢谢！

作者: yueban-1147 时间: 2013-3-29 12:51

有没有提过人组织总蛋白和核蛋白的。
最近要提人胎盘组织的总蛋白和核蛋白，之前用实验室的常规裂解液（提细胞和小鼠的裂解液）提的总蛋白和核蛋白浓度比较低，尤其是核蛋白浓度只有相同重量小鼠胎盘组织所提的1/3。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:52

楼主您好，看到帖子里之前您做过脑的BDNF（santa，14KD）、CREB（CST，43KD）及p-CREB（CST,43KD），本人新手做了三次，内参已经做出来了，但是目的蛋白一直做不出来。我的实验条件如下：
5%的浓缩胶（70V，30min）、15%的分离胶（120V，2h20min）；根据mark将胶分成两部分，BDNF恒流（300mA）转膜15——20min，CREB及P-CREB转膜50min；丽春红染色可以看到明显的条带43KD,但BDNF的条带看不到（第一次跑电泳时用考马斯亮蓝结合凝胶成像分析系统可以看到预期的条带；将转膜后的胶再次用考马斯亮蓝染色，可以看到相应的条带）；脱脂奶粉封闭2小时后，一抗孵育；其中BDNF采用1:200稀释，CREB采用1:1000稀释（根据抗体说明书进行稀释，看帖子内说磷酸化蛋白不太容易做，暂时未做），4度过夜（约16小时），漂洗后，采用公司送的二抗（在该公司订购大量抗体馈赠，二抗不会有问题吧？）室温孵育2h，之后漂洗显色，加过发光液后，目的蛋白条带上不能看到荧光（内参的荧光可以看到），压片后什么都没有。每孔加样量保证60微克蛋白，蛋白浓度平均在12微克每微升。望版主指正。

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做目的蛋白的二抗与内参的二抗是一致的吗？

作者: zsxan1990 时间: 2013-3-29 12:52

做目的蛋白的二抗与内参的二抗是一致的吗？

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用的上海康成的内参已经HRP标记过了不用再添加二抗，今天又做了一遍压片还是一片空白一抗是CST CREB (48H2) Rabbit mAb #9197，二抗是HRP conjugated goat anti-rabbit IgG(h+1).

作者: qhyu 时间: 2013-3-29 12:54

你好，我是刚刚开始学做western，最近练习了几次，有好几次我转膜后膜上的marker都没有，这一般是什么原因呀？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:54

楼主好，之前一直检测不到的目的膜蛋白在胎肝中可以看到明显的条带了，因为该蛋白在胎肝中是高表达的，因此考虑整个WB过程没有问题，主要可能是在我检测的骨髓细胞中表达量太低，那么有什么好的方法可以提高蛋白浓度（我的上样量为20ul，不能再加量），又或者是应该改用其他方法对该蛋白进行检测呢？谢谢

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更换更加敏感的ECL

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:55

用的上海康成的内参已经HRP标记过了不用再添加二抗，今天又做了一遍压片还是一片空白一抗是CST CREB (48H2) Rabbit mAb #9197，二抗是HRP conjugated goat anti-rabbit IgG(h+1).

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需要先排除二抗的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-29 12:55

你好，我是刚刚开始学做western，最近练习了几次，有好几次我转膜后膜上的marker都没有，这一般是什么原因呀？

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1、是预染marker？
2、膜正确处理了吗？
3、膜、胶、电极的顺序对吗？

作者: u234 时间: 2013-3-29 12:56

您好，

我在做一个膜蛋白的western blot，它的二聚体分子量是200kd 左右，我跑出来的时候一般是2条带，分别在100kd 和200kd. 不知道该如何跑出只有200kd 的蛋白。谢谢！！

作者: mamamiya 时间: 2013-3-29 12:59

你好，我昨天跑western，转膜后膜上marker的条带都没看见，膜、电极、胶都放对了，膜也正确处理了，后来用丽春红泡了一会，就隐约看见了72的一个条带。
我今天跑western又出现一个问题，我和师姐同时跑胶，在同一个槽子里面跑的，她跑12%的胶，我跑10%的胶，理论上她的应该慢于我，结果我的比她的还要慢，不知道哪里出问题了？这两天练习western，总出现不同的问题，始终找不到问题出在哪里，困扰！麻烦你帮我解答问题了，谢谢

作者: eric930 时间: 2013-3-29 13:00

这个蛋白用裂解的上清直接进行WB的时候能检测到吗？

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版主您好，请问用上清直接进行WB实验是什么意思？谢谢！

作者: eric930 时间: 2013-3-29 13:00

楼主好，之前一直检测不到的目的膜蛋白在胎肝中可以看到明显的条带了，因为该蛋白在胎肝中是高表达的，因此考虑整个WB过程没有问题，主要可能是在我检测的骨髓细胞中表达量太低，那么有什么好的方法可以提高蛋白浓度（我的上样量为20ul，不能再加量），又或者是应该改用其他方法对该蛋白进行检测呢？谢谢

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版主您好
我实验细胞来源是兔椎间盘组织，需要检测Collagen I 和 Collagen II两个胶原的蛋白量，内参B-atcin条带每次都能做出来，但目的蛋白都是空白的。我用的是碧云天的强PIPA裂解液，蛋白量也用到了60ug，也加大了一抗浓度，但都得不到条带，两个目的蛋白所用的一抗通过细胞免疫荧光实验检测表达都很好，这两种胶原在椎间盘组织中的含量很丰富，而且说明抗体也不存在问题。
1、现在可能是我细胞裂解这一步出现问题，是不是胶原的三级结构没有打开呢？胶原有三条链，使用的RIPA裂解液不能解开这些链，从而导致抗体不能结合，有这种可能吗？我查文献，有的人在提取蛋白之前，加入胃蛋白酶常温孵育2小时，然后做后续的蛋白提取，胃蛋白酶在这是起到解链的作用吗？
2、这两种胶原在组织中含量很丰富，80%的细胞分泌这些胶原，不应该没有表达，我觉得是样品没有处理好，但为什么内参又能跑出条带呢？
疑惑请赐教。谢谢！

作者: eric930 时间: 2013-3-29 13:01

从Abcam公司购买的抗体：Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚，请高手指点，谢谢！
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.

作者: eric930 时间: 2013-3-29 13:01

版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！

作者: gogo 时间: 2013-3-29 13:06

您好，今天是我第一次做斑点印迹实验，可是为什么我的片子洗出来贴着膜的部分整个都是黑的，而点了样，原本应该发光的地方却有点发白呢。。。

作者: ALALA 时间: 2013-3-29 13:06

请教一下WB的问题，我做的是大鼠肾脏动物蛋白内参是GAPDH 另两个分子量在52和90左右，感觉很不稳定，不明白条件和以前一样的现在出不来

作者: 莲花白 时间: 2013-3-29 13:07

楼主,你好,最近一直为WB困惑,下面是我的胶片.同样的重复做了三次,上面一排是内参,下面的是目的蛋白,分子量是27KD.上样量30ug,胶是15%的,电泳是80V,110V,共80分钟;转膜是湿转,200mA,时间60分钟.封闭是5%脱脂牛奶,一抗浓度1:500过夜,二抗1:5000两小时,分别用TBST洗3次,每次洗10分钟.目的蛋白的条带能看的到吗,背景是不是有点脏,该如何解决,谢谢.

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:07

您好，

我在做一个膜蛋白的western blot，它的二聚体分子量是200kd 左右，我跑出来的时候一般是2条带，分别在100kd 和200kd. 不知道该如何跑出只有200kd 的蛋白。谢谢！！

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这种情况下100K的一般是去不掉了
另外100K的条带存在也不影响检测效果

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:09

你好，我昨天跑western，转膜后膜上marker的条带都没看见，膜、电极、胶都放对了，膜也正确处理了，后来用丽春红泡了一会，就隐约看见了72的一个条带。
我今天跑western又出现一个问题，我和师姐同时跑胶，在同一个槽子里面跑的，她跑12%的胶，我跑10%的胶，理论上她的应该慢于我，结果我的比她的还要慢，不知道哪里出问题了？这两天练习western，总出现不同的问题，始终找不到问题出在哪里，困扰！麻烦你帮我解答问题了，谢谢

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样品电泳后染胶了吗？
不要着急做后面的检测

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:10

版主您好，请问用上清直接进行WB实验是什么意思？谢谢！

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如果在上清中用WB检测不到这个蛋白
做后续的实验就没有意义

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:10

版主您好，我和deba1116的情况差不多。
我实验细胞来源是兔椎间盘组织，需要检测Collagen I 和 Collagen II两个胶原的蛋白量，内参B-atcin条带每次都能做出来，但目的蛋白都是空白的。我用的是碧云天的强PIPA裂解液，蛋白量也用到了60ug，也加大了一抗浓度，但都得不到条带，两个目的蛋白所用的一抗通过细胞免疫荧光实验检测表达都很好，这两种胶原在椎间盘组织中的含量很丰富，而且说明抗体也不存在问题。
1、现在可能是我细胞裂解这一步出现问题，是不是胶原的三级结构没有打开呢？胶原有三条链，使用的RIPA裂解液不能解开这些链，从而导致抗体不能结合，有这种可能吗？我查文献，有的人在提取蛋白之前，加入胃蛋白酶常温孵育2小时，然后做后续的蛋白提取，胃蛋白酶在这是起到解链的作用吗？
2、这两种胶原在组织中含量很丰富，80%的细胞分泌这些胶原，不应该没有表达，我觉得是样品没有处理好，但为什么内参又能跑出条带呢？
疑惑请赐教。谢谢！

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这两个蛋白分子量比较大，不是很好检测
我检测过一些特异性不是很好

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:11

从Abcam公司购买的抗体：Anti-Aggrecan ARGxx antibody [BC-3] (ab3773)。其中说明书中这两段话不是很清楚，请高手指点，谢谢！
1. Recognises the aggrecanase (ADAMTS-1, -4 & -5)-generated N-terminal neoepitope ARG after cleavage between amino acids EGE and ARG within the interglobular domain of aggrecanase-catabolised aggrecan (Human aggrecan sequence enumeration). This antibody will not recognise the sequence ...ARG.. if it is in the non-cleaved intact aggrecan protein core; i.e. it will only recognise the aggrecanase generated neoepitope ARG... Samples need to be deglycosylated for epitope recognition.
2. Antibodies tested only in recombinant samples are not covered for use on endogenous samples. Please check the datasheet for information on tested species.

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第一点有点长，我就不解释了
第二点这个抗体只适用于检测重组蛋白

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:12

版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！

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1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:13

您好，今天是我第一次做斑点印迹实验，可是为什么我的片子洗出来贴着膜的部分整个都是黑的，而点了样，原本应该发光的地方却有点发白呢。。。

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调整一抗、二抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:14

请教一下WB的问题，我做的是大鼠肾脏动物蛋白内参是GAPDH 另两个分子量在52和90左右，感觉很不稳定，不明白条件和以前一样的现在出不来

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目的不稳定还是？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:14

楼主,你好,最近一直为WB困惑,下面是我的胶片.同样的重复做了三次,上面一排是内参,下面的是目的蛋白,分子量是27KD.上样量30ug,胶是15%的,电泳是80V,110V,共80分钟;转膜是湿转,200mA,时间60分钟.封闭是5%脱脂牛奶,一抗浓度1:500过夜,二抗1:5000两小时,分别用TBST洗3次,每次洗10分钟.目的蛋白的条带能看的到吗,背景是不是有点脏,该如何解决,谢谢.

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二抗用1:10000

作者: xyw5 时间: 2013-3-29 13:15

我现在封闭是用5%牛奶,1小时,请问曝光结果与封闭时间有关吗?有的话,该如何改进.此外,我今天又做了一次,上样量加大了,成为40ug,一抗浓度分别采用一1:500和1:1000,二抗浓度是1:2000,加发光液后,内参很弱,曝光后只看到很细的条带;目的蛋白和以前差别不是很大.请问,加大上样量后,内参应该变粗啊,我的怎么变细了?非常感谢.

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-29 13:15

1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的
谢谢版主。

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我的抗体说明书上写的是：The product does not react with the thermally-denatured molecule. 是否指的就是non-denaturing呢？还是指在加的loading buffer中可以有DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS，而仅仅不加热变性呢？
还有一个问题请教版主：我们购买的一抗要怎么验证这个抗体的真假？有专门的防伪网站吗？
谢谢！

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-29 13:16

这两个蛋白分子量比较大，不是很好检测
我检测过一些特异性不是很好

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请问版主最后有没有做出结果，能不能提供抗体的信息呢？

作者: 阿司匹林 时间: 2013-3-29 13:16

版主你好，我最近遇到一个问题，我通过排除实验证明了我的1抗B-actin及2抗均是有效的，我用了我一个老师1月前的膜，砸出了清晰的B-actin，但是却砸不出我自己的这几张膜，我需要砸的这几个膜用丽春红染色均有清晰的条带显影，但是这几张膜就是砸不出任何条带，包括VDR，AT1，AT2，B-actin等等用凝胶扫描系统每次都扫描都是白板，一开始我还以为是洗脱时间过长，后来我只洗3分钟，还是白板，所以我就请问，会不会什么原因造成这些膜上的蛋白失去活性？无法与一抗结合？还是什么其他原因引起的呢，我在收细胞后放入蛋白裂解液的持续时间这个时间有讲究么？我觉得我跟老师唯一的区别就是我放入蛋白裂解液后把他放冰箱4℃放了一晚上，会影响蛋白活性么？我头真的很大，望指教。

作者: 阿司匹林 时间: 2013-3-29 13:16

你好，我停了几个月没做试验，今天重新开工，结果发现跑WB时，蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的，而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的，应该没问题，后来想起来，去年也出现过类似情况，但是还没弄明白的时候就自己恢复了。
特此向NBA老师请教，谢谢!

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什么叫在浓缩胶里分离了，是不是加到1道，结果漏到3道旁边甚至浓缩胶和分离胶的交界面去了？如果是我也遇到过，是因为枪压得太狠了，枪头像楔子一样把玻璃板顶开了缝隙，就漏出去了，如果不是我就不知道了，等版主吧

作者: 麦丽素1986 时间: 2013-3-29 13:17

楼主，你好，问下我做western，转膜后丽春红染色，只能看到一个条带。这有可能是什么原因，我刚开始做这个，实在不懂，希望能得到你的指点。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:17

我现在封闭是用5%牛奶,1小时,请问曝光结果与封闭时间有关吗?有的话,该如何改进.此外,我今天又做了一次,上样量加大了,成为40ug,一抗浓度分别采用一1:500和1:1000,二抗浓度是1:2000,加发光液后,内参很弱,曝光后只看到很细的条带;目的蛋白和以前差别不是很大.请问,加大上样量后,内参应该变粗啊,我的怎么变细了?非常感谢.

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1、一般情况下，封闭时间与曝光结果直接关系不大，除非过长时间封闭或者不封闭
2、用什么ECL？内参一抗用1:500？？？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:19

谢谢版主。
我的抗体说明书上写的是：The product does not react with the thermally-denatured molecule. 是否指的就是non-denaturing呢？还是指在加的loading buffer中可以有DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS，而仅仅不加热变性呢？
还有一个问题请教版主：我们购买的一抗要怎么验证这个抗体的真假？有专门的防伪网站吗？
谢谢！

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请从正规代理商处购买

non-denaturing

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:19

请问版主最后有没有做出结果，能不能提供抗体的信息呢？

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都有结果

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:20

版主你好，我最近遇到一个问题，我通过排除实验证明了我的1抗B-actin及2抗均是有效的，我用了我一个老师1月前的膜，砸出了清晰的B-actin，但是却砸不出我自己的这几张膜，我需要砸的这几个膜用丽春红染色均有清晰的条带显影，但是这几张膜就是砸不出任何条带，包括VDR，AT1，AT2，B-actin等等用凝胶扫描系统每次都扫描都是白板，一开始我还以为是洗脱时间过长，后来我只洗3分钟，还是白板，所以我就请问，会不会什么原因造成这些膜上的蛋白失去活性？无法与一抗结合？还是什么其他原因引起的呢，我在收细胞后放入蛋白裂解液的持续时间这个时间有讲究么？我觉得我跟老师唯一的区别就是我放入蛋白裂解液后把他放冰箱4℃放了一晚上，会影响蛋白活性么？我头真的很大，望指教。

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1、转膜后的蛋白是没有活性的
2、WB检测的蛋白都是没有活性的
3、建议你把能杂出来的膜与你自己转膜后的一起做一下WB检测

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:20

什么叫在浓缩胶里分离了，是不是加到1道，结果漏到3道旁边甚至浓缩胶和分离胶的交界面去了？如果是我也遇到过，是因为枪压得太狠了，枪头像楔子一样把玻璃板顶开了缝隙，就漏出去了，如果不是我就不知道了，等版主吧

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在浓缩胶分离：1、浓缩胶太多，2、浓缩胶的pH不对

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:20

楼主，你好，问下我做western，转膜后丽春红染色，只能看到一个条带。这有可能是什么原因，我刚开始做这个，实在不懂，希望能得到你的指点。

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电泳完成后请在不转膜的情况下用考马斯亮蓝染一下胶试试

作者: PINK 时间: 2013-3-29 13:21

ECL检测试剂盒购于Millipore公司,内参一抗是1:5000,上面提到的浓度是目的蛋白的一抗.另外,我的蛋白是27KD,用的膜是PVDF 0.45um Millipore公司.抗体及封闭液稀释都是用加了TBST的5%脱脂牛奶.

作者: hustwb 时间: 2013-3-29 13:21

电泳完成后请在不转膜的情况下用考马斯亮蓝染一下胶试试

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染了就不能转膜了吧？

染了也是一条是什么原因呢？

作者: xueyouzhang 时间: 2013-3-29 13:22

1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的

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版主你好，如果注明是non-denaturing，蛋白样品还需要加上样loading buffer吗？
如果要，是不是去掉buffer配方里面的DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS，只剩下Tris-HCL、甘油和溴酚蓝？
我们的SDS-PAGE凝胶里面也有SDS，以及在跑电泳的时候也会加热，这些条件会影响蛋白样品吗？
谢谢！

作者: 二子 时间: 2013-3-29 13:23

二抗用1:10000

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NBA老师,按照您说的把目的蛋白二抗稀释了,但结果仍不令人满意,本来加了两个样品,但是目的蛋白(27KDa)根本看不出来是两个样,并且也不像是条带,像是一些非特异性.另外,加了ECL后,内参也几乎看不到荧光,这是压片8分钟后曝出来的,请问该如何解决;期待您的消息.

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作者: wood533 时间: 2013-3-29 13:24

非常感谢楼主这么多年的坚持！
向您请教两个问题
1、上图第一为GAPDH内参，第二为p-CaMKii（50kDa，一抗1:500，二抗1:5000），第三位CaMKii（50kDa，一抗1:500，二抗1:5000），后面两个分子量一样，一个为磷酸化，一个为非磷酸化，没有显出来，请问可能是什么原因呢？是否需要稀释二抗浓度。
2、关于western结果的统计，因为我们一般会曝光20张膜，是否实验组和对照组都得选曝光时间一样的那张膜？
谢谢您！

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作者: fsdd817 时间: 2013-3-29 13:24

请问这是什么情况呢？谢谢@做了很多次都是那样，不知道哪里出问题了
小鼠，心脏组织，胰蛋白酶
电泳：上层胶：80v，下层胶：120v
转膜：350ma，2h
封闭：5%脱脂奶粉，2h
一抗：santa兔抗（1:200），二抗：1:2000
ECL显色

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作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:25

ECL检测试剂盒购于Millipore公司,内参一抗是1:5000,上面提到的浓度是目的蛋白的一抗.另外,我的蛋白是27KD,用的膜是PVDF 0.45um Millipore公司.抗体及封闭液稀释都是用加了TBST的5%脱脂牛奶.

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内参无阳性条带吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:26

染了就不能转膜了吧？

染了也是一条是什么原因呢？

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染胶后不能再转

染了也是一条带？
你用的是纯化后的蛋白还是提取的总蛋白？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:27

版主你好，如果注明是non-denaturing，蛋白样品还需要加上样loading buffer吗？
如果要，是不是去掉buffer配方里面的DTT及β-巯基乙醇等还原剂和SDS，只剩下Tris-HCL、甘油和溴酚蓝？
我们的SDS-PAGE凝胶里面也有SDS，以及在跑电泳的时候也会加热，这些条件会影响蛋白样品吗？
谢谢！

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注明是non-denaturing，蛋白样品需要加上样loading buffer

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:30

按照您说的把目的蛋白二抗稀释了,但结果仍不令人满意,本来加了两个样品,但是目的蛋白(27KDa)根本看不出来是两个样,并且也不像是条带,像是一些非特异性.另外,加了ECL后,内参也几乎看不到荧光,这是压片8分钟后曝出来的,请问该如何解决;期待您的消息.

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我们一直用millipore的ecl
效果很好的
内参需要压片8min的话，系统还是需要调整呢
目的的条带类型可能与一抗有关系

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:30

非常感谢楼主这么多年的坚持！
向您请教两个问题
1、上图第一为GAPDH内参，第二为p-CaMKii（50kDa，一抗1:500，二抗1:5000），第三位CaMKii（50kDa，一抗1:500，二抗1:5000），后面两个分子量一样，一个为磷酸化，一个为非磷酸化，没有显出来，请问可能是什么原因呢？是否需要稀释二抗浓度。
2、关于western结果的统计，因为我们一般会曝光20张膜，是否实验组和对照组都得选曝光时间一样的那张膜？
谢谢您！

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1、非磷酸化的没现出来？
如果是这样，建议换抗体
2、做统计的话：需要在每张膜上加一个共同的样品来消除误差

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:31

请问这是什么情况呢？谢谢@做了很多次都是那样，不知道哪里出问题了
小鼠，心脏组织，胰蛋白酶
电泳：上层胶：80v，下层胶：120v
转膜：350ma，2h
封闭：5%脱脂奶粉，2h
一抗：santa兔抗（1:200），二抗：1:2000
ECL显色

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如果内参做的很好，且二抗与目的蛋白的相同的话
考虑目的蛋白一抗的问题

作者: superboy 时间: 2013-3-29 13:32

如果内参做的很好，且二抗与目的蛋白的相同的话
考虑目的蛋白一抗的问题

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已经找到问题所在了，原来是二抗的问题

作者: hold住 时间: 2013-3-29 13:32

我们一直用millipore的ecl
效果很好的
内参需要压片8min的话，系统还是需要调整呢
目的的条带类型可能与一抗有关系

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后来又把原来的膜用TBST洗后,用抗体重新孵育,内参还是很好的.整个体系还是很好的.我是想27分子量的蛋白,用200mA的电流,60分钟会不会转过?另外背景高,与孵育二抗的时间有关吗?我现在是二抗孵育2小时.谢谢啊.

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-29 13:33

相关疾病：
头痛
看了您的很多解答，我也有问题想请教您：
1.蛋白超声，因为的样品才50--100ul，体积这么少，是不是不能超声啊，还是有专门的仪器，我们实验室的超声仪是比较旧的，探头比较粗。CST的抗体如果做不出来就要超声试试。
2.虽然不同大小的蛋白有不同的转膜条件，我也试过几种，我的蛋白大小在40KD左右和110KD，您建议用什么条件转，我们只有湿转的仪器。
3.曝光的问题真的让我很头疼，目的条带周围总是黑压压的一片，我曝光的时候压片压好几张，附件里的是上面的，不是最底下的，周围都很黑，这个黑的是显色液的问题吗，我用的是thermo的超敏的显示液。总是曝不好，您有什么好的建议吗。
4.一抗回收的问题，如果用TBST配一抗，可以回收使用吗，放在四度的，大概能用多久啊，
谢谢您，期待您的指导。

作者: am10 时间: 2013-3-29 13:33

染胶后不能再转

染了也是一条带？
你用的是纯化后的蛋白还是提取的总蛋白？

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总蛋白。

作者: tangxin_80 时间: 2013-3-29 13:34

还有一个问题，就是曝光的时候加ECL，说明书说要孵育5 min，但是我一加ECL就能看到目的条带发光，也就十几秒，这种情况也要孵育5min后再曝光吗，还有我听同学说，一加ECL就曝光，怕荧光很快猝灭，到底该这么操作啊？谢谢

作者: 831226 时间: 2013-3-29 13:35

请问加上ECL显色液后显示白茫茫的一片是怎么回事？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:36

后来又把原来的膜用TBST洗后,用抗体重新孵育,内参还是很好的.整个体系还是很好的.我是想27分子量的蛋白,用200mA的电流,60分钟会不会转过?另外背景高,与孵育二抗的时间有关吗?我现在是二抗孵育2小时.谢谢啊.

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有关系
二抗孵育30min即可

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:37

看了您的很多解答，我也有问题想请教您：
1.蛋白超声，因为的样品才50--100ul，体积这么少，是不是不能超声啊，还是有专门的仪器，我们实验室的超声仪是比较旧的，探头比较粗。CST的抗体如果做不出来就要超声试试。
2.虽然不同大小的蛋白有不同的转膜条件，我也试过几种，我的蛋白大小在40KD左右和110KD，您建议用什么条件转，我们只有湿转的仪器。
3.曝光的问题真的让我很头疼，目的条带周围总是黑压压的一片，我曝光的时候压片压好几张，附件里的是上面的，不是最底下的，周围都很黑，这个黑的是显色液的问题吗，我用的是thermo的超敏的显示液。总是曝不好，您有什么好的建议吗。
4.一抗回收的问题，如果用TBST配一抗，可以回收使用吗，放在四度的，大概能用多久啊，
谢谢您，期待您的指导。

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1、超声的多少与超声头大小有关，如果头太大，只能增加体积了
2、湿转，300mA 恒流，40KD，30-40min，110KD，90-120min
3、调整二抗
4、回收抗体建议用1-2次

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:37

总蛋白。

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1、染色有问题
2、提取蛋白有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:38

还有一个问题，就是曝光的时候加ECL，说明书说要孵育5 min，但是我一加ECL就能看到目的条带发光，也就十几秒，这种情况也要孵育5min后再曝光吗，还有我听同学说，一加ECL就曝光，怕荧光很快猝灭，到底该这么操作啊？谢谢

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能看到荧光，说明荧光较强，可以赋予1-2min就进行曝光

作者: NBA 时间: 2013-3-29 13:38

请问加上ECL显色液后显示白茫茫的一片是怎么回事？

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1、ECL本身的背景
2、二抗浓度太高

作者: kuohao17 时间: 2013-3-29 13:39

我更换了样品后，实验条件中，转膜时间调整为目的蛋白转160mA,40min,膜依然是0.45的，二抗浓度分别采用了1:5000，及1:20000，二抗孵育时间是1h，2h.曝光结果是，二抗浓度为1:5000及二抗孵育时间为2h的结果如下（上面是内参，下面是目的蛋白），请问该怎样解释？另外浓度为1:20000及时间为1h的曝光，目的条带什么都没有；是说之前的样品有问题，还是说什么？非常感谢啦。

作者: lxh031 时间: 2013-3-29 13:39

老师您好，最近我做了两次WB，有两个问题想请教：
1.电泳的时候样品跑不成一条直线，而且连marker也看不大清楚，图左数第二个孔是marker。
2.跑胶的条件是恒流35mA，同实验室的师兄一般90min都可以跑完，但我的跑很慢。
请问这是否是胶的问题？还是样品问题？
谢谢！！

作者: dog002 时间: 2013-3-29 13:39

楼主您好！马上要做western,现在准备订HES1抗体，在网上找了一些，现在不知道选哪个了，有epitomics公司的EPR4226，这个是单抗效价比较高1:1000到1:10000稀释的。还有santa的sc-25397是多抗1:100到1:1000稀释，好几篇文献上写的用的这个。请问选单抗好还是多抗好？epitomics公司抗体之前用过一只GAPDH还不错，不知道其他产品怎么样，楼主用的多希望指点一下！谢谢！

作者: ROSE李 时间: 2013-3-29 13:40

你好，我想跑20KD的目的蛋白，43KD的内参。
1.请问一下，电泳积层胶80V，分离胶100V, 跑多长时间合适呢？？
2. 我的24KD的目的蛋白总是跑不出来，是不是我制胶有什么问题？因为每次胶染色后20KD的蛋白都没有颜色。
3.我有好几次制的分离胶都有有分层，不知道是什么原因？胶染色后分离胶上面明显深浅不一。

作者: 8princess8 时间: 2013-3-29 13:40

1.我今天用您说的<湿转，300mA 恒流，40KD，30-40min>,我转了40min，转膜之后缓冲液很烫，虽然我也用冰浴，而且转移槽里还放了冰袋，温度这么烫对蛋白有影响吗？
2.我的marker转的很不好，最近经常碰到，marker转过后不是直线（横向的单个marker的线条），单个的marker它会往上翘又往下去，一头变粗，要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带，这个是什么问题啊

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:39

老师您好，最近我做了两次WB，有两个问题想请教：
1.电泳的时候样品跑不成一条直线，而且连marker也看不大清楚，图左数第二个孔是marker。
2.跑胶的条件是恒流35mA，同实验室的师兄一般90min都可以跑完，但我的跑很慢。
请问这是否是胶的问题？还是样品问题？
谢谢！！

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用的什么loading啊？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:40

楼主您好！马上要做western,现在准备订HES1抗体，在网上找了一些，现在不知道选哪个了，有epitomics公司的EPR4226，这个是单抗效价比较高1:1000到1:10000稀释的。还有santa的sc-25397是多抗1:100到1:1000稀释，好几篇文献上写的用的这个。请问选单抗好还是多抗好？epitomics公司抗体之前用过一只GAPDH还不错，不知道其他产品怎么样，楼主用的多希望指点一下！谢谢！

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santa的就别试了

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:40

你好，我想跑20KD的目的蛋白，43KD的内参。
1.请问一下，电泳积层胶80V，分离胶100V, 跑多长时间合适呢？？
2. 我的24KD的目的蛋白总是跑不出来，是不是我制胶有什么问题？因为每次胶染色后20KD的蛋白都没有颜色。
3.我有好几次制的分离胶都有有分层，不知道是什么原因？胶染色后分离胶上面明显深浅不一。

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内参做的很好嘛？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:46

上图！左侧四个，目的条带出来了，但是背景太重了，上样量50ug,转膜300ma,1小时，牛奶封闭1小时，一抗室温1小时，二抗室温半小时，ecl--曝片就这样了................................................... 太杯具了....求大牛解释！

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二抗稀释度加大一倍

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:46

1.我今天用您说的<湿转，300mA 恒流，40KD，30-40min>,我转了40min，转膜之后缓冲液很烫，虽然我也用冰浴，而且转移槽里还放了冰袋，温度这么烫对蛋白有影响吗？
2.我的marker转的很不好，最近经常碰到，marker转过后不是直线（横向的单个marker的线条），单个的marker它会往上翘又往下去，一头变粗，要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带，这个是什么问题啊

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1、没有影响
2、转之前marker条带直吗？

作者: bongte 时间: 2013-3-29 14:47

1、没有影响
2、转之前marker条带直吗？

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1.我今天用您说的<湿转，300mA 恒流，40KD，30-40min>,我转了40min，转膜之后缓冲液很烫，虽然我也用冰浴，而且转移槽里还放了冰袋，温度这么烫对蛋白有影响吗？
2.我的marker转的很不好，最近经常碰到，marker转过后不是直线（横向的单个marker的线条），单个的marker它会往上翘又往下去，一头变粗，要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带，这个是什么问题啊，

2 转膜之前电泳后是直的，也很好看，但是转膜之后就不行了，就是我上面说的情况，有查到说是新海绵会出现marker转的不好，但是我的是旧的海绵啊，不知道为什么

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-29 14:47

你好，我做动物实验，比如我有3个组正常、模型、治疗组，每组有10个样本，是这30个样本都要检测吗？谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:48

QUOTE:

原帖由 redbutterfly 于 2013-3-29 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你好，我做动物实验，比如我有3个组正常、模型、治疗组，每组有10个样本，是这30个样本都要检测吗？谢谢！

每组检测3个就够了
最好检测6个
能10个都检测当然ok

作者: standbyme 时间: 2013-3-29 14:48

内参做的很好嘛？

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您好，这是Actin.做出来的结果，但是24KD没有曝出来。胶上面也没有染上色。

图片附件: 87584048.jpg (2013-3-29 14:48, 5.67 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: tangxin_80 时间: 2013-3-29 14:49

用的什么loading啊？

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用的碧云天的5X上样缓冲液，昨天改了电泳液后好了，可能是之前电泳液配不好了··谢谢老师！

作者: 8princess8 时间: 2013-3-29 14:49

您好，这是Actin.做出来的结果，但是24KD没有曝出来。胶上面也没有染上色。

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我和你一样，内参做出来，分子量是２７的一直没有做出来！

作者: ending 时间: 2013-3-29 14:50

首先非常感谢楼主，开贴
想问下上样缓冲液有多种，任选一种对结果影响大吗，我准备做个分之量265的蛋白，还有就是不同的电泳及转膜缓冲液是否对结果也有很大影响？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:50

1.我今天用您说的<湿转，300mA 恒流，40KD，30-40min>,我转了40min，转膜之后缓冲液很烫，虽然我也用冰浴，而且转移槽里还放了冰袋，温度这么烫对蛋白有影响吗？
2.我的marker转的很不好，最近经常碰到，marker转过后不是直线（横向的单个marker的线条），单个的marker它会往上翘又往下去，一头变粗，要不就是好几个marker都模糊成一条纵向的带，这个是什么问题啊，

2 转膜之前电泳后是直的，也很好看，但是转膜之后就不行了，就是我上面说的情况，有查到说是新海绵会出现marker转的不好，但是我的是旧的海绵啊，不知道为什么

===================

这个海绵是哪里的？
用之前泡了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:51

您好，这是Actin.做出来的结果，但是24KD没有曝出来。胶上面也没有染上色。

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从WB结果及SDS-PAGE染胶图来看，样品处理的可能性较大

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:51

首先非常感谢楼主，开贴
想问下上样缓冲液有多种，任选一种对结果影响大吗，我准备做个分之量265的蛋白，还有就是不同的电泳及转膜缓冲液是否对结果也有很大影响？谢谢

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主要看这个蛋白抗体的相关说明
如果没有特殊说明的话
用还原型的上样缓冲液

作者: 大尾巴 时间: 2013-3-29 14:52

从WB结果及SDS-PAGE染胶图来看，样品处理的可能性较大

=============================================================

您好，您能说具体一点吗？

样品处理可能存在什么问题呢？是Sample buffer的问题？还是什么问题呢？

那么要怎么解决呢？

还要请教老师一个问题，您做过关于RhoA的WB吗？它是磷酸化蛋白吗？

作者: 大尾巴 时间: 2013-3-29 14:52

我和你一样，内参做出来，分子量是２７的一直没有做出来！

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你有什么改进实验的好方法吗

作者: bongte 时间: 2013-3-29 14:52

你有什么改进实验的好方法吗

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没找到，所以打算换抗体！

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:53

您好，您能说具体一点吗？

样品处理可能存在什么问题呢？是Sample buffer的问题？还是什么问题呢？

那么要怎么解决呢？

还要请教老师一个问题，您做过关于RhoA的WB吗？它是磷酸化蛋白吗？

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RhoA做过，还是很好做的。RhoA不是磷酸化蛋白
如果有磷酸化形式会用Phospho标出来，具体的你自己查查是否有磷酸化形式
换一下sample buffer看看

作者: popo520 时间: 2013-3-29 14:53

β-actin 内参都做不出来真心崩溃！
转膜后Marker清晰，其他条带的比较浅，1%BSA封闭，1:1000稀释一抗，室温3h,TBST洗膜4次，每次5分，1:2000稀释羊抗鼠HRP，室温3h,TBS洗膜同上，加北京普利来ECL，按说明操作，什么也没有。求教！

作者: wmp1234 时间: 2013-3-29 14:54

请教一个关于二聚体的问题，我在真核细胞中表达一个带GFP的融合蛋白，融合蛋白的大小在100KD左右，但用western-bloting检测，条带每次都在210KD左右，是不是形成了二聚体？这次，我在样品buffer中加大了巯基乙醇的量，100度煮5min，但做western-bloting检测时，条带仍在210KD左右。我想问的是：怎样才能得到单体的融合蛋白大小的条带？谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-3-29 14:54

我现在用western做分子量300KD左右的蛋白P300，分类胶6%，浓缩胶3.5%；电泳条件：恒压100V，转膜条件：300ma，6h，放在冰盒里转的，
感觉电泳没问题，但转膜后marker可见，丽春红染色后所有的蛋白都没染上，说明下：1.转膜是今天夜里转的，中间比较困，睡着了，6点多去时，转膜已经结束1：30分钟，后用丽春红染的；这期间没有向
里面加冰块，结束时温度感觉也不高，想问下转膜温度对转膜效果影响大吗，这个期间需要加冰降温吗？2.我昨天做过同样条件，结果立春后染色后出现条带？但是比较浅，中间也没控制温度。3.请教下NBA老师有没好的经验，传授下，不胜感激！谢谢！

作者: kswl870 时间: 2013-3-29 14:56

不充点：我的上样量设置为20ul, 有四个条件分别为 9，18 , 64, 128（ug）

作者: zhezhe 时间: 2013-3-29 14:56

每组检测3个就够了
最好检测6个
能10个都检测当然ok

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谢谢NBA！请问你做动物的话也是做3个吗？3个的话是否有统计学意义？出来条带之后是不是有个分析软件分析。会出一些数据的吗？是不是需要计算均值标准差这些？论文中[t(14)=3.36; P=0.005]，t是表示什么？(F(5,55) =7.437, p < 0.0001）F是表示什么？括号中（5,55）又是代表什么呢？

作者: wu11998866 时间: 2013-3-29 14:57

老师，你好，我做WB时洗出来的片子背景太亮，什么原因？另外，我从公司订的特异抗体，但做出来之后结果显示好几条带，是因为抗体不特异吗？WB能检测出其复合体的形式吗？谢谢您！

作者: gemei0115 时间: 2013-3-29 14:57

您好：
刚开始做western，内参大小43结果曝出的片子内参在55-43之间，且背景不干净发黑，想问一下怎么回事。二抗在4℃孵了一小时不知道有没有关系。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:57

β-actin 内参都做不出来真心崩溃！
转膜后Marker清晰，其他条带的比较浅，1%BSA封闭，1:1000稀释一抗，室温3h,TBST洗膜4次，每次5分，1:2000稀释羊抗鼠HRP，室温3h,TBS洗膜同上，加北京普利来ECL，按说明操作，什么也没有。求教！

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转膜后丽春红染色了吗

作者: NBA 时间: 2013-3-29 14:57

您好！请教一个关于二聚体的问题，我在真核细胞中表达一个带GFP的融合蛋白，融合蛋白的大小在100KD左右，但用western-bloting检测，条带每次都在210KD左右，是不是形成了二聚体？这次，我在样品buffer中加大了巯基乙醇的量，100度煮5min，但做western-bloting检测时，条带仍在210KD左右。我想问的是：怎样才能得到单体的融合蛋白大小的条带？谢谢！

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1、巯基乙醇是否挥发？
2、可以用DTT替代
3、用多大浓度的胶？是marker显示的具体位置还是大致看的位置在210KDa？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:04

我现在用western做分子量300KD左右的蛋白P300，分类胶6%，浓缩胶3.5%；电泳条件：恒压100V，转膜条件：300ma，6h，放在冰盒里转的，
感觉电泳没问题，但转膜后marker可见，丽春红染色后所有的蛋白都没染上，说明下：1.转膜是今天夜里转的，中间比较困，睡着了，6点多去时，转膜已经结束1：30分钟，后用丽春红染的；这期间没有向
里面加冰块，结束时温度感觉也不高，想问下转膜温度对转膜效果影响大吗，这个期间需要加冰降温吗？2.我昨天做过同样条件，结果立春后染色后出现条带？但是比较浅，中间也没控制温度。3.请教下fangweibin119老师有没好的经验，传授下，不胜感激！谢谢！

