分析测试百科

标题: 【讨论帖】多重PCR与荧光定量PCR [打印本页]

作者: 园丁## 时间: 2015-12-4 16:07 标题: 【讨论帖】多重PCR与荧光定量PCR

本人最近在设计一个多重的实时荧光定量PCR实验，即在一次PCR反应中既实验对多种DNA模板的检测，又想同时实现对这几种DNA模板的定量，因为以前没有这方面的经验，希望在这方面经验和有兴趣的前辈来这里讨论，把你们的方法、心得、经验到这里给大家介绍介绍！我会非常欢迎并投票支持你们的！谢谢！
（本人想法：在一次PCR反应中能检测到多种目的菌株，这些菌株是一类在生理生化方面具有相同功能的菌株（3到4种），目前方案有两种：1.根据针对它们相同的功能设计一对这个类群的特异引物，然后再针对不同菌株分别设计荧光探针来进行PCR反应检测？2.针对这一类群中的不同菌株分别设计不同的特异性引物和荧光探针然后进行PCR检测？前提是在同一个PCR反应体系中，这两个哪个更可行，难点可能出现在哪儿，有哪些注意的问题，欢迎讨论，谢谢！）

作者: woshi 时间: 2015-12-4 16:07

楼主我劝你还是不用在这里问了，我感觉这里做荧光多重的人很少，要不就是不愿意回答，反正我好几次都在问，没办法。靠自己，看文献吧。哎。。

作者: 3.14 时间: 2015-12-4 16:07

相关疾病：
头痛
方案都不错！但是难度在于实现的过程！
1。对于这个方案，最大的难度在于探针设计。我理解你的意思是只设计一对引物，针对这一类群的功能区，也就是说引物是保守的，基因的同源性很高，那么在这个同一类群的几个基因中想找到各自特异的探针似乎不是很容易。由于没有基因的信息，暂时猜测两种情况：a.虽然同一类群，但是剪切方式不一样，得到的RNA有区别，可以在区别区域设计探针，但如果长度差异较大，后续扩增效率优化会比较困难；b.表达产物或基因本身长度都一样，但其中有SNPs之类的突变，探针则选择在这一区域，但是难度（包括设计和后续试验）也比较大，祝好运。但是这个方案的最大好处就在于在这一体系中所有的引物与模板的结合效率都是一样的，对于后续的反应的扩增效率的优化会比较容易。
2。这个方案实施起来相对比较容易，如引物和探针设计都会有更多的选择余地，但是难度在于引物和探针的特异性，引物二聚体的避免，不仅一对的两个引物，还要避免这几对引物相互之间的二聚体，由于探针法二聚体多了虽然对信号没有影响，但是扩增效率肯定受影响，此外各基因之间由于引物和探针不同，导致与模版的结合效率或多或少有差异，这种差异在多重PCR中更容易被放大，直接影响扩增效率的优化。
其实这两个方案都会牵扯到扩增效率的优化，只不过有利有弊，没有哪个是完美的，这是无法避免的，而且多重里最头疼的就在这里，所以做多重的人少，只能智者见智了。说的不够全面，另外再参考参考导师和老外文献的经验。好运！

作者: misswu61 时间: 2015-12-4 16:08

我目前也在做这方面的内容，采用的是液态芯片技术，主要先多重PCR扩增目的片段，再通探针标记的芯片杂交，检测。与你的方法有很大相同之处，如：多重PCR引物设计，探针的设计，特别要考虑到多重检测，因此在引物探针设计方面需多加注意，多分析Tm值的大小及引物间形成二聚体等。在荧光定量PCR中，还要考虑到多个探针与目的片段的非特异性结合等问题。有时候，也不能完全依赖软件，软件分析不出问题，但在实验中也有时会出现很大的问题，所以还要多靠实验摸索。
不知你要做几重，我目前已经做到9重了，即有9对引物在同一PCR反应体系中同时扩目的片段。你是采用通用引物还是多对特异性引物？

