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标题: [分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇 [打印本页]

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 14:45 标题: [分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇

[分享帖]CCK8试验~。~菜鸟篇（转载）

我没有做过MTT实验，但其实原理及目的都是一样的（反应机理不一样）。都说CCK8简单点而且数据更稳定，所以就用了这个试剂盒。

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间；4、cck8试剂加入量；5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 14:45

做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。

能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。

补充：谢谢大家的热烈讨论。突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题，园子里也有前辈提过。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊

补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？

这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。

再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。

不知道以上补充的内容是否能够回答同学们的那个问题。

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 14:45

我今天刚刚接种了一批细胞，准备培养24小时后加入CCK-8检测。到时结果出来请大家指教啊。

[ 本帖最后由 milkdog 于 2011-12-19 14:57 编辑 ]

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 14:47

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

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请问，假如加药的时间长于5天，应该是可以换液的吧？如果真的不换液，是不是做多可以培养3天？我印象中3天不换液培养基颜色都有变化了

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 14:51 标题: 回复 #4 milkdog 的帖子

CCK8试验我掌握到的文献还没有5天这样长时间的。
而且我考虑到这里有一个问题，就是你加药后孵育，培养基里应该就是有药物的，你如果换液，那么这个药物的量该如何去计算？这个时候细胞内肯定已经有药物进入了，我觉得这个也许就是CCK8试验没有提到换液问题的原因吧。当然是个人推测。
我觉得这个试验与用六孔板做TRANSPORT试验需要换液是不一样的。因为目的不一样，考虑的细节就不一样。

作者: whitesheep 时间: 2011-12-19 14:51

本人也是刚刚做细胞试验，正在用CCK8做细胞增殖抑制试验，很头疼加了CCK8后孵育时间，我摸索了0.5h、1h、2h及4h，其中一例，OD从0.5h的0.2到4h的0.9，差得也忒大了吧!? 另外一实验，2h读数复孔之间跳孔严重，4h后CV值立马下降，但OD值已经2.7了。关于最大OD控制在1.0的说法，请楼主指明出处，可有权威资料共享一下，不甚感激

作者: whitesheep 时间: 2011-12-19 14:52

呵呵，我们用的也是dojindo的，我看了说明书，包括官方网站上的Q&A，均未提到OD值范围。
网址如下：cuturl('http://www.dojindo.cn/products/C/cck-8.htm')

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 14:52 标题: 回复 #7 whitesheep 的帖子

2010年1月印刷的产品说明书P7Q&A： Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。

再有异议欢迎再讨论。

作者: +小生怕怕+ 时间: 2011-12-19 14:55

我用CCK8不长，就一年，之前都是MTT、结晶紫之类，楼主说得很好很详细的，真是很用心做事情了，佩服一记！我就补充个小小的细节问题。
曾经做过一个抑制凋亡实验，显色一直不完美，于是做了这么一个预实验。在24孔板内加细胞加药后培养适当时间，取上清，离心，收集了上清液，离心沉淀物，分别加CCK8，同时24孔板内原有贴壁细胞也加CCK8，结果是：三者都有不同程度的显色，随着细胞凋亡越多，上清和离心沉淀显色值越高。
看了很多资料，有一篇文献里是这么说的：细胞凋亡后裂解出的乳酸脱氢酶会很稳定的存在于培养液中。我料想可能是部分脱氢酶的存在与CCK8发生了氧化还原反应。
我是针对我的细胞查得这一资料，不知道是否所有的细胞都有这个特质。大家有时间可以考证下自己的细胞，在得到的活性检测曲线不完美的情况下，这个因素可以考虑下。
鉴于这个原因，我每次做CCK8测活都是换液的，换无血清培养基（PBS我也试过，好像也可以），1：10配制CCK8。最大程度降低了细胞代谢物已经低浓度血清的影响，实验结果也不错。DOJINDO回访的时候我也提了这个问题，他们也觉得不错。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 14:57 标题: 回复 #9 +小生怕怕+ 的帖子

前辈好。我也有考虑过测之前换液，不过说明书上说酚红对检测不影响，就偷懒没有换。不过想请问换液是直接用吸管将废液吸走吗，要吸很干净吗？

作者: nn255 时间: 2011-12-19 14:58

正在做，顶一下。

可是，
我的细胞在加药后所有的细胞都死了。晕！

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 14:59 标题: 回复 #11 nn255 的帖子

什么药？效果这么好?

