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标题: 【求助】如何确定二硫键是否形成 [打印本页]

作者: caihong 时间: 2014-1-14 10:55 标题: 【求助】如何确定二硫键是否形成

请问各位高手，我的蛋白只含一对二硫键，表达出来时没有形成二硫键的，我如何让它形成，并检测到已经形成了二硫键？

作者: remonte 时间: 2014-1-14 10:56

如果该蛋白是以包涵体形式表达的话，就无法形成其天然构象，二硫键可能被破坏。这就需要一个蛋白复性的过程，即使表达出的蛋白恢复其天然构想，复性后再对其进行蛋白结构与构象检测再与该蛋白的天然构象进行比较分析。
个人拙见

作者: caihong 时间: 2014-1-14 10:56

蛋白表达出来的时候是在上清的，只是没有形成二硫键，考虑到可以通过加一些氧化剂来让它形成，但是不知道如何检测是否形成了

作者: niangao1980 时间: 2014-1-14 10:57

你是如何知道没有形成二硫键的？相同方法去检测啊。

作者: bring 时间: 2014-1-14 10:57

表达出来在上清，楼主如何确定它没有形成二硫键？
加入铜离子，或用其他方法氧化嘛，具体楼主可以再查查，这个是常见的方法。
如果二硫键形成，相对于没有形成的蛋白，它们的构像是不同的，检测办法不少啊。荧光光谱，CD光谱都可以看。简单点，跑个native PAGE应该都是有差别的。反应在HPLC上是否有差别，我不确定，可能要具体去试了，保留时间或许会有差异。

作者: moonlight45 时间: 2014-1-14 10:58

做个氧化还原分析就搞定~~

作者: windy+++ 时间: 2014-1-14 10:59

检测二硫键是否形成，跑个非还原胶作对照就可以啦，其显示的分子量与还原胶是有区别的。

作者: caihong 时间: 2014-1-14 11:00

呵呵，谢谢楼上各位高手指点！恩，跑个native 胶还是个不错的方法呵！

作者: glass 时间: 2014-1-14 11:00

给它一个氧化性的环境，让它自己复性，如果能形成二硫键，应该就会形成。而且最接近自然构象

作者: ladyhuahua 时间: 2014-1-14 11:00

做肽图，最简单就是测游离巯基个数

作者: ladyhuahua 时间: 2014-1-14 11:02

呵呵，谢谢楼上各位高手指点！恩，跑个native 胶还是个不错的方法呵！

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如果是两亚基之间的二硫键，跑个native胶还行，如果同一条肽链上的二硫键，native胶行得通吗？
同一条肽链上的二硫键鉴定：生化书上介绍的是对角线电泳，楼上的战友说看其空间结构也行，对这一块不太熟悉，结构生物学有学，感觉挺高深的呵。
如果只有一个二硫键，加氧化剂就行了，多个可能会出现巯基之间的错误搭配。

作者: wood533 时间: 2014-1-14 11:03

如果想要形成二硫键，可以蛋白溶液换成氧化型的buffer，如GSH/GSSG溶液搅拌1个小时；或者NH4HCO3溶液，室温搅拌过夜，此法为自然氧化。
检测方面提供几种我想到的方法：
1.质谱。适用与分子量较小的蛋白
2.HPLC。二硫键形成后蛋白的保留时间会变化
3.CD谱。

作者: 15133632614 时间: 2023-1-31 10:02 标题: 如何确定蛋白中二硫键是否形成

各位老师好，我是个新手小白，我想知道如何确定蛋白中二硫键是否形成，请问有什么方法么，刚才查看帖子，跑native胶也可以，那native胶和SDS-PAGE胶的结果对比有什么区别么？

作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-7 11:15

要使蛋白质中的二硫键形成并检测到其存在，可以考虑以下方法：

提供适当的还原环境：二硫键的形成通常需要还原条件。可以在表达和纯化过程中添加还原剂，例如二巯基乙醇（DTE）或二巯基丙醇（DTT），以提供适当的还原环境。将还原剂添加到蛋白质表达系统（例如细胞培养基）中或在纯化过程中加入还原剂，以促进二硫键的形成。

优化氧化条件：在纯化过程中，可以使用适当的氧化剂来促进二硫键的形成。例如，可以添加氧化剂如氧化谷胱甘肽（GSSG）或氧化二巯基巴比妥酸（DTNB），以促使蛋白质中的巯基形成二硫键。

应用还原和非还原条件下的电泳：可以使用还原性电泳和非还原性电泳技术来检测蛋白质中的二硫键。还原性电泳在含有还原剂的条件下进行，可以断裂二硫键，使蛋白质以单体形式迁移。非还原性电泳则保持二硫键的形成，蛋白质以聚合物形式迁移。通过对比两种电泳条件下的蛋白质迁移方式，可以判断是否形成了二硫键。