作者: zhihui小新 时间: 2015-12-4 16:08

我是做两重的，目前还处于查资料阶段。新手。以前觉得多重的很容易，但是真的看了一些资料之后才发现，不像我想象的那样简单。我觉得首先得看实验室的荧光定量PCR仪是哪个型号的，这台仪器可检测的荧光标记基团都有哪几类？再从中进行选择合适的荧光基团。同时，需要注意该PCR仪的有效检测通道有几条？像ABI7500，检测通道有5条，但是ROX是用来校正的，这条通道不可用，TAMRA是淬灭基团，也不可用，这样只有3条有效通道，再针对这三条通道选择荧光基团。注意荧光基团和淬灭基团的最优组合。至于如何组合，我也还不大清楚，呵呵，刚看资料。
祝大家实验顺利。

作者: zhihui小新 时间: 2015-12-4 16:09

请教大家，在选择不同的荧光基团的时候，是选择发射波长相近的，还是发射波长相差比较大的？FAM是520nm，JOE是530nm，CY5是650nm，那么如果想用FAM，另一种荧光基团是选择JOE合适，还是选择CY5合适呢？哪一种效果好？

作者: 园丁## 时间: 2015-12-4 16:09

谢以上各位兄弟姐妹的回复，我和楼上一样，也是刚开做，正在查资料看文献，我们的定的仪器是就是ABI的7500还没到位，如果像说的那样，我最多也只能做三重了：）另外，冷雪兄弟说您已经做到9重了，佩服佩服，在多重这方面的问题您就是前辈，以后多给大家指导指导，希望大家以后常来这里交流交流！
目前我设想是两套方案，在一楼已经说过了，所以根据这两个方案在引物方面设计方面我也有两种想法：1、选择的引物只对我要做的这一类群的菌来说是通用的，但对于其它的微生物来说是特异的，并且探针之间要具有特异性；2、分别选择特异性的引物和探针。谢谢！

作者: zhihui小新 时间: 2015-12-4 16:11

设计一对引物在优化方面应该比较简单一些吧，毕竟涉及到的参数少，但这样的话，能够保证在上下游引物之间设计多对有效的特异性探针吗？如果探针特异性也很好，那么设计一

作者: toy 时间: 2015-12-4 16:30

我是做两重的，目前还处于查资料阶段。新手。以前觉得多重的很容易，但是真的看了一些资料之后才发现，不像我想象的那样简单。我觉得首先得看实验室的荧光定量PCR仪是哪个型号的，这台仪器可检测的荧光标记基团都有哪几类？再从中进行选择合适的荧光基团。同时，需要注意该PCR仪的有效检测通道有几条？像ABI7500，检测通道有5条，但是ROX是用来校正的，这条通道不可用，TAMRA是淬灭基团，也不可用，这样只有3条有效通道，再针对这三条通道选择荧光基团。注意荧光基团和淬灭基团的最优组合。至于如何组合，我也还不大清楚，呵呵，刚看资料。
祝大家实验顺利。
......

===============================================================================================================

TAMRA是淬灭基团，本身也发荧光，所以如果你使用的是BHQ这样的非荧光淬灭基团，是可以考虑将TAMRA作为发光集团的。另外ROX也能考虑不使用，用ABI的机器将管子集中在仪器中间位置做还是可以的。

作者: toy 时间: 2015-12-4 16:32

还有就是有一个软件叫Beacon designer.是可以设计多重荧光定量引物和探针的，就是正版非常贵，1800刀。现在最新的是7.0了

作者: seagate 时间: 2015-12-4 16:32

我最近在做两重的荧光定量PCR，做了标准曲线，但是其中一个的扩增效率只有81.8%。Sad

作者: bling 时间: 2015-12-4 16:33

我做的PCR是13对引物，不过不是我设计的，但是加入了一种内参探针后，其他通道污染了，都有荧光出现，愁死了，有可能是合成过程探针污染了吗，重新合成一次结果更乱，另一个通道又污染了，讨论一下？

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)