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:00 标题: 回复 #11 nn255 的帖子

药物的浓度是不是太高了，药物的浓度梯度也要摸索的。还有做的过程中要防止发生污染。想问一下，您的药上细胞前是通过怎样的方式灭菌的？

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 15:02

我的CCK-8的第二次试验结果：

背景：悬浮细胞，加入药物后培养24小时。

加入CCK-8后，颜色马上发生了改变。虽然CCK-8的说明书上推荐1-4小时检测，但是我的检测时间为20分钟后，结果在0.7-0.8左右。

在50分钟的时候，检测的结果在1.3-1.4左右。

请大家给提供点参考：是不是接种的细胞太多了？这次的CCK-8检测数据有效吗（那一次20或50分钟的数据比较好）？

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:04 标题: 回复 #14 milkdog 的帖子

抱歉，没有培养过悬浮细胞。不敢冒然提议。能否先说一下全细胞的OD值是多少？数据是否有效，要看整块板的数据如何，20min、50min数据哪个更好你可以先算一下RSD。取RSD更小的为佳。

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 15:06

非常感谢楼主的提示。

此次实验基本认为要失望了。总结做过的2次CCK-8实验经验，更准确的话说是失败经验如下：
1）CCK-8加法：沿侧壁加入，避免产生气泡。还有一个技巧是用1：1体积的培养基混匀后加入，这样起到减小加样误差。
2）CCK-8使用之前，先做个标准曲线。用不同的细胞数接种，然后加入CCK-8 1小时，2小时，3小时检测450nm 以OD值1.0--2.0为标准选择细胞数。
3）确认药物跟CCK-8不反应。在培养基中加入CCK-8，2-3小时后检测。以及在培养基中加入药物和CCK-8，2-3小时后检测。检测出来的OD值为空白对照，以不超过0.3为标准。
4）待续-

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 15:06

抱歉，没有培养过悬浮细胞。不敢冒然提议。能否先说一下全细胞的OD值是多少？数据是否有效，要看整块板的数据如何，20min、50min数据哪个更好你可以先算一下RSD。取RSD更小的为佳。

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什么条件下测出来的是全细胞的OD值？
数据有效性如何判断？
RSD我理解了。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:08 标题: 回复 #16 milkdog 的帖子

我用词可能不当了，全细胞在这里我想表达的就是不加药物，只有细胞和培养基，加入CCK8后的值。气泡可以在检测时吹掉，还有就是加入以后要适当敲击底部，让CCK8混匀。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:08

什么条件下测出来的是全细胞的OD值？
数据有效性如何判断？
RSD我理解了。

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数据有效与否，其实说白了就是你自己想要的实验结果是怎样的，你的实验目的是什么。你做出的实验数据与你的预想是否符合。如果不符合，在你确定所有的操作无误的情况下，再去分析讨论实验结果产生的可能原因。比如说你配了一系列浓度的药物溶液，上了细胞后OD值与浓度梯度不符合，而你又确定实验操作无误，那可能的原因就是药物的溶解性问题等等。我这是打个比方，具体的还要看你的实验是怎样设计的。在不知道你的实验设计、药物性质前提下，你这样简单说数据如何，然后问数据是否有效，真的是爱莫能助。
我们这里能够讨论的也就是实验操作，对于数据的分析肯定是自己根据实验本身去分析考虑的。

