分析测试百科

标题: 【求助】血液中提取总RNA [打印本页]

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:45 标题: 【求助】血液中提取总RNA

论坛里有没有前辈用红细胞裂解液来提白细胞的。之前有处理过一批人骨髓的标本，用红细胞裂解液提的白细胞后，加入1000UL TRIZOL ，放入-80℃保存。积累了一批标本之后整体提RNA，逆转录，电泳。最后做的PCR，可是PCR出来的结果一直很不理想。
想请教前辈，用裂红提取白细胞这一个过程是需要无酶操作的吗？还没加TRIZOL裂解白细胞之前，细胞里面的RNA会被降解吗？网上有查到一站式提取血液中总RNA的试剂盒，不知有没有前辈用过，这种方法成熟吗？有没有资料可以比较一下这些方法提出的RNA的质量？能不能给点意见，我们有没有必要换一种提RNA的方法呢？

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:45

还有很多战友提到的淋巴细胞分离液是怎么用的呢？跟红细胞裂解液有什么差别？

作者: 831226 时间: 2016-4-8 14:47

RNA会降解的，尤其是血液取样的时候杂质较多，需注意无酶操作
试剂盒只是使用方便，效果未必比试剂好
低温保存的样本仍有降解可能，尤其是反复解冻
建议提出来后跑跑rna，看看条带怎么样，这样可以排除逆转录出问题的可能性

作者: wawa 时间: 2016-4-8 14:51

分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响，因为细胞内本身有大量内源RNase，只要细胞未破裂，外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞，这就激活了内源RNase造成降解，另外分离白细胞过程也会导致某些基因mRNA丰度发生变化，因为这个过程已经不是生理状态了。
我们公司有血液RNA提取的Kit(目录号RK206)，全血(不是白细胞)直接加入2.5倍试剂，室温放置2小时，这个过程缓慢裂解所有细胞(包括白细胞)，试剂中含阳离子多聚物能屏蔽DNA和RNA的负电荷，使DNA和RNA析出，与RNase隔离。每毫升血液产量约3-8ug RNA。如果不立即提取RNA，可以室温放置24小时，4度放置1周，-20度长期保存。

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:51

QUOTE:

原帖由 831226 于 2016-4-8 14:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

RNA会降解的，尤其是血液取样的时候杂质较多，需注意无酶操作
试剂盒只是使用方便，效果未必比试剂好
低温保存的样本仍有降解可能，尤其是反复解冻
建议提出来后跑跑rna，看看条带怎么样，这样可以排除逆转录出问题的可能性 ...

您的意思是在提取出RNA之后可以跑一跑胶，看看条带吗？我们实验室的师姐之前做的时候都是在逆转录出cDNA之后跑的胶。这样子有什么差别呢？

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:53

QUOTE:

原帖由 wawa 于 2016-4-8 14:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
分离白细胞的试剂或塑料耗材是否无酶对提取无影响，因为细胞内本身有大量内源RNase，只要细胞未破裂，外源RNase无法降解RNA。但是分离白细胞过程不可避免的会损伤细胞，这就激活了内源RNase造成降解，另外分离白细胞过程也会导 ...

有没有文献提供，可以比对一下你们的试剂跟传统的全血中提RNA方法的效果？跟传统全血提RNA方法相比，你们试剂的优势主要体现在哪些方面？

作者: =菓子= 时间: 2016-4-8 14:53

外界环境中有许多RNA酶，血液中更多，所以您必须先检查您RNA的效果，只要看1，是否有拖带，2，看条带是否清晰。然后在反转，不然好可惜

作者: ns5fan 时间: 2016-4-8 14:54

直接跑RNA，这样可以观察到RNA的质量，然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力

作者: laughing妹 时间: 2016-4-8 14:54

1 不建议跑电泳,即使电泳了,也未必看到得到,因为全血提取的RNA量很少,替代方法,可以试用RT-PCR验证
2 红细胞裂解液中的成分会影响得率
3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:54

直接跑RNA，这样可以观察到RNA的质量，然后决定是否进行逆转录。这样可以节省人力和财力

===============================================================================================================