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1、转膜停了后，时间长点拿出来是没有特别大的影响的。特别是大分子，更不可能有很大的影响
2、大分子量的蛋白本身就比较少
3、需要降温，但是即使是降温，温度也会比较高，只是不要过高就可以
4、300mA，转膜2h30min到3h足够了
5、内参做的怎么样？
抗体的质量怎么样
样品中是否有文献支持有p300的表达？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:05

请问你做动物的话也是做3个吗？3个的话是否有统计学意义？出来条带之后是不是有个分析软件分析。会出一些数据的吗？是不是需要计算均值标准差这些？论文中[t(14)=3.36; P=0.005]，t是表示什么？(F(5,55) =7.437, p < 0.0001）F是表示什么？括号中（5,55）又是代表什么呢？

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后面的那些统计学上的东西我就不懂了
问问学统计的
一般都是3只动物来做统计了
要用专业软件进行读数

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:07

老师，你好，我做WB时洗出来的片子背景太亮，什么原因？另外，我从公司订的特异抗体，但做出来之后结果显示好几条带，是因为抗体不特异吗？WB能检测出其复合体的形式吗？谢谢您！

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1、是买的商业化抗体还是自己设计抗原定制的抗体？
2、目的分子量处的条带清晰、特异吗？
有图吗

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:07

您好：
刚开始做western，内参大小43结果曝出的片子内参在55-43之间，且背景不干净发黑，想问一下怎么回事。二抗在4℃孵了一小时不知道有没有关系。

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调整一抗与二抗的稀释度
二抗孵育时间室温30min就足够了

作者: yonger 时间: 2013-3-29 15:08

1、巯基乙醇是否挥发？
2、可以用DTT替代
3、用多大浓度的胶？是marker显示的具体位置还是大致看的位置在210KDa？

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1、我先在loading buffer中加入巯基乙醇，再100度煮样品5Min，是否会导致巯基乙醇挥发？如何判断？若用DTT，其用量是？在遇到二聚体时，应该采用哪种较有效的方法处理？
2、我用10%的分离胶，210KD是大致位置。
非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:09

1、我先在loading buffer中加入巯基乙醇，再100度煮样品5Min，是否会导致巯基乙醇挥发？如何判断？若用DTT，其用量是？在遇到二聚体时，应该采用哪种较有效的方法处理？
2、我用10%的分离胶，210KD是大致位置。

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1、5×loading中 DTT浓度为300mM
2、用10%的胶，分不清楚210K的位置哦

作者: 66+77 时间: 2013-3-29 15:09

想问个关于一抗的问题我买的抗体说明书上有说明Cellular Localization：Nucleus | 那是不是说我应该提细胞的核蛋白才能跑得出来如果提总蛋白就测不出来？　　还有说明书上没有推荐的二抗浓度（我看有的抗体是有推荐的），那我应该用多少呢？？　　还有听说二抗用带荧光的那种没有需加染色剂的效果好　是这样吗　　　多谢多谢

作者: summerxx 时间: 2013-3-29 15:10

你好我请教的问题如下：
我在page、封闭、孵育一抗、二抗之后采用ECL试剂盒曝光
但是发现我的胶片上的图像就是我PVDF膜的轮廓（有的时候还有点儿花）
请问这是什么原因？

十分感谢！

作者: 社会主义好 时间: 2013-3-29 15:11

想问个关于一抗的问题我买的抗体说明书上有说明Cellular Localization：Nucleus | 那是不是说我应该提细胞的核蛋白才能跑得出来如果提总蛋白就测不出来？　　还有说明书上没有推荐的二抗浓度（我看有的抗体是有推荐的），那我应该用多少呢？？　　还有听说二抗用带荧光的那种没有需加染色剂的效果好　是这样吗　　　多谢多谢

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啊补充问一下需不需要买待测蛋白的标准品来作对比呢

作者: abc816 时间: 2013-3-29 15:11

没找到，所以打算换抗体！

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你后来W-B怎么样了？

作者: bling 时间: 2013-3-29 15:11

老师你好，现在做WB遇到以下几个问题希望能帮忙解答一下：
1.目的蛋白76kDa，内参是GAPDH，恒流湿转的话电流和时间大概应该是多少？之前有用过300mA转2h和400mA转40min是否时间太长？
2.最近发现转完膜之后marker在正面条带清晰，但是在膜的背面也能看到，请问这是说明转过头了吗？
3.用5%脱脂奶粉常温封闭膜1h，封闭完之后应该用什么洗膜再加一抗？TBST吗？

作者: bling 时间: 2013-3-29 15:12

还有一个问题忘记问了…
膜结合好二抗之后用TBST和TBS洗膜，如果需要过一段时间（不太长，大概1-2h）再用ECL发光的话膜应该怎么样暂时保存比较好？可以一直放在TBST或者TBS里面吗？然后使用完的膜如果还想保存较长时间的话应该怎么保存？

作者: INK 时间: 2013-3-29 15:12

大侠：Marker和内参不是一回事儿吗？Marker是什么啊谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:13

想问个关于一抗的问题我买的抗体说明书上有说明Cellular Localization：Nucleus | 那是不是说我应该提细胞的核蛋白才能跑得出来如果提总蛋白就测不出来？　　还有说明书上没有推荐的二抗浓度（我看有的抗体是有推荐的），那我应该用多少呢？？　　还有听说二抗用带荧光的那种没有需加染色剂的效果好　是这样吗　　　多谢多谢

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提取总蛋白亦可
二抗没有说明书？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:13

你好我请教的问题如下：
我在page、封闭、孵育一抗、二抗之后采用ECL试剂盒曝光
但是发现我的胶片上的图像就是我PVDF膜的轮廓（有的时候还有点儿花）
请问这是什么原因？

十分感谢！

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曝光多久？

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:15

老师你好，现在做WB遇到以下几个问题希望能帮忙解答一下：
1.目的蛋白76kDa，内参是GAPDH，恒流湿转的话电流和时间大概应该是多少？之前有用过300mA转2h和400mA转40min是否时间太长？
2.最近发现转完膜之后marker在正面条带清晰，但是在膜的背面也能看到，请问这是说明转过头了吗？
3.用5%脱脂奶粉常温封闭膜1h，封闭完之后应该用什么洗膜再加一抗？TBST吗？

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我们常用300mA恒流
转1h即可
转过一点也没问题
用什么封闭、孵育抗体就用什么缓冲液来洗膜

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:15

大侠：Marker和内参不是一回事儿吗？Marker是什么啊谢谢

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不是一回事
marker是用于确定分子量位置的
内参适用于做上样等误差校正的

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-29 15:16

您好，我也要做WB，新手，实验设计中，其中好多问题不懂想请教谢谢老师

1内参需不需要买标准蛋白，还是只卖内参的一抗、；内参怎么选呢如果分子量和目的蛋白差不多的话是不是到时候就跑不开了

2我要测大鼠的MMP-2（72kDa），MMP-9（92kDa），β-DG（43kDa），和P38不知道要买哪个公司的我查了一下abc的好贵都四千多其他性价比高点的有哪个公司的，迷茫中

3除了一抗以外WB中所需的试剂有哪些需要买进口的？买国产的可以吗，您觉得哪个公司的好一些呢

初来乍到，问题颇多，谢谢大侠指教

刚才您的解答我看不见可以再帮我发一遍吗谢谢您

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-29 15:16

不是一回事
marker是用于确定分子量位置的
内参适用于做上样等误差校正的

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大侠那我要是测不同的蛋白就需要购买不同的Marker吗，你建议一般买那个公司的谢谢

作者: u234 时间: 2013-3-29 15:16

曝光多久？

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15 min
我现在更改了曝光方式，以前用的是胶片；现在改用公共实验室的分析仪器，坐等结果；随时update！
祝好多谢！

作者: lxh031 时间: 2013-3-29 15:17

提取总蛋白亦可
二抗没有说明书？

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我是说有的一抗说明书上会有推荐的二抗浓度您的意思是如果没有就按照二抗说明书是吧另外，听说有两种二抗，一种是带荧光的一种是不带荧光需要染色剂的哪种效果好一点呢？？另外需不需要用待测蛋白的标准品（单体）来做阳性对照呢一般？？（因为我测得东西还不知道到底存不存在于被测细胞中。。。）

作者: glass 时间: 2013-3-29 15:18

您好老师：我现在要做的目的蛋白分子量540kda，需要用梯度胶吗？内参选择转膜跑胶的条件是怎样的？谢谢

作者: tie8 时间: 2013-3-29 15:19

版主您好。
最近在做Collagen Type I 这个蛋白的WB，一抗中注明需要non-reducing和non-denaturing的蛋白样品，我根据native page 的protocol 完成实验：1、配制的细胞裂解液中去除SDS；2、上样loading buffer中去除SDS和DTT等还原剂；3、PAGE制备5%的分离胶和层积胶，均不含有SDS；4、样品不加热变性；5、running buffer中不含SDS；6、电泳110V（实际只有60V），跑得比较慢，大概8个小时溴酚蓝到达底部；7、转膜恒压80V，3h；8、封闭1h，洗膜6次，5min/次，一抗：1:500，4度过夜，洗膜6次，5min/次，二抗：1:1000，之后加ECL，曝光。（丽春红染色及曝光X片见下图）
我的问题是：1、没有变性的样品电泳后，因为分子量比较大，都集中在分离胶的最上面，从我曝光的情况来看，条带很模糊，是不是抗体特异性不好或者是我的样品在电泳和转膜后已经变性？
2、转膜的时间是不是要延长，并把电压或电流减小，因为电流过大温度过高会导致蛋白变性。
3、版主以前是否有做过native PAGE的经验，以上的操作是否有错误，请指导一下，谢谢。

丽春红染色膜左边的的条带是预染Mark，在最上面可以看到被染色的蛋白条带；曝光的X线片在相应的位置也有条带，但不是很明显。而且在曝光完这两个胶片后，在次曝光就什么也没有了。

图片附件: 81947142.snap.jpg (2013-3-29 15:19, 7.04 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15413

作者: 33号 时间: 2013-3-29 15:19

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~

作者: bgf5 时间: 2013-3-29 15:20

还有一个问题忘记问了…
膜结合好二抗之后用TBST和TBS洗膜，如果需要过一段时间（不太长，大概1-2h）再用ECL发光的话膜应该怎么样暂时保存比较好？可以一直放在TBST或者TBS里面吗？然后使用完的膜如果还想保存较长时间的话应该怎么保存？

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1.这个转膜时间是有点长，具体时间是根据你的湿转液配方而定；
2.奶粉封闭完可以不洗膜（如果你的抗体也是用奶粉稀释的），如果不是，就用TBST洗膜‘

作者: newway 时间: 2013-3-29 15:21

请问前辈能不能给详细讲下如何进行Stripping，包括液体配制，如何洗涤，使用次数？万分感谢

作者: newway 时间: 2013-3-29 15:21

我们常用300mA恒流
转1h即可
转过一点也没问题
用什么封闭、孵育抗体就用什么缓冲液来洗膜

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前辈我也是用这个条件转膜，我想问一下这个条件适用于多大分子量的蛋白？大分子量的应该增加电流还是增加时间？

作者: milkdog 时间: 2013-3-29 15:24

老师您好！我是新手，做了两次WB，背景是亮的，条带是黑的，这是怎么回事呢？
还有，actin跑得粗细不一，同一上样孔的蛋白跑出了几个条带。求解!
希望得到您的指导！

作者: DDD 时间: 2013-3-29 15:24

76kd蛋白，电流200mA，转膜2.5h就差不多了。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:24

您好，我也要做WB，新手，实验设计中，其中好多问题不懂想请教谢谢老师

1内参需不需要买标准蛋白，还是只卖内参的一抗、；内参怎么选呢如果分子量和目的蛋白差不多的话是不是到时候就跑不开了

2我要测大鼠的MMP-2（72kDa），MMP-9（92kDa），β-DG（43kDa），和P38不知道要买哪个公司的我查了一下abc的好贵都四千多其他性价比高点的有哪个公司的，迷茫中

3除了一抗以外WB中所需的试剂有哪些需要买进口的？买国产的可以吗，您觉得哪个公司的好一些呢

初来乍到，问题颇多，谢谢大侠指教

刚才您的解答我看不见可以再帮我发一遍吗谢谢您

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1、内参不需要标准蛋白。买内参一抗即可
常用内参有三种GAPDH（37K），b-actin（43K），b-tubulin（53K）
有时候分子量差的不多的话可以stripping后再孵育内参
2、看看CST的吧，MMP-2、MMP-9，P38我都用过CST的，不错
3、我们用的试剂90%都是进口的
国产的我只用：BSA（这个不好进口），NaCl，无水甲醇等，其他都是用进口的，以Sigma为主

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:25

大侠那我要是测不同的蛋白就需要购买不同的Marker吗，你建议一般买那个公司的谢谢

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marker一般买一种就可以了
marker有一个分子量范围，选择一下即可。我们常用fermentas的

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:25

您好老师：我现在要做的目的蛋白分子量540kda，需要用梯度胶吗？内参选择转膜跑胶的条件是怎样的？谢谢

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需要梯度胶
如果不做内参的话
可以选择普通的6%的分离胶

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:26

版主您好。
最近在做Collagen Type I 这个蛋白的WB，一抗中注明需要non-reducing和non-denaturing的蛋白样品，我根据native page 的protocol 完成实验：1、配制的细胞裂解液中去除SDS；2、上样loading buffer中去除SDS和DTT等还原剂；3、PAGE制备5%的分离胶和层积胶，均不含有SDS；4、样品不加热变性；5、running buffer中不含SDS；6、电泳110V（实际只有60V），跑得比较慢，大概8个小时溴酚蓝到达底部；7、转膜恒压80V，3h；8、封闭1h，洗膜6次，5min/次，一抗：1:500，4度过夜，洗膜6次，5min/次，二抗：1:1000，之后加ECL，曝光。（丽春红染色及曝光X片见下图）
我的问题是：1、没有变性的样品电泳后，因为分子量比较大，都集中在分离胶的最上面，从我曝光的情况来看，条带很模糊，是不是抗体特异性不好或者是我的样品在电泳和转膜后已经变性？
2、转膜的时间是不是要延长，并把电压或电流减小，因为电流过大温度过高会导致蛋白变性。
3、版主以前是否有做过native PAGE的经验，以上的操作是否有错误，请指导一下，谢谢。

丽春红染色膜左边的的条带是预染Mark，在最上面可以看到被染色的蛋白条带；曝光的X线片在相应的位置也有条带，但不是很明显。而且在曝光完这两个胶片后，在次曝光就什么也没有了。

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没做过native page

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:26

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~

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那就是胶片的问题喽

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:31

请问前辈能不能给详细讲下如何进行Stripping，包括液体配制，如何洗涤，使用次数？万分感谢

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stripping这个简单
液体的配制这个不方便告诉你

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:31

前辈我也是用这个条件转膜，我想问一下这个条件适用于多大分子量的蛋白？大分子量的应该增加电流还是增加时间？

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增加时间

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:31

老师您好！我是新手，做了两次WB，背景是亮的，条带是黑的，这是怎么回事呢？
还有，actin跑得粗细不一，同一上样孔的蛋白跑出了几个条带。求解!
希望得到您的指导！

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你说的是哪一步？背景是亮的，条带是黑的没理解
有图片吗

作者: fox_79 时间: 2013-3-29 15:33

1、内参不需要标准蛋白。买内参一抗即可
常用内参有三种GAPDH（37K），b-actin（43K），b-tubulin（53K）
有时候分子量差的不多的话可以stripping后再孵育内参
2、看看CST的吧，MMP-2、MMP-9，P38我都用过CST的，不错
3、我们用的试剂90%都是进口的
国产的我只用：BSA（这个不好进口），NaCl，无水甲醇等，其他都是用进口的，以Sigma为主

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谢谢您的给我的帮助最近一直也在查阅过程中发现自己有的问题很低级感谢您耐心的解释真心感谢！！

作者: yjf1026 时间: 2013-3-29 15:33

前辈您好
1、我想咨询一下在封胶时用DDW和0.1%SDS有什么具体的不同
2、NC膜可直接泡在转印液吗

作者: ququer787 时间: 2013-3-29 15:33

您好，我想请教一下，我将要做的实验是用蛋白印迹分别检测四个通路蛋白在组织中的表达量，我想一次WESTERN 中四个蛋白一起检测，请问这样合理吗？如果可以的话，那是不是加一抗和二抗的过程中，可以把四个蛋白的一抗和二抗一起加进去呢？望指教，谢谢！

作者: KGZ564 时间: 2013-3-29 15:34

一般提取的蛋白-20度保存能保存多长时间？？
要是蛋白变性之后呢？-20度保存能放多长时间？？要是放-80度冰箱呢？？？
紧急求助。
因为最近刚做WB，不太懂。所以这半个月一直都用之前都提取完变性了，连buffer都加完了的蛋白，都是月初的时候做好的。

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:35

前辈您好
1、我想咨询一下在封胶时用DDW和0.1%SDS有什么具体的不同
2、NC膜可直接泡在转印液吗

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1、封胶我们用DDW
2、NC在转膜前放入转印液中pre-absorb

作者: NBA 时间: 2013-3-29 15:36

您好，我想请教一下，我将要做的实验是用蛋白印迹分别检测四个通路蛋白在组织中的表达量，我想一次WESTERN 中四个蛋白一起检测，请问这样合理吗？如果可以的话，那是不是加一抗和二抗的过程中，可以把四个蛋白的一抗和二抗一起加进去呢？望指教，谢谢！

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不可以一起加进去做

作者: NBA 时间: 2013-3-30 09:35

一般提取的蛋白-20度保存能保存多长时间？？
要是蛋白变性之后呢？-20度保存能放多长时间？？要是放-80度冰箱呢？？？
紧急求助。
因为最近刚做WB，不太懂。所以这半个月一直都用之前都提取完变性了，连buffer都加完了的蛋白，都是月初的时候做好的。

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提取的蛋白在-20度千万别放，放一晚上就有沉淀析出
变性后放-20度2个月是没有问题的
-80度就保存时间更长了

作者: wood533 时间: 2013-3-30 09:41

大师，我又来提问了。。。
我做的是dot blot，封闭条件是10 %的脱脂牛奶4 °C下封闭18 h，一抗稀释度为1:2000，二抗稀释度为1:50000，可是为什么我的图出来是这个样子的。。。背景比点了样的地方还亮，而且中间还有一块不亮，像缺了一块似的。。。

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作者: guagua 时间: 2013-3-30 09:44

您好！这是我转膜后丽春红染膜图。（ＮＣ膜）
问题：上面的是大蛋白，染色深，下面染色很浅，连GAPDH,beta-actin内参所在的位置都很浅，这是不是说明下面的小蛋白已经转过去了？我的转膜液配方是Tris base 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，定容至1000ml；转膜条件是湿转，200mA，120min。
如果是转过去了，应该再缩短一点转膜时间？请问大概要多久？另外，这个转膜液我看有一些是加SDS，有一些是不加的，请问一般哪个好一些？
谢谢老师~！

图片附件: 65361211.jpg (2013-3-30 09:44, 28.24 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15416

作者: 66小飞侠 时间: 2013-3-30 09:45

那就是胶片的问题喽

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其实还有可能是显影液定影液的问题。。。。我们那边用洗片机，太久了不换液也会这样的。。。。

作者: u234 时间: 2013-3-30 09:46

您好！我检测骨骼肌细胞膜蛋白和浆蛋白的FAT/CD36的表达，内参用的β-actine，采用的BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，之前预实验做内参出来过一次，感觉条带模糊，表达量高，且怀疑显色时间过长，最近几次内参效果都不理想，要不就是条带很淡很淡，要不就是很模糊。这次分别用5%BSA和2%牛奶封效果都不好。
另外，预实验用的人家实验室的光明脱脂奶粉，4%牛奶封闭可以，但我自己从淘宝上买回来的同样4%的牛奶觉得好浓，且条带一直出不来或很淡（目的蛋白和内参均是），改用5%BSA目的蛋白可出条带，但杂带也较多。请问这跟封闭有关系吗？我买的奶粉是不是有问题？请老师指教！

作者: memory 时间: 2013-3-30 09:47

请教：最后一步加了ECL后整张膜在暗室都看到发亮，拍照却是黑的，也没有条带。什么原因呢？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-30 09:47

老师，你好

我是个新手，第一次做的时候ECL发光后能看到膜上明显的荧光，但是2min，5min，10min分别曝光后根本没有条带。片子完全是透明的。求解~

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我也遇到过这种情况，你会不会也是贴保鲜膜的时候，没铺平，导致荧光猝灭了啊。

作者: NBA 时间: 2013-3-30 09:48

大师，我又来提问了。。。
我做的是dot blot，封闭条件是10 %的脱脂牛奶4 °C下封闭18 h，一抗稀释度为1:2000，二抗稀释度为1:50000，可是为什么我的图出来是这个样子的。。。背景比点了样的地方还亮，而且中间还有一块不亮，像缺了一块似的。。。

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二抗继续稀释撒
另外二抗孵育条件是什么？洗膜条件是什么？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 09:48

您好！这是我转膜后丽春红染膜图。（ＮＣ膜）
问题：上面的是大蛋白，染色深，下面染色很浅，连GAPDH,beta-actin内参所在的位置都很浅，这是不是说明下面的小蛋白已经转过去了？我的转膜液配方是Tris base 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，定容至1000ml；转膜条件是湿转，200mA，120min。
如果是转过去了，应该再缩短一点转膜时间？请问大概要多久？另外，这个转膜液我看有一些是加SDS，有一些是不加的，请问一般哪个好一些？
谢谢老师~！

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1、转膜没问题
2、我认为问题出现在：样品
你可以在SDS-PAGE完成后，用考马斯亮蓝染一下胶看看（不转膜）

作者: NBA 时间: 2013-3-30 09:49

您好！我检测骨骼肌细胞膜蛋白和浆蛋白的FAT/CD36的表达，内参用的β-actine，采用的BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色，之前预实验做内参出来过一次，感觉条带模糊，表达量高，且怀疑显色时间过长，最近几次内参效果都不理想，要不就是条带很淡很淡，要不就是很模糊。这次分别用5%BSA和2%牛奶封效果都不好。
另外，预实验用的人家实验室的光明脱脂奶粉，4%牛奶封闭可以，但我自己从淘宝上买回来的同样4%的牛奶觉得好浓，且条带一直出不来或很淡（目的蛋白和内参均是），改用5%BSA目的蛋白可出条带，但杂带也较多。请问这跟封闭有关系吗？我买的奶粉是不是有问题？请老师指教！

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1、我们用伊利的高钙脱脂奶粉，效果没问题
2、我们封闭及稀释一抗用3%BSA-TBST，稀释二抗用5%奶粉-TBST
3、调整beta-actin的稀释度试试
4、还有二抗的稀释度也需要调整

作者: NBA 时间: 2013-3-30 10:24

请教：最后一步加了ECL后整张膜在暗室都看到发亮，拍照却是黑的，也没有条带。什么原因呢？
1、如果整张膜都发亮
主要原因在二抗稀释度是否合适
其次有些一抗也会造成发亮的背景
再次国内有些公司的ECL本身就有荧光背景
2、拍照是黑的指什么？用CCD拍照还是？

作者: 小糖块 时间: 2013-3-30 11:03

大师，我又来提问了。。。
我做的是dot blot，封闭条件是10 %的脱脂牛奶4 °C下封闭18 h，一抗稀释度为1:2000，二抗稀释度为1:50000，可是为什么我的图出来是这个样子的。。。背景比点了样的地方还亮，而且中间还有一块不亮，像缺了一块似的。。。

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身边有人也曾遇到过类似的情况，建议你换新的膜试试；
而且封闭不必10%的脱脂牛奶，1%的BSA或者5%的Tween20-PBS，37℃ 30min-2h就可以了，如果你的膜没问题，估计问题就出在这，封闭液浓度过高封闭时间过长，有可能会对你点膜的地方造成一种“漂洗”的作用

作者: qianqin1977 时间: 2013-3-30 11:04

1、如果整张膜都发亮
主要原因在二抗稀释度是否合适
其次有些一抗也会造成发亮的背景
再次国内有些公司的ECL本身就有荧光背景
2、拍照是黑的指什么？用CCD拍照还是？

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中杉金桥的羊抗鼠IgG/HRP 1000和2000倍稀释都亮，还要稀释？国产货效价这么高？用CCD拍的。黑的就是没背景啊，神马都没有。按理，发亮应该拍出来是白的啊！？郁闷，做了N次了，背景要么全白，要么全黑，就是没带！

作者: sunnyB 时间: 2013-3-30 13:00

因为我想检测的是transcription factor，所以应该是nuclear protein, 但是我又不想单独做nuclear protein extraction. RIPA buffer 应该足够break down the nuclear membrane
. 网上有很多的recipes, 区别在于detergent的浓度不一样。老板给了我一个recipe （1% Triton, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1XPBS), 但是如果用Bradford 测浓度的话，会有沉淀。我没有其他的试剂盒测浓度。网上的RIPA buffer的detergent的浓度会低些。我以前用NP40 buffer，只含有1%的NP40，用Bradford完全没有问题。请问老师，如果我采用其他的recipe，适当的降低detergent的浓度，可以吗？比如来自Abcam的recipe
50 mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
您用的recipeshi 是什么？谢谢老师！

作者: ero11 时间: 2013-3-30 14:28

二抗继续稀释撒
另外二抗孵育条件是什么？洗膜条件是什么？

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二抗孵育条件是室温下1 h，洗膜条件是TBST洗5次，每次10 min

作者: ritou1985 时间: 2013-3-30 14:29

1、转膜没问题
2、我认为问题出现在：样品
你可以在SDS-PAGE完成后，用考马斯亮蓝染一下胶看看（不转膜）

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谢谢老师的回复！
好吧，我试一下染胶。不过不是很明白，“样品的问题”，是指哪些方面呢？是指蛋白可能降解了？

p.s,不过我这个曝光也有条带哦。。。内参、目的都有。

作者: bs4665 时间: 2013-3-30 14:34

我做分子量是44kd的蛋白，一抗，二抗稀释1000，封闭两小时，最后洗出来片子有很多非特异条带。一周后我用上次已加入上样缓冲液的蛋白，二抗改为1：2000，最后洗出的片子没有条带，请问是什么原因呢？
敬盼回复，谢谢！

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-30 14:36

stripping这个简单
液体的配制这个不方便告诉你

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哦，不好意思啊，我以为这个是通用的呢~~~谢谢楼主的答复

作者: DONT 时间: 2013-3-30 14:38

你好，我最近做WB,marker是完好的，可是就是显色的时候只有小蛋白的能模模糊糊显出结果。小蛋白湿转100min，300mA，大蛋白湿转180min，300mA。一抗重复使用的，但是实验室其他人重复使用可以做出来，我就做不出来了。PS：转膜液的ph很重要吗? 谢谢！

作者: yes4 时间: 2013-3-30 14:38

你好，我是个新手，想请问一下做apoE基因敲除小鼠主动脉LOX-1测定，用WB法所需样本最低需多少呀？谢谢！可行性大吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-3-30 14:40

楼主好！我在检测细胞中Cox-2和iNos的表达量，以α-Tubulin做内参。条件是：20μL上样量，NuPAGE的4-12% Bis-Tris胶。转膜用iBlot，7min。之后Block 30min，一抗1:1000稀释，孵育过夜。TBST洗4次，每次大约5min。二抗1:5000稀释，孵育1h。TBST洗7次，每次大约5min。内参OK，但是对于其他蛋白，时而可以看到条带，时而看不到，看不到的时候比较多。请问，是否是抗体的问题？如果可以看到内参，是否一定会看到其他蛋白条带呢？谢谢。

作者: H2O 时间: 2013-3-30 14:41

前辈，我想问一下考染条带清晰的话能说明样品没问题么？我染胶染膜条带都挺清晰的，却始终孵育不出来，可是换试剂公司的样本就可以孵出来，是不是样本出问题了？

作者: H2O 时间: 2013-3-30 14:42

前辈，我想问一下考染条带清晰的话能说明样品没问题么？我染胶染膜条带都挺清晰的，却始终孵育不出来，可是换试剂公司的样本就可以孵出来，是不是样本出问题了？

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前辈，这个是我用别人的样本和我的样本孵育的同一个抗体，第一张图左边是marker,中间我的样本，右边是别人的样本，第二张图右边是marker，中间是我的样本，左边是别人的样本，通过这张图能看出我的样本蛋白降解了么？

作者: mamamiya 时间: 2013-3-30 14:43

话说为啥某些WB的一抗带标签呢？哪位牛人能解答一下？谢谢！菜鸟膜拜~

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:44

身边有人也曾遇到过类似的情况，建议你换新的膜试试；
而且封闭不必10%的脱脂牛奶，1%的BSA或者5%的Tween20-PBS，37℃ 30min-2h就可以了，如果你的膜没问题，估计问题就出在这，封闭液浓度过高封闭时间过长，有可能会对你点膜的地方造成一种“漂洗”的作用

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这个dot blot用的是什么膜？NC还是PVDF膜？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:45

中杉金桥的羊抗鼠IgG/HRP 1000和2000倍稀释都亮，还要稀释？国产货效价这么高？用CCD拍的。黑的就是没背景啊，神马都没有。按理，发亮应该拍出来是白的啊！？郁闷，做了N次了，背景要么全白，要么全黑，就是没带！

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国产的很少
大部分以进口分装为主
试试1:10000与1:50000

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:45

因为我想检测的是transcription factor，所以应该是nuclear protein, 但是我又不想单独做nuclear protein extraction. RIPA buffer 应该足够break down the nuclear membrane
. 网上有很多的recipes, 区别在于detergent的浓度不一样。老板给了我一个recipe （1% Triton, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1XPBS), 但是如果用Bradford 测浓度的话，会有沉淀。我没有其他的试剂盒测浓度。网上的RIPA buffer的detergent的浓度会低些。我以前用NP40 buffer，只含有1%的NP40，用Bradford完全没有问题。请问老师，如果我采用其他的recipe，适当的降低detergent的浓度，可以吗？比如来自Abcam的recipe
50 mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
您用的recipeshi 是什么？谢谢老师！

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RIPA就可以了

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:46

谢谢老师的回复！
好吧，我试一下染胶。不过不是很明白，“样品的问题”，是指哪些方面呢？是指蛋白可能降解了？

p.s,不过我这个曝光也有条带哦。。。内参、目的都有。

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在SDS-PAGE完成后，用考马斯亮蓝染一下胶看看（不转膜）

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:47

我做分子量是44kd的蛋白，一抗，二抗稀释1000，封闭两小时，最后洗出来片子有很多非特异条带。一周后我用上次已加入上样缓冲液的蛋白，二抗改为1：2000，最后洗出的片子没有条带，请问是什么原因呢？
敬盼回复，谢谢！

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封闭30min足够
调整一抗与二抗的稀释度
如果二抗稀释度不合适的话，不光是会出现背景，也会出现非特异性条带

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:52

你好，我最近做WB,marker是完好的，可是就是显色的时候只有小蛋白的能模模糊糊显出结果。小蛋白湿转100min，300mA，大蛋白湿转180min，300mA。一抗重复使用的，但是实验室其他人重复使用可以做出来，我就做不出来了。PS：转膜液的ph很重要吗? 谢谢！

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小蛋白是多小？
每个抗体不同，有些可以重复，有些不可以

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:56

你好，我是个新手，想请问一下做apoE基因敲除小鼠主动脉LOX-1测定，用WB法所需样本最低需多少呀？谢谢！可行性大吗？

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组织检测一般需要20-40ug上样量
可行

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:57

楼主好！我在检测细胞中Cox-2和iNos的表达量，以α-Tubulin做内参。条件是：20μL上样量，NuPAGE的4-12% Bis-Tris胶。转膜用iBlot，7min。之后Block 30min，一抗1:1000稀释，孵育过夜。TBST洗4次，每次大约5min。二抗1:5000稀释，孵育1h。TBST洗7次，每次大约5min。内参OK，但是对于其他蛋白，时而可以看到条带，时而看不到，看不到的时候比较多。请问，是否是抗体的问题？如果可以看到内参，是否一定会看到其他蛋白条带呢？谢谢。

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大分子量iBlot靠谱吗？
我认为不是一抗的问题

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:57

前辈，我想问一下考染条带清晰的话能说明样品没问题么？我染胶染膜条带都挺清晰的，却始终孵育不出来，可是换试剂公司的样本就可以孵出来，是不是样本出问题了？

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WB中的问题不能一概而论
考染清楚的话，转膜后，膜用丽春红等染色方法检测了吗？
一抗、二抗是否work
试剂公司的样品是高表达或者是纯蛋白样品
有可能是您检测样品中表达量低或者不表达

作者: NBA 时间: 2013-3-30 14:58

话说为啥某些WB的一抗带标签呢？哪位牛人能解答一下？谢谢！菜鸟膜拜~

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一抗带标签？
带什么标签呢？
你说下看看，看我能不能解释

作者: jingling845 时间: 2013-3-30 15:01

这个dot blot用的是什么膜？NC还是PVDF膜？

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PVDF膜如何做Dot Blot？曾纠结了好久，一直不知道该怎么用，呵呵？

[ 本帖最后由 jingling845 于 2013-3-30 15:02 编辑 ]

作者: glass 时间: 2013-3-30 15:04

大分子量iBlot靠谱吗？
我认为不是一抗的问题

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谢谢楼主回复！我的蛋白最大的是130KB，最小的40KB左右，应该没问题吧？因为偶尔，曾经看到过130KB的。

iBlot不适合？需要传统方法转膜？

作者: zwsyrt 时间: 2013-3-30 15:07

WB中的问题不能一概而论
考染清楚的话，转膜后，膜用丽春红等染色方法检测了吗？
一抗、二抗是否work
试剂公司的样品是高表达或者是纯蛋白样品
有可能是您检测样品中表达量低或者不表达

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膜染有条带的，二抗应该也没问题，内参是可以出的，同样的一抗用别人的样本就可以出，我的样本就不出。图是我用我的样本和别人的样本做的同一个抗体，左边是别人的样本，中间是我的，右边是marker。
~~~您觉得提取蛋白以后用什么方法保存最好？是分装了直接负80保存好，还是加了上样缓冲液后煮沸再保存好？

作者: mimili_901 时间: 2013-3-30 15:10

您好，又要麻烦您了，我最近跑24KD的RHOA蛋白，一直曝不出来。都一个月了，不知道是什么原因。内参曝出来了
并且尝试了很多条件，15%胶跑50分钟，02μmPVDF膜转1小时，脱脂奶粉+TBST封闭1小时，一抗1:200 孵育4℃过夜。TBST洗涤。二抗1:10000孵育1小时，TBST洗涤，加ECL曝光。请您帮我看看，怎么回事呢，最近真的是着急需要啊。

作者: mimili_901 时间: 2013-3-30 15:11

我的电泳是80V-100V.
转磨条件100V。

立春红染了，只有内参有显示。

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 15:11

一抗带标签？
带什么标签呢？
你说下看看，看我能不能解释
说明书原话：Western blot against tagged recombinant protein immunogen using ab55015 GilZ / TilZ antibody at 1ug/ml. Predicted band size of immunogen is 37 kDa

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tagged recombinant protein immunogen为啥带标签呢？
说明书网址：cuturl('http://www.abcam.com/GilZ-TilZ-antibody-ab55015.html')
谢谢！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 15:13

请问做免疫组化（石蜡切片）用的抗体都必须是一抗么？多抗行不行？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:15

PVDF膜如何做Dot Blot？曾纠结了好久，一直不知道该怎么用，呵呵？

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用NC膜做dot blot

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:15

膜染有条带的，二抗应该也没问题，内参是可以出的，同样的一抗用别人的样本就可以出，我的样本就不出。图是我用我的样本和别人的样本做的同一个抗体，左边是别人的样本，中间是我的，右边是marker。
~~~您觉得提取蛋白以后用什么方法保存最好？是分装了直接负80保存好，还是加了上样缓冲液后煮沸再保存好？

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我们的样品处理方法：变性后分装，-20度冻存，2-3个月没问题
如果想保存时间长一些，可以-80度保存

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:16

您好，又要麻烦您了，我最近跑24KD的RHOA蛋白，一直曝不出来。都一个月了，不知道是什么原因。内参曝出来了
并且尝试了很多条件，15%胶跑50分钟，02μmPVDF膜转1小时，脱脂奶粉+TBST封闭1小时，一抗1:200 孵育4℃过夜。TBST洗涤。二抗1:10000孵育1小时，TBST洗涤，加ECL曝光。请您帮我看看，怎么回事呢，最近真的是着急需要啊。
内参曝光条带能放上来看看嘛？

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描述的实验条件都没问题
1、样品可能没有表达
2、抗体效果不行

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:16

说明书原话：Western blot against tagged recombinant protein immunogen using ab55015 GilZ / TilZ antibody at 1ug/ml. Predicted band size of immunogen is 37 kDa

tagged recombinant protein immunogen为啥带标签呢？
说明书网址：cuturl('http://www.abcam.com/GilZ-TilZ-antibody-ab55015.html')
谢谢！

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一抗不带标签啊
它的意思是：免疫原是重组蛋白，重组蛋白纯化的时候带标签的。

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:18

请问做免疫组化（石蜡切片）用的抗体都必须是一抗么？多抗行不行？

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单抗、多抗都可

作者: vivian4123 时间: 2013-3-30 15:19

内参曝光条带能放上来看看嘛？
描述的实验条件都没问题
1、样品可能没有表达
2、抗体效果不行

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您好，这是内参
β-actin

还有一个问题想请教一下，我以前买过双螺旋的考马斯亮蓝快速染色液，用了很久很好用。但是现在我自己配的考马斯亮蓝染色液总是用了两三次后效果就不行了，又得重新配。有没有持久一些的配方呢?
我的配方是0.1考马斯亮蓝R-250.25%异丙醇，50%冰醋酸。定容至100ML.

作者: loli 时间: 2013-3-30 15:20

你好版主，请问cell signaling的二抗7074的western工作浓度是多少？最好能跟我说下孵育条件，比如说孵育时间和温度要求等，谢谢。

作者: qqq111 时间: 2013-3-30 15:20

不知楼主还在不在？请楼主帮忙解析一问题，我已发过贴了，没人理我啊.
最近实验室western blot 出现一新问题：配好胶后胶与玻璃板之间没有气泡，但等样品跑进分离胶不久后，分离胶和厚玻璃板之间出现气泡，气泡随着电泳的继续会越来越大。曝光后条带跟虫子爬似的歪歪斜斜...
厚玻璃板是bio-rad，薄板是国产的（经常打破，最近就换了国产的），梳子和电泳仪也都是bio-rad。
玻璃板绝对洗得很干净了，胶的配方，成分也检查过了，没有问题。电泳电压电流跟以前的一样，没有改变条件。浓缩胶电压60-80v,分离胶100-130v。实验室师兄怀疑是厚板与薄板不配套导致？但是一开始胶都是好好的啊！

作者: ero11 时间: 2013-3-30 15:22

你好，我第一次做wb，昨天才配好胶，想将我的过程写在此处，请各位老师指教：

1、国庆前蛋白质定量：选用bradford法
标曲的公式的R值是0.998，

图片附件: 19048931.snap.jpg (2013-3-30 15:22, 43.25 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15417

作者: ero11 时间: 2013-3-30 15:23

蛋白定量结果：（黄色为选择的稀释倍数的od值）

图片附件: 22081935.snap.jpg (2013-3-30 15:23, 78.86 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15418

作者: ero11 时间: 2013-3-30 15:24

最后一列为上样体积。
2、昨天配胶：
用洗洁精清洗玻璃板（之前浸酸过夜），用刷子清洁，再用清水洗净，然后用纯水再洗一遍。放置于架子上，夹好，加水测漏，倒去水，用滤纸吸干水，放置于烘干箱中，烘干后，配胶。我做的是内参：β-actin，分子量45kda，下层胶用10%，碧云天的凝胶试剂盒，配制好了以后，灌胶，在板的一边将胶灌入，马上用正丁醇封胶（凝后发现胶不是非常的平，求原因！），凝后，将正丁醇吸去，加纯水冲洗，倾斜板，用滤纸将水吸去（板内有余下水滴），加上层胶，放置梳子，凝后，将板浸入新制电泳液中，4度保存
3、明天跑电泳转膜：
第一个孔加marker4ul，最后一个孔加5×loading baffer3ul，其他孔加蛋白样品，样品在上样前需要涡旋离心混匀。
加样完后，槽中间加新的电泳液，外侧加旧电泳液，开始时10v 10min，后面60v跑到底。
在电泳的时候，准备转膜需要的物品，电泳结束后，将胶切好，按顺序放置，在PVDF膜上写上抗体名称，夹好，正负极对上，100v恒压，35min。转膜结束后用立春红染色，染完，用纯水冲洗，洗完，用tbst漂洗5min，3次，然后封闭，孵育（我采用的是康为世纪的western blot一步法，就是不需要加二抗的一种做法，也不知道好不好用呢），成像！

作者: ero11 时间: 2013-3-30 15:25

请问楼主，一抗是兔多抗，内参是鼠单抗，那是不是要把转膜好的PVDF膜切成两块，分别进行一抗孵育，然后再分别进行二抗孵育？有没有其他办法？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:25

您好，这是内参
β-actin

还有一个问题想请教一下，我以前买过双螺旋的考马斯亮蓝快速染色液，用了很久很好用。但是现在我自己配的考马斯亮蓝染色液总是用了两三次后效果就不行了，又得重新配。有没有持久一些的配方呢?
我的配方是0.1考马斯亮蓝R-250.25%异丙醇，50%冰醋酸。定容至100ML.

