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标题: 【求助】诱导细菌表达异源蛋白时加葡萄糖起什么作用？ [打印本页]

作者: pulala 时间: 2014-6-17 11:32 标题: 【求助】诱导细菌表达异源蛋白时加葡萄糖起什么作用？

本人现在用Qiagen公司的pQE-30载体，在M15细胞中表达一种蛋白。加了IPTG诱导后，细菌生长速度都减慢，有的减慢多，有的减慢少，但我就是方法提炼不出我要的蛋白来。
各位大侠，加IPTG后细菌生长减慢是好事还是不好？是说明异源蛋白表达占用了细菌的资源导致细菌生长减慢，还是可能有异源蛋白表达，但后者对细胞的生长有毒性作用，导致细菌生长减慢？
看了许多高手在IPTG诱导细菌表达过程中加不同浓度的葡萄糖，加葡萄糖诱导细菌表达异源蛋白的机理是什么？多大的浓度比较好？
再次感谢各位大侠的赐教。

作者: vvmmoy 时间: 2014-6-17 11:32

你的问题在本版归档贴中已有介绍,请参看:
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蛋白的表达水平与诱导时的温度(25-37度)、IPTG浓度（0.1-1mM）及AMP浓度（50-200ug/ml）都有关系，你可以改变一下诱导条件，跑SDS-PAGE看表达的水平，我也在实验中遇到过不表达的情况，做了半个月，不断改变条件，终于成功了，因此你还得有耐心啊，再试试吧。

作者: DONT 时间: 2014-6-17 11:32

加葡萄糖是为了降低目的蛋白在诱导前的表达,如果目的蛋白是对菌有毒性的,加葡萄糖就很有必要了.

作者: DONT 时间: 2014-6-17 11:33

葡萄糖使用浓度是1%,IPTG的使用浓度要看不同的载体了,如果是T7启动子,是0.4mM,如果是T7lac启动子就是1mM.我的经验是温度比较低的时候诱导表达较好,30度就差不多.180rpm

作者: pulala 时间: 2014-6-17 11:33

非常感谢您们的指点。我已经改变一些条件诱导3~4个月了，还是没起色。请问你在修改条件时，那项是最关键的？你最好改了那一项表达蛋白了？若是30度低温诱导，多长时间比较好？另外，我们在诱导时从没有添加AMP，是否很重要，或是否必须另加？培养基是用LB好还是2×YT好？还有文献报道用TB培养基，这种培养基是否用于结核菌培养的？
再次感谢。

作者: wu11998866 时间: 2014-6-17 11:33

温度很重要，我是在32度培养了4小时，加IPTG后转为30度培养3小时。不同质粒及细菌的表达条件肯定有差异，只有尝试了。
有一个提示，你是否做过鉴定和测序？也就是你的重组菌是正确的！
此外你在诱导表达包括细菌扩大培养时，不加AMP肯定不行！因为转入质粒的重组菌是带AMP抗性的，如不加AMP，则有可能会有杂菌甚至是污染菌生长，故必须加AMP，且最适浓度范围在50-200ug/ml为妥。

作者: DONT 时间: 2014-6-17 11:34

诱导多长时间,每个蛋白有不同的时间,我的诱导八小时表达量最大,也有的三小时就够了,AMP是肯定要加的, 不然会有杂菌生长.加AMP就是为了让有重组质粒的菌大量生长.

作者: pulala 时间: 2014-6-17 11:34

我的表达体系测序过了，序列是对的，在培养体系中加入了氨苄青霉素和卡他霉素两种抗生素，一般都是头一天挑选菌落过夜，第二天上午按1:10的比例接种到新鲜培养基，培养2~3个小时，到D600为0.6的时候，开始诱导4~6个小时，好像效果不大。我诱导的蛋白前半段cDNA的CG比例相当高，近70%，蛋白表达不出来是否和此有关。另外，在诱导的过程中，有的菌落加IPTG后生长明显减慢，有的减慢不明显，那一种值得我花更多的时间去筛选？
非常感谢！

作者: windy+++ 时间: 2014-6-17 11:34

SDS-PAGE有时很难检出低表达的蛋白，有条件试一下western blot,测序是对的，表达元件什么的没有突变，也不是说就一定能表达，有的基因在某个特定的启动子下就是不表达。
前半段cDNA的CG比例相当高，近70%，极可能会影响表达。我试过干扰素2b、GM-CSF（GC含量较高），在 pET系列T7启动子下就是不表达，换了个热启动子TLTR pBV220就表达了，表达量还很高，你也可以试一下融合表达嘛，做个N端融合试一下。
如果该做的表达优化都做了，测序又对，真该换一下表达载体了。
我的经验是如果重组蛋白对细胞毒性较小，诱导后菌浓还是会有所增长的。如果细胞毒性较大的话，就要用严谨型表达载体，表达量也不会太高。因为微量的毒性蛋白表达，菌体生长就很受影响，菌体会想办法把你的目的基因表达框破坏掉（一般是通过突变的方式），这样的话质粒稳定性也成问题。

作者: 67993836@qq.com 时间: 2021-9-20 15:28

伙伴们，我做蛋白诱导，有个奇怪的现象，我用的是GST标签，37℃诱导，待OD值为0.5-0.8时按照1:100的比例添加0.1M IPTG，16℃诱导过夜，蛋白包涵体很多，并且，除了目的蛋白外，载体也很明显，有没有大佬知道这是怎么回事啊，上面浅的那条是我的目的蛋白，下面是GST载体