使用生物学检测方法：可以利用二硫键特异性的还原酶，例如二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI），来检测二硫键的形成。PDI可以识别和催化蛋白质中的二硫键，从而帮助确认二硫键的存在。

请注意，二硫键的形成受到多种因素的影响，包括蛋白质的结构、氧化还原环境、温度等。因此，具体的条件和方法可能需要进行优化和调整，以获得最佳的二硫键形成和检测结果。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 15:43

确定蛋白质中是否形成了二硫键，以及如何促使二硫键形成，需要一些实验操作和技术。以下是一些可能的步骤和方法：

1. 促进二硫键形成：

* 还原条件：通常，蛋白质二硫键形成的过程是在还原环境下，如还原剂DTT（二硫苏糖醇）或β-巯基乙醇等的存在下进行的。你可以将已表达的蛋白在含有还原剂的缓冲液中进行再折叠和再氧化。

* 缓冲液的选择：使用适当的缓冲液和pH条件也可以有助于二硫键的形成。

2. 检测二硫键的形成：

* 还原性SDS-PAGE：这是一种常用的方法，通过将样品在还原条件下进行SDS-PAGE，然后与在非还原条件下进行的样品进行对比。在还原条件下，二硫键被断开，蛋白质会以解链的形式出现，而在非还原条件下，蛋白质会形成较大的复合物。

* 西方印迹（Western Blot）：类似于还原性SDS-PAGE，你可以将样品在还原和非还原条件下进行电泳，然后使用适当的抗体来检测蛋白质的状态。

* 质谱分析：质谱分析可以帮助确定蛋白质中二硫键的存在与否。通过质谱分析，你可以检测到蛋白质中的二硫键断裂产物，从而确定二硫键的形成。

* 环己二烯（Ellman's Assay）：这是一种检测游离巯基的方法，可以用来评估蛋白质中二硫键的形成。环己二烯试剂与游离巯基反应产生颜色变化。

* 巯基化试剂：使用带有巯基化试剂的技术可以在蛋白质中特异性地标记巯基，从而帮助检测二硫键的形成。

需要注意的是，不同蛋白质的折叠和二硫键形成过程可能存在差异，因此可能需要对实验步骤进行优化。此外，确保在实验过程中使用合适的实验室安全操作，并根据需要咨询同事、导师或专业技术支持，以确保获得准确的结果。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:18

确定蛋白质中是否形成了二硫键是蛋白质结构和功能研究中的一个重要问题。以下是一些常用的方法来确定蛋白质中是否形成了二硫键以及如何检测已经形成的二硫键：

1. 还原和氧化条件：通常，二硫键的形成和断裂可以通过还原和氧化条件来控制。对于包含潜在二硫键的蛋白质，可以在还原条件下（如DTT或β-巯基乙醇）断裂已有的二硫键，然后在氧化条件下（如空气暴露或氧化剂，如氧化性亚铁氰化钾）促使新的二硫键形成。

2. SDS-PAGE迁移模式： SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是常用于分离蛋白质的方法。形成二硫键的蛋白质通常会显示出不同的迁移模式，因为二硫键的存在会影响蛋白质的线性结构，从而影响电荷密度和凝胶迁移速度。在还原条件下迁移的蛋白质可能会显示出更快的迁移率。

3. 非还原性SDS-PAGE：这是一种用于检测形成二硫键的蛋白质的方法。在非还原性SDS-PAGE条件下，样品不会添加还原剂，这样形成的二硫键会在电泳过程中保持稳定。因此，蛋白质在凝胶上的迁移位置会更加接近其天然状态。

4. 质谱分析：质谱分析可以提供蛋白质的分子质量信息，包括可能的二硫键形成。质谱分析可以用于检测蛋白质的还原和氧化状态，并确定二硫键的存在。

5. X射线晶体学：如果蛋白质可以晶体化，X射线晶体学是一种非常强大的方法，可以直接观察蛋白质结构，包括二硫键的形成情况。

6. 二硫键还原剂和还原剂敏感性：一些二硫键还原剂（如二巯基丙磺酸）可以帮助还原并断裂二硫键，然后你可以通过比较蛋白质在存在和不存在还原剂的情况下的结构变化来判断是否形成了二硫键。

总之，确定蛋白质中是否形成了二硫键通常需要一系列的实验方法和分析，涵盖了结构、电泳和质谱等方面。根据你的研究目的和可用的实验条件，你可以选择适合的方法或结合多种方法来进行分析。

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