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从这张图来看，胶不是特别好
考染配方请参考分子克隆，经典的很
目的蛋白建议你再做做
WB的条件需要多调整

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:26

你好版主，请问cell signaling的二抗7074的western工作浓度是多少？最好能跟我说下孵育条件，比如说孵育时间和温度要求等，谢谢。

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1、这个说明书上没写吗？
2、不同的检测方法及不同公司的ECL对二抗稀释度的要求都是不同的，需要您自己来做预实验确定
3、二抗孵育条件：室温，30min就可以了
4、不当版主已经好久了，掳了

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:28

不知楼主还在不在？请楼主帮忙解析一问题，我已发过贴了，没人理我啊.
最近实验室western blot 出现一新问题：配好胶后胶与玻璃板之间没有气泡，但等样品跑进分离胶不久后，分离胶和厚玻璃板之间出现气泡，气泡随着电泳的继续会越来越大。曝光后条带跟虫子爬似的歪歪斜斜...
厚玻璃板是bio-rad，薄板是国产的（经常打破，最近就换了国产的），梳子和电泳仪也都是bio-rad。
玻璃板绝对洗得很干净了，胶的配方，成分也检查过了，没有问题。电泳电压电流跟以前的一样，没有改变条件。浓缩胶电压60-80v,分离胶100-130v。实验室师兄怀疑是厚板与薄板不配套导致？但是一开始胶都是好好的啊！

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这个配胶出现气泡的问题
我没碰到过

作者: NBA 时间: 2013-3-30 15:28

请问楼主，一抗是兔多抗，内参是鼠单抗，那是不是要把转膜好的PVDF膜切成两块，分别进行一抗孵育，然后再分别进行二抗孵育？有没有其他办法？

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可以两个抗体一起做试试

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 15:29

您好，

我在做一个膜蛋白的western blot，它的二聚体分子量是200kd 左右，我跑出来的时候一般是2条带，分别在100kd 和200kd. 不知道该如何跑出只有200kd 的蛋白。谢谢！！

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你好，我有个蛋白分子量是190kd左右，我想问下你做WB的胶浓度、转膜条件、封闭、一抗、二抗的浓度时间分别是怎样的呢？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 15:30

细胞样品：1-2ug/ul，上样10-20ug
组织样品：2-4ug/ul，上样20-40ug
跑到底才成黄色吗？

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我想问下组织样品浓度太高会怎么样啊？我一般80ug/15ul的呀，这样内参（一抗1:1000，二抗1:2000）总是很浓，连成了一条线，分子量60kd的目的蛋白有时连成一条，有时呈船型，而目的（120kd、190kd）则比较淡，很少看出完整的条带，要么堆成一坨，要么缺了一部分，杂带较多，较难分辨目的，不知道是什么原因，应该怎么能选择玩wb的条件呢？

我上样量110ug左右，浓缩胶40v 1小时，8%分离胶80v2.5小时左右，转膜不加SDS内参和60KD的蛋白300ma 1h，120kd转1.5h，190kd转2.5h，封闭5%BSA或脱脂牛奶室温至少2小时（也尝试过过夜），一抗是CST的，1:500,4度过夜，二抗1:2000，室温2h。

还有我想问下，稀释好的一抗一般能孵育几次呢，可存放多久啊？如果转膜液加了SDS，我应该怎么调整转膜时间呢？非常感谢您的建议！！！

作者: ladyhuahua 时间: 2013-3-30 15:30

我一个多月一直在做肝癌细胞COX2这个分子我用过很多条件，都没有作出条带，包括12%、10%、8%的分离胶，湿转250MA 4h,300MA 2h,半干转 15V 1.5h,15V 1h,20V 1h,0.8mA/M2 1.5h,

一抗浓度从1:400,1:500,1:1000均做过，用丽春红染色后，上述条件均可见在80kd附近的条带，但是用抗体孵育后，却没有条带，所以，我一直很困惑，RT-PCR检测该分子在细胞中是有表达的，不知道是什么原因，请您帮我分析下，谢谢！

作者: ero11 时间: 2013-3-30 15:31

新手，之前不知道上样缓冲液还有非还原性和还原性的，结果变性的时候加了非还原性的上样缓冲液，做内参，转膜以后立春红染色什么都没有，胶也拿去染色了，也什么都没有，是不是因为二硫键没有打开，蛋白不能根据分子量而跑开来啊？？？

作者: redbutterfly 时间: 2013-3-30 15:37

从这张图来看，胶不是特别好
考染配方请参考分子克隆，经典的很
目的蛋白建议你再做做
WB的条件需要多调整

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您好，您以前给我说过RhoA很好做出的，请教一下您曝出RhoA的具体条件，我想参考一下调整方案，因为我自己也调整过很多方案，做了2个月了，一直没有结果，真心麻烦您了，这个真的很着急。

作者: 04906 时间: 2013-3-30 16:11

这个dot blot用的是什么膜？NC还是PVDF膜？

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NC膜，封闭液浓度过高，封闭时间过长会有影响吗？

作者: 04906 时间: 2013-3-30 16:13

二抗继续稀释撒
另外二抗孵育条件是什么？洗膜条件是什么？

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您好，我将二抗稀释度从1:50000增大到了1:100000，室温下孵育1 h，洗膜是TBST洗3次，每次10 min，可是为什么得到的结果还是背景很高？
封闭条件依然是10 %脱脂奶粉，4度18h；一抗是1:2000，室温1h。
二抗还要再继续稀释吗？还是如zhihui_li所说，更换NC膜，或者降低封闭液浓度和时间试试？

[ 本帖最后由 04906 于 2013-3-30 16:17 编辑 ]

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作者: youyou99 时间: 2013-3-30 16:18

能不能帮我看看我的western 电泳考染，染胶后发现上面的条带还是很清晰（55KD），到下面就发散称胡须状，要做的蛋白是40KD，先是10%胶如此，换成12%胶仍如此，实在是没得法啊。只有一次10%胶考染后比较清晰，以后就又成这样了，转膜后丽春红染是白的，没有条带，真心谢谢，希望老师能给我解答。

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作者: kuohao17 时间: 2013-3-30 16:18

做akt p-akt的western blot，最近一直做不出来？背景很黑，什么原因？

作者: ROSE李 时间: 2013-3-30 16:19

提问~

我跑western电泳时用了两块胶所有东西都一样配胶一样上样一样在同一个电泳盒里电泳就是其中一块胶配的时候稍微有一点点斜不超过5°
但是跑出来有一块胶的溴酚蓝很斜很斜大概有二三十度斜度了另一块很正常另一块都到分离胶了倾斜的这块最高的地方还没怎么动 marker 也没跑开请问这可能是为什么?

另外我配的浓缩胶黏黏糊糊的有时候很脆很干净有时候又很黏糊配方都一样不知道可能是什么原因

谢谢老师辛苦啦！~

作者: woshituzhu 时间: 2013-3-30 16:19

不知道融合基因转录形成的融合蛋白的蛋白印记怎么做呢？没有该融合基因的一抗

作者: bring 时间: 2013-3-30 16:20

老师求助啊~~最近要做WB检测IL-8,但是看到老师的回答里面有说，IL-8不适合做WB，请问这是为什么，有那些类的蛋白是不适合做WB？谢谢老师~~·

作者: mysmdbl 时间: 2013-3-30 16:20

内参为：β-actin（分子量45），目的蛋白是α-SMA（分子量42）
已经做了一次的内参，根据内参已经调整了上样量，我的样品比较少，请问，可不可以切胶转膜后，一抗稀释液中同时加入这两种抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:20

我想问下组织样品浓度太高会怎么样啊？我一般80ug/15ul的呀，这样内参（一抗1:1000，二抗1:2000）总是很浓，连成了一条线，分子量60kd的目的蛋白有时连成一条，有时呈船型，而目的（120kd、190kd）则比较淡，很少看出完整的条带，要么堆成一坨，要么缺了一部分，杂带较多，较难分辨目的，不知道是什么原因，应该怎么能选择玩wb的条件呢？

我上样量110ug左右，浓缩胶40v 1小时，8%分离胶80v2.5小时左右，转膜不加SDS内参和60KD的蛋白300ma 1h，120kd转1.5h，190kd转2.5h，封闭5%BSA或脱脂牛奶室温至少2小时（也尝试过过夜），一抗是CST的，1:500,4度过夜，二抗1:2000，室温2h。

还有我想问下，稀释好的一抗一般能孵育几次呢，可存放多久啊？如果转膜液加了SDS，我应该怎么调整转膜时间呢？非常感谢您的建议！！！

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上样量太大了
一抗我们一般只用一次，不会重复使用
如果要保存的话，-20度，冻存，用2次

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:21

我一个多月一直在做肝癌细胞COX2这个分子我用过很多条件，都没有作出条带，包括12%、10%、8%的分离胶，湿转250MA 4h,300MA 2h,半干转 15V 1.5h,15V 1h,20V 1h,0.8mA/M2 1.5h,

一抗浓度从1:400,1:500,1:1000均做过，用丽春红染色后，上述条件均可见在80kd附近的条带，但是用抗体孵育后，却没有条带，所以，我一直很困惑，RT-PCR检测该分子在细胞中是有表达的，不知道是什么原因，请您帮我分析下，谢谢！

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一抗是哪个公司的？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:21

新手，之前不知道上样缓冲液还有非还原性和还原性的，结果变性的时候加了非还原性的上样缓冲液，做内参，转膜以后立春红染色什么都没有，胶也拿去染色了，也什么都没有，是不是因为二硫键没有打开，蛋白不能根据分子量而跑开来啊？？？

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蛋白跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染胶了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:22

您好，您以前给我说过RhoA很好做出的，请教一下您曝出RhoA的具体条件，我想参考一下调整方案，因为我自己也调整过很多方案，做了2个月了，一直没有结果，真心麻烦您了，这个真的很着急。

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蛋白跑完SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:22

NC膜，封闭液浓度过高，封闭时间过长会有影响吗？

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dot blot需要用NC膜
封闭时间过长我没试过

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:23

能不能帮我看看我的western 电泳考染，染胶后发现上面的条带还是很清晰（55KD），到下面就发散称胡须状，要做的蛋白是40KD，先是10%胶如此，换成12%胶仍如此，实在是没得法啊。只有一次10%胶考染后比较清晰，以后就又成这样了，转膜后丽春红染是白的，没有条带，真心谢谢，希望老师能给我解答。

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样品中有沉淀

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作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:24

做akt p-akt的western blot，最近一直做不出来？背景很黑，什么原因？

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内参做的怎么样？
背景很黑，调整一下二抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:25

提问~

我跑western电泳时用了两块胶所有东西都一样配胶一样上样一样在同一个电泳盒里电泳就是其中一块胶配的时候稍微有一点点斜不超过5°
但是跑出来有一块胶的溴酚蓝很斜很斜大概有二三十度斜度了另一块很正常另一块都到分离胶了倾斜的这块最高的地方还没怎么动 marker 也没跑开请问这可能是为什么?

另外我配的浓缩胶黏黏糊糊的有时候很脆很干净有时候又很黏糊配方都一样不知道可能是什么原因

谢谢老师辛苦啦！~

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没出现过这种情况

浓缩胶的问题：注意APS与TEMED的量

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:25

不知道融合基因转录形成的融合蛋白的蛋白印记怎么做呢？没有该融合基因的一抗

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用融合蛋白中的标签抗体

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:26

老师求助啊~~最近要做WB检测IL-8,但是看到老师的回答里面有说，IL-8不适合做WB，请问这是为什么，有那些类的蛋白是不适合做WB？谢谢老师~~·

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分泌型的抗体不适合用WB检测
具体原因未知
我自己个人认为：分泌蛋白可能在血液中

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:27

内参为：β-actin（分子量45），目的蛋白是α-SMA（分子量42）
已经做了一次的内参，根据内参已经调整了上样量，我的样品比较少，请问，可不可以切胶转膜后，一抗稀释液中同时加入这两种抗体？

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1、α-SMA先检测
之后用stripping buffer处理，检测beta-actin
2、用两种不同荧光的二抗，用仪器可以实现

作者: KGZ564 时间: 2013-3-30 16:28

蛋白跑完SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色了吗？

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蛋白跑完SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色了，20KD左右的蛋白颜色很浅。
每次都是我觉得我的操作没有问题啊

作者: one 时间: 2013-3-30 16:28

大侠，我跑的内参很亮，可是我的目的抗体foxo1连个影都没有，封闭，37度2小时，买的CST的抗体，1:1000，4度过夜，二抗santa,1:1000,37度两小时，可是爆出来就是一张白膜，啥都没有，求教啊！！！附上内参actin的图，求教内参还能做的更好看点么？

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作者: plaa 时间: 2013-3-30 16:29

你好，我的目的条带是90KD，内参用的Actin，曝光结果90KD的条带还不错，但是Actin条带很不好看，不知道是什么原因，我的条件是250mA转膜2h，5%脱脂奶封闭2h，一抗用5%BSA稀释（Actin1： 2000，santa的mouse anti Actin）封闭过夜，TBST洗3次，每次10min，二抗用5%BSA稀释（1：2000，santa的goat anti mouse）室温1h，TBST洗3次，每次10min，底物用的Pierce的，特此向fangweibin119请教，是什么原因造成Actin条带成这样呢?

[ 本帖最后由 plaa 于 2013-3-30 16:30 编辑 ]

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作者: kuaizige 时间: 2013-3-30 16:31

你好，最近本人做westren 遇到很多问题，看到你对这方面的问题又很多好的答复，能不能留个联系方式？谢谢，由于今天的站内联系名额没有了，就在这里联系了。

作者: KGZ564 时间: 2013-3-30 16:32

样品中有沉淀

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谢谢老师了，我昨天的样品上样前离心了一下，染胶条带正常，很清晰。但丽春红染膜仍是白板。哎

作者: kswl870 时间: 2013-3-30 16:32

老师求助！！我提取胰腺组织蛋白，不知道为什么，连内参都没有，胰腺蛋白酶特别丰富，不知道要怎么样提取蛋白啊，求指教！！做了好久，一直都是这样，急死我啦。浓浓的内参是别人的蛋白，不是胰腺组织的，其他都是空白，55555

[ 本帖最后由 kswl870 于 2013-3-30 16:33 编辑 ]

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作者: moonlight45 时间: 2013-3-30 16:34

老师：
您好，我用的是巴傲德的BS1076，用这些条件做内参可以出来（见下面的这两张图，抗体也是用的这个公司的），但是我做COX-2的WB一直都没有结果，用他们的实验条件：
浓缩胶 4%，分离胶12%；
电泳：85V跑至marker出现分离后改为135V ；
转膜：恒流0.30A，90min （NC膜）；
封闭：5%脱脂奶粉（TBS配置）；室温1小时；
一抗：1：500（2%BSA的TBST配制），4度过夜。
可以我用这个条件和阳性样品也没有作出来，后来用我们师兄做80kD分子条件用伯乐的半干转的条件20V 30min去做，依然没有结果，我现在真的不知道该怎么办了，麻烦您给我给点建议，是否需要换一抗呢？

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作者: lixi559 时间: 2013-3-30 16:36

蛋白跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染胶了吗？

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染了，是康为世纪公司的考马粉末配的，1g加250ml异丙醇，加100ml冰醋酸，加水定容至1升的配方来的！
染了30分钟，洗胶用的是脱色液，10min 3次。。。出来就是下图，一片蓝蓝的，底下是白色的。。。。

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作者: lixi559 时间: 2013-3-30 16:37

老师好，我买了一支抗体：E-cadherin，说明书写：Molecular Weight of E-cadherin precursor:135kDa, Molecular Weight of mature E-cadherin:120/80kDa
我想请问下，是不是用这个抗体可以跑出三条条带，分别在135、120、80这几个分子量。。。。
如果转膜的话，120/80是E-cadherin的主体的分子量，那怎么一起转膜呢？一般120跑80min，80跑70min。135跑90min吧。。。。。

作者: 算盘阿星 时间: 2013-3-30 16:38

您好，我也要做WB，新手，实验设计中，其中好多问题不懂想请教谢谢老师

1内参需不需要买标准蛋白，还是只卖内参的一抗、；内参怎么选呢如果分子量和目的蛋白差不多的话是不是到时候就跑不开了

2我要测大鼠的MMP-2（72kDa），MMP-9（92kDa），β-DG（43kDa），和P38不知道要买哪个公司的我查了一下abc的好贵都四千多其他性价比高点的有哪个公司的，迷茫中

3除了一抗以外WB中所需的试剂有哪些需要买进口的？买国产的可以吗，您觉得哪个公司的好一些呢

初来乍到，问题颇多，谢谢大侠指教

刚才您的解答我看不见可以再帮我发一遍吗谢谢您

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你好，我也是做MMP-2,,MMP-9这两个，请问你现在做的怎么样了，我自己做的一塌糊涂，迷茫中~~~

作者: 算盘阿星 时间: 2013-3-30 16:39

前辈，想问一下，MMP-2和MMP-9的转膜时间是多少？我转膜时间是100V,6Omin。但是转膜之后发现膜上marker的部分上只有红色和红色上边的条带清楚，其他的都不清楚，是否说明我的转膜时间不够？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:40

蛋白跑完SDS-PAGE后，考马斯亮蓝染色了，20KD左右的蛋白颜色很浅。
每次都是我觉得我的操作没有问题啊

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这个浅是正常的
转膜后检测过吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:41

大侠，我跑的内参很亮，可是我的目的抗体foxo1连个影都没有，封闭，37度2小时，买的CST的抗体，1:1000，4度过夜，二抗santa,1:1000,37度两小时，可是爆出来就是一张白膜，啥都没有，求教啊！！！附上内参actin的图，求教内参还能做的更好看点么？

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foxo1用的是哪里的抗体？
样品来源呢？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:42

你好，我的目的条带是90KD，内参用的Actin，曝光结果90KD的条带还不错，但是Actin条带很不好看，不知道是什么原因，我的条件是250mA转膜2h，5%脱脂奶封闭2h，一抗用5%BSA稀释（Actin1： 2000，santa的mouse anti Actin）封闭过夜，TBST洗3次，每次10min，二抗用5%BSA稀释（1：2000，santa的goat anti mouse）室温1h，TBST洗3次，每次10min，底物用的Pierce的，特此向fangweibin119请教，是什么原因造成Actin条带成这样呢?

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上样量太大了
降低一半

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:42

谢谢老师了，我昨天的样品上样前离心了一下，染胶条带正常，很清晰。但丽春红染膜仍是白板。哎

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转膜条件是？
说的详细些：试剂配方等都说一下

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:42

老师求助！！我提取胰腺组织蛋白，不知道为什么，连内参都没有，胰腺蛋白酶特别丰富，不知道要怎么样提取蛋白啊，求指教！！做了好久，一直都是这样，急死我啦。浓浓的内参是别人的蛋白，不是胰腺组织的，其他都是空白，55555

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您做的是什么内参？beta-actin？还是？
1、提取蛋白是否存在问题
2、胰腺中是否表达有这种内参

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:51

染了，是康为世纪公司的考马粉末配的，1g加250ml异丙醇，加100ml冰醋酸，加水定容至1升的配方来的！
染了30分钟，洗胶用的是脱色液，10min 3次。。。出来就是下图，一片蓝蓝的，底下是白色的。。。。

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这也看不到条带啊。。。。。
继续脱色试试吧

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:51

老师好，我买了一支抗体：E-cadherin，说明书写：Molecular Weight of E-cadherin precursor:135kDa, Molecular Weight of mature E-cadherin:120/80kDa
我想请问下，是不是用这个抗体可以跑出三条条带，分别在135、120、80这几个分子量。。。。
如果转膜的话，120/80是E-cadherin的主体的分子量，那怎么一起转膜呢？一般120跑80min，80跑70min。135跑90min吧。。。。。

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转膜：300mA 湿转，2h即可
三个蛋白都没有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-30 16:51

你好，我也是做MMP-2,,MMP-9这两个，请问你现在做的怎么样了，我自己做的一塌糊涂，迷茫中~~~

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1、要选择好的抗体，检测过程很简单啦
这两个蛋白还是很好检测的，不过在不同来源的样品中有些条带特异，有些会有很多杂带
2、可以试试明胶酶谱法检测

作者: jkobn 时间: 2013-3-30 16:52

没有，我好像没说清楚，是我的MARKER条带在跑胶时很正常但是转膜后条带就很扭曲。。。。

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作者: loli 时间: 2013-3-30 16:53

转膜：300mA 湿转，2h即可
三个蛋白都没有问题

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我有2个抗体，是α-SMA（分子量是42，是鼠源），内参（分子量45，是兔源），如果：我第一天下午17点把膜浸入α-SMA稀释液中，第二天10点，抗鼠二抗显影后，可不可以用TBST 3*10min漂洗后，再把膜浸入含内参的稀释液中，再进行内参的检测？这里出现了一个问题，我如果11：00am 一抗4度孵育的话，什么时候二抗孵育呢？？？膜在一抗孵育最多可以几小时啊？另外，有帖子说，封闭5min就足够了，是真的吗？用奶粉、bsa、专门买现成的封闭液它们之前有差异吗？

作者: bamboo16 时间: 2013-3-30 16:54

转膜条件是？
说的详细些：试剂配方等都说一下

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250MA恒流1个小时，我的蛋白分子量40KD，电转液为tris 5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200ml，定容至1000毫升。

作者: remenb 时间: 2013-3-30 16:54

你好！我想问问你做WB时，大家常说的裂解细胞时加的细胞裂解液，是不是就是5*SDS上样缓冲液。我刚开始做实验，不太懂。麻烦你给我讲一讲吧！

作者: kuaizige 时间: 2013-3-30 16:55

您做的是什么内参？beta-actin？还是？
1、提取蛋白是否存在问题
2、胰腺中是否表达有这种内参

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是GAPDH的内参。有表达的，以前的师姐做过，我也觉得是提取的蛋白有问题，可是不知道胰腺蛋白提取有什么需要注意的吗？

作者: october7 时间: 2013-3-30 16:55

楼主你好我曝的caspase-3的17KaD的小亚基，有反白的现象就是背景是黑的但是目的条带的地方是透明的，这是什么原因啊？我的条件是80V 30min 浓缩胶，120V 90min 15%分离胶，0.25A 90min电转，5%脱脂奶封闭2h，一抗中杉金桥 1:1000稀释二抗中杉金桥 1:5000（实际1:10000）加发光液曝光4min

作者: 98776langtao 时间: 2013-3-30 16:56

用的CST的foxo1抗体，做的是胎盘组织，前两天试着加大样品量，一抗调到1:500，二抗1:2000，还是一片空白

作者: 算盘阿星 时间: 2013-3-30 16:57

老师，我目前在检测MMP-2这一指标。我的一抗是abcam的，推荐浓度是1:1000~2000，二抗是Jackson的，推荐浓度是1:10，000~1:200,000。我该怎么选择这两个抗体的浓度。

作者: vivian4123 时间: 2013-3-30 16:58

抗体说明书写：For western blots 1：1000, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS,
0.1% Tween-20
不明白到底怎么加。比如抗体1ul，那么 BSA？量， 1*TBS 1ml，0.1% Tween-20又是多少量？谢谢

作者: BOSS2011 时间: 2013-3-30 16:59

本人做蛋白已经有两个月了，但是一直没有把目的蛋白做出来，想请教群里面的高手，希望能帮帮小弟。我的目的蛋白是一个45kd大小的蛋白，是连接在pEGFP-N1载体上的，与标签蛋白EGFP属于融合表达，EGFP大小是27KD，所以我检测的蛋白大小应该就是72KD，我内参使用的ACTIN，大小为45KD。做了很多次了，一般都是内参一般比较清晰明显，但是目的基因要么条带很弱，要不就是杂带很多。
下面我说说我最近的一次实验的实验条件，我的浓缩胶的浓度是5%，分离胶的浓度是12%，膜是用的0.22的NC膜。转膜条件是：转膜液含有20%的甲醇，膜长6.5，宽3.2，转膜时间80min,电流大小为60mA,转后用TBST稍微洗了下，然后用5%的脱脂奶粉室温，最低转速，封闭2h .然后TBST: 3X5min,TBS :5min,一抗孵育：目的1：200，内参1：2000。4度过夜。次日洗膜：TBST: 3X5min,TBS :5min,。二抗孵育2h，目的和内参都是1：2000。洗膜TBST: 3X5min,TBS :5min.
结果，内参十分明显，暴光时间在2分左右，目的基因暴光时间在15分钟，且条带不是那种完整的直线，有些中间没有，感觉是孔的边缘还比较亮一点。
我问过我们实验室以前做过蛋白的师兄，师兄说可能是我转膜的时间太长了，但是我觉得目的蛋白72KD，内参45KD，如果时间长了，内参会比较浅才对的。还有的就是我的分离胶是用的12%的浓度，大了点，对于转膜的时候会产生很大的影响吗？

这个是内参actin的图片，大小在45kd左右。曝光时间为2min左右。

这是目的基因suv39h1的图片，大小在72kd左右曝光时间有15min左右

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作者: dream2013 时间: 2013-3-30 17:00

你好，我是新手，刚刚开始做WB，有几个问题想跟你请教一下。我用的博士德公司的哺乳蛋白抽提试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒。目的蛋白是66KD。
不同组织提取蛋白后算出的浓度分别是——
2245.486
6215.746
2642.512
ug/ml
疑问：蛋白浓度测定的意义到底在哪里？结果值除了能算出电泳上样量以外，能看出什么？一般值为多少有意义，可以继续往下做？

根据上值算出了50ug 所需量，定容到20ul,加入5×SDS上样缓冲液5ul,煮沸5min。先80V，后120V。

跑完电泳以后，考马斯亮蓝染色，结果如下图：

能否帮我分析一下结果。条带颜色很浅，似乎浓度不够。这样的结果能不能继续往下做呢？

图片附件: 10924172.jpg (2013-3-30 17:00, 11.96 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15430

作者: ukonptp 时间: 2013-3-30 17:00

老师，您好！我又来麻烦您了。我之前买的奶粉有问题，换了新的封闭效果很好，之前用5%BSA封闭摸出来上样量为15微克，换了4%奶粉封闭效果更好，但这次4块胶做下来，内参效果不错，但目的条带一张也没显出来，是不是还要摸下上样量？望老师指教！

作者: quiqui008 时间: 2013-3-30 17:01

做了半个月的WB了，每次结果都一样，曝光后什么都没有。连内参都做不出来。之前实验室相同条件下，他们有做出过内参及其他蛋白条带的。
我对电泳后凝胶进行考染，蛋白条带、泳道应该都没什么问题。转膜后，丽春红染色能看到淡淡的条带。现在问题在哪呢，是不是在抗体孵育或者曝光阶段呢？
孵育曝光过程大致如下，PVDF膜一抗1:1000（5ml），室温摇床1小时，后4℃静置过夜；PBST3*5min；二抗1:1000（5ml）36℃振荡1.5小时。PBST3*5min清洗后，ECL A+B混合液接触1min，曝光5min。（在膜与ECL A+B接触后，未见到荧光。另外我直接把二抗与ECL A+B混合，也未见到任何荧光）
请大侠救助，问题到底出在哪里呢？不胜感激！（最近快要崩溃了......）

作者: quiqui008 时间: 2013-3-30 17:02

封闭用过碧云天的封闭液，后来换成了5%脱脂奶粉（PBST配制），均为室温摇床1小时。另外抗体及稀释液均来自碧云天。（注，写出厂家，没别的意思，只是单纯的求助，请大家见谅，谢谢！）

作者: jingling845 时间: 2013-3-30 17:02

大家好，我最近在做western blot的时候问题如下：
我一般都是同时跑2块胶，一块做SDS-PAGE，另一块做western blot，
SDS-PAGE进过染色之后能很好的显示蛋白条带，western blot转膜之后，彩色的MARKER能很好的转上去，
然后5%脱脂奶粉封闭2小时，在一抗2小时或者4度过夜，在TBST洗3次，每次10min，再二抗2小时，TBST洗3次，每次10min，显影，曝光，就是什么都没有。
我将二抗直接放进显影液中，能发出亮光。将直接亮的，进行曝光，能显影。10×的TBS的PH在7.6。
基本证明我转膜和二抗是没有问题的，我想问下为什么显不出来，是什么原因。
万分感谢！

作者: vivian4123 时间: 2013-3-30 17:03

老师您好！最近做WB又出现新问题，跑胶过程中marker分离到从上往下第4条，后面的条带没了，就这样一直跑到底，是不是我的胶做得不好，问题出在哪里，望老师指教，不甚感激…

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:03

我有2个抗体，是α-SMA（分子量是42，是鼠源），内参（分子量45，是兔源），如果：我第一天下午17点把膜浸入α-SMA稀释液中，第二天10点，抗鼠二抗显影后，可不可以用TBST 3*10min漂洗后，再把膜浸入含内参的稀释液中，再进行内参的检测？这里出现了一个问题，我如果11：00am 一抗4度孵育的话，什么时候二抗孵育呢？？？膜在一抗孵育最多可以几小时啊？另外，有帖子说，封闭5min就足够了，是真的吗？用奶粉、bsa、专门买现成的封闭液它们之前有差异吗？

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1、孵育a-SMA后用stripping buffer洗脱后再孵育内参，两者分子量离得太近
2、我们都是自己配封闭液的哦，建议你现用现配

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:04

250MA恒流1个小时，我的蛋白分子量40KD，电转液为tris 5.8g，甘氨酸2.9g，SDS0.37g，甲醇200ml，定容至1000毫升。

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这个转膜条件足够

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:04

你好！我想问问你做WB时，大家常说的裂解细胞时加的细胞裂解液，是不是就是5*SDS上样缓冲液。我刚开始做实验，不太懂。麻烦你给我讲一讲吧！

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裂解液与5*SDS上样缓冲液不是同一种东西
裂解液是用于裂解细胞或者组织的（使蛋白溶解在裂解液中）
而5*SDS上样缓冲液是用来变性蛋白用的

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:05

是GAPDH的内参。有表达的，以前的师姐做过，我也觉得是提取的蛋白有问题，可是不知道胰腺蛋白提取有什么需要注意的吗？

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注意防止降解就行了

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:07

楼主你好我曝的caspase-3的17KaD的小亚基，有反白的现象就是背景是黑的但是目的条带的地方是透明的，这是什么原因啊？我的条件是80V 30min 浓缩胶，120V 90min 15%分离胶，0.25A 90min电转，5%脱脂奶封闭2h，一抗中杉金桥 1:1000稀释二抗中杉金桥 1:5000（实际1:10000）加发光液曝光4min

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调整一抗与二抗的浓度

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:07

tracy4907 wrote:
用的CST的foxo1抗体，做的是胎盘组织，前两天试着加大样品量，一抗调到1:500，二抗1:2000，还是一片空白！

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可能Foxo1在胎盘组织中无表达

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:07

老师，我目前在检测MMP-2这一指标。我的一抗是abcam的，推荐浓度是1:1000~2000，二抗是Jackson的，推荐浓度是1:10，000~1:200,000。我该怎么选择这两个抗体的浓度。

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1、先确定二抗稀释度：用NC膜做dot blot，我的帖子有专门的说明
2、然后做二抗的不同稀释度实验

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:08

做WB有什么书对实验帮助大的新手实验谢谢老师

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1、汪家政等写的《蛋白质技术手册》
2、翻译的，《抗体实验技术指南》

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:08

抗体说明书写：For western blots 1：1000, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS,
0.1% Tween-20
不明白到底怎么加。比如抗体1ul，那么 BSA？量， 1*TBS 1ml，0.1% Tween-20又是多少量？谢谢

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配好5% w/v BSA, 1X TBS 0.1% Tween-20
这个不会配制吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:09

本人做蛋白已经有两个月了，但是一直没有把目的蛋白做出来，想请教群里面的高手，希望能帮帮小弟。我的目的蛋白是一个45kd大小的蛋白，是连接在pEGFP-N1载体上的，与标签蛋白EGFP属于融合表达，EGFP大小是27KD，所以我检测的蛋白大小应该就是72KD，我内参使用的ACTIN，大小为45KD。做了很多次了，一般都是内参一般比较清晰明显，但是目的基因要么条带很弱，要不就是杂带很多。
下面我说说我最近的一次实验的实验条件，我的浓缩胶的浓度是5%，分离胶的浓度是12%，膜是用的0.22的NC膜。转膜条件是：转膜液含有20%的甲醇，膜长6.5，宽3.2，转膜时间80min,电流大小为60mA,转后用TBST稍微洗了下，然后用5%的脱脂奶粉室温，最低转速，封闭2h .然后TBST: 3X5min,TBS :5min,一抗孵育：目的1：200，内参1：2000。4度过夜。次日洗膜：TBST: 3X5min,TBS :5min,。二抗孵育2h，目的和内参都是1：2000。洗膜TBST: 3X5min,TBS :5min.
结果，内参十分明显，暴光时间在2分左右，目的基因暴光时间在15分钟，且条带不是那种完整的直线，有些中间没有，感觉是孔的边缘还比较亮一点。
我问过我们实验室以前做过蛋白的师兄，师兄说可能是我转膜的时间太长了，但是我觉得目的蛋白72KD，内参45KD，如果时间长了，内参会比较浅才对的。还有的就是我的分离胶是用的12%的浓度，大了点，对于转膜的时候会产生很大的影响吗？

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WB系统有问题

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:09

老师，您好！我又来麻烦您了。我之前买的奶粉有问题，换了新的封闭效果很好，之前用5%BSA封闭摸出来上样量为15微克，换了4%奶粉封闭效果更好，但这次4块胶做下来，内参效果不错，但目的条带一张也没显出来，是不是还要摸下上样量？望老师指教！

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目的蛋白是？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:10

封闭用过碧云天的封闭液，后来换成了5%脱脂奶粉（PBST配制），均为室温摇床1小时。另外抗体及稀释液均来自碧云天。（注，写出厂家，没别的意思，只是单纯的求助，请大家见谅，谢谢！）

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抗抗体试试吧

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:10

大家好，我最近在做western blot的时候问题如下：
我一般都是同时跑2块胶，一块做SDS-PAGE，另一块做western blot，
SDS-PAGE进过染色之后能很好的显示蛋白条带，western blot转膜之后，彩色的MARKER能很好的转上去，
然后5%脱脂奶粉封闭2小时，在一抗2小时或者4度过夜，在TBST洗3次，每次10min，再二抗2小时，TBST洗3次，每次10min，显影，曝光，就是什么都没有。
我将二抗直接放进显影液中，能发出亮光。将直接亮的，进行曝光，能显影。10×的TBS的PH在7.6。
基本证明我转膜和二抗是没有问题的，我想问下为什么显不出来，是什么原因。
万分感谢！

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转膜后用丽春红染色了吗？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:11

老师您好！最近做WB又出现新问题，跑胶过程中marker分离到从上往下第4条，后面的条带没了，就这样一直跑到底，是不是我的胶做得不好，问题出在哪里，望老师指教，不甚感激……

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SDS-PAGE or pH

作者: jkobn 时间: 2013-3-30 17:11

小鼠的FAT/CD36，分子量约为88

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:12

小鼠的FAT/CD36，分子量约为88

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条带的问题与SDS-PAGE配制中需要的缓冲液有关

作者: jkobn 时间: 2013-3-30 17:12

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-3-30 17:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
小鼠的FAT/CD36，分子量约为88

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条带的问题与SDS-PAGE配制中需要的缓冲液有关

做的8%的分离胶，4%的浓缩胶，之前都没这样的问题，就这次，marker分离前面几条后面不出来了，急啊

作者: star#room 时间: 2013-3-30 17:13

我看到文献中有人做过胎盘免疫组化，确实有foxo1啊，最近转膜后用丽春红染色，发现没有红色条带，是不是转膜转的不好啊？我的转膜是0.22的PVDF膜，250mA, 2小时，可是内参好好的呀！楼主，求解！！！

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作者: mimili_901 时间: 2013-3-30 17:13

我点的marker是彩色的，能在膜上清楚的显示出来，所以就没有丽春红染过！我看过一些资料，一般彩色marker转膜成功的话，不需要再用丽春红染色的。

作者: 算盘阿星 时间: 2013-3-30 17:14

老师，我的蛋白分子量分别是22KD、29KD、72KD、92KD,请问我配多大浓度的胶？转膜能一起转吗？电流和时间怎么定？谢谢

作者: 969 时间: 2013-3-30 17:15

LZ你好，我打算做NF-kB方面的，因为要看p65的转位，是不是要分别抽核蛋白和胞浆蛋白，再行WB？请问能否推荐相应的KIt啊？
是不是用kit后，一次抽提胞核和胞浆蛋白都能得到啊？谢谢

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-30 17:15

一抗博奥森action内参1:1000，二抗中杉抗兔1:3000,发光液用普利莱的超敏。
加上之后荧光不强，曝光3min，洗出的效果。再降抗体就没带了，要是按照这个清晰程度，还不如DAB敏感。
这是DAB显的。

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作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-30 17:16

大家帮忙判断下原因，谢谢！同学在动物所用和我一样的东西，他说用的就是国产二抗1:10000，说荧光很强，曝光就几秒钟。

压片结果

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15433

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-30 17:16

这是另外一个样品的，条件同上，是原核表达的蛋白，
荧光也是不强

图片附件: 51271107.jpg (2013-3-30 17:16, 4.98 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15434

作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-30 17:17

看着目的带还可以，但是降一抗要去除非特异性条带就不清楚了，同等条件DAB的结果就很特异，dab的结果下图，条件同上。

图片附件: 75344853.jpg (2013-3-30 17:17, 2.81 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: 鲇鱼少爷 时间: 2013-3-30 17:18

另外向大家咨询下，胶片大家都是怎么扫图的，用扫胶片的扫描仪可以吗，上面是我用扫蛋白胶的bio-rad扫的，不清晰，看胶片能比这个清晰点。

作者: greenbee 时间: 2013-3-30 17:19

开始做WB，一直用Actin练手，前几天结果还可以，最近几次，背景特别黑，条带在灯光下能看清，我们用的是ECL+，X光片手动显影，请教一下是什么原因，我自己查了一下，有的说是显影液中浸泡的时间太长了，显影液中应该浸泡到X光片达到什么程度啊？谢谢！