我跟师姐说过，想要先跑一下RNA，看看RNA质量怎么样，再决定是否逆转录。但是因为我们做的是临床上病人骨穿后取的骨髓血，病人的标本都是很珍贵的，所以师姐建议我要跑RNA可以拿养的细胞来跑。师姐说如果细胞的RNA跑出来结果是好的，就可以了。但我觉得每个病人是不一样的，而且骨穿的标本是临床上给的，我们实验组的人，并没有在临床上，所以拿到标本的时候，一般都是骨穿过了好几天之后了的。虽然我们提RNA用的是相同的方法，但提出来的RNA的质量，对每个病人而言，都是不完全一样的。

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:55

QUOTE:

原帖由 =菓子= 于 2016-4-8 14:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
外界环境中有许多RNA酶，血液中更多，所以您必须先检查您RNA的效果，只要看1，是否有拖带，2，看条带是否清晰。然后在反转，不然好可惜

师姐的意思的临床上的标本很珍贵，为了节省标本的损耗，建议我们不跑RNA...
前辈，有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 14:55

1 不建议跑电泳,即使电泳了,也未必看到得到,因为全血提取的RNA量很少,替代方法,可以试用RT-PCR验证
2 红细胞裂解液中的成分会影响得率
3 可以将100ul骨髓加1mltrizol直接混匀后保存于-20度提取,效果不错,可以一试

====================================================

有没有什么方法可以尽量减少红细胞裂解液对得率的影响呢？

作者: 盼盼 时间: 2016-4-8 15:00

有没有哪位前辈有自己提取过骨髓血或外周血中总RNA，能否将您的方法供给我参考一下呢？

作者: 33号 时间: 2016-4-8 15:00

师姐的意思的临床上的标本很珍贵，为了节省标本的损耗，建议我们不跑RNA...
前辈，有没有自己做过的提取骨髓血或外周血中总RNA的方法提供参考呢?
当时我们提取的是外周血的总RNA，感觉提取的质量要比组织的RNA还要差一些。所以我才建议你第一次提的时候跑RNA
既然标本这么珍贵，为何不用非标本血液提下RNA练习下基本技术呢
如果之前你们师姐按这种方法已经成功提取过RNA并扩增，这就没问题

========================================

但是如果仅仅停留在理论阶段，建议还是试试
不然实验不顺利，根本不知道哪个环节出了问题

作者: 轰轰 时间: 2016-4-8 15:01

有没有哪位前辈有自己提取过骨髓血或外周血中总RNA，能否将您的方法供给我参考一下呢？
我们经常提取的，我上面描述的方法比较可靠的，全血最多加150ul/1ml Trizol，不必裂解红细胞

作者: vcve 时间: 2016-4-8 15:01

我们经常提取的，我上面描述的方法比较可靠的，全血最多加150ul/1ml Trizol，不必裂解红细胞

===============================================================================================================

赞成！！Trizol说明书上明明白白写着可以这么操作的，方法简单可靠，但是那个Trizol要注意了，其具体型号是Trizol LS Reagent，专门用来处理液体样本的，这种方法尤其适用于小体积样本，方法越简单越好，出错的机会越少。

作者: 少林弟子 时间: 2016-4-8 15:02

QUOTE:

原帖由 vcve 于 2016-4-8 15:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们经常提取的，我上面描述的方法比较可靠的，全血最多加150ul/1ml Trizol，不必裂解红细胞

===============================================================================================================

赞成！！T ...

Trizol LS Reagent优势在哪里？用过国内的，差不多

作者: any333 时间: 2016-4-8 15:03

Trizol LS Reagent其实成分和Trizol Reagent是一样的，只是因为处理的是液体样本，所以把Trizol的成分浓缩了一下，这个Trizol LS Reagent优势就在于这是一种大品牌，国际通用哈哈，很多人都用，国内的试剂可能效果也差不多，只不过总给人一种不可靠的感觉。

作者: 13775112843 时间: 2020-2-17 14:07

像天根、百代的试剂盒都挺好用的，一般RNA容易降解，跑PCR是没问题的。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)