[总结帖]细胞版疑难帖 - 经验共享

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [总结帖]细胞版疑难帖

369 10/37 |‹‹‹8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[总结帖]细胞版疑难帖

utt0989[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 78340
精华 1
积分 660
帖子 975
信誉分 102
可用分 5663
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-28
状态离线

发表于 2012-8-30 17:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

偶做过啊。

试验中兔源大鼠nNOS 单抗、SABC 免疫组化试剂盒、DAB试剂盒,由武汉博士德生物工程有限公司提供。

具体步骤：
　nNOS 免疫组化反应　用SABC 法。(1) 先烤片,恒温烤箱内60 ℃放置1 h ; (2) 脱蜡,梯度酒精脱水, PBS 洗10 min ×3 次; ( 3) 新鲜3 % H2 O2 中10 min灭活内源性过氧化物酶,双蒸水洗10 min ×3 次; (4) 切片置于0. 01 mol/ L 柠檬酸盐缓冲液中行微波抗原修复,25 min ; (5) 冷却后,滴加抗原修复液30 min ,双蒸水洗10 min ×3 次; (6) 滴加正常山羊血清60 min ,不洗,甩去多余液体; (7) 滴加兔抗鼠
nNOS 一抗(1 ∶2 000) ,室温下(25 ℃) 孵育1 h ,再4 ℃过夜,PBS 洗10 min ×3 次; (8) 滴加生物素化山羊抗兔IgG, 室温下60 min , PBS 洗10 min ×3 次; ( 9 ) 滴加试剂SABC , 室温60 min , PBS 洗15 min ×4 次; (10) DAB 显色,室温下20 min ,双蒸水多次洗涤; (11) 脱水,透明,中性树胶封片。

kulee[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态离线

发表于 2012-8-30 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不知你们的结果怎样，听说有南京建成的NOS及亚型检测试剂盒，不知咋样？

pengke1983[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 78619
精华 0
积分 470
帖子 639
信誉分 100
可用分 3986
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-1
状态离线

发表于 2012-8-30 17:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我曾经用过南京建成的分型NOS的试剂盒，一个试剂盒可以策总NOS和iNOS，结果还可以，价钱也不贵

kulee[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态离线

发表于 2012-8-30 17:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！！

viviwang1987[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77490
精华 0
积分 458
帖子 636
信誉分 100
可用分 3953
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2012-8-30 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

鄙人做过iNOS的检测。采用的一抗是rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA)，武汉博士德的ABC试剂盒。当时没有做nNOS,但是估计sigma也有该一抗。具体请到以下网址查询：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/Local/SA_Splash.html')

此外，在近期我们发表的一篇文章里详细介绍了试验方法，操作类似，在此提供，希望能有所帮助。
The primary anti-iNOS was rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA), and the ABC kit was purchased from the Boster Company in Wuhan, China. The procedure of iNOS immunohistochemistry was as follows. Phosphate buffered saline (PBS, 0.1 mol/L, pH 7.2-7.4) was used to replace the primary antibody for negative control. The sections were soaked in double distilled water for 15 min, then incubated at room temperature in 3% hydrogen peroxide for 10 min to inactivate endogenous peroxidase, and then treated with PBS for 2 min. After the nonspecific reaction was blocked with normal goat serum at room temperature for 20 min, the sections were incubated with a reaction buffer containing primary antibody at a dilution of 1:100 for at least 14 h at 4°C. The sections were then washed three times with PBS for 15 min before being incubated with biotinylated anti-rabbit IgG for 20 min at 37°C. The reaction was terminated by washing the sections with PBS for 15 min. Then the sections were incubated with streptavidin biotin complex solution at 37°C for 20 min, followed by four washings with PBS for 5 min each time. Finally, they were visualized with diaminobenzidine substrate working solution and then counterstained with hematoxylin.

阿敏[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74162
精华 0
积分 298
帖子 316
信誉分 100
可用分 2356
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2012-8-30 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人欲用Alcian blue法检测细胞硫酸软骨素的含量,但找不到硫酸软骨素做标准曲线,不知那位好心人能提供一点或告之如何买!谢谢!

HP007[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2012-8-30 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这里还有一点，不知道够不够你用。呵呵。其实不算太贵的。自己买吧。

我用的是从sigma买的：
Chondroitin 6-sulgate sodium, Sigma, C4384, 1g, 38.00$

详情：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail/SIGMA/C4384')

阿敏[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74162
精华 0
积分 298
帖子 316
信誉分 100
可用分 2356
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态离线

发表于 2012-8-30 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在做实验，需要分离大鼠的卵泡膜细胞和颗粒细胞，还有哪位知道卵泡膜细胞上含有那些酶？我的信箱是moqu214@sohu.com

kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态离线

发表于 2012-8-30 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 颗粒细胞分离与培养：
采用成年雌性大鼠, 在动情周期的滤泡阶段处死动物, 取出卵巢并去除粘连的脂肪, 放入含少量培养基(DM ENM /H am ’s F12 培养基1∶1, 0.1% 牛血清白蛋白、碳酸氢钠2.4g/L 及抗菌素) 的器皿中; 在体视显微镜下解剖出卵泡并切开, 冲洗出颗粒细胞,收集后清洗、离心, 将颗粒细胞悬浮于2m l 培养基中反复吹打使之分散。如需提高纯度, 可用0～ 90%Perco ll 介质作密度梯度离心; 如细胞分散不佳, 可用透明质酸酶(230U/m l) 对细胞作分散处理15 分钟。细胞分离制备后, 计数细胞数的存活率, 调整细胞密度后分装到含10% 小牛血清的培养基中, 每孔10 万个细胞, 在37℃、5%CO 2 下孵育24 小时。24 小时后更换不含小牛血清的培养基(原因是血清对细胞激素分泌功能有抑制作用) , 并加入睾酮作为芳香化酶的底物及受试物, 视研究目的培养不同时间。

2. 卵泡膜分离和培养：
取已去除颗粒细胞的卵泡膜, 用培养液反复吹打清洗或用一金属环进一步刮去粘附的颗粒细胞, 然后分装到培养管(孔) 中(3～ 4 个卵泡膜/m l) ,用上述DM EM/Ham′s F12 培养基在37℃的二氧化碳孵箱中培养。

eric930[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态离线

100

发表于 2012-8-30 17:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位楼上楼下的乡邻：
你们好！
我从sigma 公司购买了从蛋黄提取的溶血卵磷脂(LPC)用于试验，需要配制它的摩尔浓度，但目前不知道其分子量，各位知情的乡亲能否指点迷津。本人将不胜感激！

369 10/37 |‹‹‹8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 ›››|