作者: purrr 时间: 2013-3-30 17:19

封闭可以不用奶粉吗谢谢老师

作者: DONT 时间: 2013-3-30 17:21

各位麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为120蛋白的WB，步骤如下：
1.配制8%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑，待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟，300mA的60分钟也跑过（也能看到，可是我们实验室的转膜机有时恒流，大部分恒压，没办法），现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来！
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500（推荐1:200~1000），4°过夜，TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1：5000（推荐浓度，没找到说明书），室温60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光，（师姐们说，她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来）我现在看不到荧光的都是压30min左右，最后显影的时候还是看不到条带，今天不死心，把pvdf膜洗了洗，用丽春红染色能看到条带！（见图、、、）但是就是曝不出来！麻烦各位帮忙分析，指导下！谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方，我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢！

图片附件: 15996965.jpg (2013-3-30 17:21, 6.6 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15436

作者: JK.jon 时间: 2013-3-30 17:22

老师您好，我的二抗说明书上标明：do not freeze ，可是我不小心把二抗放进了-20度，过了一夜才拿出来，现在还能用吗？谢谢！

作者: ffooll 时间: 2013-3-30 17:22

请问有没有做细胞膜蛋白的？用什么做内参呀？文献上有用Na-K ATP酶做内参的？但是这样的抗体实在太贵了，不知道能有更普遍，便宜的细胞膜的内参没？我做GSK-3β磷酸化的能出来，但是去除一抗二抗后总的GSK-3β却怎么也做不出来；如果先做总的，再做磷酸化的就都能出，不知道是怎么回事！

作者: hold住 时间: 2013-3-30 17:22

老师你好，我遇到了一个棘手的问题：之前做WB也做了不少次，电泳时间一般是70V 30min，100V 1h 溴酚蓝就跑到底了，但是这次用了新配制的母液，刚煮的蛋白做WB，70V跑了 40分钟还算正常，可是换到100V跑分离胶时，却非常慢。已经跑了2H了还有一截子没到底。是母液的PH问题,还是我煮蛋白时的上样缓冲液加少了呢（自己感觉煮蛋白的时候，加的上样缓冲液不到4:1的比例，也没当回事）。求指点，感谢！

作者: #问号# 时间: 2013-3-30 17:23

我是新手，打算做western blot，内参和marker是否根据测出的蛋白浓度而选择？可是我时间比较紧张，想一次把抗体和marker等试剂都买全了，这样就无法根据蛋白浓度选择内参和marker了，我做的是人TLR4，朋友有做鼠TLR4的，想问下，是否TLR4的分子量都差不多？能否根据他测得的蛋白浓度选择marker？如果不能，现在一头雾水，请高手指点一下，万分感谢！

作者: 子衿青青 时间: 2013-3-30 17:23

你好，我最近做western，总是曝不出条带，实在是找不到原因，但是内参很好，很齐也很亮
真是愁死了，最近一直在做，总也不出来好点的条带，麻烦帮忙分析一下原因，谢谢您！

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 17:24

准备做western的新手，目的蛋白分子量较大，320多KD，关于浓缩胶和分离胶大小，内参的选择，以及转膜的电流和时间，想请教高手，本人刚接触实验，不懂的地方麻烦给予指导，不甚感激！

作者: popo520 时间: 2013-3-30 17:24

你好，我做目的Vim（60kd）和snail（30kd），用恒流160mA，60m，结果Vim出来了，而Snail没有条带，请问该如何处理？谢谢

作者: kulee 时间: 2013-3-30 17:24

您好。请问转膜时候胶与膜的反正会影响转膜的效果吗。转膜时候marker是在哪边。

作者: 雪山飞鹿 时间: 2013-3-30 17:25

WB必须要有内参吗？我希望观察某种处理下GAPDH的变化，一般可用什么做内参？似乎有的文献中也没有指明用了什么做内参。

作者: bgf5 时间: 2013-3-30 17:25

请问是干转好还是湿转好

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 17:26

大家好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色

注：1.同样的胶和转膜方法，同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，

实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊~~~~
请问，我上面的步骤有问题吗？非常感谢~~~~

作者: any333 时间: 2013-3-30 17:26

WB系统有问题

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不一定是WB系统有问题,你要确认转染效率是没问题的

作者: owanaka 时间: 2013-3-30 17:27

大家好，我是用的抗体是CST（9664）的cleaved caspase-3（17/19kD），没做出来。这个抗体不检测未活化caspase-3（35kD）
组织：新生6天SD大鼠脑海马组织的，提取的是全蛋白，储存-80的；
上样量：为60微克/lane；10%的胶（细胞色素C14kD跑出来了，但cleaved caspase-3没出来）
电泳参数：浓缩胶60v、30min，分离胶120v、60min；
转膜（半干转）：恒流转，按照1mA/cm2（我同时跑的两块胶，胶总面积为16.6cm2，所以我转膜的电流为16mA），时间按照分子量定（1min/kD），选择了19min
封闭：5%脱脂牛奶封闭1小时
一抗：5%脱脂牛奶稀释（1:1000），摇床上摇1h，4度过夜
二抗：5%脱脂牛奶稀释（1:2000），摇床上摇1h
洗膜：PBST洗10min*3遍
显色：ECL显色

注：1.同样的胶和转膜方法，同时做的细胞色素C（14kD）就做出来了，不过信号也不是很强。
2.β-actin也全部做出来的，不知道为什么就是cleaved caspase-3出不来，

