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标题:[求助]转染带有GFP的目的基因载体后,观察不到荧光

bananapeople[使用道具]
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[求助]转染带有GFP的目的基因载体后,观察不到荧光




转染带有目的基因的EGFP-N1载体后,观察不到荧光,转染应该没问题。质粒浓度纯度都符合要求,且测序正确,无移码突变。不知道问题出现在什么地方,我于转染24,48小时后观察,都没有荧光,请大家帮帮我.
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hot_hot_hot[使用道具]
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你可以延长一下时间再观察荧光,有时间荧光的表达会延迟到3到5天的。
还有就是你是怎样确定转染没问题的,你的判断标准?
你最好做另外一个质粒试试你的转染是不是没有问题。
如果转染体系没有问题还是这样的话,那你的质粒的设计是不是合理?
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redbutterfly[使用道具]
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呵呵,不知楼主你转染的是什么细胞,但就我的经验,GFP表达最早的可在第二天能观察到,但到不了高峰,有的则是在5~6天后才会出现。不要着急,再等一下吧。
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DDD[使用道具]
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你转染成功了吗?
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greenbee[使用道具]
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你转染的是什么细胞啊?用得是什么载体啊?我转染肿瘤细胞时使用纳米载体在第一天都有荧光,脂质体就更明显了。
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ending[使用道具]
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我用的是EGFP-N1, 转染应该没有问题,因为转的空载体有荧光。谢谢的大家的帮助,我在多观察几天,真不行就在换一种载体。
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remenb[使用道具]
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我用的是EGFP-N1, 转染应该没有问题,因为转的空载体有荧光。谢谢的大家的帮助,我在多观察几天,真不行就在换一种载体。

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你的质粒构建没有问题吧!!
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remenb[使用道具]
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我想请问,假如荧光暂时看不到,3-5天以后才能看得更清楚,这期间细胞应该怎么处理?三天换一次液就行了么?还是需要抗性基因筛选?如G418。如能快速回答,不胜感激!
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sunnyB[使用道具]
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你构建的载体有没有问题?应为有些酶切位点的位置不是3的倍数,需要增加几个碱基的,不然密码子移位,荧光蛋白不能正确表达,细胞自然不会发出荧光了。

转染有两种:1瞬时转染,2稳定转染。如果你要筛选出稳定表达蛋白的细胞株,将质粒整合入细胞的染色体,这时候要拿G418进行筛选,如果只是瞬时转染,检测目的基因能否表达,就不需要用G418筛选。

瞬时转染的时候,一般细胞转染荧光蛋白24小时后,就能发出荧光,48-72小时,荧光强度会增强,因为是瞬时转染72小时后会逐渐衰落。
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49888[使用道具]
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留爪,我也碰到了相同问题。

同时转染,空载没问题,但是装了基因的质粒就是不发光。

序列已经确定没有移码。
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