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【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊?
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作者:
am10
时间:
2014-5-12 16:47
标题:
【求助】请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊?
请问200Kd的蛋白做westenblot要注意什么啊?做了几次预实验结果都不理想,跑的是细胞裂解液,不知道跑分子量大的蛋白是和小分子量蛋白有什么区别?包括转膜液、转移时间等等,希望大家指教。
作者:
plaa
时间:
2014-5-12 16:47
我做过几次大分子的蛋白,我们采用的是8%的胶,湿转法,低电压4度过夜 或冰浴70V恒压转8-10小时,做出的结果还是比较特异的
希望这些对你有帮助
作者:
PINK
时间:
2014-5-12 16:48
大分子蛋白跑胶时难度大点,最好用低浓度的胶,我们用的是6%的胶,取胶时容易破哦!转膜时一般低电压长时间冰箱内转效果会好些,我们用60mA,转膜过夜。转移液倒是没有什么特别要求!祝实验顺利!
作者:
04906
时间:
2014-5-12 16:48
我做的也是6%的胶,冰浴,200MA,210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。
作者:
kuohao17
时间:
2014-5-12 16:49
我做的也是6%的胶,冰浴,200MA,210min。取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。
作者:
am10
时间:
2014-5-12 16:50
好像大家的转膜条件比我的强烈一点,我一般用的是100v转1个小时,或者20mA过夜转,彩虹Marker一般转的还可以,是不是弱了一点啊,难道问题就在这里?
作者:
zzzz
时间:
2014-5-12 16:50
我做560kd,建议40ma,过夜(12-18小时)
作者:
abc816
时间:
2014-5-12 16:51
我也做过200KD的大分子,条件还是比较成熟,希望对你有用.
跑胶:分离胶用6%,如果要同时做内参切两快胶可以用 8%,只要根据marker把目的蛋白切进去就可以.
转膜:大分子建议湿转效果比较好,条件可能根据仪器不同而有所不同,我用过BIO-RAD的湿转仪,恒压100V转2.5小时.
半干转也可以,条件也相对比较容易控制,恒流1.5-2mA/cm2,转2.5小时.对于大分子蛋白转膜液中最好加入SDS.
希望实验成功.
作者:
wawa
时间:
2014-5-12 16:51
请问楼上战友,大分子蛋白转膜液中最好加入SDS,那么加多少浓度较合适?你是不是加了之后效果比较好呢
作者:
hustwb
时间:
2014-5-12 16:51
我用的胶浓度7.5%,半干转,恒流2.5mA/cm2,转2.5h.
作者:
Kiwi2021
时间:
2022-8-22 12:03
取胶铺胶时用塑料小铲子带着转膜缓冲液操作比较好。
https://168won.com/
作者:
一个著名的按键
时间:
2022-10-11 11:52
标题:
回复 #1 am10 的帖子
我当时做的是180kd的蛋白,不喜欢太软的胶,配了10%的胶,转膜液加了5%的SDS,恒流100mA转膜2h,转出来还可以在胶上看到一点170的marker条带,用胶去跑个考染也可以看到不少蛋白,但是由于膜上的蛋白已经足够我用了,我就没有再继续折腾了。
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作者:
chenzhen2016
时间:
2023-7-26 16:50
对于较大的蛋白(如200 kDa),在进行Western Blot实验时,确实需要注意一些因素,以下是一些建议:
1. 蛋白分离:由于蛋白分子量较大,传统的SDS-PAGE电泳可能不适用。可以考虑使用较低的聚丙烯酰胺浓度(例如6%或8%)或使用Bis-Tris缓冲系统。此外,使用长时间的电泳(如慢速电泳)可能更适合分离大分子量的蛋白。
2. 转膜条件:由于蛋白分子量较大,转膜的条件需要进行优化。可能需要使用低电流和较长的转膜时间来确保蛋白成功转移到膜上。
3. 转膜膜:选择适合大分子量蛋白的转膜膜。PVDF膜通常比NC膜更适合转移大蛋白,因为它具有更好的蛋白结合性能。
4. 阻断缓冲液:使用合适的阻断缓冲液,例如5%的脱脂奶粉或3%的牛血清白蛋白,来防止非特异性结合。
5. 抗体选择:确保使用的一抗和二抗对目标蛋白有较高的特异性和敏感性。
6. 标记的蛋白量:对于大分子量的蛋白,可能需要加载更多的样品量,以确保可以检测到充足的信号。
7. 选择合适的标准品:如果需要估算蛋白的分子量,使用合适的蛋白标准品,例如蛋白分子量标尺。
8. 成像条件:根据实验结果的要求和蛋白表达水平,选择合适的曝光时间以获取清晰的图像。
以上建议是为了优化大分子量蛋白的Western Blot实验。注意,每个实验室和蛋白质可能存在差异,因此可能需要根据实验结果进行进一步优化。预实验是很重要的,通过多次尝试和优化,你会逐渐找到最适合你实验条件的方法。祝你实验顺利!
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