实验老是做不出来，也怕被怕被老板说，着急啊
~~~~
请问，我上面的步骤有问题吗？非常感谢~~~~

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新生6天SD大鼠脑海马组织为什么会表达cleaved caspase-3？有细胞凋亡吗？

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 17:27

新生6天SD大鼠脑海马组织为什么会表达cleaved caspase-3？有细胞凋亡吗？

===================================================================================

哦，你好
我做的对照组和实验组，对照组按理说应该不表达、但实验组的海马组织是用药了的、按理应该是要表达的。
如果不表达，可能为：
1.实验组的药物并没诱导海马组织凋亡
2.实验方法有问题：胶浓度、转膜等
3.抗体有问题

你觉得怎么解决啊？
一般怎么样找阳性对照呢？

作者: owanaka 时间: 2013-3-30 17:28

QUOTE:

原帖由 tuuu2 于 2013-3-30 17:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
新生6天SD大鼠脑海马组织为什么会表达cleaved caspase-3？有细胞凋亡吗？

===================================================================================

哦，你好
我做的对照组和实验组，对照组按理说应该不表 ...

检测细胞色素c？从线粒体释放到胞浆中么？
凋亡时细胞色素c的释放早于caspase-3的激活
你可以看看细胞形态有没有发生凋亡的变化，皱缩，什么的，
或者用hochest 33258看看从细胞核的形态上有没有诱导凋亡啊

作者: tuuu2 时间: 2013-3-30 17:28

QUOTE:

原帖由 owanaka 于 2013-3-30 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

检测细胞色素c？从线粒体释放到胞浆中么？
凋亡时细胞色素c的释放早于caspase-3的激活
你可以看看细胞形态有没有发生凋亡的变化，皱缩，什么的，
或者用hochest 33258看看从细胞核的形态上有没有诱导凋亡啊 ...

我是提取全蛋白做的，细胞色素C对照组和实验组都有，但是cleaved caspase-3就是没有。
不知道是不是没有发生凋亡。

作者: IAM007 时间: 2013-3-30 17:31

前辈好，我是在原代细胞和耐药细胞两株细胞中提取蛋白然后检测目的蛋白，但是曝光时原代细胞的条带却非常淡且细，耐药细胞的条带却异常深且粗（这个目的蛋白确实是在耐药细胞中高表达的）。是上样的问题么，上样两个都是35ug，一抗的浓度是1：37500（之前一次用的是1：25000但是背景很深所以稀释了一下）还是曝光时间短了？请老师指教啊~谢谢~

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:32

做的8%的分离胶，4%的浓缩胶，之前都没这样的问题，就这次，marker分离前面几条后面不出来了，急啊

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重新跑电泳吧

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:32

我看到文献中有人做过胎盘免疫组化，确实有foxo1啊，最近转膜后用丽春红染色，发现没有红色条带，是不是转膜转的不好啊？我的转膜是0.22的PVDF膜，250mA, 2小时，可是内参好好的呀！楼主，求解！！！

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样品先电泳后考马斯亮蓝检测

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:33

我点的marker是彩色的，能在膜上清楚的显示出来，所以就没有丽春红染过！我看过一些资料，一般彩色marker转膜成功的话，不需要再用丽春红染色的。

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marker与你的样品不是一回事
如果你以marker来判断的话
除非系统非常稳定

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:33

老师，我的蛋白分子量分别是22KD、29KD、72KD、92KD,请问我配多大浓度的胶？转膜能一起转吗？电流和时间怎么定？谢谢

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12% 分离胶
分开转
22K、29K，300mA 恒流，转膜 30min
72,92K，300mA恒流，转膜 80min
湿转

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:34

LZ你好，我打算做NF-kB方面的，因为要看p65的转位，是不是要分别抽核蛋白和胞浆蛋白，再行WB？请问能否推荐相应的KIt啊？
是不是用kit后，一次抽提胞核和胞浆蛋白都能得到啊？谢谢

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胞浆、胞核抽提试剂盒即可

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:35

一抗博奥森action内参1:1000，二抗中杉抗兔1:3000,发光液用普利莱的超敏。
加上之后荧光不强，曝光3min，洗出的效果。再降抗体就没带了，要是按照这个清晰程度，还不如DAB敏感。
这是DAB显的。

大家帮忙判断下原因，谢谢！同学在动物所用和我一样的东西，他说用的就是国产二抗1:10000，说荧光很强，曝光就几秒钟。

压片结果

这是另外一个样品的，条件同上，是原核表达的蛋白，
荧光也是不强

看着目的带还可以，但是降一抗要去除非特异性条带就不清楚了，同等条件DAB的结果就很特异，dab的结果下图，条件同上。
另外向大家咨询下，胶片大家都是怎么扫图的，用扫胶片的扫描仪可以吗，上面是我用扫蛋白胶的bio-rad扫的，不清晰，看胶片能比这个清晰点。

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先把系统摸索好吧

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:35

最近刚开始做WB，一直用Actin练手，前几天结果还可以，最近几次，背景特别黑，条带在灯光下能看清，我们用的是ECL+，X光片手动显影，请教一下是什么原因，我自己查了一下，有的说是显影液中浸泡的时间太长了，显影液中应该浸泡到X光片达到什么程度啊？谢谢！

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用红光看看啊

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:36

封闭可以不用奶粉吗谢谢老师

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可以

可以用BSA、Gelatin，Casein，无蛋白封闭液等等

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:36

各位麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为120蛋白的WB，步骤如下：
1.配制8%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑，待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟，300mA的60分钟也跑过（也能看到，可是我们实验室的转膜机有时恒流，大部分恒压，没办法），现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来！
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500（推荐1:200~1000），4°过夜，TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1：5000（推荐浓度，没找到说明书），室温60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光，（师姐们说，她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来）我现在看不到荧光的都是压30min左右，最后显影的时候还是看不到条带，今天不死心，把pvdf膜洗了洗，用丽春红染色能看到条带！（见图、、、）但是就是曝不出来！麻烦各位帮忙分析，指导下！谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方，我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢！

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丽春红染色看着还不错啊
检测什么蛋白？
抗体洗脱的配方有，但是不方便说

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:36

老师您好，我的二抗说明书上标明：do not freeze ，可是我不小心把二抗放进了-20度，过了一夜才拿出来，现在还能用吗？谢谢！

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可以用
没问题的

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:37

请问如果配胶时拔掉梳子之后胶孔里有胶（这个堵住孔的胶是和浓缩胶练成一块的不是碎的），然后上样时几乎每个孔都加不进样，以前从来没出现过，最近经常出现这种情况，同样的玻璃板和梳子配的胶胶孔的有可能被堵了，也可能不堵，请问是什么地方的原因？

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多加点APS与TEMED

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:37

请问有没有做细胞膜蛋白的？用什么做内参呀？文献上有用Na-K ATP酶做内参的？但是这样的抗体实在太贵了，不知道能有更普遍，便宜的细胞膜的内参没？我做GSK-3β磷酸化的能出来，但是去除一抗二抗后总的GSK-3β却怎么也做不出来；如果先做总的，再做磷酸化的就都能出，不知道是怎么回事！

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内参文献中有用GAPDH，beta-actin等
后面这个问题不懂

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:37

老师你好，我遇到了一个棘手的问题：之前做WB也做了不少次，电泳时间一般是70V 30min，100V 1h 溴酚蓝就跑到底了，但是这次用了新配制的母液，刚煮的蛋白做WB，70V跑了 40分钟还算正常，可是换到100V跑分离胶时，却非常慢。已经跑了2H了还有一截子没到底。是母液的PH问题,还是我煮蛋白时的上样缓冲液加少了呢（自己感觉煮蛋白的时候，加的上样缓冲液不到4:1的比例，也没当回事）。求指点，感谢！

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电泳槽中的缓冲液是否检查了？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:38

我是新手，打算做western blot，内参和marker是否根据测出的蛋白浓度而选择？可是我时间比较紧张，想一次把抗体和marker等试剂都买全了，这样就无法根据蛋白浓度选择内参和marker了，我做的是人TLR4，朋友有做鼠TLR4的，想问下，是否TLR4的分子量都差不多？能否根据他测得的蛋白浓度选择marker？如果不能，现在一头雾水，请高手指点一下，万分感谢！

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TLR4我们就在做
不同公司的分子量是不同的

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:38

你好，我最近做western，总是曝不出条带，实在是找不到原因，但是内参很好，很齐也很亮
真是愁死了，最近一直在做，总也不出来好点的条带，麻烦帮忙分析一下原因，谢谢您！

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目的用哪里的抗体？

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:39

WB必须要有内参吗？我希望观察某种处理下GAPDH的变化，一般可用什么做内参？似乎有的文献中也没有指明用了什么做内参。

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目前的情况下都是要求有内参的

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:39

请问是干转好还是湿转好

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各有优劣
我们用湿转

作者: NBA 时间: 2013-3-30 17:39

前辈好，我是在原代细胞和耐药细胞两株细胞中提取蛋白然后检测目的蛋白，但是曝光时原代细胞的条带却非常淡且细，耐药细胞的条带却异常深且粗（这个目的蛋白确实是在耐药细胞中高表达的）。是上样的问题么，上样两个都是35ug，一抗的浓度是1：37500（之前一次用的是1：25000但是背景很深所以稀释了一下）还是曝光时间短了？请老师指教啊~谢谢~

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内参呢？

作者: ffooll 时间: 2013-3-30 17:42

老师你好，
我的蛋白是72KD, 5%浓缩胶， 10%分离胶，100V 2h，转膜200mA 2h. 奶粉封闭1h，一抗是santa cruz 1:200 (推荐1:100-1000), 4度过夜，TBST 5min 3次，二抗 1:2000 （推荐1:2000-10000），37度1h，TBST 15min 3次， DAB显色. 结果actin有条带，目的蛋白没有条带，背景清晰。丽春红染膜，目的蛋白周围有条带（所以这个是目的蛋白的条带吗，还是显示的是什么）。求解答！

作者: dongdongqiang 时间: 2013-3-30 17:42

老师，您好。我想问一下。我的目的条带的分子量分别为37、54、140KDa，我应该用怎样百分之多少的分离胶和浓缩胶。能在一张膜上面跑吗？，电泳和电转条件建议该怎么设置？谢谢

作者: one 时间: 2013-3-30 17:43

请问各位大侠，
啥时候选择磷酸化的一抗？啥时候选择非磷酸化的一抗？
貌似磷酸化的一抗还要贵一些。
菜鸟膜拜！！
回答本帖的肯定交好运，发大财！

作者: tianmei001 时间: 2013-3-30 17:43

老师，我做western转膜时不小心切多了一大块PVDF膜，而且已经泡在甲醇里了，今天是用不了这个膜了。我想请教您——这个膜明天还能用吗？还是只能扔掉？谢谢！

作者: yychen 时间: 2013-3-30 17:43

电泳槽中的缓冲液是否检查了？

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电泳槽中的电泳液没问题啊，都是按以前的配方配的，两块板中间的电泳缓冲液都是满的，外槽的缓冲液也是足够的。TRIS hcl的PH定的不准会影响么？

作者: bamboo16 时间: 2013-3-30 17:44

各位麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为120蛋白的WB，步骤如下：
1.配制8%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.电泳时间先用80v的跑，待mark分开之后再用120v的跑个50分钟。
3.再100v转膜100分钟，300mA的60分钟也跑过（也能看到，可是我们实验室的转膜机有时恒流，大部分恒压，没办法），现在还是用100v的跑。最后都能看到mark转过来！
4.转膜后TBST洗5min×3次。
5.用5%的脱脂奶粉室温封闭60-70分钟。
6.一抗浓度1:500（推荐1:200~1000），4°过夜，TBST漂洗10min×3次。
7.二抗浓度1：5000（推荐浓度，没找到说明书），室温60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
最后的结果是pvdf膜上没有看到荧光，（师姐们说，她们有做过没有看到荧光多压会也能曝出来）我现在看不到荧光的都是压30min左右，最后显影的时候还是看不到条带，今天不死心，把pvdf膜洗了洗，用丽春红染色能看到条带！（见图、、、）但是就是曝不出来！麻烦各位帮忙分析，指导下！谢谢、、、
另外还有麻烦你知道如何去除已经结合的一抗的配方，我想把这张膜从新孵一抗看看、、、谢谢！

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当时没有看到荧光压片了也是可以曝出来的不过一般超过半小时就没有意义了检查下ECL 不同批次ECL效果不一样洗脱一抗重新孵育可以用膜再生液祝实验顺利

作者: kuaizige 时间: 2013-3-30 17:45

相关疾病：
急性胰腺炎
LZ有小鼠急性胰腺炎WB操作步骤吗？

作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:46

我内参还没有做出来，问题也不知道出在哪里，麻烦你给看看，
这是第一次做的beta-actin，问题很多，转膜可能存在气泡，没洗干净
跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk， tbst稀释，1h，室温；

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作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:46

一抗santa 1:200，TBST稀释，4℃过夜； TBST洗膜4*5min;
二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜4*5min。PIERCE supersignal显影5min。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15438

作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:47

这张是时隔两个月后做的，左边1-5孔样品和上面那张图一样，6孔和7孔样品新制备
（制备方法：
上样10ul, 样品处理：50mg组织，反复冻融两次，冰上研磨，加200ulRIPA裂解液（自己配置，1%triton，1mMEDTA, 1mMPMSF, 50mMTRIS-HCL,pH8.0, 0.1%SDS）冰上研磨，匀浆机匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，超生5min，冰上孵育15min，4℃，12000g，离心20min,取上清，分装，加Loading buffer 煮沸10min，-20℃保存。煮完貌似有点沉淀，但上样前，煮了3min，沉淀似乎又溶解了）

跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk，tbst稀释；

封闭4℃过夜（之前室温封闭1h）

一抗santa 1:200，TBST稀释，室温4h（第一次是4°过夜的）；

TBST洗膜3*10min（第一次是4*5min）;

二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；

TBST洗膜3*10min。PIERCE supersignal显影10min。
第6孔和第七孔明明是一样的样品，结果是6没有，7有一条浅浅的带，不知道什么原因；

作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:48

所以又将6和7的样品重新按上面步骤做了一遍，上样量都是一样的，抗体都是新配置的，转膜液，TBST，电极缓冲液都是之前配置的母液稀释的，要说变化的条件，应该是：转膜时滤纸换了新的，一抗4度过夜了，二抗是先在室温30min, 4° 3h,室温30min，以前孵育用12cm培养皿，这次为了节省抗体用了5cm培养皿，膜正好能放下.其他都没怎么变的；
结果ECL30min,还是没有结果，一片空白，上面那张10min就有结果了；费解啊。。。。。。下面我把转膜后丽春红染得图放上来，手机照的有一点模糊

图片附件: 66774857.snap.jpg (2013-3-30 17:48, 93.7 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:48

下面是转膜完的胶银染图片

图片附件: 44681337.snap.jpg (2013-3-30 17:48, 139.91 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15440

作者: lxh031 时间: 2013-3-30 17:49

20KD左右的蛋白似乎都转过去了。转膜完我发现滤纸上20kd的marker很深，应该转过了~~actin分子量43kd，应该不至于转过了吧；

曝光后的膜染了丽春红，挺干净的，我记得以前敷过抗体后，结合抗体的地方经染色后有一条很深得条带的~~这个没有，我猜测一抗结合的不好，不知道对不对，下图

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15441

作者: 987789 时间: 2013-3-30 17:49

老师，我想请教一下，最近我在做小鼠某个分泌蛋白在各组织中的表达水平，包括脂肪组织，脑，肌肉，肝脏等，BCA严格定量后，跑出来的β-actin很不齐，然后我根据灰度重新调整上样量，最后β-actin还是和之前一样很不齐，需要怎么优化这个实验？另外我想问一下骨骼肌样品需要选择哪个内参？谢谢！

作者: tie8 时间: 2013-3-30 17:49

内参呢？

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今天做的内参没有做出来不知道是不是因为二抗时间久了

作者: fei1226com 时间: 2013-3-30 17:50

你好，我的一抗是Abcam的（ab74734，兔多抗whole serum），二抗Santa，内参博奥森的Beta-actin。目的和内参都做不出，很是着急，不知哪些环节可能有问题。
组织：人心肌组织，目的蛋白是膜蛋白，分子量97KD，用碧云天P0013裂解液提取全蛋白，测浓度20-30mg/ml。
上样量：20微升
电泳仪：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra
电泳：5%浓缩胶60v、30min，8%分离胶120v、60min（胶用考马斯亮蓝染色后，目的分子量周围条带清晰分明）
转膜：冰浴恒流300mA 60min（0.22的PDVF膜,1.5mm厚胶转膜后染胶没有条带，染膜隐隐约约有，但不确定是不是）
封闭：碧云天封闭液室温封闭1小时
一抗：碧云天一抗稀释液稀释1:1000（说明书说1:300到1:4000），摇床上4度过夜
内参稀释1:1000（说明书1:1000到1:1500）
洗膜：TBST洗10min*3遍
二抗：碧云天二抗稀释液稀释1:2000，摇床上室温摇1h
洗膜：TBST洗10min*3遍
显色：ECL显色未见荧光，压片10分钟也什么都没有（稀释过的二抗直接加发光剂显影定影没有问题）

请问可能是哪些环节有问题？
1.组织在-80℃放了半年，有无影响？提取蛋白的方法有无问题，膜蛋白能用总蛋白做出来吗？
2.心肌组织是不是不能用Beta-actin作内参？
3.一抗-20℃放了4个月，期间一共就冻融过3次，会不会已经失效，如何验证？
4.转膜条件有无问题？转膜液配方：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，SDS 1g，加水至1000ml，有无问题？
5.Beta-actin和GAPDH 适合的转膜条件是多少？

作者: cwcwcww 时间: 2013-3-30 17:50

TLR4我们就在做
不同公司的分子量是不同的

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那能请问老师做的是TLR4哪个方面的实验吗？我做的是人癌细胞TLR4受体表达，也需要外源性TLR4，我找的R＆D公司的TLR4，但价格偏高，老师能推荐一下哪个公司的外源性TLR4价格稍便宜吗?

作者: windy+++ 时间: 2013-3-30 17:51

老师好，我又来提问啦，我做的是运动对骨骼肌信号通路的影响，运动刺激包括中等、大强度运动，最近我想把内参从beta-actin改成GAPDH，但我犹豫的一点是：GAPDH在肌肉中的表达量是否受运动影响？它是糖代谢中的一种关键酶，那我们的试验中，大鼠进行不同强度运动时，或多或少会影响到骨骼肌糖代谢，那么会影响到GAPDH的表达量吗？我担心，我的内参的不一致不是因为定量不均引起的，而会是运动强度引起的。

作者: is2011 时间: 2013-4-3 09:24

老师好，我又来提问啦，我做的是运动对骨骼肌信号通路的影响，运动刺激包括中等、大强度运动，最近我想把内参从beta-actin改成GAPDH，但我犹豫的一点是：GAPDH在肌肉中的表达量是否受运动影响？它是糖代谢中的一种关键酶，那我们的试验中，大鼠进行不同强度运动时，或多或少会影响到骨骼肌糖代谢，那么会影响到GAPDH的表达量吗？我担心，我的内参的不一致不是因为定量不均引起的，而会是运动强度引起的。

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缺氧条件下糖酵解途径活性增加，GAPDH表达量也增加。骨骼肌里面的白纤维是专门进行无氧呼吸的，本底GAPDH表达量是其他组织的数倍。如果是RT-PCR的话肯定是不行的，不清楚你的实验细节所以不好说对WB是否有影响。

[ 本帖最后由 is2011 于 2013-4-3 09:42 编辑 ]

作者: windy+++ 时间: 2013-4-3 09:43

老师你好，请问一抗可以重复使用么？可以的话最多使用几次？

作者: 831226 时间: 2013-4-3 09:43

老师麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为115的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的WB，一般是先显磷酸化蛋白，然后strip，重新封闭孵育抗体再显非磷酸化蛋白。步骤如下：
1.配制10%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.预电泳30V 10分钟，电泳时间先用60v的跑，待mark分开之后再用80v的跑个120分钟左右待溴酚蓝跑到底部。
3.再200mA转膜120分钟（恒流，冰浴）。最后一般mark也会转过来。
4.转膜后用5%的BSA四度封闭20小时左右（封闭时间略长应该没问题的吧）。
5.5%的BSA孵一抗1:1000（按cst推荐比例）过夜，TBST漂洗10min×3次
6.5%的BSA二抗浓度1：5000（按说明书），室温轻摇60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
9.然后strip6小时或过夜，重新用5％脱脂奶粉封闭，孵非磷酸化蛋白的一抗，再孵二抗显影。
0.45um的pvdf膜
最后的结果如图背景很深，做了几次都是这样，到底是什么原因呢，抗体都是只有一次的，都不敢回收用，全都买的cst的抗体

图片附件: 27740627.jpg (2013-4-3 09:44, 16.62 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15451

作者: 831226 时间: 2013-4-3 09:44

对了，第一张是actin的感觉还行，第二张是磷酸化蛋白的，第三张是非磷酸化蛋白，后面两张背景都很深

作者: kswl870 时间: 2013-4-3 09:45

内参文献中有用GAPDH，beta-actin等
后面这个问题不懂

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谢谢老师的回到。我了解的文献是细胞膜的蛋白是用的Na-K ATP酶的内参，细胞浆蛋白用的是GAPDH做内参。在我的理解是GAPDH，beta-actin是细胞浆蛋白的内参。关于GSK就是我们做的P-GSK3β能出，但是膜再生后的GSK3β却总是做不出来，抗体均为CST 兔单克隆的，不知道是抗体的缘故还是这个蛋白有什么特殊之处

作者: duoduo 时间: 2013-4-3 09:46

老师您好，我做WB转膜的时候经常碰到这种问题，Marker在跑电泳的时候都很正常，很直，但是转膜后却出现了问题，观察到的Maker转花掉了，然后上抗出现的就是这样的条带，我的转膜条件是300mA,1h

这个到底是什么问题呢！。我做WB失败的只有这一步了。。。。非常感谢

图片附件: 46217195.jpg (2013-4-3 09:46, 6.01 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15452

作者: qianqin1977 时间: 2013-4-3 09:46

封闭用过碧云天的封闭液，后来换成了5%脱脂奶粉（PBST配制），均为室温摇床1小时。另外抗体及稀释液均来自碧云天。（注，写出厂家，没别的意思，只是单纯的求助，请大家见谅，谢谢！）

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你和我的情况一样，我用的预染蛋白，抗体稀释液也都是是碧云天的，但是封闭液是5%脱脂奶粉（TBST配制），室温摇床1小时。做了差不多三周连内参都没做出条带来。你做的步骤几乎和我一模一样。后来，我师兄帮我分析了一下原因，可能是抗体没孵育好。你应该也是将抗体稀释到4~5mL后置于10mL离心管中，再将膜放入管子横放冰箱4度孵育。如果是这样的话，可能就是你的膜正面浮在抗体液上方，也就是没有完全浸入抗体中。我后来就注意到这点后去改善就做出来了。

作者: 子衿青青 时间: 2013-4-3 09:47

你和我的情况一样，我用的预染蛋白，抗体稀释液也都是是碧云天的，但是封闭液是5%脱脂奶粉（TBST配制），室温摇床1小时。做了差不多三周连内参都没做出条带来。你做的步骤几乎和我一模一样。后来，我师兄帮我分析了一下原因，可能是抗体没孵育好。你应该也是将抗体稀释到4~5mL后置于10mL离心管中，再将膜放入管子横放冰箱4度孵育。如果是这样的话，可能就是你的膜正面浮在抗体液上方，也就是没有完全浸入抗体中。我后来就注意到这点后去改善就做出来了。

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我孵育是用封口机做的袋子，大小跟膜差不多，膜倒是全部浸在液体里了。最近又做了几次内参，结果倒还可以。步骤大致同前吧，只是二抗孵育换到了室温下。现在捉摸，有可能是二抗孵育时用的恒温振荡器温度不准把二抗破坏了，亦或者是ECL A+B与膜结合时的量不够吧。呵呵只是目的蛋白还没出来，比较纠结。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:47

老师你好，
我的蛋白是72KD, 5%浓缩胶， 10%分离胶，100V 2h，转膜200mA 2h. 奶粉封闭1h，一抗是santa cruz 1:200 (推荐1:100-1000), 4度过夜，TBST 5min 3次，二抗 1:2000 （推荐1:2000-10000），37度1h，TBST 15min 3次， DAB显色. 结果actin有条带，目的蛋白没有条带，背景清晰。丽春红染膜，目的蛋白周围有条带（所以这个是目的蛋白的条带吗，还是显示的是什么）。求解答！

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1、内参条带如何？
2、目的蛋白的一抗孵育建议4度过夜

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:47

老师，您好。我想问一下。我的目的条带的分子量分别为37、54、140KDa，我应该用怎样百分之多少的分离胶和浓缩胶。能在一张膜上面跑吗？，电泳和电转条件建议该怎么设置？谢谢

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想在一块胶上出来
不是很理想
用10%的试试

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:48

请问各位大侠，
啥时候选择磷酸化的一抗？啥时候选择非磷酸化的一抗？
貌似磷酸化的一抗还要贵一些。
菜鸟膜拜！！
回答本帖的肯定交好运，发大财！

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看你的实验设计要求了
磷酸化抗体是研究蛋白活性形式的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:48

老师，我做western转膜时不小心切多了一大块PVDF膜，而且已经泡在甲醇里了，今天是用不了这个膜了。我想请教您——这个膜明天还能用吗？还是只能扔掉？谢谢！

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放在蒸馏水中即可

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:48

电泳槽中的电泳液没问题啊，都是按以前的配方配的，两块板中间的电泳缓冲液都是满的，外槽的缓冲液也是足够的。TRIS hcl的PH定的不准会影响么？

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会影响
是配胶的Tris-HCl？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:49

我内参还没有做出来，问题也不知道出在哪里，麻烦你给看看，

这是第一次做的beta-actin，问题很多，转膜可能存在气泡，没洗干净
跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk， tbst稀释，1h，室温；

一抗santa 1:200，TBST稀释，4℃过夜； TBST洗膜4*5min;
二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜4*5min。PIERCE supersignal显影5min。

这张是时隔两个月后做的，左边1-5孔样品和上面那张图一样，6孔和7孔样品新制备
（制备方法：
上样10ul, 样品处理：50mg组织，反复冻融两次，冰上研磨，加200ulRIPA裂解液（自己配置，1%triton，1mMEDTA, 1mMPMSF, 50mMTRIS-HCL,pH8.0, 0.1%SDS）冰上研磨，匀浆机匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，匀浆2次，10s/次，冰上孵育20min，超生5min，冰上孵育15min，4℃，12000g，离心20min,取上清，分装，加Loading buffer 煮沸10min，-20℃保存。煮完貌似有点沉淀，但上样前，煮了3min，沉淀似乎又溶解了）

跑胶，浓缩5%30min左右，分离12%60min左右转膜时间300mA,1h，封闭5%nofat milk，tbst稀释；

封闭4℃过夜（之前室温封闭1h）

一抗santa 1:200，TBST稀释，室温4h（第一次是4°过夜的）；

TBST洗膜3*10min（第一次是4*5min）;

二抗博士德，1:2000，TBST稀释，室温1h；

TBST洗膜3*10min。PIERCE supersignal显影10min。
第6孔和第七孔明明是一样的样品，结果是6没有，7有一条浅浅的带，不知道什么原因；

所以又将6和7的样品重新按上面步骤做了一遍，上样量都是一样的，抗体都是新配置的，转膜液，TBST，电极缓冲液都是之前配置的母液稀释的，要说变化的条件，应该是：转膜时滤纸换了新的，一抗4度过夜了，二抗是先在室温30min, 4° 3h,室温30min，以前孵育用12cm培养皿，这次为了节省抗体用了5cm培养皿，膜正好能放下.其他都没怎么变的；
结果ECL30min,还是没有结果，一片空白，上面那张10min就有结果了；费解啊。。。。。。下面我把转膜后丽春红染得图放上来，手机照的有一点模糊

下面是转膜完的胶银染图片

20KD左右的蛋白似乎都转过去了。转膜完我发现滤纸上20kd的marker很深，应该转过了~~actin分子量43kd，应该不至于转过了吧；

曝光后的膜染了丽春红，挺干净的，我记得以前敷过抗体后，结合抗体的地方经染色后有一条很深得条带的~~这个没有，我猜测一抗结合的不好，不知道对不对，下图

麻烦你帮我分析一下是什么原因，接下来怎么改进实验~~

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首要一点：就是把电泳跑好
1、样品中似乎看着有沉淀或者降解了
2、从marker来看，胶也不是很好

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:49

老师，我想请教一下，最近我在做小鼠某个分泌蛋白在各组织中的表达水平，包括脂肪组织，脑，肌肉，肝脏等，BCA严格定量后，跑出来的β-actin很不齐，然后我根据灰度重新调整上样量，最后β-actin还是和之前一样很不齐，需要怎么优化这个实验？另外我想问一下骨骼肌样品需要选择哪个内参？谢谢！

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1、不同组织中beta-actin能跑齐吗？答案是可以跑齐，但是难度灰常大。不同组织中表达是不同的哦
2、骨骼肌不能用actin，建议用tubulin或者GAPDH

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:53

那能请问老师做的是TLR4哪个方面的实验吗？我做的是人癌细胞TLR4受体表达，也需要外源性TLR4，我找的R＆D公司的TLR4，但价格偏高，老师能推荐一下哪个公司的外源性TLR4价格稍便宜吗?

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做的是WB检测组织中TLR4蛋白的表达

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:53

你好，我的一抗是Abcam的（ab74734，兔多抗whole serum），二抗Santa，内参博奥森的Beta-actin。目的和内参都做不出，很是着急，不知哪些环节可能有问题。
组织：人心肌组织，目的蛋白是膜蛋白，分子量97KD，用碧云天P0013裂解液提取全蛋白，测浓度20-30mg/ml。
上样量：20微升
电泳仪：Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra
电泳：5%浓缩胶60v、30min，8%分离胶120v、60min（胶用考马斯亮蓝染色后，目的分子量周围条带清晰分明）
转膜：冰浴恒流300mA 60min（0.22的PDVF膜,1.5mm厚胶转膜后染胶没有条带，染膜隐隐约约有，但不确定是不是）
封闭：碧云天封闭液室温封闭1小时
一抗：碧云天一抗稀释液稀释1:1000（说明书说1:300到1:4000），摇床上4度过夜
内参稀释1:1000（说明书1:1000到1:1500）
洗膜：TBST洗10min*3遍
二抗：碧云天二抗稀释液稀释1:2000，摇床上室温摇1h
洗膜：TBST洗10min*3遍
显色：ECL显色未见荧光，压片10分钟也什么都没有（稀释过的二抗直接加发光剂显影定影没有问题）

请问可能是哪些环节有问题？
1.组织在-80℃放了半年，有无影响？提取蛋白的方法有无问题，膜蛋白能用总蛋白做出来吗？
2.心肌组织是不是不能用Beta-actin作内参？
3.一抗-20℃放了4个月，期间一共就冻融过3次，会不会已经失效，如何验证？
4.转膜条件有无问题？转膜液配方：Tris 3g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，SDS 1g，加水至1000ml，有无问题？
5.Beta-actin和GAPDH 适合的转膜条件是多少？

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1、先检测内参吧，别折腾目的蛋白了。我看了下，这个蛋白做的人很少。
2、心肌组织我们不用actin做内参，我们用tubulin或者GAPDH
3、冻融3次，不会失效
4、转膜没问题，把SDS浓度调整到0.01%
5、湿转，恒流 300mA，30-50min

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:54

老师好，我又来提问啦，我做的是运动对骨骼肌信号通路的影响，运动刺激包括中等、大强度运动，最近我想把内参从beta-actin改成GAPDH，但我犹豫的一点是：GAPDH在肌肉中的表达量是否受运动影响？它是糖代谢中的一种关键酶，那我们的试验中，大鼠进行不同强度运动时，或多或少会影响到骨骼肌糖代谢，那么会影响到GAPDH的表达量吗？我担心，我的内参的不一致不是因为定量不均引起的，而会是运动强度引起的。

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可以用GAPDH或者beta-tubulin呢

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:55

老师你好，请问一抗可以重复使用么？可以的话最多使用几次？

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可以重复使用
但是具体重复几次不同抗体均不同，无任何参考

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:55

老师麻烦帮忙分析下原因！最近在做分子量为115的磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的WB，一般是先显磷酸化蛋白，然后strip，重新封闭孵育抗体再显非磷酸化蛋白。步骤如下：
1.配制10%的分离胶，再灌注5%的分离胶。
2.预电泳30V 10分钟，电泳时间先用60v的跑，待mark分开之后再用80v的跑个120分钟左右待溴酚蓝跑到底部。
3.再200mA转膜120分钟（恒流，冰浴）。最后一般mark也会转过来。
4.转膜后用5%的BSA四度封闭20小时左右（封闭时间略长应该没问题的吧）。
5.5%的BSA孵一抗1:1000（按cst推荐比例）过夜，TBST漂洗10min×3次
6.5%的BSA二抗浓度1：5000（按说明书），室温轻摇60-70分钟，TBST漂洗10min×3次。
8.ECL曝光。
9.然后strip6小时或过夜，重新用5％脱脂奶粉封闭，孵非磷酸化蛋白的一抗，再孵二抗显影。
0.45um的pvdf膜
最后的结果如图背景很深，做了几次都是这样，到底是什么原因呢，抗体都是只有一次的，都不敢回收用，全都买的cst的抗体

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二抗用1:10000

作者: NBA 时间: 2013-4-3 09:56

老师您好，我做WB转膜的时候经常碰到这种问题，Marker在跑电泳的时候都很正常，很直，但是转膜后却出现了问题，观察到的Maker转花掉了，然后上抗出现的就是这样的条带，我的转膜条件是300mA,1h
这个到底是什么问题呢！。我做WB失败的只有这一步了。。。。非常感谢

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有蛋白考马斯亮蓝染胶图吗？

作者: okhaha 时间: 2013-4-3 09:56

1、内参条带如何？
2、目的蛋白的一抗孵育建议4度过夜

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内参条带很清楚，背景清晰。目的蛋白是4度过夜的。然后我又做了一个目的蛋白，46KD（内参43KD），有条带，很清晰。但是之前的两个蛋白（一个71KD，一个68KD），都没有条带。

作者: any333 时间: 2013-4-3 09:57

有个COIP跑出来的条带问题想问一下楼主，下面上图
在2A拉的泳道中均出现了泳道黑的情况，这可能是什么原因呢？开始怀疑蛋白没煮散，所以加多LB和增加煮的时间，但是没什么效果

图片附件: 83953331.snap.jpg (2013-4-3 09:57, 39.18 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15453

作者: ha111 时间: 2013-4-3 09:57

QUOTE:

原帖由 any333 于 2013-4-3 09:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有个COIP跑出来的条带问题想问一下楼主，下面上图
在2A拉的泳道中均出现了泳道黑的情况，这可能是什么原因呢？开始怀疑蛋白没煮散，所以加多LB和增加煮的时间，但是没什么效果 ...

看上去好像是电泳时没浓缩好，浓缩胶是不是太短了？导致分离效果不好。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-4-3 09:58

楼主，您好，我现在做的蛋白里有184KDa，100KDa，52KDa，还有内参是GAPDH，分子量才35KDa，请问我是否可以在一板胶里跑开这些蛋白，什么浓度最合适，如果实在不行，分成两种浓度的胶跑，最后可以放在一起分析吗？比如184，和100的用低浓度跑，52和内参高浓度跑，最后的结果可以一起分析吗？

还有就是184这么大的蛋白，转膜多久可以转上呢？谢谢楼主

作者: ending 时间: 2013-4-3 09:59

请教老师：
我的目标蛋白越40kD，10%的胶。电泳80V跑30min，在100跑90min。转膜恒流80mA 90min，电泳液和转膜液都是新配的，用的是普利莱公司的10×浓缩液。甲醇现加。
膜用的是PVDF膜，转完膜后5%脱脂奶粉封闭1h。
加一抗。β-actin用的是碧云天的，抗体及抗体稀释液。1:1000稀释
其他的一抗用的是abcam公司的，用封闭液稀释。这次用的是1:200稀释的。
TBST用的是普利莱公司的10×封闭洗涤缓冲液。
一抗袋4℃ 静置过夜，第二天拿出来再室温摇床1h。
一抗孵育完后再TBST中洗三次，每次20min
二抗用的是碧云天的HRP山羊抗鼠。1:1000用TBST稀释。
室温摇床1h。
再用TBST洗三次，每次20min。

结果是这样的：目标蛋白大小24kd左右但是抗体说明书上说会在43kd左右观察到条带。

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作者: ending 时间: 2013-4-3 09:59

我有几个问题：
1.碧云天的一抗稀释液除了稀释β-actin之外，还能不能用来稀释其他的一抗？
2.为什么显影里β-actin的背景这么黑？
3.右侧目标蛋白出现了很多条带是怎么回事啊？？

作者: ending 时间: 2013-4-3 10:08

这是我之前做的β-actin

在暗室肉眼可以看到中间深色的条带，很亮，看不见背景发光，但是我X光片就在膜上碰一下，拿去显影就出现这样的结果了。是什么原因导致的呢？

图片附件: 52351433.jpg (2013-4-3 10:08, 28 KB) / 该附件被下载次数 1
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作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:09

内参条带很清楚，背景清晰。目的蛋白是4度过夜的。然后我又做了一个目的蛋白，46KD（内参43KD），有条带，很清晰。但是之前的两个蛋白（一个71KD，一个68KD），都没有条带。

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可能目的一抗不工作喽

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:09

楼主，您好，我现在做的蛋白里有184KDa，100KDa，52KDa，还有内参是GAPDH，分子量才35KDa，请问我是否可以在一板胶里跑开这些蛋白，什么浓度最合适，如果实在不行，分成两种浓度的胶跑，最后可以放在一起分析吗？比如184，和100的用低浓度跑，52和内参高浓度跑，最后的结果可以一起分析吗？

还有就是184这么大的蛋白，转膜多久可以转上呢？谢谢楼主

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1、转膜，184Kd， 300mA 恒流，湿转，恒流2h
2、分开跑吧，184KD的可以用beta-tubulin

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:10

请教老师：
我的目标蛋白越40kD，10%的胶。电泳80V跑30min，在100跑90min。转膜恒流80mA 90min，电泳液和转膜液都是新配的，用的是普利莱公司的10×浓缩液。甲醇现加。
膜用的是PVDF膜，转完膜后5%脱脂奶粉封闭1h。
加一抗。β-actin用的是碧云天的，抗体及抗体稀释液。1:1000稀释
其他的一抗用的是abcam公司的，用封闭液稀释。这次用的是1:200稀释的。
TBST用的是普利莱公司的10×封闭洗涤缓冲液。
一抗袋4℃ 静置过夜，第二天拿出来再室温摇床1h。
一抗孵育完后再TBST中洗三次，每次20min
二抗用的是碧云天的HRP山羊抗鼠。1:1000用TBST稀释。
室温摇床1h。
再用TBST洗三次，每次20min。

结果是这样的：目标蛋白大小24kd左右但是抗体说明书上说会在43kd左右观察到条带。

我有几个问题：
1.碧云天的一抗稀释液除了稀释β-actin之外，还能不能用来稀释其他的一抗？
2.为什么显影里β-actin的背景这么黑？
3.右侧目标蛋白出现了很多条带是怎么回事啊？？

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1、可以用来稀释其他一抗
2、调整一抗与二抗的浓度
3、调整一抗稀释度

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:10

这是我之前做的β-actin

在暗室肉眼可以看到中间深色的条带，很亮，看不见背景发光，但是我X光片就在膜上碰一下，拿去显影就出现这样的结果了。是什么原因导致的呢？

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1、洗膜次数增加几次
2、一抗、二抗稀释度加大

作者: am10 时间: 2013-4-3 10:15

老师你好，我有两个问题：
1：为什么我跑胶（15%的分离胶）小分子蛋白（17KD）几乎都是如下图而不是直的，只有偶尔是值的，但是大蛋白都是直的，marker也是这样的，30K及以上就是直的？是30%AB的问题么？
2：我15孔的胶，17K的蛋白。marker放最左边的孔，标为1孔道，之后依次为2-15孔。western检测偶尔会出现某张膜上一边或者两边的孔中没有信号，中间的反而有，即2、3、4以及13、14、15孔中没信号（都是loarding,理论上上样量都差不多）怀疑是转膜问题，但是marker放最最左边的1孔道转膜没问题。奇怪的是再次重复就好了。我知道这种问题的解决方法之一是重做，但是这样很不爽，偶尔出个问题却不能解决，且一个月中出现三次了，不定时出个问题很抓狂。

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作者: 04906 时间: 2013-4-3 10:18

老师，你好，我的问题是我做的WB的是大鼠组织，一抗是安博的兔多抗TGF-β1，40几Kd，货号C0340，网址 cuturl('http://www.anbobio.com/product_detail.asp?sort_id=54&shop_id=2185&page=1')
10%的分离胶，5%的浓缩胶。一抗浓度是 1:500，二抗浓度是1:5000，0.45μm PVDF膜（索莱宝的），转膜条件：80V，1h。5%脱脂牛奶封闭1h。一抗4℃孵育过夜（总量1ml保险膜上，倒扣）。二抗（5%脱脂牛奶稀释）封闭1h。

每个孔，蛋白上样量是一致的。
原先一抗浓度用1:2000也没做出来，后改为1:1000也不是很理想。
想请老师帮我分析下原因，需做哪些改进？？O(∩_∩)O谢谢~~~~~

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作者: lgm 时间: 2013-4-3 10:22

您好，我的目的蛋白是92kD，下图是我在不同时间跑的两个条带，请问最下面70左右的这一排是我的目的蛋白吗？

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作者: lgm 时间: 2013-4-3 10:22

这是扫出来的条带，但肉眼看NC 膜有点奇怪：

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作者: lgm 时间: 2013-4-3 10:23

我的内参actin跑出来是这样的：

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作者: lgm 时间: 2013-4-3 10:23

而同一实验室其他人（同样的actin一二抗）跑出来的actin是这样的：

请教一下：
那个是我的目的蛋白吗？感激不尽！！谢谢！！

图片附件: 46337405.snap.jpg (2013-4-3 10:23, 8.01 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: 987789 时间: 2013-4-3 10:24

我也来提问一个吧，溴酚蓝指示剂不是直线啊怎么，貌似中间跑的慢，两边跑的快，和拱形似的，另一块儿胶上和抛物线似的，为什么啊

作者: KGZ564 时间: 2013-4-3 10:24

我也来提问一个吧，溴酚蓝指示剂不是直线啊怎么，貌似中间跑的慢，两边跑的快，和拱形似的，另一块儿胶上和抛物线似的，为什么啊

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可以在加蛋白的左右两边，再加上等量或一半的上样缓冲液，应该可避免类似的情况。

作者: 66+77 时间: 2013-4-3 10:25

楼主你好！最近做ｈｅｓ１蛋白，分子量３０，用的转膜条件是２５０ｍＡ转８０分钟，用的０.４５ｕｍ的ＰＶＤＦ膜。做了几次ａｃｔｉｎ都出来的不错，但是目的蛋白总是没有条带。抗体用的ＥＰＩ的浓度１:１０００做的。做了多次，只有一次出来了很模糊的影子，希望楼主给点建议！谢谢！

作者: finger 时间: 2013-4-3 10:25

老师，有问题请教，刚开始学做western blot ,按照实验室之前的流程，做出来的结果是

上样20ul, 浓度3，上样量就是60ug左右，跑胶，2.5小时，80V恒压，转膜 300mA,1小时，封闭5% milk-tbst，2小时摇床一抗bcl-2,比例1:500，TBST稀释，4度过夜；TBST洗膜3*10min，二抗，1:1000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜3*10min。显影10min。结果只出现单个的亮条，不知道是怎么回事：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15463

作者: 831226 时间: 2013-4-3 10:27

您好！从咱们的论坛上得知您是Western-blot专家，看到您以前也回答过关于细胞mTOR和p-mTOR的问题，我现在的问题是“做了很长时间hela细胞mTOR和p-mTOR Western-blot就是不出带”，能想到的存在的各类问题和可能调整的实验条件都尝试过了，还是做不出来。我们猜测可能是hela细胞表达mTOR和p-mTOR过少或者不同癌细胞表达mTOR和p-mTOR量不同。这样，我们分别用Western-blot针对hela、NIH3T3、SIHA、SW116、CAPAV-1等细胞检测了mTOR和p-mTOR，从SDS-PAGE考马斯亮兰条带看这些细胞均在marker 250-300kD之间的蛋白条带很浅（有的重复试验还没有条带），但是Western-blot都没有杂出来。抗体是cst公司的。

需要问您的问题是：（1）有的文献说要用对数生长期的细胞，我们用的是接种后24h细胞（也用过48h细胞），还做过胰岛素刺激细胞及不同厂家的hela，都没有杂出来，请问和细胞周期及细胞状态有关吗？请问您是在什么时期收蛋白做Western-blot的，用什么裂解液？

（2）请问在考马斯亮兰条带很浅或几乎看不见的情况下能杂出清晰的Western-blot带吗？

作者: lxh031 时间: 2013-4-3 10:27

楼主，你好，非常感谢你的耐心回答，我最近做了两次预实验，有两个蛋白的抗体，做了之后出来的条带都不在抗体说明书里给的地方

上是30,40,50，抗体说明书给的observed的分子量是63KDa，predicted是115KDa，但是我做了两次都在30和40之间，我的抗体是santa的多抗，蛋白来自培养的大鼠神经元细胞，文献中说在大鼠里检测到的分子量是100到130之间（用的abcam的多抗），我的蛋白是前一天提了，第二天做的western，我想知道是蛋白降解了，还是抗体不好，非常感谢，我最近很迷惑

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作者: jujuba 时间: 2013-4-3 10:28

各位好，我是新手，正准备做western，不过测的是人血浆中的某种蛋白，分子量30KD左右，看过一些文章，但提到的标本都是组织或细胞，没有涉及血浆的，不知道要选什么内参合适，请教各位了，急需，谢谢!

作者: www.1 时间: 2013-4-3 10:28

有蛋白考马斯亮蓝染胶图吗？

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没有，不过我现在初步估计是转膜用的夹子的海绵用久了变薄导致三明治结构夹的不紧，蛋白从中间缝隙流动了，我现在让我这边的研究生三明治里多加了块海绵，他做出来的结果挺好的，我最近没做表达了，所以还没再尝试。

等过段时间我再来向老师请教O(∩_∩)O~谢谢

作者: fsdd817 时间: 2013-4-3 10:29

前辈你好：
我是新手，刚开始WB，我的蛋白分子量是156kd，能不能给推荐一下电泳的时间，电压。转膜的时间，电压（我们实验室半干转和湿转都可以做）；
我配的都是10x的电泳缓冲液和转膜缓冲液，有的师兄说可以直接使用然后回收，有的师兄说稀释为一倍的使用，自己有点迷茫了。请前辈指教

作者: bs4665 时间: 2013-4-3 10:29

楼主您好，我想请教能使背景干净或变淡一点的方法。下面是我做的western blot 条带。

一抗1：1000，4度，16小时，二抗 1：1000，室温，1小时。
曝光使用ECL+，因为我要看的条带是120kDa, 目的条带不清楚，所以在暗盒和developer中的时间长一点了。
能否给个建议改善哪一方面再试一试呢？

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作者: tangxin_80 时间: 2013-4-3 10:34

您好，我最近做western有个问题，就是我的marker跑出来的条带颜色很浅而且很宽，以前也是用这个marker也没有这个问题，应该是最近的胶的问题，但是不知道问题在哪里，求指导！谢谢！

作者: yychen 时间: 2013-4-3 10:34

配裂解液忘记调pH值了，提取完一测才5.9,会有很大影响吗？

作者: ha111 时间: 2013-4-3 10:34

有关Western blot的问题请提问
我会及时给大家解答

希望大家提问的时候尽量把问题说的详细一些

需要联系方式请站内短信息联系

求大神帮我分析原因啊！

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上样完了跑电泳大概八分钟的样子就漏样了，开始怀疑浓缩胶没凝好，后来加长浓缩胶凝缩时间，还是不行；然后怀疑是制胶问题，然后换人制胶（上样、把梳子还是我），跑起来还是漏。到底是什么原因呢？

作者: shenkunjie 时间: 2013-4-3 10:35

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？

作者: redbutterfly 时间: 2013-4-3 10:35

二抗用1:10000