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 15:09

这个帖子开的非常适合我，我正在做这方面的实验。

最近做了一个5000，开始倍比递增的细胞生长曲线。
分别检测1，2，3，4小时的CCK-8 在450nm的OD值。

结果说明，细胞以2万的接种浓度比较适合，依据是此时OD值接近1.0。

作者: 兔唇 时间: 2011-12-19 15:09

前辈好。我也有考虑过测之前换液，不过说明书上说酚红对检测不影响，就偷懒没有换。不过想请问换液是直接用吸管将废液吸走吗，要吸很干净吗？

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枪头吸会更干净些哦！操作熟练后基本可以控制每次的实验误差在10%或20%之内。
检测之前最好镜检，要相信自己看到的，而不是一味遵从比色数据。我就是因为每次镜检，才会发现很多显色液使用过程中的问题，再加以改进，直到理论数据与实际看到的相符。不要怀疑自己的能力，有时候只是细节方面没有做好罢了，我们一味照本宣科了，太迷信产品说明，没有做足预实验。
说下最近遇到的问题，也许会对一些人有些帮助。测活用的细胞株的药物敏感度是最重要但是也是很容易被忽视的问题。如果你不是用原代的话，商品化的细胞株有个很致命的问题就是细胞代次。测活用的细胞不能有所变异或者功能退化，这很致命，但这是不停的传代必然导致的问题。我一直坚持认为要用从ATCC购买的细胞，在小代数以内尽可能冻存尽量多的细胞。这回贪便宜在某院细胞所买了一株未知代数的细胞株（再具体就不说了，大家心里明白啊，呵呵），我花了大半年时间几乎没有任何实验结果，最后用干扰素一测，该细胞压根儿没有反应……崩溃了！挨了很多批评不说，自己的信心差点丢失了。现在又要花两个月的时间去买ＡＴＣＣ的细胞，真的很得不偿失的。说下ＡＴＣＣ的细胞价格，官网价格乘以１８，就是人民币的价格，代理商么大陆就一个，我就不作宣传了，大家可以自己去查。最好走正规代理商，运输历时近两个月，小代万一出问题了，赔偿问题很纠结的。如果你的产品最后需要申报，细胞来源也需要证明，当然走正规渠道比较放心些。
我又废话多了……＾＿＾

作者: milkdog 时间: 2011-12-19 15:11

细胞的问题也是一个大问题。
我做了几次CCK-8没有反应之后，也曾经想过细胞的问题。
偏偏这个细胞是我所不太熟悉的半悬浮细胞。
而且该细胞异型性明显。

文献所提供的照片与自己养的细胞照片不同，但是该文献与细胞建株最原始的照片中倍增时间明显也不同。所以不好判断。
而细胞建株的原始文献在上世纪70年代。原文也找不到了。

苦恼中。

作者: fei1226com 时间: 2011-12-19 15:11

想问个问题，你们用DMSO做药物溶剂吗？DMSO对细胞到底是有毒性的还是没毒性的？为什么我做出的结果不一样啊

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:13 标题: 回复 #23 fei1226com 的帖子

有毒，而且毒性很大。要把终浓度控制在千分之一以内。

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:13

请教楼主，在铺96孔板时，每孔铺100μL或是200μL，根据什么来决定啊？

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:17

请教楼主啊，我师兄以前做的是MTT，我接着他做，但是我用CCK-8，你说的那些条件要不要重新摸过啊？
谢谢楼主解答！

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:17

楼主，我也在用CCK-8啊，请问体积200μL，那加CCK-8 10μL还是20μL？

作者: dotaaa 时间: 2011-12-19 15:19

谢谢楼主，顶一下
顺便说一些使用CCK-8的体会
我们用CCK-8检测细胞活性，每次读96孔板，都换液，无血清培养基+CCK-8，1:10，我们不用枪头吸，就是甩板，反复甩几下就OK了，每次读出的数据还是比较正常的，孔与孔之间的误差不大

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:22 标题: 回复 #26 rxcc33 的帖子

不好意思啊，忙着做实验，好久没有上来看。
细胞数应该不用重新摸了。孵育时间要摸。100微升还是200微升体系要看自己实验设计，一般参照同类细胞其他文献资料。cck8的量也要看实验数据来定。量多显色就深，OD值就大。预实验肯定是要做足功夫的。浪费小小是必然的。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:22 标题: 回复 #28 dotaaa 的帖子

这样做应该还会节省CCK8，不过想请教下你们怎么进行甩板操作的。在超净台里吗？我用的抽真空吸管吸的，发现差异还是存在的。虽然理论上说细胞贴壁了就不会那么容易被吸走。