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作者: chenzhen2016 时间: 2023-7-17 16:34

加入IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）后，细菌生长减慢是正常现象，表明蛋白表达被诱导。细菌生长减慢是因为异源蛋白的表达占用了细菌的资源，包括能量和营养物质，从而减缓了细菌的生长速度。

异源蛋白表达可能对细菌的生长产生毒性作用，导致细菌生长减慢。某些异源蛋白可能具有结构上的毒性，如聚集或沉积形成包涵体。此外，高水平的蛋白表达可能对细胞代谢和调控产生负面影响。

在IPTG诱导细菌表达时，加入适量的葡萄糖可以减轻异源蛋白表达对细菌生长的负面影响。葡萄糖是一种碳源，通过提供额外的能量和营养物质，可以帮助细菌维持正常的生长代谢，并提高异源蛋白表达的效率。

葡萄糖浓度的选择要根据具体的实验条件和需求来确定。一般来说，适量的葡萄糖浓度通常为0.1-0.2%（质量/体积），但最佳浓度可能因实验系统和蛋白的特性而异。在进行实验前，建议进行一些优化实验，尝试不同浓度的葡萄糖，以确定最适合您的实验条件的浓度。

最后，需要注意的是，每个表达系统和蛋白质都可能有不同的特点和要求。因此，建议参考相关文献、抗体供应商的建议，以及已有的实验室经验，来优化您的表达条件和实验方案。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-8 14:59

在原核细胞中表达异源蛋白时，添加葡萄糖可以对细菌的生长和蛋白表达产生影响。让我为您解释一下相关的机制和策略。

1. 添加IPTG后细菌生长减慢的解释：

* IPTG是一种人工诱导剂，用于激活T7启动子驱动的表达系统，促使目标蛋白的表达。添加IPTG后，细菌会将大部分资源用于目标蛋白的合成，因此细菌的生长速度会减慢。
*异源蛋白表达可能需要大量的能量和细胞资源，导致细菌的生长受到限制，从而造成生长减慢。

2. 细菌生长减慢的原因：

* 细菌表达异源蛋白需要耗费大量的代谢能量和生物合成资源，这可能导致细菌的生长减缓。这通常是正常现象，但如果生长受到过多限制，可能需要优化表达条件，例如IPTG浓度、诱导时间等。

3. 葡萄糖的作用：

* 葡萄糖可以作为能源供应给细菌进行代谢和生长。在表达异源蛋白时，细菌需要分配资源来完成蛋白的合成，这可能会导致细菌代谢受到影响。
* 在一些情况下，适当的葡萄糖浓度可以缓解细菌资源被过多耗费的情况，从而改善生长和蛋白表达。

4. 加葡萄糖诱导细菌表达的机理：

* 加葡萄糖可以提供额外的碳源，使细菌可以更有效地利用能量和合成资源来完成异源蛋白的表达。
* 葡萄糖还可能通过调节代谢途径和细胞生理状态，减轻异源蛋白表达对细菌生长的抑制作用。

5. 葡萄糖浓度的选择：

* 葡萄糖浓度的选择取决于具体的情况。一般来说，添加适量的葡萄糖（通常在0.1-0.5%范围内）可以在维持细菌生长的同时促进异源蛋白的表达。但需要注意，葡萄糖浓度过高也可能会抑制IPTG诱导的T7启动子活性。

总的来说，细菌生长减慢是正常现象，但在优化表达条件时，可以考虑调整葡萄糖浓度以平衡生长和蛋白表达的需求。最佳浓度可能需要在实验中进行尝试和优化。如果您在优化过程中遇到问题，不妨与同事或导师讨论，共同找到适合您实验的最佳条件。

作者: chenzhen2016 时间: 2023-8-18 16:38

加入葡萄糖在IPTG诱导的异源蛋白表达过程中可以起到多种作用，具体作用可能与你的实验条件和系统有关。以下是一些可能的解释：

1. 能量供应：葡萄糖是细菌的主要能源来源，特别是在高强度的代谢过程中，比如异源蛋白的过量表达。加入葡萄糖可以提供足够的能量，保持细菌代谢活性，有助于异源蛋白的表达。

2. 解除毒性：有些异源蛋白对细菌来说可能具有一定的毒性。通过加入葡萄糖，可以减轻蛋白对细菌的毒性影响，从而保护细菌的生长。

3. 维持细菌生长： IPTG诱导表达时，细菌往往会分配更多的资源来表达异源蛋白，可能会导致其他细菌生长所需的资源减少。加入适量的葡萄糖可以维持细菌整体的生长状态，减缓异源蛋白表达对细菌生长的影响。

关于葡萄糖浓度，没有一个通用的标准，因为实验条件和细菌株不同，最佳浓度会有所变化。通常来说，起始浓度可以从0.1%（w/v）开始尝试，然后根据实验结果进行调整。在实验中，你可以尝试不同浓度的葡萄糖，观察细菌的生长情况和异源蛋白的表达情况，选择最适合你的系统的浓度。

最终，最好的方法是在你的实验系统中进行试验，根据观察到的结果来优化葡萄糖浓度和其他实验条件，以获得最佳的异源蛋白表达效果。

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