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您好，我用了1:10000的稀释比还是黑漆漆的一片，请问是什么原因啊

作者: wmp1234 时间: 2013-4-3 10:36

看上去好像是电泳时没浓缩好，浓缩胶是不是太短了？导致分离效果不好。

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浓缩胶不短啊，而且其他泳道也没出现这种情况

作者: 8s5g 时间: 2013-4-3 10:37

我想请教一下关于样品缓冲液的问题，我们实验室一直用的是fermentas的5X protein loading buffer 加入5%比例的巯基乙醇，然后在100度加热5分钟，结果时好时坏，我觉得这步应该很关键，想问您是怎么处理样本的？还有其他更好的样品处理液吗？谢谢

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:37

老师你好，我有两个问题：
1：为什么我跑胶（15%的分离胶）小分子蛋白（17KD）几乎都是如下图而不是直的，只有偶尔是值的，但是大蛋白都是直的，marker也是这样的，30K及以上就是直的？是30%AB的问题么？
2：我15孔的胶，17K的蛋白。marker放最左边的孔，标为1孔道，之后依次为2-15孔。western检测偶尔会出现某张膜上一边或者两边的孔中没有信号，中间的反而有，即2、3、4以及13、14、15孔中没信号（都是loarding,理论上上样量都差不多）怀疑是转膜问题，但是marker放最最左边的1孔道转膜没问题。奇怪的是再次重复就好了。我知道这种问题的解决方法之一是重做，但是这样很不爽，偶尔出个问题却不能解决，且一个月中出现三次了，不定时出个问题很抓狂。

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系统不稳定
小分子量条带是不太直的
想直的话用梯度胶系统

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:38

老师，你好，我的问题是我做的WB的是大鼠组织，一抗是安博的兔多抗TGF-β1，40几Kd，货号C0340，网址 cuturl('http://www.anbobio.com/product_detail.asp?sort_id=54&shop_id=2185&page=1')
10%的分离胶，5%的浓缩胶。一抗浓度是 1:500，二抗浓度是1:5000，0.45μm PVDF膜（索莱宝的），转膜条件：80V，1h。5%脱脂牛奶封闭1h。一抗4℃孵育过夜（总量1ml保险膜上，倒扣）。二抗（5%脱脂牛奶稀释）封闭1h。

每个孔，蛋白上样量是一致的。
原先一抗浓度用1:2000也没做出来，后改为1:1000也不是很理想。
想请老师帮我分析下原因，需做哪些改进？？O(∩_∩)O谢谢~~~~~

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呵呵
这个抗体我用过
效果一般
调整一下二抗稀释度试试吧

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:39

您好，我的目的蛋白是92kD，下图是我在不同时间跑的两个条带，请问最下面70左右的这一排是我的目的蛋白吗？

这是扫出来的条带，但肉眼看NC 膜有点奇怪：

我的内参actin跑出来是这样的：

而同一实验室其他人（同样的actin一二抗）跑出来的actin是这样的：

请教一下：
那个是我的目的蛋白吗？感激不尽！！谢谢！！

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70K与100K之间的可能是你的目的条带哦
用的marker是？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:39

楼主你好！最近做ｈｅｓ１蛋白，分子量３０，用的转膜条件是２５０ｍＡ转８０分钟，用的０.４５ｕｍ的ＰＶＤＦ膜。做了几次ａｃｔｉｎ都出来的不错，但是目的蛋白总是没有条带。抗体用的ＥＰＩ的浓度１:１０００做的。做了多次，只有一次出来了很模糊的影子，希望楼主给点建议！谢谢！

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有图片吗？
目的蛋白的一抗试了几个稀释度？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:40

老师，有问题请教，刚开始学做western blot ,按照实验室之前的流程，做出来的结果是：

上样20ul, 浓度3，上样量就是60ug左右，跑胶，2.5小时，80V恒压，转膜 300mA,1小时，封闭5% milk-tbst，2小时摇床一抗bcl-2,比例1:500，TBST稀释，4度过夜；TBST洗膜3*10min，二抗，1:1000，TBST稀释，室温1h；TBST洗膜3*10min。显影10min。结果只出现单个的亮条，不知道是怎么回事

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上样量太大了

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:40

您好！从咱们的论坛上得知您是Western-blot专家，看到您以前也回答过关于细胞mTOR和p-mTOR的问题，我现在的问题是“做了很长时间hela细胞mTOR和p-mTOR Western-blot就是不出带”，能想到的存在的各类问题和可能调整的实验条件都尝试过了，还是做不出来。我们猜测可能是hela细胞表达mTOR和p-mTOR过少或者不同癌细胞表达mTOR和p-mTOR量不同。这样，我们分别用Western-blot针对hela、NIH3T3、SIHA、SW116、CAPAV-1等细胞检测了mTOR和p-mTOR，从SDS-PAGE考马斯亮兰条带看这些细胞均在marker 250-300kD之间的蛋白条带很浅（有的重复试验还没有条带），但是Western-blot都没有杂出来。抗体是cst公司的。

需要问您的问题是：（1）有的文献说要用对数生长期的细胞，我们用的是接种后24h细胞（也用过48h细胞），还做过胰岛素刺激细胞及不同厂家的hela，都没有杂出来，请问和细胞周期及细胞状态有关吗？请问您是在什么时期收蛋白做Western-blot的，用什么裂解液？

（2）请问在考马斯亮兰条带很浅或几乎看不见的情况下能杂出清晰的Western-blot带吗？

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1、mTor与p-mTor经常做，用的是CST的抗体，这两个蛋白很好检测哦，表达量很大
2、用多大浓度的分离胶跑完电泳后进行的考染？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:41

楼主，你好，非常感谢你的耐心回答，我最近做了两次预实验，有两个蛋白的抗体，做了之后出来的条带都不在抗体说明书里给的地方，
比如这个，我的marker最下面的条带是25，然后往上是30,40,50，抗体说明书给的observed的分子量是63KDa，predicted是115KDa，但是我做了两次都在30和40之间，我的抗体是santa的多抗，蛋白来自培养的大鼠神经元细胞，文献中说在大鼠里检测到的分子量是100到130之间（用的abcam的多抗），我的蛋白是前一天提了，第二天做的western，我想知道是蛋白降解了，还是抗体不好，非常感谢，我最近很迷惑

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试过阳性样品吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:41

各位好，我是新手，正准备做western，不过测的是人血浆中的某种蛋白，分子量30KD左右，看过一些文章，但提到的标本都是组织或细胞，没有涉及血浆的，不知道要选什么内参合适，请教各位了，急需，谢谢!

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我自己没有做过血浆的内参
但是我知道有人用过beta-actin

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:42

前辈你好：
我是新手，刚开始WB，我的蛋白分子量是156kd，能不能给推荐一下电泳的时间，电压。转膜的时间，电压（我们实验室半干转和湿转都可以做）；
我配的都是10x的电泳缓冲液和转膜缓冲液，有的师兄说可以直接使用然后回收，有的师兄说稀释为一倍的使用，自己有点迷茫了。请前辈指教

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1、电泳完成后先考染胶
2、湿转，300mA 恒流，2h30min

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:43

楼主您好，我想请教能使背景干净或变淡一点的方法。下面是我做的western blot 条带。

一抗1：1000，4度，16小时，二抗 1：1000，室温，1小时。
曝光使用ECL+，因为我要看的条带是120kDa, 目的条带不清楚，所以在暗盒和developer中的时间长一点了。
能否给个建议改善哪一方面再试一试呢？

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把二抗浓度降下来，稀释度试试1:10000

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:43

配裂解液忘记调pH值了，提取完一测才5.9,会有很大影响吗？

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肯定有很大影响的撒

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:43

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？

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用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:44

您好，我用了1:10000的稀释比还是黑漆漆的一片，请问是什么原因啊

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继续稀释二抗

作者: utt0989 时间: 2013-4-3 10:44

老师您好！
最近做wb遇到了很严重的瓶颈，原来能出来的所有条带，现在一个都出不来，β-actin 的信号也很弱，希望您能够给一些建议：
需要蛋白是40-190 kD 的蛋白，跑胶和电泳时按照前面跟您讨论的结果做的，湿转后，用甲醇活化，可以在目标蛋白区域看到很明显的条带，可是在敷完抗体曝光以后，β-actin 的信号很弱，继续曝光后，原本有的信号也没有了，而目标蛋白区域直接未出现条带。
请问老师，这问题可能会出现在哪里？

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用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

用的是自己配置的ECL发光液，用胶片曝光，也能爆出来条带，就连β-actin都很细，或者就是出不全，用的是abcam的抗体，1:5000的二抗，今天试了个1:2000，出来的条带还是一样的。

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作者: remenb 时间: 2013-4-3 10:45

楼主你好，最近才开始ECL显色，我做的是p-ERK和p-p65，一抗是1:1000，二抗是1:5000，加入发光液后只有marker的位置有荧光，其他位置都没有，延长压片时间也没有条带，做actin有条带，条带的荧光很清晰，已经遇到两次这种问题了，回忆操作过程也找不出原因是什么，很上火

作者: dog002 时间: 2013-4-3 10:46

老师你好，我想问一下左边的三张图发这样是压片时间过长还是抗体浓度过高？？

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作者: applebook=213 时间: 2013-4-3 10:46

楼主用过cell-based ELISA吗？据说做出来的结果跟western一样？

作者: bling 时间: 2013-4-3 10:47

求助：主要问题是为什么泳道里没有条带，其余的部位这么黑！条件如下：电泳：100v，1.5小时转膜：300mA, 1小时封闭：5%脱脂奶粉 1小时一抗：1:500 封闭过夜4度二抗：1:2k，室温40分钟ecl曝光后就这样了，求高人指点！我怀疑：是否是我的蛋白没有转上，转过膜之后，槽里的电泳液都很热了，膜和胶都很热了，会有影响么？

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作者: c86v 时间: 2013-4-3 10:47

呵呵
这个抗体我用过
效果一般
调整一下二抗稀释度试试吧

==============================================================================================================

调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参…… 那TGF-β1单抗，版主推荐的是哪家公司的？跟大鼠组织反应的。
哈哈还有个问题，就是细胞蛋白大概每孔需上多少的量？蛋白总量和体积？我用的是1mm的玻璃板，1mm的梳子，我上了30μg，用抗体孵育好，发现没测出来。想问下版主，细胞蛋白，怎么上最少的蛋白量测出我想要的结果？改用0.75mm的梳子？？上多少μg或μl？？同样条件下，组织50μg能做出来。

作者: c86v 时间: 2013-4-3 10:48

老师您好，想请教您两个问题
1. 提细胞总蛋白时培养基未洗干净就加了裂解液，会对蛋白提取造成什么影响吗？（这次细胞状态不太好，漂了不少，没敢使劲洗）
2. 二抗用久了为什么会出絮状沉淀？师兄说是反复4°C室温的结果，老师怎么看。这样的二抗还能用吗？

作者: yychen 时间: 2013-4-3 10:48

老师能不能回答我非还原-变性的蛋白如何处理？不加DTT 需要加热吗？DTT的终浓度是100mM还是50mM？

作者: yychen 时间: 2013-4-3 10:49

请看《蛋白质技术手册》汪家政，范明编的

非还原：不能有DTT及beta-巯基乙醇等还原剂

可以有SDS
不加热

marshall80 wrote:
版主您好，请教以下几个问题：
1、有的一抗会标明样品必需是non-reducing and non-denaturing，这是什么意思？
2、能具体给出样品制备或准备的操作注意事项吗？与需要变性的样品准备有什么不同之处？
谢谢！

1、non-reducing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，可以含有SDS，需要加热变性
non-denaturing：指loading中无DTT及β-巯基乙醇等还原剂，不含有SDS，不能加热变性
2、这个所来就话长了
没有特殊说明的情况下：样品都是还原，变性的

能加热变性

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我想问非还原到底可以加热吗？？

作者: tuuu2 时间: 2013-4-3 10:49

如图，本想比较一下GAPDH内参好调整上样量，但一个出来了，另一个没出来。最上面是白蛋白67kDa。两种细胞都是rat来源。是不是剪膜时把内参剪掉了，但我感觉可能性不大。请问还有其他原因吗？

[ 本帖最后由 tuuu2 于 2013-4-3 10:51 编辑 ]

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作者: windy+++ 时间: 2013-4-3 10:51

老师您好，
我要做的是大鼠海马组织的WB，测定的是磷酸化Tau蛋白，请问老师我的内参，maker应该怎么选择呢？
谢谢！

作者: one 时间: 2013-4-3 10:52

试过阳性样品吗？

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阳性样品是指高表达这个蛋白的样品吗？需要买还是自己提取的就行？

作者: is2011 时间: 2013-4-3 10:52

您好，我最近做Western的时候碰到了一个奇怪的问题，去暗房曝片子的时候发现我的目的条带要不就是前三个泳道特别浅，要不就是后三个泳道特别浅（一共6个泳道），但actin是正常的，而且丽春红染色后条带也是正常的，actin的膜和目的条带的膜都是同步操作的，只是用的一抗二抗不一样，能解决下我的疑惑吗？谢谢啦

作者: ROSE李 时间: 2013-4-3 10:53

可以用GAPDH或者beta-tubulin呢

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谢谢老师！还有一个问题：
我们每次在做wb前都要配制样品，我们的样品中除了要加5*上缓外，还要加水和DTT，我不知道DTT的作用是什么？它会对我们做的蛋白有影响吗？DTT和5*上缓的比例是1:2。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:54

用的是ECL孵育后，胶片曝光吗？
如果是，ECL厂家是哪里的？

用的是自己配置的ECL发光液，用胶片曝光，也能爆出来条带，就连β-actin都很细，或者就是出不全，用的是abcam的抗体，1:5000的二抗，今天试了个1:2000，出来的条带还是一样的。

==================

这个胶跑的有问题哦
有考染的图片吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:54

楼主你好，最近才开始ECL显色，我做的是p-ERK和p-p65，一抗是1:1000，二抗是1:5000，加入发光液后只有marker的位置有荧光，其他位置都没有，延长压片时间也没有条带，做actin有条带，条带的荧光很清晰，已经遇到两次这种问题了，回忆操作过程也找不出原因是什么，很上火

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p-erk是很好做的
p-p65，目前我没碰到好用的抗体

marker位置有荧光是正常的
1、有些marker本身就是可以发光的
2、有些marker中的蛋白与抗体有反应

一抗用的是哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:55

老师你好，我想问一下左边的三张图发这样是压片时间过长还是抗体浓度过高？？

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稀释一抗、二抗

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:55

求助：主要问题是为什么泳道里没有条带，其余的部位这么黑！条件如下：电泳：100v，1.5小时转膜：300mA, 1小时封闭：5%脱脂奶粉 1小时一抗：1:500 封闭过夜4度二抗：1:2k，室温40分钟ecl曝光后就这样了，求高人指点！我怀疑：是否是我的蛋白没有转上，转过膜之后，槽里的电泳液都很热了，膜和胶都很热了，会有影响么？

=============================

首先排除二抗浓度太高的问题
稀释二抗

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:57

调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参…… 那TGF-β1单抗，版主推荐的是哪家公司的？跟大鼠组织反应的。
哈哈还有个问题，就是细胞蛋白大概每孔需上多少的量？蛋白总量和体积？我用的是1mm的玻璃板，1mm的梳子，我上了30μg，用抗体孵育好，发现没测出来。想问下版主，细胞蛋白，怎么上最少的蛋白量测出我想要的结果？改用0.75mm的梳子？？上多少μg或μl？？同样条件下，组织50μg能做出来。

======================

细胞我们一般上样量10-20ug

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:58

老师您好，想请教您两个问题
1. 提细胞总蛋白时培养基未洗干净就加了裂解液，会对蛋白提取造成什么影响吗？（这次细胞状态不太好，漂了不少，没敢使劲洗）
2. 二抗用久了为什么会出絮状沉淀？师兄说是反复4°C室温的结果，老师怎么看。这样的二抗还能用吗？

==============================

1、会对蛋白定量产生很大的影响
2、二抗保存温度应该是多少？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 10:59

老师能不能回答我非还原-变性的蛋白如何处理？不加DTT 需要加热吗？DTT的终浓度是100mM还是50mM？

=======================

非还原-变性
不加DTT或者beta-巯基乙醇
但是要加热变性
终浓度50mM或者62.5mM

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:00

如图，本想比较一下GAPDH内参好调整上样量，但一个出来了，另一个没出来。最上面是白蛋白67kDa。两种细胞都是rat来源。是不是剪膜时把内参剪掉了，但我感觉可能性不大。请问还有其他原因吗？

=========================

这个应该不是检测技术的问题
剪掉的可能性大

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:00

老师您好，
我要做的是大鼠海马组织的WB，测定的是磷酸化Tau蛋白，请问老师我的内参，maker应该怎么选择呢？
谢谢！

==================================================

一般按照分子量来选择marker
看看fermentas有没有适合的marker
内参可以选择beta-actin、GAPDH、beta-tubulin，三种常用的
还可以参考文献，选择适合你这个模型的内参

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:01

阳性样品是指高表达这个蛋白的样品吗？需要买还是自己提取的就行？

========================================

一般指在某一细胞或者组织中特异性高表达的样品

也特制：转染后过表达的，或者重组表达的样品

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:02

您好，我最近做Western的时候碰到了一个奇怪的问题，去暗房曝片子的时候发现我的目的条带要不就是前三个泳道特别浅，要不就是后三个泳道特别浅（一共6个泳道），但actin是正常的，而且丽春红染色后条带也是正常的，actin的膜和目的条带的膜都是同步操作的，只是用的一抗二抗不一样，能解决下我的疑惑吗？谢谢啦

=======================================

1、一抗是否回收使用了？
2、目的一抗孵育体系多大？如果太小，加大一倍

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:02

谢谢老师！还有一个问题：
我们每次在做wb前都要配制样品，我们的样品中除了要加5*上缓外，还要加水和DTT，我不知道DTT的作用是什么？它会对我们做的蛋白有影响吗？DTT和5*上缓的比例是1:2。

====================

为什么要加水？？？
这个配方很奇怪哦

作者: tangxin_80 时间: 2013-4-3 11:03

一般指在某一细胞或者组织中特异性高表达的样品

也特制：转染后过表达的，或者重组表达的样品

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哦，谢谢，那我还是买吧，请问老师您了解CDKL5这个蛋白的抗体吗？我做的抗大鼠的，但是查来查去就santa一家有，但是抗体效价很低，1:200，好多人反应说santa的抗体容易出问题，后来我在文献上看到有用abcam抗大鼠的多抗，但是我在官网上没查到，想问一下，有可能是停产了吗？不好意思，可能我的问题有点超出您的范围了，但是实在是不懂，呵呵，谢谢老师

作者: yjf1026 时间: 2013-4-3 11:03

如果细胞中做不出来
可能细胞中没有表达吧
我用的是CST公司的

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1、安博的TGFβ1抗体效果一般，还是不好？调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参……
2、哈哈，版主您用的是CST公司的哪款，可否提供下货号丫？3709 或者 3711?

作者: langlang 时间: 2013-4-3 11:04

p-erk是很好做的
p-p65，目前我没碰到好用的抗体

marker位置有荧光是正常的
1、有些marker本身就是可以发光的
2、有些marker中的蛋白与抗体有反应

一抗用的是哪里的？

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一抗是Cell Signaling，抗体是师姐留下来的，可能有一年的时间了，这两天1:500做也没有看到条带

作者: dog002 时间: 2013-4-3 11:04

老师，您好。最近在做western时遇到如下问题（急啊）：
1.ECL显影时发现膜部分发白，是何原因？
2.HSL-p（CST）推荐浓度是1:2000，我们用的是1:1000，二抗1:2000，但是单克隆抗体出现了明显的非特异性条带，应该如何调整抗体浓度？
谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15470

作者: okhaha 时间: 2013-4-3 11:05

最近做western遇到了问题，跨膜蛋白，抗体说明书说目标蛋白在23KD，但我的结果条带在43KD左右。怀疑是膜蛋白聚集，采用70度10分钟的方式加热样品。可是条带还是下不来。请教是否哪里出现了问题呢？先谢谢了！

作者: any333 时间: 2013-4-3 11:05

可能的问题在你做三明治的时候把胶压的太扁了
在300mA的电流下转缓是很热的
容易把胶压扁
我也出现过你说的这种条带情况
还要检查一下浓缩胶是否凝好
good luck

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老师您好
想问下这个压扁了是什么意思？
我是湿转法，目的条带180KD。200mA三个小时
每次转完之后胶都被拉长了（切过的长条，我是竖着放的，因为有两块胶，横向貌似没变化）
但是转膜后maker都是弥散的
是不是应该每次只转一块胶，横着把他放中间比较好？
谢谢老师

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:06

1、安博的TGFβ1抗体效果一般，还是不好？调整了二抗浓度之后，您有做出趋势么？我做了几次，五组均一样的粗细，感觉像在做内参……
2、哈哈，版主您用的是CST公司的哪款，可否提供下货号丫？3709 或者 3711?

===================

是3711
还有abcam的也用过
也还可以

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:06

老师，您好。最近在做western时遇到如下问题（急啊）：
1.ECL显影时发现膜部分发白，是何原因？
2.HSL-p（CST）推荐浓度是1:2000，我们用的是1:1000，二抗1:2000，但是单克隆抗体出现了明显的非特异性条带，应该如何调整抗体浓度？
谢谢！

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这个我感觉胶没有跑好呢

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:07

最近做western遇到了问题，跨膜蛋白，抗体说明书说目标蛋白在23KD，但我的结果条带在43KD左右。怀疑是膜蛋白聚集，采用70度10分钟的方式加热样品。可是条带还是下不来。请教是否哪里出现了问题呢？先谢谢了！

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加还原剂了？
现用现加的还是？

作者: mimili_901 时间: 2013-4-3 11:07

加还原剂了？
现用现加的还是？

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还原剂是用的1M的DTT，2*的loading buffer每毫升含有100微升1M的DTT，是否量不够呢？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-3 11:07

请问我做脑组织的，使用罗氏公司（Roche）蛋白酶抑制剂。就是那种片剂。我把它配成1*之后是按什么比例加入到裂解液中呢？我需要检测磷酸化和总蛋白，需要加磷酸化的蛋白酶抑制剂吗？谢谢前辈。

作者: 3648755 时间: 2013-4-3 11:08

老师，您好！这个是跑完胶后，直接烤染的胶，最大的maker是250kD，需要的目标蛋白为170kD，就图片中看到的胶，以及最终曝光后发现目标蛋白区域集中在250kD 以上，这是什么原因呢？蛋白没有跑下来，是因为胶，或者是因为蛋白的空间结构并没有被破坏，还保持二聚体结构？如果是后者，需要怎么调节蛋白变形这个过程？（我们现在用的是样品：Buffer=4:1，在水浴锅中95℃ 变性10min ）

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作者: PINK 时间: 2013-4-3 11:08

老师，您好，

问个很弱的问题，WB为什么要用脱脂的奶粉啊？？

作者: windy+++ 时间: 2013-4-3 11:09

向前辈请教个western blot的问题，
多次试验，总是目的蛋白能出来，且有较高的亮度，但内参beta-actin总是无法显影出来(HRP-ECL)，麻烦问下造成这个的原因是呀，谢谢了。
内参beta-actin曝光的时间为15min，

作者: qiangren789 时间: 2013-4-3 11:09

前辈，我想问我的蛋白分子量是22kd和29kd的，我配的是12％的胶，转膜条件是：0.22um的膜，100V，60min，发现背景特别高，黑乎乎的一大片，查了一下说0.22的膜就是会导致背景很高。于是我改用了：0.45的膜，100V，40min，但是曝不出条带来，不知道是不是转膜时间过短。想问一下：如果选用0.45的膜的话，转膜条件应该是什么呢？谢谢!

作者: vera+ 时间: 2013-4-3 11:09

前辈您好：现在刚开始做WB，就碰到一个530kDa的大蛋白，一点经验木有，求指导和经验，越详细越好，化胶、转膜、电压、内参、marker都求教，不甚感激，急！！！

作者: 49888 时间: 2013-4-3 11:11

目的蛋白条带
请问老师，我的目的蛋白用的是单抗，1:1000，abcam公司产品，各孔上样量30ug左右，电泳 100v，150v 转膜 250mA 半小时，一抗4°C冰箱过夜，5%脱脂奶粉封闭2小时，二抗常温3小时。为什么显出来会有这么多条带？哪一步出现的问题呢？

作者: 49888 时间: 2013-4-3 11:12

目的蛋白条带：

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作者: 49888 时间: 2013-4-3 11:12

内参条带：

请问老师，我的目的蛋白用的是单抗，1:1000，abcam公司产品，各孔上样量30ug左右，电泳 100v，150v 转膜 250mA 半小时，一抗4°C冰箱过夜，5%脱脂奶粉封闭2小时，二抗常温3小时。为什么显出来会有这么多条带？哪一步出现的问题呢？

图片附件: 63646518.jpg (2013-4-3 11:12, 5.63 KB) / 该附件被下载次数 0
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作者: 00无名指00 时间: 2013-4-3 11:13

,我现在做人β防御素2（hBD2）的WB检测，蛋白标本来自肺上皮细胞总蛋白提取液，我的分离胶用15%的胶，上样量为80ug/孔，电泳条件为70v（浓缩胶）、120v（分离胶），电泳后marker在胶上清晰可见，最小分子量的一条marker为10kd也可以清楚看到，我的目的蛋白hBD2分子量为7kd（abcam一抗，说明书上提示该产品分子量为7kd），故电泳后切胶时，在10kd以下切1cm宽的胶进行转膜；“三明治”夹的搭建应该没有问题；我的转膜条件为：湿转，300mA，50min，用的膜是0.22um PVDF膜（millipore）；5%脱脂牛奶室温封闭1.5h；abcam一抗1：750 4°C孵育过夜，HPR标记二抗（进口分装）1:2000，室温孵育2h；洗膜均为TBST（含0.1%吐温）10min×3次；最后ECL发光（pierce公司产品），内参选用GAPDH，内参条带非浓，很容易曝光，但是目的蛋白至今未能做出来（已经近1个月了），心情极度沮丧，不知“fangweibin119”老师能否指点迷津，哪些步骤需要改进？期待您的回复，非常感谢！
另外说明一下，我提取的总蛋白，做其他指标（分子量为100kd，转膜条件为300mA，1.5h，用的膜为0.45um）是有条带的，可是是做hBD2没有任何条带让我看到！

作者: 2541 时间: 2013-4-3 11:13

老师你好
1.我做的是分子大小为14的膜蛋白用的是pierce的膜蛋白提取试剂盒分离胶为12% 0.22um的NC膜条件大致是
100V浓缩胶 30分钟 150V 30分钟溴酚蓝离胶底部还有不到一厘米的样子
转膜250毫安恒流25分钟
5%脱脂奶粉封闭2小时
一抗1:500 RT 2小时洗膜5min*6 稀释液是1%的BSA
二抗1:20000 RT 1.5小时洗膜5min*6
曝光就这样了 6条泳道只有一个特异条带还不知道是不是且荧光加在膜上后整张膜几乎都发光是不是膜没有洗干净分离胶是不是该用15%的还有哪些问题希望老师指正
2.还有一个问题是如果用gelation做抗体稀释液应该如何配制呢

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作者: moonlight45 时间: 2013-4-3 11:14

最近做western遇到了问题，跨膜蛋白，抗体说明书说目标蛋白在23KD，但我的结果条带在43KD左右。怀疑是膜蛋白聚集，采用70度10分钟的方式加热样品。可是条带还是下不来。请教是否哪里出现了问题呢？先谢谢了！

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你好看到你说你做的是跨膜蛋白我也在做这种蛋白做的比我好很多想请教你是用试剂盒提的膜蛋白么蛋白的加热变性有没有特殊温度跟时间的？我现在就是微波加热5分钟跑的条带很扭曲能交流一下吗

作者: newway 时间: 2013-4-3 11:14

你们好，我是WB的新手，最近做WB，总是不出结果，还不知道问题在哪，我觉得自己对WB的原理整的不是很明白，特意在此询问各位高手，我应该看点什么书或者什么的才能搞明白WB的原理呢？有没有什么好的推荐？谢谢

作者: hot_hot_hot 时间: 2013-4-3 11:20

LZ好，谢谢LZ的细心及耐心。今天湿转完丽春红染了染膜，发现膜是花的，有的地方空白没有条带，而且形状不规则，可能什么原因啊？是PVDF膜，甲醇活化了的。败了。

作者: loli 时间: 2013-4-3 11:20

你好看到你说你做的是跨膜蛋白我也在做这种蛋白做的比我好很多想请教你是用试剂盒提的膜蛋白么蛋白的加热变性有没有特殊温度跟时间的？我现在就是微波加热5分钟跑的条带很扭曲能交流一下吗

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我是总蛋白裂解液跑的电泳，变性条件就是煮沸5分钟，也做过70度10分钟。结果都没有差别。比较纠结的是分子量不对，大很多。不知道你有好的解决办法没有？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:21

加还原剂了？
现用现加的还是？

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DTT浓度有点低

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:21

请问我做脑组织的，使用罗氏公司（Roche）蛋白酶抑制剂。就是那种片剂。我把它配成1*之后是按什么比例加入到裂解液中呢？我需要检测磷酸化和总蛋白，需要加磷酸化的蛋白酶抑制剂吗？谢谢前辈。

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看说明书了吗？
配成1*之后怎么加到裂解液中呢？
需要配成10*或者50*的储液撒

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:21

老师，您好，

问个很弱的问题，WB为什么要用脱脂的奶粉啊？？

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起封闭作用

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:21

向前辈请教个western blot的问题，
多次试验，总是目的蛋白能出来，且有较高的亮度，但内参beta-actin总是无法显影出来(HRP-ECL)，麻烦问下造成这个的原因是呀，谢谢了。
内参beta-actin曝光的时间为15min

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两者的一抗都是HRP标记的吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:22

目的蛋白条带
请问老师，我的目的蛋白用的是单抗，1:1000，abcam公司产品，各孔上样量30ug左右，电泳 100v，150v 转膜 250mA 半小时，一抗4°C冰箱过夜，5%脱脂奶粉封闭2小时，二抗常温3小时。为什么显出来会有这么多条带？哪一步出现的问题呢？

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先调整一抗稀释度试试吧

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:22

LZ好，谢谢LZ的细心及耐心。今天湿转完丽春红染了染膜，发现膜是花的，有的地方空白没有条带，而且形状不规则，可能什么原因啊？是PVDF膜，甲醇活化了的。败了。

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请先跑好电泳
呵呵

作者: qqq111 时间: 2013-4-3 11:23

我的问题是：
请问WB高手我现在做人β防御素2（hBD2）的WB检测，蛋白标本来自肺上皮细胞总蛋白提取液，我的分离胶用15%的胶，上样量为80ug/孔，电泳条件为70v（浓缩胶）、120v（分离胶），电泳后marker在胶上清晰可见，最小分子量的一条marker为10kd也可以清楚看到，我的目的蛋白hBD2分子量为7kd（abcam一抗，说明书上提示该产品分子量为7kd），故电泳后切胶时，在10kd以下切1cm宽的胶进行转膜；“三明治”夹的搭建应该没有问题；我的转膜条件为：湿转，300mA，50min，用的膜是0.22um PVDF膜（millipore）；5%脱脂牛奶室温封闭1.5h；abcam一抗1：750 4°C孵育过夜，HPR标记二抗（进口分装）1:2000，室温孵育2h；洗膜均为TBST（含0.1%吐温）10min×3次；最后ECL发光（pierce公司产品），内参选用GAPDH，内参条带非浓，很容易曝光，但是目的蛋白至今未能做出来（已经近1个月了），心情极度沮丧，不知“fangweibin119”老师能否指点迷津，哪些步骤需要改进？期待您的回复，非常感谢！
另外说明一下，我提取的总蛋白，做其他指标（分子量为100kd，转膜条件为300mA，1.5h，用的膜为0.45um）是有条带的，可是是做hBD2没有任何条带让我看到！

作者: 阿k 时间: 2013-4-3 11:23

请先跑好电泳
呵呵

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电泳？制胶有问题？考马斯亮蓝染了胶，没看出啥异常啊。请lz明示，真的不懂啊。

作者: lgm 时间: 2013-4-3 11:24

两者的一抗都是HRP标记的吗？

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两者的二抗都市HRP标记的呀。

作者: mysmdbl 时间: 2013-4-3 11:24

为什么最近做组织的actin老是有两条带呢

作者: ukonptp 时间: 2013-4-3 11:24

您好，我做dot blot已经好几个月了，一直做不出来，心急如焚之下只好又来麻烦您了。。。我的封闭条件是10%的脱脂奶粉4°C下封闭12 h，一抗已经稀释到1:10000了，二抗也稀释到1:40000，可是出来的结果背景还是很高。有一次还做出来过圆点很明显的结果，只是背景还有些高，但是最近连这个样子的都做不出来了，结果背景很高，圆点也不明显，甚至看不出来。这是为什么呢为什么呢为什么呢为什么呢。。。是我的膜有问题？还是封闭有问题？还是抗体浓度有问题呢？请您指点。。。谢谢

作者: kulee 时间: 2013-4-3 11:25

请问我检测的蛋白是在43左右。那么我可以先检测目的蛋白，再用一二抗去除液洗膜后再做beta-actin吗？这对发文章有没有影响？文章是不是需要把beta-actin的图也放上去？谢谢！

作者: kulee 时间: 2013-4-3 11:25

我是做MAPK，p-MAPK，我是打算先曝磷酸化的p-MAPK，洗膜后再做MAPK，再洗膜做内参。我看文献人家比较多的是用GAPDH做内参。请问是不是GAPDH更加合适呢？
非常感谢！

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:25

电泳？制胶有问题？考马斯亮蓝染了胶，没看出啥异常啊。请lz明示，真的不懂啊。

=======================

嗯
转膜后用丽春红染膜了吗？
蛋白条带分布情况如何？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:26

两者的二抗都市HRP标记的呀。

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目的抗体的稀释度摸索过了吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:26

为什么最近做组织的actin老是有两条带呢

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可能样品降解
还有一种情况是胶不好

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:27

您好，我做dot blot已经好几个月了，一直做不出来，心急如焚之下只好又来麻烦您了。。。我的封闭条件是10%的脱脂奶粉4°C下封闭12 h，一抗已经稀释到1:10000了，二抗也稀释到1:40000，可是出来的结果背景还是很高。有一次还做出来过圆点很明显的结果，只是背景还有些高，但是最近连这个样子的都做不出来了，结果背景很高，圆点也不明显，甚至看不出来。这是为什么呢为什么呢为什么呢为什么呢。。。是我的膜有问题？还是封闭有问题？还是抗体浓度有问题呢？请您指点。。。谢谢

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一直做dot blot？
二抗用哪里的？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:27

请问我检测的蛋白是在43左右。那么我可以先检测目的蛋白，再用一二抗去除液洗膜后再做beta-actin吗？这对发文章有没有影响？文章是不是需要把beta-actin的图也放上去？谢谢！

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可以用你说的这种方法来操作
但是从我的经验来说
1、stripping 后，并不能把所有的一抗都洗脱掉
2、我建议换GAPDH或者beta-tubulin内参，除非你的模型中对这两种内参有影响

作者: 8s5g 时间: 2013-4-3 11:28

一直做dot blot？
二抗用哪里的？

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对啊二抗用的是Promega的，一抗是Invitrogen的

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 11:28

楼主好：

我最近做western，转完膜以后什么，看到有maker了，但是丽春红染色后一个条带都没有。做了两次，曝光也是什么都没有。以前做的蛮好，不知道这次是什么问题？

谢谢楼主

作者: TAT 时间: 2013-4-3 11:29

我的目的蛋白是29kd的，蛋白上样量40ug，抗体浓度为推荐的最大值，每次显影条带很细颜色很浅，泳道两边颜色较深（小黑点），中间浅，请问该如何改进？

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作者: 911 时间: 2013-4-3 11:29

请教 fangweibin119前辈，刚开始做WB，遇到问题不知道什么原因，内参36kd，目的蛋白19kd，实验条件：15%的分离胶，6%浓缩胶，上样量50ug，电泳：80V，100V跑到底，转膜：100V 1h，5%脱脂牛奶封闭1h，abcam的一抗1：500（说明书推荐1：200~1：1000），内参GAPDH1：1000，都是用5%的脱脂牛奶稀释，4℃过夜，TBST洗5min×3次，二抗1：3000（TBST稀释的），37℃孵育1h，再次TBST洗5min×3次，压片就成下面的样子，这是第二次做WB，还是连内参也没看到，很困惑，会是样品的问题吗？先谢谢了！！

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作者: eric930 时间: 2013-4-3 11:30

我觉得你的转膜时间应该缩短。因为分子量太小了。你可以试试。而且我觉得0.22的膜不怎么好转。换0.45的试试。把你要的目的多留点试试

作者: tie8 时间: 2013-4-3 11:30

我觉得你的转膜时间应该缩短。因为分子量太小了。你可以试试。而且我觉得0.22的膜不怎么好转。换0.45的试试。把你要的目的多留点试试

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因为临时没找到0.22的膜，所以用的就是0.45的，下次把转膜时间缩短点试试，谢谢你回复

作者: JK.jon 时间: 2013-4-3 11:31

老师，您好，这是我这几天敷的膜，条件和我之前做出来的一模一样，可是现在是这样子的，麻烦你帮我看看这个是哪里出问题了

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作者: 2541 时间: 2013-4-3 11:31

我的内参发光很好，可目的蛋白没看到，提取蛋白时目的蛋白浓度低了点，会不会是浓度太低，而没有发光显色呢，还有一抗、二抗的浓度配比怎么合适，我的是细胞提取蛋白

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:32

对啊二抗用的是Promega的，一抗是Invitrogen的

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先把二抗做一个dot blot

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:32

楼主好：

我最近做western，转完膜以后什么，看到有maker了，但是丽春红染色后一个条带都没有。做了两次，曝光也是什么都没有。以前做的蛮好，不知道这次是什么问题？

谢谢楼主

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检测电泳及转膜

作者: NBA 时间: 2013-4-3 11:32

我的目的蛋白是29kd的，蛋白上样量40ug，抗体浓度为推荐的最大值，每次显影条带很细颜色很浅，泳道两边颜色较深（小黑点），中间浅，请问该如何改进？
样品中有沉淀

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上样前高速、短时间离心

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:23

刚开始做WB，遇到问题不知道什么原因，内参36kd，目的蛋白19kd，实验条件：15%的分离胶，6%浓缩胶，上样量50ug，电泳：80V，100V跑到底，转膜：100V 1h，5%脱脂牛奶封闭1h，abcam的一抗1：500（说明书推荐1：200~1：1000），内参GAPDH1：1000，都是用5%的脱脂牛奶稀释，4℃过夜，TBST洗5min×3次，二抗1：3000（TBST稀释的），37℃孵育1h，再次TBST洗5min×3次，压片就成下面的样子，这是第二次做WB，还是连内参也没看到，很困惑，会是样品的问题吗？先谢谢了！！

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先跑电泳，考马斯亮蓝染胶看效果
之后再考虑是否转膜

作者: 66小飞侠 时间: 2013-4-3 14:32

检测电泳及转膜

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楼主，难道western还有除了电泳和转膜还有其他步骤吗？考染检测过了，胶上有蛋白，是转膜的事，但是不知道是膜不行还是转膜液的问题。转膜液的Ph有要求不？

作者: is2011 时间: 2013-4-3 14:33

先把二抗做一个dot blot

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谢谢~那个已经做过了，我现在把抗体稀释到了一抗1:15000，二抗1:40000，差不多可以出来想要的结果了，但是还是有一定的背景，膜上有的地方会有点黑，这个要怎么解决呢？

作者: okhaha 时间: 2013-4-3 14:33

我在做130kd蛋白的western
做了很多次，膜上要么没有条带，要么就是很浅而且很乱。实验的蛋白，和一二抗应该是没有问题的。我觉得问题就是出在转膜上。
我们实验室只能半干转膜。
转膜条件试过：（胶面积X10；15V，57min；15V，49min）
转的时候我用两层PVDF膜。
转完后在第一层上会有marker的颜色，显色后会有些条带，但是亮度低不理想。
转膜后最下面那一层滤纸上也会有marker的颜色，感觉好像是有点过。
但是第二层膜上又没有蛋白条带。
请楼主帮我分析一下怎么回事，我应该怎么调整转膜条件才能有良好的效果啊。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-4-3 14:34

老师您好，我想请教您WB实验中用5%脱脂奶粉封闭完了孵育一抗时需要洗吗（一抗用5%BSA稀释）？又说不用的，有说需要洗以防脱脂奶粉占据目的蛋白位点，您怎么看呢？

作者: fsdd817 时间: 2013-4-3 14:35

先跑电泳，考马斯亮蓝染胶看效果
之后再考虑是否转膜

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你好，老师，这是考马斯亮蓝染胶的图，可能是脱色不彻底和拍照的缘故，实际胶上条带要清楚些、也要多一点，但很有限，这样的结果是不是说明蛋白样品提取有问题呢？要重新提取吗？请指教，谢谢！

图片附件: 23386888.snap.jpg (2013-4-3 14:35, 61.46 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15480

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作者: abc816 时间: 2013-4-3 14:37

第一次做WESTERN ，请前辈多多指教，谢谢啦

一个120 KD，一个40-45 kd,还有一个20 kd , 如果在一块胶上跑电泳，一般用多少浓度的胶？

我用了12 % ,转膜时120kd的蛋白120 V，2个半小时，另外俩个蛋白在一张膜上，转了1个小时，结果见下图（附件）
另外，想问，1. 为啥我跑胶的时候，跑的有点偏呢？电泳缓冲液是新的？

2. 如果小分子量的蛋白，20kd /40 kd 的转膜条件一般是怎样的？120V， 1个小时后转过了吗？
如果转膜转过了，会怎样？对结果有什么影响呢

非常感谢

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作者: loli 时间: 2013-4-3 14:38

目的蛋白35KD,一般湿转膜多久比较合适？谢谢

作者: loli 时间: 2013-4-3 14:38

补充个问题，我在暗室发光的时候，把膜放在皿里，然后加放光液，结果整个皿都亮了，膜刚开始也有点亮，但很快就不亮了，重复几次都一样，后换了抗体也会，但是做内参的好些，这个问题纠结了很久，刚开始以为没洗干净膜，但后来发现不是，洗膜的时间TBST10分钟，封闭室温下一小时，求救

作者: TAT 时间: 2013-4-3 14:38

您好，血红蛋白对我的目的蛋白是不是也会有影响啊？我离心了，没看到沉淀，就是有血

作者: TAT 时间: 2013-4-3 14:42

我的是水通道蛋白，是不是要换提取的方法？

作者: lixi559 时间: 2013-4-3 14:42

请问一下，25KD分子量的蛋白，半干转，转模条件，谢谢楼主

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:43

楼主，难道western还有除了电泳和转膜还有其他步骤吗？考染检测过了，胶上有蛋白，是转膜的事，但是不知道是膜不行还是转膜液的问题。转膜液的Ph有要求不？

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我们从来不调转膜液的pH

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:44

谢谢~那个已经做过了，我现在把抗体稀释到了一抗1:15000，二抗1:40000，差不多可以出来想要的结果了，但是还是有一定的背景，膜上有的地方会有点黑，这个要怎么解决呢？

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1、黑点：可能奶粉等没有完全溶好
2、背景：二抗还需要稀释下

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:46

我在做130kd蛋白的western
做了很多次，膜上要么没有条带，要么就是很浅而且很乱。实验的蛋白，和一二抗应该是没有问题的。我觉得问题就是出在转膜上。
我们实验室只能半干转膜。
转膜条件试过：（胶面积X10；15V，57min；15V，49min）
转的时候我用两层PVDF膜。
转完后在第一层上会有marker的颜色，显色后会有些条带，但是亮度低不理想。
转膜后最下面那一层滤纸上也会有marker的颜色，感觉好像是有点过。
但是第二层膜上又没有蛋白条带。
请楼主帮我分析一下怎么回事，我应该怎么调整转膜条件才能有良好的效果啊。

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用湿转

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:46

老师您好，我想请教您WB实验中用5%脱脂奶粉封闭完了孵育一抗时需要洗吗（一抗用5%BSA稀释）？又说不用的，有说需要洗以防脱脂奶粉占据目的蛋白位点，您怎么看呢？

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需要洗膜

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:46

你好，老师，这是考马斯亮蓝染胶的图，可能是脱色不彻底和拍照的缘故，实际胶上条带要清楚些、也要多一点，但很有限，这样的结果是不是说明蛋白样品提取有问题呢？要重新提取吗？请指教，谢谢！

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样品提的还可以

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:47

第一次做WESTERN ，请前辈多多指教，谢谢啦

一个120 KD，一个40-45 kd,还有一个20 kd , 如果在一块胶上跑电泳，一般用多少浓度的胶？

我用了12 % ,转膜时120kd的蛋白120 V，2个半小时，另外俩个蛋白在一张膜上，转了1个小时，结果见下图（附件）
另外，想问，1. 为啥我跑胶的时候，跑的有点偏呢？电泳缓冲液是新的？

2. 如果小分子量的蛋白，20kd /40 kd 的转膜条件一般是怎样的？120V， 1个小时后转过了吗？
如果转膜转过了，会怎样？对结果有什么影响呢

非常感谢

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跑偏主要与胶有关哦
一抗多试几个稀释度

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:48

第一次做WESTERN ，请前辈多多指教，谢谢啦

一个120 KD，一个40-45 kd,还有一个20 kd , 如果在一块胶上跑电泳，一般用多少浓度的胶？

我用了12 % ,转膜时120kd的蛋白120 V，2个半小时，另外俩个蛋白在一张膜上，转了1个小时，结果见下图（附件）
另外，想问，1. 为啥我跑胶的时候，跑的有点偏呢？电泳缓冲液是新的？

2. 如果小分子量的蛋白，20kd /40 kd 的转膜条件一般是怎样的？120V， 1个小时后转过了吗？
如果转膜转过了，会怎样？对结果有什么影响呢

非常感谢

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二抗的稀释度也需要调整一下

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:51

目的蛋白35KD,一般湿转膜多久比较合适？谢谢

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300mA，恒流，30-40min即可

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:54

您好，血红蛋白对我的目的蛋白是不是也会有影响啊？我离心了，没看到沉淀，就是有血

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最定量会有很大的影响
同时对后续的蛋白电泳、内参条带强度都有影响

作者: NBA 时间: 2013-4-3 14:54

请问一下，25KD分子量的蛋白，半干转，转模条件，谢谢楼主

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半干转
1.2mA每平方厘米膜面积，恒流，转膜30min

作者: greenbee 时间: 2013-4-3 14:54

1、黑点：可能奶粉等没有完全溶好
2、背景：二抗还需要稀释下

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最近我用大概2-3平方厘米的NC膜做出了想要的结果，膜的背景较浅，点是黑的，用的一抗稀释度是1:15000，二抗是1:40000，可是为什么换成大块的NC膜之后结果就不一样了呢？又变成了背景黑点白。。。

作者: qhyu 时间: 2013-4-3 14:55

最定量会有很大的影响
同时对后续的蛋白电泳、内参条带强度都有影响

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再请问一下我提取的是耳蜗组织的蛋白，但是每次浓度都很低，用同样的方法提取脑组织蛋白浓度就很高，想问一下这个是什么原因啊

作者: ero11 时间: 2013-4-3 14:56

楼主你好，我最近在做一个9KD的蛋白，做了几次效果都不好，我的条件是，80V，25min，积层胶；100V，50min
分离胶；90V，90min，转膜；NC膜，0.45的，内参很好，但是目的条带不行，一抗是santa cruz的多抗
图片如下，请问这是怎么回事？应该如何改进？谢谢

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15483

作者: ero11 时间: 2013-4-3 14:58

内参如下

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作者: xingyi08 时间: 2013-4-3 14:58