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:23

谢谢楼主回复！
不过我对如何摸CCK8细胞浓度感到很疑惑！因为这有两个变量，细胞数和CCK8孵育时间
1、我可以铺很多细胞数，孵育时间很短，应该可以使OD值在1左右；
2、或者铺很少细胞，孵育时间加长，也可使OD值在1左右。
请楼住指教！

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:24 标题: 回复 #31 rxcc33 的帖子

我想你应该是还没有做过这个实验。你不能迷信数据，你要清楚你的细胞何时贴壁，何时为对数生长期，你的药物作用在细胞的什么期。你当然可以种很多细胞数，可是你加药还要孵育那么长时间，细胞堆积生长的话，你的数据一样不好。

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:25

谢谢楼主回复！
那你说的摸细胞浓度的预实验到底怎么做呢？
我不明白应该具体怎么做啊，谢谢楼主赐教啊！

作者: zhezhe 时间: 2011-12-19 15:25

这样做应该还会节省CCK8，不过想请教下你们怎么进行甩板操作的。在超净台里吗？我用的抽真空吸管吸的，发现差异还是存在的。虽然理论上说细胞贴壁了就不会那么容易被吸走。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-19 15:25

是呀，这样会节省CCK-8。
我们就是在超净台里甩板的。就是把板子翻过来甩几下就OK了。
我们的真空吸液器是得一个孔一个孔吸，我们是整板操作嘛，比较麻烦，而且吸液时间长，细胞容易干死，呵呵，个人看法。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:26 标题: 回复 #33 rxcc33 的帖子

你对你的细胞了解吗？你知道细胞贴壁要多长时间吗？
你实验总共是多长时间？在这个时间里你的细胞在孔里能长多满？
其实你师兄做过MTT，我个人觉得是不用再摸细胞数的。
还有MTT或者CCK8只是个试剂盒而已，如果你没有必要换，你大可以继续做MTT，这样可以省去很多走弯路的时间，大把的实验要做呢，别在这个评价手段上纠结浪费宝贵的时间。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:27 标题: 回复 #35 zhezhe 的帖子

想象不出是怎么甩的，你们是不是在旁边放了个废液缸，然后把废液甩在里面。不然很难想象你们是把废液甩在哪里的。我们的真空洗液器也是一孔一孔吸，不过我的手法还不熟练，还是会有细胞损失。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-19 15:28

楼主厉害，是我没说明白，我们就是那么做的，我们就是用96孔板的塑料外壳当做废液缸的，然后把废液甩在里面。
用真空吸液器一孔一孔吸，是不是也是一孔一孔加还是用排枪加CCK-8那？那样会用很长时间吗？

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:29 标题: 回复 #38 zhezhe 的帖子

塑料外壳，嗯，不错，我要试试。就是怕会污染。
对，吸的时候是一孔孔吸。加的时候用的是排枪。速度倒是还可以，就是我发现还是有细胞损失。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-19 15:30 标题: 回复 #39 吴才子的帖子

楼主试试吧，我们一直用这种方法，没有污染过。
我个人认为，甩板没有真空吸液器的力量大，所以细胞损失可能小一点。楼主比较一下吧，有什么问题在交流。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:31 标题: 回复 #40 zhezhe 的帖子

我今天特意把塑封都留下来了，后天加药的时候用紫外照照应该可以试试。嗯，多多交流啊。一直觉得那句话说的好，不要怀疑自己的能力，只是有些细节没做好而已。加油。

作者: caihong 时间: 2011-12-19 15:32

顶楼主我也一种在用cck8 还是蛮好用的，一般的体系也就是200ul +10ul 试剂，孵育2h检测，要是不小心吹出气泡我就用烧热的针头把它们干掉，呵呵

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:34

顶楼主我也一种在用cck8 还是蛮好用的，一般的体系也就是200ul +10ul 试剂，孵育2h检测，要是不小心吹出气泡我就用烧热的针头把它们干掉，呵呵

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仁兄你好啊，我做的也是200μL，可是CCK8的技术员都说要加10%，也就是20μL才行啊，你为什么加10μL啊？谢谢赐教啊！