楼主您好，我最近在做eIF2 alpha磷酸化的western blot，结果一直不是很好，信号很弱。现在老板要我找一下有没有eIF2 alpha磷酸化的阳性对照，以此检验一下我是实验技术不行，还是我的抗体不行。我现在蛋白上样量已经到了75微克，内参（alpha-actinin）表达很好，但就是磷酸化eIF2 alpha信号太差。提蛋白也是按照提取磷酸化蛋白的lysis buffer配置的。天天被老板骂，哎，白辛苦了，希望能得到您的帮助。

作者: 49888 时间: 2013-4-3 14:59

滴上发光液后整张膜都是亮的，显影显出来一张膜。而且感觉蛋白有弥散，请问该怎么办啊？

作者: leifengta 时间: 2013-4-3 14:59

我是一个初学者，容易犯错误，跟楼主请教一个问题：
我在配备WB二抗的时候错拿一抗稀释液配置了，配完才发现，需要配制的是Goat-anti-Rabbit:1:1000，
需要检测的是VEGF，请问有干扰吗？
谢谢了

作者: kuaizige 时间: 2013-4-3 15:00

为什么要加水？？？
这个配方很奇怪哦

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老师好，我又来啦。
因为上样量有一个固定值，DTT和5倍上缓按照1：2比例加，同时，蛋白量是定的，剩下的水就是固定上样量减去蛋白量、DTT量还有5倍上缓量。
另外，还要求教一个大问题，快纠结死我了。
磷酸化蛋白和总蛋白有可能不在一个位置吗？？
为什么我的p70S6K和p-p70S6K位置差异那么大呢？？磷酸化P70几乎接近80，而p70接近60，这是怎么回事呢？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:00

再请问一下我提取的是耳蜗组织的蛋白，但是每次浓度都很低，用同样的方法提取脑组织蛋白浓度就很高，想问一下这个是什么原因啊

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耳蜗组织蛋白含量低
正常的
加大耳蜗组织用量或者降低裂解液量

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:01

楼主你好，我最近在做一个9KD的蛋白，做了几次效果都不好，我的条件是，80V，25min，积层胶；100V，50min
分离胶；90V，90min，转膜；NC膜，0.45的，内参很好，但是目的条带不行，一抗是santa cruz的多抗
图片如下，请问这是怎么回事？应该如何改进？谢谢

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小分子量蛋白不太好检测
用0.22um的膜试试
转膜：90V，30min
另外小分子量蛋白的marker也不会很准确的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:01

楼主您好，我最近在做eIF2 alpha磷酸化的western blot，结果一直不是很好，信号很弱。现在老板要我找一下有没有eIF2 alpha磷酸化的阳性对照，以此检验一下我是实验技术不行，还是我的抗体不行。我现在蛋白上样量已经到了75微克，内参（alpha-actinin）表达很好，但就是磷酸化eIF2 alpha信号太差。提蛋白也是按照提取磷酸化蛋白的lysis buffer配置的。天天被老板骂，哎，白辛苦了，希望能得到您的帮助。

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ECL用的是什么货号？什么公司的？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:02

滴上发光液后整张膜都是亮的，显影显出来一张膜。而且感觉蛋白有弥散，请问该怎么办啊？

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调整二抗浓度
蛋白弥散要从胶开始考虑

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:02

我是一个初学者，容易犯错误，跟楼主请教一个问题：
我在配备WB二抗的时候错拿一抗稀释液配置了，配完才发现，需要配制的是Goat-anti-Rabbit:1:1000，
需要检测的是VEGF，请问有干扰吗？
谢谢了

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没有干扰

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:03

老师好，我又来啦。
因为上样量有一个固定值，DTT和5倍上缓按照1：2比例加，同时，蛋白量是定的，剩下的水就是固定上样量减去蛋白量、DTT量还有5倍上缓量。
另外，还要求教一个大问题，快纠结死我了。
磷酸化蛋白和总蛋白有可能不在一个位置吗？？
为什么我的p70S6K和p-p70S6K位置差异那么大呢？？磷酸化P70几乎接近80，而p70接近60，这是怎么回事呢？

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不同公司的抗体？

作者: wmp1234 时间: 2013-4-3 15:05

请问大虾：
抗原包被到NC膜后免疫印迹测试出现抗原带中间空心是什么原因引起（两边染色深；中间较浅），实验过很多工艺和样品，没法解决。
（我们是采用划线法划到NC上。也预先加了甲醇.22的膜）

[ 本帖最后由 wmp1234 于 2013-4-3 15:42 编辑 ]

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作者: kuohao17 时间: 2013-4-3 15:43

ECL用的是什么货号？什么公司的？

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磷酸化抗体是cell signal的，#9721。我在做ER stress。我没有用ECL，是用的荧光二抗，直接用荧光扫描获得结果的。谢谢您！

作者: 987789 时间: 2013-4-3 15:43

请问老师，我做组织的磷酸化P38，上样量20ug，为什么条带爆出来很强。我用的是超敏发光液。听实验室的说，P-P38并不多。

作者: 987789 时间: 2013-4-3 15:44

老师，请问您有没有做过组织CHOP/GADD153，用的是SANTA抗体，分子量30，一直跑不出来，不知道为什么？实验室的其他人用细胞就可以跑出来，而且对照组也是有表达的。

作者: wood533 时间: 2013-4-3 15:44

不同公司的抗体？

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都是CST公司的，我很纳闷，难道它的磷酸化基团上去以后，分子量会变大吗？

作者: ritou1985 时间: 2013-4-3 15:45

调整二抗浓度
蛋白弥散要从胶开始考虑

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用考马斯亮蓝染的胶上一个泳道一个泳道是很清楚的

作者: ero11 时间: 2013-4-3 15:46

老师，我们在跑电泳的时候出现蛋白质外漏的现象，请问是什么原因呢，我们的电泳是开始时120v，10min后改为100V

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作者: gmjghh 时间: 2013-4-3 15:47

楼主，你好，我的目的蛋白是28KD和79KD，我用恒压转膜，电压多少，时间多长，谢谢！

作者: ffooll 时间: 2013-4-3 15:48

小分子量蛋白不太好检测
用0.22um的膜试试
转膜：90V，30min
另外小分子量蛋白的marker也不会很准确的

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那再请问，NC膜和PVDF膜那个更适合呢？

作者: star#room 时间: 2013-4-3 15:49

老师你好，我做的是玉米根总蛋白羰基化修饰，Millipore的羰基化试剂盒，刚开始按照说明书上的抗体稀释浓度做的转完膜显色一点信号都没有，后来就加大了上样量和抗体浓度结果转完之后就变成如图这样了，整个泳道都是亮的是什么原因啊？是上样量太大还是抗体浓度太大？而且那个边缘总是少了一些，有什么办法可以避免么？

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作者: yapuyapu 时间: 2013-4-3 15:49

老师，我们在跑电泳的时候出现蛋白质外漏的现象，请问是什么原因呢，我们的电泳是开始时120v，10min后改为100V

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同样遭遇过，制胶有问题，冬天确保凝胶时间有一小时

作者: sunnyB 时间: 2013-4-3 15:50

是这样的我们一直是在浓缩胶的部分出现一个到两个孔的漏胶而且可以明显看到漏了后会在浓缩胶和分离胶的分界线有一条线我们想了很多办法包括换试剂换装置等等还是漏实在不知道该怎么办了请大家能帮帮忙特别感谢

作者: mysmdbl 时间: 2013-4-3 15:50

楼主您好，先感谢您这么有耐心地一一解答。
我有几个问题想问您，我是新手，可能语言上不是太专业。
1.我是从大鼠肾组织中提取的蛋白，按照100mg加入1ml的RIPA裂解液进行提取，并加入了蛋白酶及蛋白磷酸酶抑制剂。提取后12000g，4度离心10min，取上清，BCA定量。大概定后按照每孔120ug上样。
前两次没有任何条带，就怀疑是不是蛋白降解，后又做了一次beta-actin，结果出来了而且非常漂亮，那么就证明我的蛋白首先提取应该是没问题的吧。
最近一次想开始做我的目的蛋白，16KD的leptin。结果是一塌糊涂，背景特别的脏，而且在脏乱的背景中依稀好像看得到某些条带。
问题是：
1.一抗用的是SANTA的 1:500 稀释的。我是先5%奶粉封闭37°一小时，然后再用5%奶粉稀释一抗后4度过夜。
2.二抗用的是国产的中杉金桥的，1:2000.
3.电泳是用15%的胶，先80V，后120V。
4.转膜是用的恒压，100V，90min.这个条件就是完全木有目的蛋白存在！
请教楼主所谓的二抗摸条件是怎么个摸法，是用不同的浓度挨个试？那得折腾多少次呢？
盼您回信指导！啰嗦了，回复万分感谢！

作者: zsxan1990 时间: 2013-4-3 15:51

你好,看了你从09年开始开了这个专题,造福了无数晚辈.有这样的前辈为大家解惑,是我等晚辈之福!是我们学习的榜样.最近我做WB也碰到了一些问题,查过一些帖子,但因为是菜鸟,时间又紧,所以想尽快找到答案,恳请赐教.谢谢!!!
1.超级菜鸟的问题:你是用什么调整蛋白浓度的?使得上样体积和总蛋白量都一样!我查了一直,有用TBST的,有用 1Xloading buffer的,也有用RIPA的.哪种方法更好呢?
2.电泳时,会出现条带偏离泳道的情况,特别是靠板两边的孔,MARKER孔也会出现,还好MARKER最后感觉还是回到它本身,但蛋白孔就不得而知了.查了论坛里的一些资料,有网友说最靠边的两孔最好不上样,加等量的1Xloading buffer就可以了,MARKER孔也加1Xloading buffer调至与其它孔等体积,请问这种方法是否可行?前辈你又是用何种方法避免这种现象的呢?我用的10孔的,有没有什么办法把两边的孔也上样但又可以不偏离泳道呢?因为我有这样的需要,15孔的经常和邻孔有交叉!

作者: PINK 时间: 2013-4-3 15:52

您好，前来向你请教
最近在做人胰岛素（分子量约为6KD）有关的实验，可胰岛素抗体一直不行，都买了两个不同的公司（CST与abcam)的抗体，现有点急，现都分不清是实验过程出问题，还是与抗体灵敏度有关？CST抗体抗鼠，但说明书上说可与人胰岛素交叉反应（实际上可能不会发生），abcam的抗体的抗原来自于人胰岛素。
点印迹过程：PVDF膜甲醇处理-凉干-胰岛素溶液点样-封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育。结果要么什么都没有，要么就背景很深。

（所看到的样品点，是不是因曝光过底所致.重复多次仅有一次这样的结果，其他都是白茫茫一片，太坑爹了！）
WB（SDS-PAGE）过程：配15%分离胶-上样（5ug）-电泳至溴芬兰离底部约2CM-半干转（1.0mA/cm2)）-10min 与15min（两张膜）-封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育。无结果。
是不是小分子的蛋白质不容易做WB？之前做胰蛋白酶（23KD）点印迹，结果很好，不知是不是因胰岛素分子量小，不容易与膜结合或后续洗膜过程中易被洗掉有关，从而导致阳性对照（胰岛素）点印迹无结果？小分子蛋白抗体的灵敏度相对于大蛋白的抗体是不是会低很多？？
非常感谢！

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作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:53

磷酸化抗体是cell signal的，#9721。我在做ER stress。我没有用ECL，是用的荧光二抗，直接用荧光扫描获得结果的。谢谢您！

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荧光标记二抗敏感性要比曝光差一点

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:55

请问老师，我做组织的磷酸化P38，上样量20ug，为什么条带爆出来很强。我用的是超敏发光液。听实验室的说，P-P38并不多。

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我们检测p-p38的结果也是类似哦
条带很强

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:55

老师，请问您有没有做过组织CHOP/GADD153，用的是SANTA抗体，分子量30，一直跑不出来，不知道为什么？实验室的其他人用细胞就可以跑出来，而且对照组也是有表达的。

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这个蛋白做过
选择抗体的时候只能是在别的大公司抗体都找不到的情况下再用santa 的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:55

都是CST公司的，我很纳闷，难道它的磷酸化基团上去以后，分子量会变大吗？

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会有变化是正常的
因为磷酸化与非磷酸化抗体可能从抗原设计上就不同
采用的抗原片段不同

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:56

老师，我们在跑电泳的时候出现蛋白质外漏的现象，请问是什么原因呢，我们的电泳是开始时120v，10min后改为100V

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考马斯亮蓝染胶情况怎样？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 15:56

楼主，你好，我的目的蛋白是28KD和79KD，我用恒压转膜，电压多少，时间多长，谢谢！

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我我们转膜一般用恒流
是湿转吗？
湿转恒压，100V，28K，30min
79K，70-90min均可

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:04

那再请问，NC膜和PVDF膜那个更适合呢？

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均可
我们用NC多一些

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:06

楼主您好，先感谢您这么有耐心地一一解答。
我有几个问题想问您，我是新手，可能语言上不是太专业。
1.我是从大鼠肾组织中提取的蛋白，按照100mg加入1ml的RIPA裂解液进行提取，并加入了蛋白酶及蛋白磷酸酶抑制剂。提取后12000g，4度离心10min，取上清，BCA定量。大概定后按照每孔120ug上样。
前两次没有任何条带，就怀疑是不是蛋白降解，后又做了一次beta-actin，结果出来了而且非常漂亮，那么就证明我的蛋白首先提取应该是没问题的吧。
最近一次想开始做我的目的蛋白，16KD的leptin。结果是一塌糊涂，背景特别的脏，而且在脏乱的背景中依稀好像看得到某些条带。
问题是：
1.一抗用的是SANTA的 1:500 稀释的。我是先5%奶粉封闭37°一小时，然后再用5%奶粉稀释一抗后4度过夜。
2.二抗用的是国产的中杉金桥的，1:2000.
3.电泳是用15%的胶，先80V，后120V。
4.转膜是用的恒压，100V，90min.这个条件就是完全木有目的蛋白存在！
请教楼主所谓的二抗摸条件是怎么个摸法，是用不同的浓度挨个试？那得折腾多少次呢？
盼您回信指导！啰嗦了，回复万分感谢！

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leptin适合做WB吗？
是分泌型蛋白，不适合用WB检测

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:06

你好,看了你从09年开始开了这个专题,造福了无数晚辈.有这样的前辈为大家解惑,是我等晚辈之福!是我们学习的榜样.最近我做WB也碰到了一些问题,查过一些帖子,但因为是菜鸟,时间又紧,所以想尽快找到答案,恳请赐教.谢谢!!!
1.超级菜鸟的问题:你是用什么调整蛋白浓度的?使得上样体积和总蛋白量都一样!我查了一直,有用TBST的,有用 1Xloading buffer的,也有用RIPA的.哪种方法更好呢?
2.电泳时,会出现条带偏离泳道的情况,特别是靠板两边的孔,MARKER孔也会出现,还好MARKER最后感觉还是回到它本身,但蛋白孔就不得而知了.查了论坛里的一些资料,有网友说最靠边的两孔最好不上样,加等量的1Xloading buffer就可以了,MARKER孔也加1Xloading buffer调至与其它孔等体积,请问这种方法是否可行?前辈你又是用何种方法避免这种现象的呢?我用的10孔的,有没有什么办法把两边的孔也上样但又可以不偏离泳道呢?因为我有这样的需要,15孔的经常和邻孔有交叉!

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1、在知道是什么裂解液的情况下，调整蛋白浓度用裂解液
2、正常现象，有边缘效应。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:07

您好，前来向你请教
最近在做人胰岛素（分子量约为6KD）有关的实验，可胰岛素抗体一直不行，都买了两个不同的公司（CST与abcam)的抗体，现有点急，现都分不清是实验过程出问题，还是与抗体灵敏度有关？CST抗体抗鼠，但说明书上说可与人胰岛素交叉反应（实际上可能不会发生），abcam的抗体的抗原来自于人胰岛素。
点印迹过程：PVDF膜甲醇处理-凉干-胰岛素溶液点样-封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育。结果要么什么都没有，要么就背景很深。

（所看到的样品点，是不是因曝光过底所致.重复多次仅有一次这样的结果，其他都是白茫茫一片，太坑爹了！）
WB（SDS-PAGE）过程：配15%分离胶-上样（5ug）-电泳至溴芬兰离底部约2CM-半干转（1.0mA/cm2)）-10min 与15min（两张膜）-封闭-一抗孵育-洗膜-二抗孵育。无结果。
是不是小分子的蛋白质不容易做WB？之前做胰蛋白酶（23KD）点印迹，结果很好，不知是不是因胰岛素分子量小，不容易与膜结合或后续洗膜过程中易被洗掉有关，从而导致阳性对照（胰岛素）点印迹无结果？小分子蛋白抗体的灵敏度相对于大蛋白的抗体是不是会低很多？？
非常感谢！

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做dot blot？
还是Western Blot？
6KD用15%的胶不合适

作者: summerxx 时间: 2013-4-3 16:08

谢谢楼主，是湿转。那半干转恒压用多少，时间多长？

作者: avi317 时间: 2013-4-3 16:08

做dot blot？
还是Western Blot？
6KD用15%的胶不合适

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都做了，所给图是Dot-blot结果。胶浓度不合适，那请问多大合适，不会是要跑tricine-SDS PAGE吧？？

作者: 49888 时间: 2013-4-3 16:09

最近做了一个分子量68KD左右的蛋白，蛋白没有问题（以前做过），抗体也做出来过一次，在重复试验的时候就出现以上的匪夷所思的条带：有很多的杂点，蛋白也看不清有没有转上？！但是同时同一块膜上的内参是条带是出来了的，请楼主（或哪位热心的高手）帮忙诊断一下这个膜处出了什么问题？在哪一步上需要修正？非常感谢！！！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15490

作者: 987789 时间: 2013-4-3 16:09

会有变化是正常的
因为磷酸化与非磷酸化抗体可能从抗原设计上就不同
采用的抗原片段不同

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啊，谢谢老师！
另外还有两个个问题，
1、可以直接用TBST稀释抗体吗？我做出来过一次，后来没再试，不知道用封闭液稀释抗体的原理是什么。
2、如果我们把封闭液配成10%的（原来是5%的BSA），会不会封闭效果更好些？我们做的有背景有杂带，可伤心呢，再做不好就回不了家了。。。
谢谢老师回复。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:10

都做了，所给图是Dot-blot结果。胶浓度不合适，那请问多大合适，不会是要跑tricine-SDS PAGE吧？？
tricine胶不好跑

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我跑过，效果不怎么样
这种小分子量的蛋白，我也没有经验

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:10

啊，谢谢老师！
另外还有两个个问题，
1、可以直接用TBST稀释抗体吗？我做出来过一次，后来没再试，不知道用封闭液稀释抗体的原理是什么。
2、如果我们把封闭液配成10%的（原来是5%的BSA），会不会封闭效果更好些？我们做的有背景有杂带，可伤心呢，再做不好就回不了家了。。。
谢谢老师回复。

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1、可以直接用TBST稀释一抗，但是最好不要用。封闭的原理上网查
2、浓度太高不行3%-5%即可

作者: nn255 时间: 2013-4-3 16:11

tricine胶不好跑
我跑过，效果不怎么样
这种小分子量的蛋白，我也没有经验

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查一些资料，就是跑非还原的SDS-PAGE。

作者: xueyouzhang 时间: 2013-4-3 16:19

５%脱脂奶粉封闭一小时,acting一抗,1:1000，４度过夜，１：５０００兔二抗１小时，每次洗膜都是ＴＢＳＴ１０min,3次，背景总是过高，求老师分析原因。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15491

作者: yonger 时间: 2013-4-3 16:20

首先谢谢楼主
我想请问一下我自己采用试剂盒提取的细胞总蛋白保存调节是-20摄氏度但是反复冻融几次之后就会出现絮状沉淀然后上清里面的蛋白质浓度就很低了 SDS-PAGE之后基本不能够曝光出条带我用考马斯亮蓝染色发现膜上其实是有蛋白质的只是量很少很少我估计是与生成了絮状沉淀有关请问这个问题要怎么解决谢谢！

作者: misswu61 时间: 2013-4-3 16:21

谢谢楼主想问您一下 20KD一下的小蛋白的转膜时间应该大约在多久？多少电压呢？

作者: 00无名指00 时间: 2013-4-3 16:21

最近在做HSP27蛋白的western blot实验，但是做了很多次都没有结果。内参能做出来，但是目的条带就是没做出来过。我用的是10%的分离胶，5%的浓缩胶。转膜：半干转15V 30min（27kd的蛋白转膜时间是多少？会不会转过的情况？）。封闭1.5h，一抗1:1000过夜，二抗1:10000 37度1.5h，最后目的条带没有。请教高手指点迷津！

作者: fox_79 时间: 2013-4-3 16:22

您好！有没有遇到这样的情况，就是最后扫描出的条带上会有很多纵行黑色杂质（请看下图），本来跑出来的条带还不错的，结果全被这些脏东西毁了，我不清是哪里出问题了，帮我分析一下哪些环节可能出现这样的情况，最近跑的两次都是这样，以前都没有出现过这样的情况的。谢谢您！还有就是有的条带中间破开，又是什么原因呢？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15492

作者: 831226 时间: 2013-4-3 16:23

我做的大致步骤描述一下，上样体积在10-17微升间，电泳：80V,120V；电转：恒流220mA，时间为分子量的2倍；封闭：5%奶粉，摇床1.5h；一抗（1:100；santa cruz多克隆抗体）4度孵育16小时；二抗（1:10000，荧光标记二抗）避光，摇床孵育1h;我怀疑是不是PAGE胶有问题，因为除开TEMED是现成的，其他的都是自己用粉剂配制的。另外Tris-hcl（PH8.8和 PH6.8）均未经高压灭菌保存，配好后直接放在室温（现在开着空调，23度）；所以我怀疑是不是被污染了；
我还想我问一下，这些配置PAGE胶的试剂能否都放4度保存；还有1*电转液和电泳液能否回收使用，有没有次数限制；
这些是我最近的疑问，问得有些多，谢谢啦！

作者: INK 时间: 2013-4-3 16:23

您好：我想请教一下，我第一次做western，目的蛋白320KD,想请教一下浓缩胶和分离胶的浓度，电泳时在浓缩胶和分离胶中的条件（恒压还是恒流，数值多少较合适），以及转膜的条件？

因为做实验时间不是很多了，望能尽快给予指导，先在此表示感谢！

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:24

５%脱脂奶粉封闭一小时,acting一抗,1:1000，４度过夜，１：５０００兔二抗１小时，每次洗膜都是ＴＢＳＴ１０min,3次，背景总是过高，求老师分析原因。

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调整二抗至1:10000
孵育时间：30min
室温
洗膜：3min，5-6次

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:31

首先谢谢楼主
我想请问一下我自己采用试剂盒提取的细胞总蛋白保存调节是-20摄氏度但是反复冻融几次之后就会出现絮状沉淀然后上清里面的蛋白质浓度就很低了 SDS-PAGE之后基本不能够曝光出条带我用考马斯亮蓝染色发现膜上其实是有蛋白质的只是量很少很少我估计是与生成了絮状沉淀有关请问这个问题要怎么解决谢谢！

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这种现象正常的
不能在-20度保存提取的蛋白样品
需要用-80度冰箱或者液氮

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:46

谢谢楼主想问您一下 20KD一下的小蛋白的转膜时间应该大约在多久？多少电压呢？

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湿转：300mA恒流，20-30min都可以

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:46

最近在做HSP27蛋白的western blot实验，但是做了很多次都没有结果。内参能做出来，但是目的条带就是没做出来过。我用的是10%的分离胶，5%的浓缩胶。转膜：半干转15V 30min（27kd的蛋白转膜时间是多少？会不会转过的情况？）。封闭1.5h，一抗1:1000过夜，二抗1:10000 37度1.5h，最后目的条带没有。请教高手指点迷津！！！

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内参做出来了？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:47

您好！有没有遇到这样的情况，就是最后扫描出的条带上会有很多纵行黑色杂质（请看下图），本来跑出来的条带还不错的，结果全被这些脏东西毁了，我不清是哪里出问题了，帮我分析一下哪些环节可能出现这样的情况，最近跑的两次都是这样，以前都没有出现过这样的情况的。谢谢您！还有就是有的条带中间破开，又是什么原因呢？

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样品中有沉淀

作者: NBA 时间: 2013-4-3 16:47

我做的大致步骤描述一下，上样体积在10-17微升间，电泳：80V,120V；电转：恒流220mA，时间为分子量的2倍；封闭：5%奶粉，摇床1.5h；一抗（1:100；santa cruz多克隆抗体）4度孵育16小时；二抗（1:10000，荧光标记二抗）避光，摇床孵育1h;我怀疑是不是PAGE胶有问题，因为除开TEMED是现成的，其他的都是自己用粉剂配制的。另外Tris-hcl（PH8.8和 PH6.8）均未经高压灭菌保存，配好后直接放在室温（现在开着空调，23度）；所以我怀疑是不是被污染了；
我还想我问一下，这些配置PAGE胶的试剂能否都放4度保存；还有1*电转液和电泳液能否回收使用，有没有次数限制；
这些是我最近的疑问，问得有些多，谢谢啦！

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1、电转与电泳液我们都不回收
2、不用进行高压灭菌
胶好不好的话，跑完SDS-PAGE用考马斯亮蓝染色

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 16:48

楼主你好，我最近在做western-blot，样本是猪的肠道黏膜，现在有个220kDa大小的ZO-1蛋白一直没做出来，现将我的实验条件跟你说明一下，望楼主指点一下：
1、样品制备：裂解液配方50mM Tris-HCl 7.4，150mM NaCl，1% IGEPAL GA-360，0.5% Sodium dexycholate，0.5% SDS，10mM 焦磷酸钠，1% Triton-X 100，样品采集后于-80度保存，裂解时采用液氮研磨后以1：9比例加入裂解液（使用时加入PMSF和cocktail）于冰上裂解30min，期间进行旋涡振荡数次，12000r/min-4度离心，收集上清，分装保存于-80度冰箱，上样前调整蛋白浓度后，以1：4比例加入5X上样缓冲液95度-5min变性，上样量为20ug
2、电泳条件：8%分离胶-5%浓缩胶，80V-20min，120V-1h；转膜：冰上湿转200mA-2.5h，染胶后胶上已经看不到蛋白条带
3、封闭：3%BSA室温封闭1h
4、抗体：ZO-1（santa兔抗和羊抗）、zymed（兔抗），3%BSA稀释：1：1000、1：500，1：250（3种比例都尝试过），4度过夜；二抗（兔抗和羊抗）1：3000，3%BSA
图1
图1是三种抗体，不同裂解液裂解的样品：配为上述裂解液配方裂解，NP-40、中和弱为碧云天裂解液
zymed有淡淡的条带，但不在220kDa位置

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作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 16:48

图2
0
图2是采用zymed兔抗的结果，但条带依然不在220kDa位置
本人的疑问：
1、样品裂解问题：ZO-1属于外周膜蛋白，是不是样品裂解时间不够，还是裂解过了，ZO-1蛋白降解成亚基了，不是是没有裂解出来还是裂解过头了，
2，抗体问题：我这种裂解方法做其它蛋白都没问题，有100多kDa的也没问题，目前就这个蛋白很头大，以前我师妹做出来过一次（图3如下）

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15494

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 16:49

图3-santa兔抗

图片附件: 86329129.snap.jpg (2013-4-3 16:49, 34.37 KB) / 该附件被下载次数 4
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作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 16:49

图4-zymed兔抗,样品是猪肠上皮细胞样，有进行超声（3s-10次-4度），而我也有作过一次超声裂解的，

图片附件: 29067782.snap.jpg (2013-4-3 16:49, 34.24 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15496

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 16:50

如图5

现在真搞不清是什么问题，我师妹细胞样能做出来，但以前我的细胞样也没做出来过，还烦请楼主帮忙分析一下原因，谢谢

图片附件: 96267266.jpg (2013-4-3 16:50, 50.35 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: zsxan1990 时间: 2013-4-3 16:50

正在做人白细胞Rho 激酶活性即利用Western 检测MYPT-1，做了好几次都没结果。
6%的胶（目的蛋白 130KD 内参β-actin 42KD）电泳90分钟，BIO-rad湿转 2小时 260ma ，一抗 1:300-500都试过（santa公司的推荐 1:100-1000）孵育过夜，摇床复温2h，二抗 1:5000-10000（推荐 1:5000-100000）孵育2h，ECL发光，除目的蛋白有些非特异性的发光外（很少），内参一片空白，请老师解惑。

作者: junjie05 时间: 2013-4-3 16:51

这种现象正常的
不能在-20度保存提取的蛋白样品
需要用-80度冰箱或者液氮

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这里有个问题就是保存在-80度冰箱的蛋白样品再拿出来上样的时候，是直接室温融化?还是37度快速溶一下？前提是蛋白样品已经变性用loading buffer保存了。

作者: ukonptp 时间: 2013-4-3 16:51

调整二抗至1:10000
孵育时间：30min
室温
洗膜：3min，5-6次

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多谢，尝试之后得到结果，再向老师讨教。

作者: IAM007 时间: 2013-4-3 16:52

正在做人白细胞Rho 激酶活性即利用Western 检测MYPT-1，做了好几次都没结果。
6%的胶（目的蛋白 130KD 内参β-actin 42KD）电泳90分钟，BIO-rad湿转 2小时 260ma ，一抗 1:300-500都试过（santa公司的推荐 1:100-1000）孵育过夜，摇床复温2h，二抗 1:5000-10000（推荐 1:5000-100000）孵育2h，ECL发光，除目的蛋白有些非特异性的发光外（很少），内参一片空白，请老师解惑。

作者: wsll 时间: 2013-4-3 16:52

请问楼主及各位有识之士，为什么我的蛋白条带跑成这样，是铂丝没洗干净吗？

图片附件: 31600186.jpg (2013-4-3 16:52, 5.35 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15498

作者: nn255 时间: 2013-4-3 16:54

最近在做肾组织MCP-1的western，分子量12kd，用15%的分离胶，santa的一抗，都做到1:100了，还是没有带，只有背景。有没有做过这个蛋白的同道给指点一下迷津，还有如果要换一抗的话，有没有哪家公司的一抗可以推荐一下？谢谢。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:08

楼主你好，我最近在做western-blot，样本是猪的肠道黏膜，现在有个220kDa大小的ZO-1蛋白一直没做出来，现将我的实验条件跟你说明一下，望楼主指点一下：
1、样品制备：裂解液配方50mM Tris-HCl 7.4，150mM NaCl，1% IGEPAL GA-360，0.5% Sodium dexycholate，0.5% SDS，10mM 焦磷酸钠，1% Triton-X 100，样品采集后于-80度保存，裂解时采用液氮研磨后以1：9比例加入裂解液（使用时加入PMSF和cocktail）于冰上裂解30min，期间进行旋涡振荡数次，12000r/min-4度离心，收集上清，分装保存于-80度冰箱，上样前调整蛋白浓度后，以1：4比例加入5X上样缓冲液95度-5min变性，上样量为20ug
2、电泳条件：8%分离胶-5%浓缩胶，80V-20min，120V-1h；转膜：冰上湿转200mA-2.5h，染胶后胶上已经看不到蛋白条带
3、封闭：3%BSA室温封闭1h
4、抗体：ZO-1（santa兔抗和羊抗）、zymed（兔抗），3%BSA稀释：1：1000、1：500，1：250（3种比例都尝试过），4度过夜；二抗（兔抗和羊抗）1：3000，3%BSA
图1

图1是三种抗体，不同裂解液裂解的样品：配为上述裂解液配方裂解，NP-40、中和弱为碧云天裂解液
zymed有淡淡的条带，但不在220kDa位置
图2

图2是采用zymed兔抗的结果，但条带依然不在220kDa位置
本人的疑问：
1、样品裂解问题：ZO-1属于外周膜蛋白，是不是样品裂解时间不够，还是裂解过了，ZO-1蛋白降解成亚基了，不是是没有裂解出来还是裂解过头了，
2，抗体问题：我这种裂解方法做其它蛋白都没问题，有100多kDa的也没问题，目前就这个蛋白很头大，以前我师妹做出来过一次（图3如下）
图3-santa兔抗

图4-zymed兔抗

样品是猪肠上皮细胞样，有进行超声（3s-10次-4度），而我也有作过一次超声裂解的，
如图5

现在真搞不清是什么问题，我师妹细胞样能做出来，但以前我的细胞样也没做出来过，还烦请楼主帮忙分析一下原因，谢谢

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ZO-1我也做过，没做出来
可能表达量小或者抗体没有特异性

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:08

正在做人白细胞Rho 激酶活性即利用Western 检测MYPT-1，做了好几次都没结果。
6%的胶（目的蛋白 130KD 内参β-actin 42KD）电泳90分钟，BIO-rad湿转 2小时 260ma ，一抗 1:300-500都试过（santa公司的推荐 1:100-1000）孵育过夜，摇床复温2h，二抗 1:5000-10000（推荐 1:5000-100000）孵育2h，ECL发光，除目的蛋白有些非特异性的发光外（很少），内参一片空白，请老师解惑。

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1、样品跑完电泳后用考马斯亮蓝染过胶吗？
2、转膜后，用丽春红染过膜吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:09

这里有个问题就是保存在-80度冰箱的蛋白样品再拿出来上样的时候，是直接室温融化?还是37度快速溶一下？前提是蛋白样品已经变性用loading buffer保存了。

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放在冰上融化
如果加了loading buffer处理的
可以-20度保存，不会出现沉淀。
如果是蛋白样品，没变性处理的是不行的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:09

请问楼主及各位有识之士，为什么我的蛋白条带跑成这样，是铂丝没洗干净吗？

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胶的问题

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:10

最近在做肾组织MCP-1的western，分子量12kd，用15%的分离胶，santa的一抗，都做到1:100了，还是没有带，只有背景。有没有做过这个蛋白的同道给指点一下迷津，还有如果要换一抗的话，有没有哪家公司的一抗可以推荐一下？谢谢。

=============================================

这个蛋白我好像做过
cuturl('http://www.abcam.com/mcp1-antibody-ab25124.html')

作者: utt0989 时间: 2013-4-3 17:10

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-4-3 17:10 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近在做肾组织MCP-1的western，分子量12kd，用15%的分离胶，santa的一抗，都做到1:100了，还是没有带，只有背景。有没有做过这个蛋白的同道给指点一下迷津，还有如果要换一抗的话，有没有哪家公司的一抗可以推荐一下？谢谢。

======= ...

请问Abcam这个抗体好不好做，能否提供一下具体的条件，如转膜，抗体浓度等，谢谢。

作者: DNA 时间: 2013-4-3 17:11

1、样品跑完电泳后用考马斯亮蓝染过胶吗？
2、转膜后，用丽春红染过膜吗？

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跑完电泳染过，目的蛋白位置没有条带，内参附近有条带，但不是特别清晰的那种。转膜后没用过丽春红。是我蛋白提取的问题吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:16

跑完电泳染过，目的蛋白位置没有条带，内参附近有条带，但不是特别清晰的那种。转膜后没用过丽春红。是我蛋白提取的问题吗？

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内参蛋白检测结果很好？

作者: qumm1985 时间: 2013-4-3 17:16

新手问个问题，要跑40kd左右的蛋白，用多少的胶比较好，我看15%和10%都可以的，但是师兄让我用10%的，不知道为什么啊

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:18

新手问个问题，要跑40kd左右的蛋白，用多少的胶比较好，我看15%和10%都可以的，但是师兄让我用10%的，不知道为什么啊

=============

最好用12%的

作者: zzzz 时间: 2013-4-3 17:18

这位老师辛苦了，最近小弟立春红染色出现问题，100v，1小时，染色出现不规则形状图形，已赶过气泡，上图，请老师帮忙看看是什么问题，怎么解决？

图片附件: 38767993.jpg (2013-4-3 17:18, 3.49 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15499

作者: 蒲公英 时间: 2013-4-3 17:19

请问一下分子量两百多在wb时应该注意些?_?啊？

作者: guagua 时间: 2013-4-3 17:20

常规的western blot实验通过每孔上样的目的蛋白含量不同，与同样的一抗孵育，通过条带的灰度值进行半定量

我做的western blot一抗来源于患者血清，上样时可以保证每孔抗原底物完全相同，然后一抗孵育不同的抗体（患者血清）。我的设计思路是根据条带的灰度值对抗体（患者血清）进行定量，不知道这样是否靠谱？

如果不靠谱的话，有没有什么方法进行改良？

作者: remenb 时间: 2013-4-3 17:21

請教個問題，我做出來的蛋白分子量在60kD 左右，可是，我的目標蛋白是pSTAT3，大概80kD左右。高手們，這是啥問題呢？蛋白被降解了么？以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝！

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:21

这位老师辛苦了，最近小弟立春红染色出现问题，100v，1小时，染色出现不规则形状图形，已赶过气泡，上图，请老师帮忙看看是什么问题，怎么解决？

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跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染色看看效果

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:23

请问一下分子量两百多在wb时应该注意些?_?啊？

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正常操作即可

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:24

常规的western blot实验通过每孔上样的目的蛋白含量不同，与同样的一抗孵育，通过条带的灰度值进行半定量

我做的western blot一抗来源于患者血清，上样时可以保证每孔抗原底物完全相同，然后一抗孵育不同的抗体（患者血清）。我的设计思路是根据条带的灰度值对抗体（患者血清）进行定量，不知道这样是否靠谱？

如果不靠谱的话，有没有什么方法进行改良？

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不是特别靠谱
考虑一下如何消除误差
因为每孔蛋白量相同，但是误差如何排除？
如果可以排除这个蛋白量的误差就可以
目前有一种方法是ELISA，理论上可以定量

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:24

請教個問題，我做出來的蛋白分子量在60kD 左右，可是，我的目標蛋白是pSTAT3，大概80kD左右。高手們，這是啥問題呢？蛋白被降解了么？以下是我用的實驗條件。
cells were lysised by RIPA with protease inhibitor (EDTA-free)
total protein load is about 3ug
10% Bio-Rad gel, 200V for 20min for SDA page
100V for 20min for transfering
5% non-fat milk block 1h; primary antibody 1:2000 incubate overnight; secondary antibody 1:2000 incubate 1h
非常感謝！

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1、没有加蛋白抑制剂及磷酸酶抑制剂？
2、用BSA封闭及孵育抗体
3、样品跑完电泳，SDS-PAGE，用考马斯亮蓝染胶了吗？

作者: standbyme 时间: 2013-4-3 17:25

真心佩服楼主无私奉献
另外请教
我的靶蛋白表达量很低，那么多低就不建议做WB了呢
感谢

作者: ffooll 时间: 2013-4-3 17:25

跑完SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝染色看看效果

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老师你好，我今天做了一次，两块胶，一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，考马斯染色条带很好，但立春红染色依旧是花的，请问是不是说明问题出在转膜上？具体是什么问题，应该怎么改进？谢谢

作者: ero11 时间: 2013-4-3 17:26

请教一下，做的目的蛋白11kd，用的抗体是santa的。做了几次都是是白色的条带，很诧异，不知如何改进。

现提取的蛋白，裂解液中加了PMSF，每孔上样大概8-10ug；现配的胶上层5%、下层15%；电泳80V-120V；转膜稳流200mA、50分钟；现配的5%BSA in TBST封闭1小时；现配的一抗也在5%BSA in TBST中，浓度是1:600，室温半小时-过夜4℃孵育-室温1小时复温；一抗洗膜4次各10分钟；二抗已经是重复利用过一次的了，1:4000的抗兔二抗（直接in TBST），室温1小时；二抗洗膜10分钟1次、6分钟2次；然后就发光了。

坛子里有说二抗上的酶过度催化，会出白色条带，因此可能是抗原过多，或抗体浓度过高的问题，那究竟是一抗高了还是二抗过多？如何进行调整呢？
不胜感激！

图片附件: 63671826.snap.jpg (2013-4-3 17:26, 31.45 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15500

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:26

真心佩服楼主无私奉献
另外请教
我的靶蛋白表达量很低，那么多低就不建议做WB了呢
感谢

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目前WB的敏感性可以到fg级别
基本上的蛋白都可以用WB来检测的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:27

老师你好，我今天做了一次，两块胶，一块用来考马斯亮蓝染色，一块用来转膜，考马斯染色条带很好，但立春红染色依旧是花的，请问是不是说明问题出在转膜上？具体是什么问题，应该怎么改进？谢谢

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1、什么膜？是否正确处理了？
2、湿转还是半干转？
3、转膜条件？
4、如果半干转的话，可能电极板坏了

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:28

请教一下，做的目的蛋白11kd，用的抗体是santa的。做了几次都是是白色的条带，很诧异，不知如何改进。

现提取的蛋白，裂解液中加了PMSF，每孔上样大概8-10ug；现配的胶上层5%、下层15%；电泳80V-120V；转膜稳流200mA、50分钟；现配的5%BSA in TBST封闭1小时；现配的一抗也在5%BSA in TBST中，浓度是1:600，室温半小时-过夜4℃孵育-室温1小时复温；一抗洗膜4次各10分钟；二抗已经是重复利用过一次的了，1:4000的抗兔二抗（直接in TBST），室温1小时；二抗洗膜10分钟1次、6分钟2次；然后就发光了。

坛子里有说二抗上的酶过度催化，会出白色条带，因此可能是抗原过多，或抗体浓度过高的问题，那究竟是一抗高了还是二抗过多？如何进行调整呢？
不胜感激！

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内参图片呢？

作者: KGZ564 时间: 2013-4-3 17:28

发一张前一次的beta-actin和对应的目的蛋白的图吧，因为目的条带都是这样，因此昨天发的图那一次没做内参。
做了4张膜，跑的不同样品。上面一张孵的beta-actin，下面的是目的蛋白，如同昨天一样，显出的是白色条带……

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15502

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:29

发一张前一次的beta-actin和对应的目的蛋白的图吧，因为目的条带都是这样，因此昨天发的图那一次没做内参。
做了4张膜，跑的不同样品。上面一张孵的beta-actin，下面的是目的蛋白，如同昨天一样，显出的是白色条带……

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目的蛋白的一抗浓度试了几个？
二抗与内参用的是相同的吗？

作者: yes4 时间: 2013-4-3 17:29

1、什么膜？是否正确处理了？
2、湿转还是半干转？
3、转膜条件？
4、如果半干转的话，可能电极板坏了

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nc膜，用之前先用转膜缓冲液浸泡15分钟
湿转，100v 1小时或200mA 2小时，两种转膜条件都试过，立春红染色条带总出现不规则的图案。

作者: yes4 时间: 2013-4-3 17:30

夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:30

夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。

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用的试剂是什么公司的？
原装还是分装？

作者: yes4 时间: 2013-4-3 17:31

QUOTE:

原帖由 NBA 于 2013-4-3 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
夹具和转膜装置都换了一套，仍然不理想，请老师帮忙分析下。

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用的试剂是什么公司的？
原装还是分装？

胶、电泳缓冲液、转膜缓冲液都是碧云天的，现配现用，仪器是北京六一的，膜记不清了，以前别人用完剩下的。

作者: jrwyyplt 时间: 2013-4-3 17:31

我最近在做MMP-3，MMP-13，TIMP-1 western blot,做了五遍了，条带不特异，要不就是很淡，我用的是abcam的一抗，因细胞中蛋白浓度太低，蛋白上样15微克，用5%BSA的TBST稀释，4度过夜孵育，二抗1:5000，就是不出条带，请教是何原因，望不吝赐教，多谢了！附图如下：分别是：MMP3，MMP13，TIMP-1，ECL孵育2分钟，曝光时间3分钟，请较老师是否一抗稀释有问题？应如何调整？多谢了！

图片附件: 77859378.jpg (2013-4-3 17:32, 1.93 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15503

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:32

胶、电泳缓冲液、转膜缓冲液都是碧云天的，现配现用，仪器是北京六一的，膜记不清了，以前别人用完剩下的。

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用这些试剂的话
出现这种问题就正常了

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:33

我最近在做MMP-3，MMP-13，TIMP-1 western blot,做了五遍了，条带不特异，要不就是很淡，我用的是abcam的一抗，因细胞中蛋白浓度太低，蛋白上样15微克，用5%BSA的TBST稀释，4度过夜孵育，二抗1:5000，就是不出条带，请教是何原因，望不吝赐教，多谢了！附图如下：分别是：MMP3，MMP13，TIMP-1，ECL孵育2分钟，曝光时间3分钟，请较老师是否一抗稀释有问题？应如何调整？多谢了

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1、二抗稀释度不合适
2、先确定二抗稀释度，再调整一抗稀释度
3、ECL用的是什么地方的？质量不好的ECL本身也会有自发荧光

作者: qumm1985 时间: 2013-4-3 17:33

你好，我现在需要做一个400kpa的大蛋白，请问我应该用多少浓度的分离胶

作者: sunnyB 时间: 2013-4-3 17:33

老师，您好！
我最近要检测小鼠脂肪组织中胰岛素受体的磷酸化水平（p-IR),可以直接做WB，还是需要先做IP把IR提出来之后再检测p-IR?另外，如果要先做IP，做到WB时要怎么进行定量？谢谢！

作者: lixi559 时间: 2013-4-3 17:34

老师，您好！我之前做了肺组织几个蛋白的western blot检测，我是这样提取肺组织总蛋白的：按蛋白提取试剂盒说明书，提取肺组织总蛋白（每100 mg组织加入500 μL裂解液）。但是编辑审稿意见却提出：

本文肺组织SP-B 和SP-C 的Western-blot检测方法，应以该侧肺组织（不论P1还是P14）加相同量的裂解液提取总蛋白，加等量的提取液做电泳，进行蛋白相对表达量分析。因为，P0组的那侧肺的重量肯定少于P7或P14组，按肺组织重量的比例加裂解液，必然使各组的蛋白提取液的蛋白浓度趋于相同。
请问针对这个问题，我该如何回答？非常感谢您！

作者: avi317 时间: 2013-4-3 17:34

前辈，你好!我想请问你做过ERK1/2吗？想请教下ERK1/2的话不是在42,44有两个条带，分析的时候是把两条带同时圈起来计算灰度值还是各自计算灰度值？结果分析时是用P-ERK1/2除以总ERK1/2还是P-ERK1/2除以内参？谢谢！

作者: zsxan1990 时间: 2013-4-3 17:35

请问：我今天用Tris-甘氨酸系统跑电泳，如下图，为什么啊？
1.新鲜配制电泳液，先配5X：Tris 15.1g、Gly 94g、SDS 5g 配成1L，未调PH8.23。
2.80V恒压时，电流才5mA，40mA恒流时电压达300V且电流上不去一直在20mA左右

图片附件: 70473405.snap.jpg (2013-4-3 17:35, 131.8 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15504

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-3 17:35

老师您好！
我在做Mrp家族的转运体时，经常会出现背景很高的问题，我的膜是pvdf膜，转膜后在5%的奶粉中封闭了1h，TBST洗3遍后，一抗孵育过夜或室温2h，TBST洗3遍，二抗孵育，TBST洗三遍曝光，结果如下，同时压了两张胶片后，第一张的背景更高，第二张稍微清洗一下，可还是不能统计，不知道要怎么去解决，请老师给予指点，非常感谢

图片附件: 74778738.jpg (2013-4-3 17:35, 23.58 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15505

作者: ROSE李 时间: 2013-4-3 17:36

楼主大侠：
配蛋白裂解液的时候，磷酸化酶抑制剂加多了，是正常浓度的10倍了，NaF:10mM/L,NaVO4:10mM/L, 会对蛋白质提取有什么影响么？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:36

你好，我现在需要做一个400kpa的大蛋白，请问我应该用多少浓度的分离胶

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最好用梯度胶
5%-15%的

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:36

老师，您好！
我最近要检测小鼠脂肪组织中胰岛素受体的磷酸化水平（p-IR),可以直接做WB，还是需要先做IP把IR提出来之后再检测p-IR?另外，如果要先做IP，做到WB时要怎么进行定量？谢谢！

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先做IP再做WB的话
文献有两种形式：1、用IR来进行，2、用IgG的重链来进行

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:37

老师，您好！我之前做了肺组织几个蛋白的western blot检测，我是这样提取肺组织总蛋白的：按蛋白提取试剂盒说明书，提取肺组织总蛋白（每100 mg组织加入500 μL裂解液）。但是编辑审稿意见却提出：

本文肺组织SP-B 和SP-C 的Western-blot检测方法，应以该侧肺组织（不论P1还是P14）加相同量的裂解液提取总蛋白，加等量的提取液做电泳，进行蛋白相对表达量分析。因为，P0组的那侧肺的重量肯定少于P7或P14组，按肺组织重量的比例加裂解液，必然使各组的蛋白提取液的蛋白浓度趋于相同。
请问针对这个问题，我该如何回答？非常感谢您！

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1、首先这个编辑是个SX or SB
2、加相同量的裂解液提取总蛋白，加等量的提取液就能保证蛋白量相等吗？？？答案是不可能的。