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:34

请教楼主，你的200μL加10μL还是20μL？

作者: hyuu 时间: 2011-12-19 15:34

请问楼主，我是100微升体系，做了空白组（100微升培养基+10微升CCK8），对照组（90微升细胞悬液+10微升溶药介质+10微升CCK8），加药组（90微升细胞悬液+10微升药物+10微升CCK8）。加药处理24H,48H,72H小时测OD，但大概是0.2~0.4，这样的数据有效吗？比你说1.0低了很多，是细胞数量接种少了?还是其他原因？细胞24H后贴壁了。用的细胞是HEK 293T

作者: 穿越时空 时间: 2011-12-19 15:35

仁兄你好啊，我做的也是200μL，可是CCK8的技术员都说要加10%，也就是20μL才行啊，你为什么加10μL啊？谢谢赐教啊！

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主要是我每次检测细胞都比较多所以加20ul颜色比较深容易超出酶标仪的检测范围，所以就加10 因为一直结果也蛮稳定的而且我只需要一块板同比的数据，所以影响不大。不过一般还是按人家推荐的比较好吧

作者: rxcc33 时间: 2011-12-19 15:35

请教楼主，96孔板，给细胞换液，什么方法比较好啊？可以避免细胞损失。

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:36 标题: 回复 #47 rxcc33 的帖子

我试过楼上同学说的甩板，我觉得还不错。你可以试试，换完之后在镜下看看细胞是否损失。前提当然是你的细胞已经贴壁完全。

作者: 社会主义好 时间: 2011-12-19 15:37

谢谢各位，我正在做，看到帮助很大。

我想问下：96孔板培养细胞，我分别测24h 48h 72h 化疗药物对癌细胞的抑制作用。对于72h 组，需要换液吗？

作者: pengke1983 时间: 2011-12-19 15:38

楼主写的很好我是一个将要做这个实验的初学者但是我做的是悬浮细胞，我想问一下对于悬浮细胞，实验上要注意什么谢谢指点了

作者: 阿敏 时间: 2011-12-19 15:39

请问一下，大家做cck8，得到的数据如何处理的？

我是做药物对细胞的毒性试验，想绘制细胞毒性曲线图，做了6个复孔，数据应该怎样处理呢？有软件可用吗，如何处理？谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-19 15:40

先马克一下先，准备要做了，正在吸收些经验。我的细胞是种板贴壁后进行转染，再以药物处理24，48，以及72h，做一个药物与CCK8之间有无作用的试验还是必要的哦？

作者: dongdongqiang 时间: 2011-12-19 15:41

顶下楼主。
补充一点如果药物与CCK-8有反应，可以在药物孵育后吸出药物，加入培养基轻轻洗1-2遍，然后弃去，加入混匀好的110ul培养基和CCK-8（个人经过几次试验后认为这样可以减少加样误差），其余步骤和普通的一样就行了。我也是失败了好几次，才对CCK-8有了认识的，希望对大家有帮助。

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-19 15:41

我做的是药物浓度对细胞的影响，做MTT，做了3次，浓度越大OD值越小。但是，后来我做2次CCK8后发现，浓度越大OD值越大，怎么回事呢？大家给分析下，郁闷。

作者: 铜雀 时间: 2011-12-19 15:56

有毒，而且毒性很大。要把终浓度控制在千分之一以内。

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我看的是1%，请问你这个数据的依据？

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:56 标题: 回复 #55 铜雀的帖子

我看的是1%，请问你这个数据的依据？

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eg：
以HepG2、MTT-assay、dimethyl sulfoxide为key words。在PubMed中任意寻找一篇相关英文文献。You will find a word just like :"... in 1% dimethyl sulfoxide (DMSO). " 但是注意这里的是配制浓度，我们这里所讲的是终浓度，也就是最后在细胞板中药物的终浓度，你要算上药物被细胞悬液等稀释的倍数。