3、对于这样的编辑我表示遗憾，你投别的期刊吧。我没有好的建议
4、再者，你可以回：每100 mg组织加入500 μL裂解液，这个确定的告诉他就是所有组织样品称取的重量都是相同的，加的裂解液也是相同的。

无语ing

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:37

前辈，你好!我想请问你做过ERK1/2吗？想请教下ERK1/2的话不是在42,44有两个条带，分析的时候是把两条带同时圈起来计算灰度值还是各自计算灰度值？结果分析时是用P-ERK1/2除以总ERK1/2还是P-ERK1/2除以内参？谢谢！

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一般是两者加起来的
如果说是分开的话也可以
建议用10%或者8%的分离胶，把42,44分的开一些

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:37

请问：我今天用Tris-甘氨酸系统跑电泳，如下图，为什么啊？
1.新鲜配制电泳液，先配5X：Tris 15.1g、Gly 94g、SDS 5g 配成1L，未调PH8.23。
2.80V恒压时，电流才5mA，40mA恒流时电压达300V且电流上不去一直在20mA左右

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胶跑完染色后什么结果？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:39

老师您好！
我在做Mrp家族的转运体时，经常会出现背景很高的问题，我的膜是pvdf膜，转膜后在5%的奶粉中封闭了1h，TBST洗3遍后，一抗孵育过夜或室温2h，TBST洗3遍，二抗孵育，TBST洗三遍曝光，结果如下，同时压了两张胶片后，第一张的背景更高，第二张稍微清洗一下，可还是不能统计，不知道要怎么去解决，请老师给予指点，非常感谢！

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这个背景确实有点高哈
二抗浓度调整过吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:41

楼主大侠：
配蛋白裂解液的时候，磷酸化酶抑制剂加多了，是正常浓度的10倍了，NaF:10mM/L,NaVO4:10mM/L, 会对蛋白质提取有什么影响么？

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不会有显著性的影响
是抑制剂
没有太大关系

作者: u234 时间: 2013-4-3 17:42

谢谢前辈！
还想请问下我用image j分析P-ERK1/2和ERK1/2之后是不是用P-ERK1/2除以ERK1/2，算出比值，看各组的变化趋势？
是不是做信号通路都是用磷酸化的/总的，不需要和内参做比较？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:42

老师您好！
我在做Mrp家族的转运体时，经常会出现背景很高的问题，我的膜是pvdf膜，转膜后在5%的奶粉中封闭了1h，TBST洗3遍后，一抗孵育过夜或室温2h，TBST洗3遍，二抗孵育，TBST洗三遍曝光，结果如下，同时压了两张胶片后，第一张的背景更高，第二张稍微清洗一下，可还是不能统计，不知道要怎么去解决，请老师给予指点，非常感谢！

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这个背景确实有点高哈
二抗浓度调整过吗？

老师：
这个浓度后来调整过，原来一抗是1:200，二抗是1:3000，后来调整为一抗1:3000，二抗1:5000，最后的结果就是背景变浅了，可是目标条带也变浅了，没有办法进行统计，一抗用的是博奥森的，二抗是中杉金桥的。请问老师是不是还可以有什么办法可以解决？非常感谢！

作者: yonger 时间: 2013-4-3 17:42

1、二抗稀释度不合适
2、先确定二抗稀释度，再调整一抗稀释度
3、ECL用的是什么地方的？质量不好的ECL本身也会有自发荧光

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二抗1:5000稀释的，ECL是普利来进口分装的，以前做p-ERK, ERK蛋白时都没问题的。另外，如何调整一抗和二抗浓度，是往高调还是进一步稀释？多谢了！

作者: 33号 时间: 2013-4-3 17:43

做大批量实验的时候发现部分样本的部分蛋白（有些是内参）在曝光时，X光片30kDa一下有星星点点的杂点，但是转膜后丽春红染色没有这些杂点，请问楼主到底是样本的问题、抗体的问题还是封闭的问题？

作者: greenbee 时间: 2013-4-3 17:43

做到转膜这一步都还好膜上也有marker 但是曝光时什么都没有。。。要不就是很少的条带而且很暗。。。求指教啊！

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:44

谢谢前辈！
还想请问下我用image j分析P-ERK1/2和ERK1/2之后是不是用P-ERK1/2除以ERK1/2，算出比值，看各组的变化趋势？
是不是做信号通路都是用磷酸化的/总的，不需要和内参做比较？
谢谢！

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磷酸化/总的
内参一般用于调整上样量
因为都用内参的话，相当于消掉了

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:44

做到转膜这一步都还好膜上也有marker 但是曝光时什么都没有。。。要不就是很少的条带而且很暗。。。求指教啊！！！！！！！！！！！！！！！！

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转膜后用丽春红染色了吗/

作者: moonlight45 时间: 2013-4-3 17:45

转膜后用丽春红染色了吗/

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没有染色呢。。。因为之前师姐做从没染过色但是都曝的很好。。。

作者: popo520 时间: 2013-4-3 17:45

我今天刚刚做了个western blot，出现了一个很奇怪的现象，就是曝光后为什么马克泳道上面也出现了显影？请老师分析一下这种现象对吗？下面是图片

图片附件: 86358962.jpg (2013-4-3 17:45, 66.02 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15506

作者: popo520 时间: 2013-4-3 17:45

左手边上的那条就是马克条带，你看看出现这样的现象怎么解释？那地方有问题？谢谢您

作者: greenbee 时间: 2013-4-3 17:46

您好,老师,我想问一下,蛋白酶抑制剂加几种合适?是不是把配方里的抑制剂都加上,细胞裂解时蛋白降解的少?另外,我的目的蛋白内源性表达为9KD,是个核蛋白,过表达的蛋白为30-40KD大小,可是我坐了3次WBl,每次都是内参可以跑出条带,但是目的蛋白没有跳带?我想问一下,我应该如何改进实验,才能做出来,谢谢了,辛苦您了,

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:46

没有染色呢。。。因为之前师姐做从没染过色但是都曝的很好。。。

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请染色

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:47

我今天刚刚做了个western blot，出现了一个很奇怪的现象，就是曝光后为什么马克泳道上面也出现了显影？请老师分析一下这种现象对吗？下面是图片

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marker有条带是正常的
这个要从抗体制备开始考虑

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:47

您好,老师,我想问一下,蛋白酶抑制剂加几种合适?是不是把配方里的抑制剂都加上,细胞裂解时蛋白降解的少?另外,我的目的蛋白内源性表达为9KD,是个核蛋白,过表达的蛋白为30-40KD大小,可是我坐了3次WBl,每次都是内参可以跑出条带,但是目的蛋白没有跳带?我想问一下,我应该如何改进实验,才能做出来,谢谢了,辛苦您了,

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我们用的是Roche的蛋白酶抑制剂，混合的
9KD电泳的时候需要注意下
过表达的30-40K的可以检测到吗？

作者: wmp1234 时间: 2013-4-3 17:47

请染色

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噢染色会影响后面抗体结合吗？还有我上午又做了一次还是没有
曝光后的膜没有扔还能染色吗?

作者: abc816 时间: 2013-4-3 17:48

老师您好：我做肝组织的western blot实验，目的蛋白有包浆也有胞核蛋白，有几个问题请教。1：我的蛋白提取和普通组织提取是否一样就可以？我这两次测出的蛋白浓度都很高，最好应该在什么范围？上样量在多少比较好？2,：我用的碧云天普通的裂解液是否可以？核内蛋白能裂解出来吗？3：磷酸酶抑制剂用加吗？组织离心我用的是15000G，15MIN，可以吗？4：我做的蛋白是PKC和p38，老师能根据蛋白给点宝贵建议吗？做了好几次都没出来

作者: newway 时间: 2013-4-3 17:48

楼主，我最近在做分子量是十几的蛋白，可是一直做不出来，一抗浓度是1：2000，二抗是1:2000。胶的浓度是15%，转膜条件是100mA, 60min。一抗是4度过夜，二抗是室温孵育1个小时。同样的膜上压出来的atin的效果很好。我想知道，做不出来的原因可能有哪些，有什么可以改善的地方。非常感谢

作者: JK.jon 时间: 2013-4-3 17:48

请教老师一个问题，我现在做Rat的肌肉组织，检测蛋白是GLUT4，用过santa和博士德的抗体，说明书上注明是50kd左右，但是现在曝光出来在43kd和34kd出现很明显的条带，压片很久才在55kd左右才会有条很弱的带，GLUT4应该是在肌肉组织里面是特异性的表达，其他人推荐我提取膜蛋白，因为GLUT4是在膜上表达，是不是蛋白在哪里表达就提取哪里的蛋白？
还有就是，我在同一张膜上面，上部分做80kd左右的蛋白，下部分做GLUT4，但是GLUT4曝光出来后出现竖条的背景，正常的条带应该是水平的一条，两个蛋白做的条件都是一样的，封闭是5%牛奶37°C 1h，一抗是4°C过夜，两者一抗来源是一样的，二抗是1：20000 室温1h。后来我将样本离心后再上样，还是出现竖条的背景，希望老师给点建议。谢谢

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:49

噢染色会影响后面抗体结合吗？还有我上午又做了一次还是没有
曝光后的膜没有扔还能染色吗?

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不会有影响
可以染色

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:49

老师您好：我做肝组织的western blot实验，目的蛋白有包浆也有胞核蛋白，有几个问题请教。1：我的蛋白提取和普通组织提取是否一样就可以？我这两次测出的蛋白浓度都很高，最好应该在什么范围？上样量在多少比较好？2,：我用的碧云天普通的裂解液是否可以？核内蛋白能裂解出来吗？3：磷酸酶抑制剂用加吗？组织离心我用的是15000G，15MIN，可以吗？4：我做的蛋白是PKC和p38，老师能根据蛋白给点宝贵建议吗？做了好几次都没出来

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1、提取总蛋白即可
2、这个裂解液我不知道效果如何
3、如果做磷酸化蛋白需要加的
4、PKC与p38还是灰常好做的哈
裂解液需要的话
我可以给你点我的产品试试

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:49

楼主，我最近在做分子量是十几的蛋白，可是一直做不出来，一抗浓度是1：2000，二抗是1:2000。胶的浓度是15%，转膜条件是100mA, 60min。一抗是4度过夜，二抗是室温孵育1个小时。同样的膜上压出来的atin的效果很好。我想知道，做不出来的原因可能有哪些，有什么可以改善的地方。非常感谢

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目的蛋白是什么？
抗体哪里来的？

作者: NBA 时间: 2013-4-3 17:50

请教老师一个问题，我现在做Rat的肌肉组织，检测蛋白是GLUT4，用过santa和博士德的抗体，说明书上注明是50kd左右，但是现在曝光出来在43kd和34kd出现很明显的条带，压片很久才在55kd左右才会有条很弱的带，GLUT4应该是在肌肉组织里面是特异性的表达，其他人推荐我提取膜蛋白，因为GLUT4是在膜上表达，是不是蛋白在哪里表达就提取哪里的蛋白？
还有就是，我在同一张膜上面，上部分做80kd左右的蛋白，下部分做GLUT4，但是GLUT4曝光出来后出现竖条的背景，正常的条带应该是水平的一条，两个蛋白做的条件都是一样的，封闭是5%牛奶37°C 1h，一抗是4°C过夜，两者一抗来源是一样的，二抗是1：20000 室温1h。后来我将样本离心后再上样，还是出现竖条的背景，希望老师给点建议。谢谢

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1、GLUT4抗体，abcam有一个比较好用的
2、actin效果如何？放图上来

作者: kulee 时间: 2013-4-3 17:50

你好，做了比较久的WESTERN了，但是有个问题一直搞不清楚。
某种蛋白的抗体比如说p53抗体（CST牌子），我做过，特异性很好。但我不清楚，做出来的条带代表的是否有可能是突变型p53呢？抑或这是磷酸化状态的p53？请指教，谢谢

作者: zwsyrt 时间: 2013-4-3 17:50

过表达的也没有出来，所以我怀疑是抗体出问题了。

作者: ladyhuahua 时间: 2013-4-5 09:31

另一个问题，我一个朋友要做FGF23受体的抗体

但是我根本查不到这种抗体，只能查到FGF23的抗体，或者FGF 受体抗体

请问如何选择呢？

作者: remenb 时间: 2013-4-5 09:31

我是做WB的新手，想请教一下，老鼠股骨中提取蛋白的具体方法，提出的效果如何？

作者: memory 时间: 2013-4-5 09:32

各位老师，你们好！最近做实验遇到两个个问题想请教下大家：1，你们一般都是用哪个公司的发光剂，我们这边的发光剂用起来都不怎么好使，麻烦你们给推荐几个比较好用的。2，昨天我们用一抗二抗去除液（强碱型）再用丽春红染色后发现条带变得很淡了，想问问大家有没有遇到过类似的情况，强碱可以减少PVDF膜上的蛋白么？谢了、、、

作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:38

过表达的也没有出来，所以我怀疑是抗体出问题了。
系统稳定的情况下

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可能是抗体出问题了
不能下定论
还有几个因素要排除的

作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:38

你好，做了比较久的WESTERN了，但是有个问题一直搞不清楚。
某种蛋白的抗体比如说p53抗体（CST牌子），我做过，特异性很好。但我不清楚，做出来的条带代表的是否有可能是突变型p53呢？抑或这是磷酸化状态的p53？请指教，谢谢

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这个需要与购买抗体的公司联系，看一下它这个抗体的抗原序列
要从序列开始分析

作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:39

另一个问题，我一个朋友要做FGF23受体的抗体

但是我根本查不到这种抗体，只能查到FGF23的抗体，或者FGF 受体抗体

请问如何选择呢？

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以FGF23 receptor查不到
这个名称对吗？
FGF23抗体是有的

作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:40

各位老师，你们好！最近做实验遇到两个个问题想请教下大家：1，你们一般都是用哪个公司的发光剂，我们这边的发光剂用起来都不怎么好使，麻烦你们给推荐几个比较好用的。2，昨天我们用一抗二抗去除液（强碱型）再用丽春红染色后发现条带变得很淡了，想问问大家有没有遇到过类似的情况，强碱可以减少PVDF膜上的蛋白么？谢了、、、

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我们用Millipore的
货号：WBKLS0500

作者: wood533 时间: 2013-4-5 09:40

我需要做的有 TGF-beta，VEGF,E-钙粘素，阿尔法-SMA，TAK1，NF-kB，COL-1和FN的WB，其中对于COL-1和FN买的是Abcam的抗体。不知道分子量大小是多少？总是查不到特别准确的。不知道前辈可否有经验？对于以上的指标检测有没有特别难度大的?

作者: NBA 时间: 2013-4-5 09:40

我需要做的有 TGF-beta，VEGF,E-钙粘素，阿尔法-SMA，TAK1，NF-kB，COL-1和FN的WB，其中对于COL-1和FN买的是Abcam的抗体。不知道分子量大小是多少？总是查不到特别准确的。不知道前辈可否有经验？对于以上的指标检测有没有特别难度大的?

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这些我都检测过
抗体好使的话没什么难度
分子量说明书没有吗？

作者: dongdongqiang 时间: 2013-4-5 10:08

亲，我是新手，想问问80v转120v电压时，蛋白的大小和胶的对应浓度之间的关系；而且有一种说法是300mA转膜的话，1kd等于1分钟，想确认这样的说法是否可靠；最后一问，santa的一抗，室温1h好一些还是4度过夜好一些。十分感谢！

作者: IAM007 时间: 2013-4-5 10:09

我现在在进行特定细胞器提取蛋白的试验，由于技术所限，每次得到的样品只有20-30uL，推测浓度在100ug/ml以下。
现在要做IP，肯定要求上样量一致，但是我们用BCA的Kit无法检测出样品浓度。试验组和对照组有细胞器含量的差异，因此也不能采取细胞数一致的方法来上样。
现在摸索着跑了几次IP，都有上样量的差异，求助！
另：我们实验室没有分光光度计....只有酶标仪

作者: yes4 时间: 2013-4-5 10:10

老师你好！我又来跟你请教问题了。我的目的蛋白还是没有做出来，现在是一点都做不出来了。我的实验条件如下：
电泳：80V浓缩胶，110V分离胶。
转膜:250mA 90min
5%脱脂牛奶封闭2小时
一抗：20小时
二抗：2小时
目的蛋白是29KD的，因为我提取的蛋白的浓度较低，所以为了保证40ug的上样量每次上样25ul。
请指教！

作者: xue258 时间: 2013-4-5 10:10

老师您好：我今天提了一批肝组织蛋白，强效裂解液，1：7.5提取的，测出的浓度还是很高，平均都在20ug/ul，如果按上样量100ug的话，上5ul就可以了吗？会不会有影响啊，这样的浓度我都不知道该咋办了，期待老师的意见

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:10

亲，我是新手，想问问80v转120v电压时，蛋白的大小和胶的对应浓度之间的关系；而且有一种说法是300mA转膜的话，1kd等于1分钟，想确认这样的说法是否可靠；最后一问，santa的一抗，室温1h好一些还是4度过夜好一些。十分感谢！

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1、一般我们转膜是300mA， 20KD以上的蛋白，每KD是基本上1min
2、一抗一般都是4度过夜

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:12

我现在在进行特定细胞器提取蛋白的试验，由于技术所限，每次得到的样品只有20-30uL，推测浓度在100ug/ml以下。
现在要做IP，肯定要求上样量一致，但是我们用BCA的Kit无法检测出样品浓度。试验组和对照组有细胞器含量的差异，因此也不能采取细胞数一致的方法来上样。
现在摸索着跑了几次IP，都有上样量的差异，求助！
另：我们实验室没有分光光度计....只有酶标仪

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样品量太少，没辙

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:13

老师你好！我又来跟你请教问题了。我的目的蛋白还是没有做出来，现在是一点都做不出来了。我的实验条件如下：
电泳：80V浓缩胶，110V分离胶。
转膜:250mA 90min
5%脱脂牛奶封闭2小时
一抗：20小时
二抗：2小时
目的蛋白是29KD的，因为我提取的蛋白的浓度较低，所以为了保证40ug的上样量每次上样25ul。
请指教！

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目的蛋白名称？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:13

老师您好：我今天提了一批肝组织蛋白，强效裂解液，1：7.5提取的，测出的浓度还是很高，平均都在20ug/ul，如果按上样量100ug的话，上5ul就可以了吗？会不会有影响啊，这样的浓度我都不知道该咋办了，期待老师的意见

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蛋白变性的时候要稀释样品，调整到2-4ug/ul

作者: yjf1026 时间: 2013-4-5 10:14

老师，您说的再稀释是煮蛋白前还是煮蛋白后？麻烦了

作者: avi317 时间: 2013-4-5 10:15

目的蛋白名称？

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AQP2

作者: 8princess8 时间: 2013-4-5 10:16

从外周血提的蛋白，分子量50kd，上样量30ug，50，100v电泳，200mA,1.5h湿转，5%脱脂奶粉室温封闭1.5小时，Abcam抗 1：1000TBST稀释（说明书上的图片推荐1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1小时。都是TBST洗膜3*10min，TBS洗膜1*10min。actin和目的条带还可以，可是背景特别深，还请各位高手指点迷津。

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作者: 阿k 时间: 2013-4-5 10:16

fangweibin119 wrote:
不会有影响
可以染色

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染过之后有的有红色条带有的没有他们都说蛋白的问题不大。。。。最近做还是曝不出来我做的是akt pakt您以前做过吗给点建议吧。。。。要崩溃了啊。。。

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:17

老师，您说的再稀释是煮蛋白前还是煮蛋白后？麻烦了

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变性蛋白前

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:18

AQP2

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这个是膜蛋白
不是很好检测，抗体本身会有很大的原因

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:18

从外周血提的蛋白，分子量50kd，上样量30ug，50，100v电泳，200mA,1.5h湿转，5%脱脂奶粉室温封闭1.5小时，Abcam抗 1：1000TBST稀释（说明书上的图片推荐1：1000）4°C孵过夜，国产二抗1：5000TBST稀释（推荐1：5000-1：10000）室温1小时。都是TBST洗膜3*10min，TBS洗膜1*10min。actin和目的条带还可以，可是背景特别深，还请各位高手指点迷津。

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调整一下二抗稀释度
用1:10000
室温孵育30min
洗膜：3min *5-6次

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:18

染过之后有的有红色条带有的没有他们都说蛋白的问题不大。。。。最近做还是曝不出来我做的是akt pakt您以前做过吗给点建议吧。。。。要崩溃了啊。。。

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这些都很好做啊
如果内参做的很好的话
考虑抗体的问题

作者: lixi559 时间: 2013-4-5 10:19

老师，您好：
1、蛋白名称：CYP1A1
2、组织还是细胞：肝癌细胞
3、种属：人
我刚开始接触这一部分，弱弱的咨询一下您。我要做western，打算买satan的抗体，我想问一下老师，这个能不能有结果？能做出蛋白条带吗？

作者: 8princess8 时间: 2013-4-5 10:20

老师，我做的内参（两个都是）为什么是这个样子呢？重影了，请问最可能的原因是什么？我上样量都是8微升啊

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作者: 33号 时间: 2013-4-5 10:22

老师你好，我最近做WB遇到了些麻烦，想显的蛋白分子量不到10Kd，一直不出。尝试过把分离胶的浓度调大到15%，但是跑完电泳后，17Kd的那条marker就有些模糊了，10Kd的marker就直接是smear了，所以我估计我的目的蛋白很可能像marker一样都弥散了，该改进哪些条件呢？谢谢

作者: 3N4G 时间: 2013-4-5 10:23

老师您好，我是新手，今天第一次做，我们转膜后marker的条带变得很浅，小于72kD的基本上全都没有，请问是什么原因？还能继续做吗？谢谢老师?

作者: 3N4G 时间: 2013-4-5 10:24

还有老师，1.0 1.5 0.75 的板子区别在哪里，我们不做定量，老师说按每孔20微升加样，应该选什么样的板子呀？我们目的蛋白大概28kD，内参定的actin，应该选什么样的板子和多大浓度的胶呢？一张膜如果裁开，可以跟几个一抗孵呀？

作者: duoduo 时间: 2013-4-5 10:35

大家好，我现在刚刚开始做实验，今天做了个western blot，但是结果很差劲，下面两幅图是同时做的，步骤都是一样的，但是actin背景还算可以，可是目的蛋白的背景就是一片黑，我用的抗体是多克隆的，但是不至于是一片黑吧，请大家帮我分析一下，还有可能是那些问题？谢谢

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作者: lxh031 时间: 2013-4-5 10:36

做磷酸化AKT，蛋白大小60KD，上样量为60ng，用12%的胶80v变120v，跑2个半小时，转膜1小时10分钟，TBST洗两次，每次10分钟，cell signaling的一抗1:1000，4度过夜，二抗兔抗1:15000,2小时，洗膜扫膜。内参清晰，但没有目的条带？！做western前一天提的蛋白，加磷酸酶抑制剂却依然没有条带。请教前辈可否知道原因，或是该做哪些调整，不胜感激。

作者: mimili_901 时间: 2013-4-5 10:36

您好老师，初来乍到问一些初级问题，一抗、二抗用什么溶液稀释效果比较好，封闭膜用的封闭液用什么效果较好，谢谢？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:37

老师您好〜我想知道曝光的时候能不能让marker也出现影像。听说可以曝白光，可以吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:38

老师，您好：
1、蛋白名称：CYP1A1
2、组织还是细胞：肝癌细胞
3、种属：人
我刚开始接触这一部分，弱弱的咨询一下您。我要做western，打算买satan的抗体，我想问一下老师，这个能不能有结果？能做出蛋白条带吗？

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这个有没有结果需要通过实验来确定

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:39

老师，我做的内参（两个都是）为什么是这个样子呢？重影了，请问最可能的原因是什么？我上样量都是8微升啊

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1、样品降解
2、胶的问题

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:40

老师你好，我最近做WB遇到了些麻烦，想显的蛋白分子量不到10Kd，一直不出。尝试过把分离胶的浓度调大到15%，但是跑完电泳后，17Kd的那条marker就有些模糊了，10Kd的marker就直接是smear了，所以我估计我的目的蛋白很可能像marker一样都弥散了，该改进哪些条件呢？谢谢

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小分子量蛋白是很容易smear的
建议用梯度胶或者tris-tricine胶试试
小于10KD用wb来检测其实很难的

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:40

老师您好，我是新手，今天第一次做，我们转膜后marker的条带变得很浅，小于72kD的基本上全都没有，请问是什么原因？还能继续做吗？谢谢老师?

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转膜条件是？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:40

大家好，我现在刚刚开始做实验，今天做了个western blot，但是结果很差劲，下面两幅图是同时做的，步骤都是一样的，但是actin背景还算可以，可是目的蛋白的背景就是一片黑，我用的抗体是多克隆的，但是不至于是一片黑吧，请大家帮我分析一下，还有可能是那些问题？谢谢

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调整二抗孵育时间，室温 30min
及二抗的稀释度

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:41

做磷酸化AKT，蛋白大小60KD，上样量为60ng，用12%的胶80v变120v，跑2个半小时，转膜1小时10分钟，TBST洗两次，每次10分钟，cell signaling的一抗1:1000，4度过夜，二抗兔抗1:15000,2小时，洗膜扫膜。内参清晰，但没有目的条带？！做western前一天提的蛋白，加磷酸酶抑制剂却依然没有条带。请教前辈可否知道原因，或是该做哪些调整，不胜感激。

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上样量 60ng？
这也太少了吧
非磷酸化的Akt做的怎么样？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:41

老师您好?我想知道曝光的时候能不能让marker也出现影像。听说可以曝白光，可以吗？

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有可以曝光的marker

作者: am10 时间: 2013-4-5 10:42

您好，许久没做wb，结果今天封闭用水配了牛奶，2h，后发现改用tbst配了，孵育1h，不知会有什么后果呢？T^T 求解，谢谢~

作者: c86v 时间: 2013-4-5 10:42

非磷酸化还是很清楚的，但是磷酸化条带非常不清。前辈觉得上样量多少合适？

作者: standbyme 时间: 2013-4-5 10:43

下面这种图的4 和5是IP会SDS-PAGE电泳后银染的结果。3是目的蛋白的重组蛋白，也就是我的目的蛋白在~72kd的位置，4和5都是用目的蛋白抗体做的IP，可是最后银染的结果是这样的。在泳道的大分子量位置有这么两条带，我之前做出来在重组蛋白同等位置的条带的，也就是4 和5的样本中可以拉到目的蛋白的。想问问是什么原因可能出现这样的状况呢？比如说loading buffer是非还原性的会不会到这这样的结果呢？这些大分子量蛋白是络合物么？谢谢！万分感谢。

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作者: INK 时间: 2013-4-5 10:44

这个是膜蛋白
不是很好检测，抗体本身会有很大的原因

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那我提取的时候要用膜蛋白试剂盒吗？还是加大离心的转速就可以啊？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:44

您好，许久没做wb，结果今天封闭用水配了牛奶，2h，后发现改用tbst配了，孵育1h，不知会有什么后果呢？T^T 求解，谢谢~

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没问题

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:50

非磷酸化还是很清楚的，但是磷酸化条带非常不清。前辈觉得上样量多少合适？

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我们上样
细胞10-20ug（常用15ug）
组织20-40ug（常用20ug）

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:50

下面这种图的4 和5是IP会SDS-PAGE电泳后银染的结果。3是目的蛋白的重组蛋白，也就是我的目的蛋白在~72kd的位置，4和5都是用目的蛋白抗体做的IP，可是最后银染的结果是这样的。在泳道的大分子量位置有这么两条带，我之前做出来在重组蛋白同等位置的条带的，也就是4 和5的样本中可以拉到目的蛋白的。想问问是什么原因可能出现这样的状况呢？比如说loading buffer是非还原性的会不会到这这样的结果呢？这些大分子量蛋白是络合物么？谢谢！万分感谢。
loading 非还原会出现这种情况
大分子量是：IgG未打开二硫键的结果

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:51

那我提取的时候要用膜蛋白试剂盒吗？还是加大离心的转速就可以啊？

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能提取总蛋白进行检测的话
就不需要提取膜蛋白来进行

作者: 831226 时间: 2013-4-5 10:51

请问版主，电泳缓冲液及转膜缓冲液中用tirs-Hcl和tris-base有分别吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:51

请问版主，电泳缓冲液及转膜缓冲液中用tirs-Hcl和tris-base有分别吗？

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有区别
电泳及转膜用Tris-base

作者: kswl870 时间: 2013-4-5 10:52

各位WB高手，我是新手，有好多问题不太懂，这张图片是我最近做的，显影后就是这种的，最近做了好几次都是这样的，我不知道哪里能有问题，麻烦各位高手把你们能想到的可能的问题都提出来一下吧，我学习学习，谢谢了哈

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作者: ukonptp 时间: 2013-4-5 10:53

老师，上图是内参
下图是marker（250kd和130kd）和目的蛋白（trpm2通道蛋白，171kd）。。
我怎么跑了好多次都是出来两条带呢。
谢谢楼主，太辛苦了!

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作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:54

各位WB高手，我是新手，有好多问题不太懂，这张图片是我最近做的，显影后就是这种的，最近做了好几次都是这样的，我不知道哪里能有问题，麻烦各位高手把你们能想到的可能的问题都提出来一下吧，我学习学习，谢谢了哈

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做的是什么蛋白啊？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:54

各位WB高手，我是新手，有好多问题不太懂，这张图片是我最近做的，显影后就是这种的，最近做了好几次都是这样的，我不知道哪里能有问题，麻烦各位高手把你们能想到的可能的问题都提出来一下吧，我学习学习，谢谢了哈

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内参的条带呢？结果如何？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 10:58

老师，上图是内参
下图是marker（250kd和130kd）和目的蛋白（trpm2通道蛋白，171kd）。。
我怎么跑了好多次都是出来两条带呢。
谢谢楼主，太辛苦了!

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出现这种情况也是正常的
看看这种蛋白是否存在剪切片段

作者: kuohao17 时间: 2013-4-5 10:58

那是我做的肠癌细胞的蛋白，这是我的GAPDH，我就是好困惑为啥有些地方有，有些地方又没有，是**作的问题还是什么呢？

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作者: kuohao17 时间: 2013-4-5 10:59

是我哪个细节做得不够么？

作者: yes4 时间: 2013-4-5 11:00

我刚开始做Western,在向师兄师姐学习阶段，想请教老师几个问题：
1、我的目的蛋白是25KD,35KD双条带的以及39KD的，内参是55KD,想求教一下，跑这两种目的蛋白时分别用什么浓度的胶才更合理，可以把条带分开，方便切膜。之前的问题主要是25、35分不开和55和39总是挨得太近，切膜孵一抗时怕把想要的条带切错位了。
2、一个师兄告诉我小分子量要在低温下跑，师姐又说不需要，冰上跑得太慢，电泳时间一长对蛋白不好，就想问明白，在冰上跑是为了什么？电泳的电压除了影响跑胶的速度和太高了损伤蛋白以外，对WB过程还有哪方面的影响？以上的分子量，最好的电压条件是什么？
3、我的分子量转膜时应该用多大电流，多长时间才合适？电流大小的影响要怎么分析？
谢谢！

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:00

那是我做的肠癌细胞的蛋白，这是我的GAPDH，我就是好困惑为啥有些地方有，有些地方又没有，是**作的问题还是什么呢？

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蛋白定量不是很准等误差造成的

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:01

我刚开始做Western,在向师兄师姐学习阶段，想请教老师几个问题：
1、我的目的蛋白是25KD,35KD双条带的以及39KD的，内参是55KD,想求教一下，跑这两种目的蛋白时分别用什么浓度的胶才更合理，可以把条带分开，方便切膜。之前的问题主要是25、35分不开和55和39总是挨得太近，切膜孵一抗时怕把想要的条带切错位了。
2、一个师兄告诉我小分子量要在低温下跑，师姐又说不需要，冰上跑得太慢，电泳时间一长对蛋白不好，就想问明白，在冰上跑是为了什么？电泳的电压除了影响跑胶的速度和太高了损伤蛋白以外，对WB过程还有哪方面的影响？以上的分子量，最好的电压条件是什么？
3、我的分子量转膜时应该用多大电流，多长时间才合适？电流大小的影响要怎么分析？
谢谢！

==================================

1、12%的胶就可以
别切胶
2、常温就可以
3、300mA 湿转，恒流，40min即可

作者: 49888 时间: 2013-4-5 11:01

老师您好，我是western新手，我们实验室刚建立起这项技术，还不成熟，
最近尝试做actin，转膜时预染marker全转上去了，可是加ECL时候没发光，压片1分钟，什么都没有，结果压了30分钟才有。我知道这肯定不对。谁知道最近连marker在电泳的时候都没有了……求解！

作者: mamamiya 时间: 2013-4-5 11:02

老师您好，最近做了一次western，遇到如下问题：
1.尽管上样体积很小，但是加完样跑一段时间后看别人的都是齐齐的一条线，我的却像小山丘一样参差不齐，丑啊丑啊
2，扫膜出来的结果是每个泳道明显长短不一，上样量是一致的呀，我的有三个样，中间那个明显粗壮，两边的细长。百思不得其解。特此请教，万分感谢了。谢谢呢！

作者: www.1 时间: 2013-4-5 11:02

我刚开始做Western,在向师兄师姐学习阶段，想请教老师几个问题：
1、我的目的蛋白是25KD,35KD双条带的以及39KD的，内参是55KD,想求教一下，跑这两种目的蛋白时分别用什么浓度的胶才更合理，可以把条带分开，方便切膜。之前的问题主要是25、35分不开和55和39总是挨得太近，切膜孵一抗时怕把想要的条带切错位了。
2、一个师兄告诉我小分子量要在低温下跑，师姐又说不需要，冰上跑得太慢，电泳时间一长对蛋白不好，就想问明白，在冰上跑是为了什么？电泳的电压除了影响跑胶的速度和太高了损伤蛋白以外，对WB过程还有哪方面的影响？以上的分子量，最好的电压条件是什么？
3、我的分子量转膜时应该用多大电流，多长时间才合适？电流大小的影响要怎么分析？
谢谢！

==============================================================================================================

1、12%的胶就可以
别切胶
2、常温就可以
3、300mA 湿转，恒流，40min即可
非常感谢您的意见！
还有些问题：
1、我并没切胶，是孵一抗前要把转好的膜的Tublin 和目的蛋白相应的地方切下来，分别孵一抗，因为我们一抗是4度过夜，如果不切膜，分两次孵内参和目的蛋白，就要多花一天了。
2、常温跑的话是不是电压就不能太高？之前用15%的胶，跑的太慢，所以电压用到150V,甚至200v，这样的高电压，再加上为了让25KD和35KD分得开一些，跑的时间又比较长，常温跑会不会使电泳温度太高？

作者: zhenxin 时间: 2013-4-5 11:03

NBA老师，我刚开始做western，
我蛋白分子量10 KD和18 KD，还有一个75KD的。
12%的胶， marker跑的不错。两个小分子蛋白湿转转膜恒流320mA，30min，0.45的pdvf膜，总是跑不出来结果。
请老师指导下这3个分子的转膜合适条件。

作者: mimili_901 时间: 2013-4-5 11:03

大侠，我电泳的时候marker很清楚，很直。转膜时同批配的胶分在两个转膜仪上半干转，有的胶转完后很清楚，marker也很好，但有两块胶marker完全看不清楚。不知道是怎么回事，不知大家碰到过这样的情况没有，原因在哪里？

作者: langlang 时间: 2013-4-5 11:03

老师你好，最近有个课题目的基因表达太低，做QPCR都需要用巢式才能做出来，所以目的蛋白的western blot结果很不理想，条带非常淡，想请教针对这种低表达的western blot从哪些方便改进可以得到较好的结果。谢谢。

作者: wood533 时间: 2013-4-5 11:04

左边2膜为目的条带，右边2膜为actin
WB步骤：
5%脱脂牛奶37℃封闭1h
洗脱10Min*3
一抗4℃孵育过夜
37℃复温1h
洗脱10min*3
二抗室温孵育2h
洗脱10min*3
ECL显色
不知道为何目的条带一片黑，谢谢老师！

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作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:05

老师您好，我是western新手，我们实验室刚建立起这项技术，还不成熟，
最近尝试做actin，转膜时预染marker全转上去了，可是加ECL时候没发光，压片1分钟，什么都没有，结果压了30分钟才有。我知道这肯定不对。谁知道最近连marker在电泳的时候都没有了……求解！

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用丽春红染色
确保蛋白转到膜上去了
而不只是marker转上去了

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:05

老师您好，最近做了一次western，遇到如下问题：
1.尽管上样体积很小，但是加完样跑一段时间后看别人的都是齐齐的一条线，我的却像小山丘一样参差不齐，丑啊丑啊
2，扫膜出来的结果是每个泳道明显长短不一，上样量是一致的呀，我的有三个样，中间那个明显粗壮，两边的细长。百思不得其解。特此请教，万分感谢了。谢谢呢！

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1、样品浓度太高
2、离子成分不同

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:05

1、12%的胶就可以
别切胶
2、常温就可以
3、300mA 湿转，恒流，40min即可
非常感谢您的意见！
还有些问题：
1、我并没切胶，是孵一抗前要把转好的膜的Tublin 和目的蛋白相应的地方切下来，分别孵一抗，因为我们一抗是4度过夜，如果不切膜，分两次孵内参和目的蛋白，就要多花一天了。
2、常温跑的话是不是电压就不能太高？之前用15%的胶，跑的太慢，所以电压用到150V,甚至200v，这样的高电压，再加上为了让25KD和35KD分得开一些，跑的时间又比较长，常温跑会不会使电泳温度太高？

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切胶与切膜是一个意思
做预实验的时候不要切膜
电压150-160K就可以

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:06

我刚开始做western，
我蛋白分子量10 KD和18 KD，还有一个75KD的。
12%的胶， marker跑的不错。两个小分子蛋白湿转转膜恒流320mA，30min，0.45的pdvf膜，总是跑不出来结果。
请老师指导下这3个分子的转膜合适条件。

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大分子：300mA，恒流，1h，0.45um膜
小分子：300mA，恒流，20min，0.22um膜

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:06

老师你好，最近有个课题目的基因表达太低，做QPCR都需要用巢式才能做出来，所以目的蛋白的western blot结果很不理想，条带非常淡，想请教针对这种低表达的western blot从哪些方便改进可以得到较好的结果。谢谢。

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WB用的是ECL发光照相还是胶片曝光？
ECL用的是哪个公司的？货号？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:07

左边2膜为目的条带，右边2膜为actin
WB步骤：
5%脱脂牛奶37℃封闭1h
洗脱10Min*3
一抗4℃孵育过夜
37℃复温1h
洗脱10min*3
二抗室温孵育2h
洗脱10min*3
ECL显色
不知道为何目的条带一片黑，谢谢老师！

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1、封闭室温不超过30min
2、洗膜：一抗与二抗，均3min，5-6次
3、二抗室温孵育不要超过40min
4、二抗的浓度是否合适

作者: ending 时间: 2013-4-5 11:07

麻烦看一下下图，跑出来是这样的，左边红色marker为55Kda，我的目的蛋白的分子量是50Kda，也就是说图片显示的条带是我的目的蛋白，但是有的泳道未见目的条带，有的泳道又会出现条带破裂的情况，导致条带没法用，不知道是什么原因？求楼主帮助分析一下，万分感谢！

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作者: ending 时间: 2013-4-5 11:07

楼主麻烦再看一下，下面这张图，这是另外一个指标，隐约能看见目的条带，我跑了8个泳道，加最左边marker，总共有9个泳道，但是还是看不清总的趋势，请帮助分析可能原因，谢谢！

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作者: am10 时间: 2013-4-5 11:08

lz你好，我刚刚开始westen实验，很多问题都不明白，在这里想请教一下所谓的变性胶、非变性胶、还原胶和非还原胶有何区别，分别适用于哪种情况？谢谢。

作者: applebook=213 时间: 2013-4-5 11:09

试试这种Western blot 多用途液，很好用的。可以帮你节省很多的宝贵时间。
cuturl('http://item.taobao.com/item.htm?spm=2013.1.0.106.XrMJhT&scm=1007.77.0.0&id=19395523424&pvid=8d8bb283-9e8d-41d4-b956-0316cfce5afd&ad_id=&am_id=&cm_id=&pm_id=')

作者: H2O 时间: 2013-4-5 11:10

老师：
您好！我问一下，我最近做的是一个转录因子的WB，预测条带的位置是56KD，但是在37KD和56KD的位置都出现了条带，而且与对照组相比，实验组在37KD位置的条带有升高趋势，请问，37KD大小的条带会不会是56KD的蛋白剪切修饰的产物？谢谢！

作者: duoduo 时间: 2013-4-5 11:11

用丽春红染色
确保蛋白转到膜上去了
而不只是marker转上去了

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谢谢老师，今天换用富美赛思的marker，全转上去了，换用密理博的ECL也发光了，能看到发光的条带，

结果一激动操作有些慢，觉得压片时候发光条带都快没有了，结果片子上果真什么都没有了！T^T

后来想想之所以荧光淬灭的那么快，是不是因为二抗浓度太高了？我用的是PTG的抗兔二抗，1：3000用TBST和奶粉稀

释的，一抗是1:1000TBST稀释的，感觉这个浓度还好啊，怎么淬灭的那么快呢？求指导！

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:12

麻烦看一下下图，跑出来是这样的，左边红色marker为55Kda，我的目的蛋白的分子量是50Kda，也就是说图片显示的条带是我的目的蛋白，但是有的泳道未见目的条带，有的泳道又会出现条带破裂的情况，导致条带没法用，不知道是什么原因？求楼主帮助分析一下，万分感谢！

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有跑完SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色的图吗？

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:12

lz你好，我刚刚开始westen实验，很多问题都不明白，在这里想请教一下所谓的变性胶、非变性胶、还原胶和非还原胶有何区别，分别适用于哪种情况？谢谢。

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没有说明的情况均为：变性，还原

作者: NBA 时间: 2013-4-5 11:19

谢谢老师，今天换用富美赛思的marker，全转上去了，换用密理博的ECL也发光了，能看到发光的条带，

结果一激动操作有些慢，觉得压片时候发光条带都快没有了，结果片子上果真什么都没有了！T^T

后来想想之所以荧光淬灭的那么快，是不是因为二抗浓度太高了？我用的是PTG的抗兔二抗，1：3000用TBST和奶粉稀

释的，一抗是1:1000TBST稀释的，感觉这个浓度还好啊，怎么淬灭的那么快呢？求指导！

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二抗浓度是有点高
试试1:10000

作者: youyou99 时间: 2013-4-5 11:20

有跑完SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色的图吗？

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您好，我没有做考马斯亮蓝染色，做这个是看样品中有没有蛋白吗？谢谢！

作者: qhyu 时间: 2013-4-5 11:21

western 湿转转完后PVDF膜上和胶上maker消失转膜液如下甘氨酸2.93 tris5.8 sds0.37 甲醇100 定容成1000
第一次湿转300ma 3小时这次换成2个小时但是转之前胶上还有maker 转完后就找不见哪里去了

蛋白140kd maker 140 170 条带都消失
先前半干转（转膜液无sds）过一次膜是2乘以10的用的30ma 转了2个小时只有比较小的maker转上去了后来就换湿转了
急什么原因啊谢谢老师

作者: jrwyyplt 时间: 2013-4-5 11:21

没有说明的情况均为：变性，还原

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谢谢，我还想问一下如果要进行后续质谱分析的话需要跑什么样的胶？

作者: xue258 时间: 2013-4-5 11:22

相关疾病：
胰腺癌

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二抗浓度是有点高
试试1:10000

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老师，我感觉我的actin的条带怎么那么细啊，细胞是胰腺癌PANC-1，

显影液定影液是柯达的，总是显影的时间不好掌握，涮的时间短了看不见条带，时间长了吧片子又黑了，

快被折磨死了。片子上的条带很细……

作者: 98776langtao 时间: 2013-4-5 11:23

你好，我想请问下，我用12%的胶，想一下子从一块胶上测2个蛋白，其中一个蛋白分子量120，可以这样吗？另外，120分子量，转膜，湿转，恒压100v，要转膜多久啊？

作者: gmjghh 时间: 2013-4-5 11:24

老师您好，我又来了，经过几次转膜条件的改良，我现在Western已经能跑出好看的条带了

但是仍然有个很大的问题困扰着我，就是蛋白定量（？）的问题

可能问题也不一定是出在定量的这一步，因为为了混匀蛋白我在定量和取量的时候一直用螺旋混匀，蛋白标准曲线R2也一直是0.99，但是跑出来的条带就是有深有浅，GAPDH老是跑不平，比如下面这张图

明显的看出两边有变浅，而第一个泳道是control，对于结果很重要，老是跑不好我很纠结

我现在很困惑这个结果的底是因为蛋白定量、转膜、还是孵育抗体甚至是发光或干脆是边缘效应的问题导致的呢？因为我每次跑要的样品都很多，我现在都用的15孔的胶了o(╯□╰)o

希望老师能不吝赐教。谢谢

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作者: shenkunjie 时间: 2013-4-5 11:26

1、样品浓度太高
2、离子成分不同

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嗯，谢谢老师了！
我当时也查了一下原因，也有人说与什么盐离子浓度不一有关，那您能给我建议一下怎样改进可以吗？
还有啊，样品浓度太高是说蛋白浓度高是吗？确实我的细胞提出来的浓度大概0.6 ，0.5也有0.3， 0.2多的，（我们实验室别的组一般都是0.3，0.4这样子）不过蛋白浓度不应该是高一点上样体积就可以小一些吗，所以我以为越高越好呢？
老师再请教您一下，以下是我昨天跑的电泳，这个是刚开始跑基层胶（浓缩胶），我想问您一下为什么会出现这样的情况呢，第一个和第四个是不是样品没有混匀的缘故呀，为什么跑了一小段样品感觉在胶里面完全散开了，不是顺着梳孔跑下来呢？这个是不是配胶的原因，如果是，那具体是哪块弄的不好呢，如果不是，那应该怎样改进呢？麻烦老师您了！

作者: shenkunjie 时间: 2013-4-5 11:27

楼主你好，我一直在杂一个分子量289KD的蛋白，有将近几个月的时间了，只有第一次做预实验时做出来过，后来就再没杂出来了。一直很迷惑，想请你帮忙分析一下到底是什么原因。我的样品是来源于小鼠经过磁珠分选后的细胞，用强RAPI裂解液（含PMSF，蛋白酶抑制剂，磷酸酶抑制剂）裂解4°冰上过夜，次日混匀后，低温超速离心，取上清液，测BCA。浓度基本保持在4-7 ug/ul，上样量60 ug（就是因为一直做不出来，加大样本量）。8%的胶，电泳：60v-120v，电转：300mA，6h，0.22um和0.45um的PVDF膜均用过（没什么差别，就是0.45的膜转过后，没有了Marker，于是后来用0.22），电转液：10%甲醇、0.1%SDS，在电转过程中每一时换冰。5%BSA封闭2h。一抗（CTS公司）浓度：1:300（以前1：1000），4°过夜。次日TBST洗2h，10-15min/次。二抗（国产）1:4000室温1-1.5h，TBST洗2h，最后曝光，最长压过1+h的片，什么都没有。我的阳性对照经常做出来（但也不是每一次都能出），用的是细胞系。我用压不出片的同一张胶杂小分子（转膜前裁开）的蛋白，就很好。个人觉得体系没有问题，但就是不出，很诧异啊！希望能从你的分析里找到突破口，谢谢啦。加油！

作者: kittykong 时间: 2013-4-22 13:59

楼主，你好！我最近刚开始做western，用血清里纯化的蛋白免疫兔子获得的抗血清作为一抗，二抗是HRP，结果如下图，阳性条带很多，且模糊，这样的抗体还有用吗，值得继续摸索去做吗？本人做western实验经验不多，不知怎么解决？

作者: kittykong 时间: 2013-4-22 14:03

楼主，你好！我最近刚开始做western，用血清里纯化的蛋白免疫兔子获得的抗血清作为一抗，二抗是HRP，结果如下图，阳性条带很多，且模糊，这样的抗体还有用吗，值得继续摸索去做吗？本人做western实验经验不多，不知怎么解决？

图片附件: 1.jpeg (2013-4-22 14:03, 215.03 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=15780

作者: kittykong 时间: 2013-4-22 14:10

楼主，你好！我最近刚开始做western，用血清里纯化的蛋白免疫兔子获得的抗血清作为一抗，二抗是HRP，目的蛋白76-78kD，浓缩胶5%，分离胶10%，电泳80-120V，转膜100V，35min。结果如下图，阳性条带很多，且模糊，这样的抗体还有用吗，值得继续摸索去做吗？本人做western实验经验不多，不知怎么解决？

作者: baiyun8906 时间: 2013-5-10 22:02 标题: NF-KB P65

[local]1[/local]
楼主，求救啊！最近做western blot 检测NF-KB P65（目的条带65KD），SD大鼠肝脏提取的蛋白，做出来总是有几条带，而且比目的蛋白分子量偏小，图上前三个泳道是组织的，后面一个是用肝L02细胞提取的蛋白做的，条带单一，而且应该是目的条带。组织和细胞都是一样的做法，不知道组织的为什么老是这样啊，楼主指教啊！！！

作者: hyo 时间: 2013-7-20 03:20

请教老师

不好意思图没正过来
immunoblot后目的蛋白没有成条带是什么原因啊
biorad precast 的胶
abcam 一抗
sigma HRP二抗
ECL也是sigma的
左边三个孔上样量分别5ng 10ng 15ng纯化蛋白（~90KDa）
SDSPAGE~70v
半干transfer 24v 45min

谢谢老师

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