不同细胞对DMSO的反应不一样，最好的办法是自己设置对照，观察DMSO对细胞的影响。

作者: 铜雀 时间: 2011-12-19 15:57 标题: 回复 #56 吴才子的帖子

哦。谢谢。似是而非的了解了。我现在用DMSO溶解我的刺激药物。配制为10mg/ml的药物原液。使用时再稀释1000倍使用。不知道还有影响不？我做的CCK8

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 15:58 标题: 回复 #57 铜雀的帖子

不是似是而非，也不是答非所问。方法都教给你了，查阅文献，在此基础上预试验要做。授人以鱼不如授之以渔。

作者: 831226 时间: 2011-12-19 15:59

这个帖子开的非常适合我，我正在做这方面的实验。

最近做了一个5000，开始倍比递增的细胞生长曲线。
分别检测1，2，3，4小时的CCK-8 在450nm的OD值。

结果说明，细胞以2万的接种浓度比较适合，依据是此时OD值接近1.0。

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前辈你好你们总结的太好，收益很多。刚刚开始做原代细胞做细胞毒实验。买的也是同仁的cck8 请问
1,细胞以2万的接种浓度比较适合时间是在什么时候合适呢?
2,细胞生长曲线咋么做的呢

作者: bohe221 时间: 2011-12-19 16:00

谢谢楼主的分享。马上也要开始做了这方面的实验了，老师要求用CCK-8法，正在大量的查文献的阶段。
希望预实验能够成功。

作者: yysr238 时间: 2011-12-19 16:02

哎我也正在做CCK-8测化疗药物干预24小时后原代白血病细胞的OD值，4h后用酶标仪检测发现未加化疗药的比加了化疗药的孔OD值还低，数据中最高的也只有0.4，不知道怎么回事已经做了5次，有2，3次都这样的。找原因一直没找到，求助中...

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 16:02 标题: 回复 #61 yysr238 的帖子

有没有观察过细胞的状态？细胞没有种均匀？

作者: yysr238 时间: 2011-12-19 16:14 标题: 回复 #62 吴才子的帖子

谢谢您的回复，我的悬浮细胞在显微镜下看的都还可以，我在怀疑是不是酶标仪没测正确，明天再侧一批看看

作者: tianmei001 时间: 2011-12-19 16:14

同问，我最近CCK8 的数据和预想的居然相反，请教楼主：
细胞怎么种植均匀啊？
我是每次把细胞吸到一个大概5ml的EP管里，然后每孔加90ul细胞，加10ul药物，10ul CCK8，不知这样合理不？

作者: 吴才子 时间: 2011-12-19 16:15 标题: 回复 #64 tianmei001 的帖子

反复吹打均匀。细节决定成败。

作者: gbcat 时间: 2012-9-20 23:50 标题: 回复 #5 吴才子的帖子

你好，我是做细胞毒性实验，请问加药和加CCK8时的培养基是不含血清的吗？
我做的毒性实验，加药和不加药对细胞影响不大诶。。。。药物浓度比文献上的高出3倍效果也不好，抑制率不高，最多27%。。。怎么办。。。

作者: amyjetsci 时间: 2017-11-29 11:40 标题: 实验注意事项 CCK-8实验注意事项

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) KTC011001
Abbkine CCK-8试剂盒检测非常便捷。CCK-8试剂盒仅一管已经配制好的含有WST-8的CCK-8溶液，无须再进行任何配制等操作。无须使用同位素，所有的检测步骤仅在同一块96孔板内完成。不必洗涤细胞，不必收集细胞，也不必采用额外的步骤去溶解formazan。可以用于大批量样品的检测。
品牌（规格） Abbkine Sigma Dojindo
100次 200 元 703.17 元 350 元
500次 640 元 2779.92 元 890 元
2000次 2050 元 13899.6 元(3000次） ——
10000次 7180 元 —— 8380 元

实验注意事项：
建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基页面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读数。
白细胞可能需要培养较长时间。
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
如果没有450nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450nm滤光片的检测灵敏度最高。
如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

作者: nanxun 时间: 2023-3-10 20:33 标题: 回复 #63 yysr238 的帖子

请问你后面cck8的问题怎么解决的

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