细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [总结帖]细胞版疑难帖

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 369  29/37 |‹‹‹27282930313233343536›››|
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[总结帖]细胞版疑难帖

KGZ564[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74472
精华 0
积分 452
帖子 583
信誉分 100
可用分 3756
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
281

发表于 2012-8-31 12:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

带一个本科生实验，观察线粒体的活体染色，我是用罗丹明123染色的，也用荧光显微镜拍了照，400倍下的。但一时忘了拍对照。做过的人，请帮我看一下，图中是否就是线粒体？另外，可否帖一下用RH123染色的步骤和原理？谢谢，google上查原理，只查到是：罗丹明123 (Rh123) 是阳离子染料, 能够依赖线粒体跨膜电位进入线粒体基质, 而使其荧光猝灭。线粒体跨膜电位丧失后, Rh123 重新释放出线粒体, 从而发出荧光，但我需要给学生较详细的解释。不好意思，初次带这种实验，见谅。


查看积分策略说明
附件
2012-8-31 12:47
60616845.snap.jpg (20.45 KB)
 
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
282

发表于 2012-8-31 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图的背景很高，细胞形态也无法辨认。线粒体一般是在核周围呈弥散的点状分布，因此，取出一部分细胞，用DAPI或者hochest将细胞核染色染色，分别用蓝色荧光和红色荧光拍照，然后两张图重叠起来，此时如果看到你的红色荧光是在蓝色的核周围呈现点状分布的话，断定它确实是线粒体的可能性会大一些。
顶部
小糖块[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76231
精华 0
积分 259
帖子 258
信誉分 100
可用分 2056
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态 离线
283

发表于 2012-8-31 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

作hES核型分析，目前我遇到这样的问题：

1。染色体高度凝集－－所有染色体看起来都是一个小短棒的形状，无法分辨配对。

2。染色体分散不开－－基本上聚集在小范围内，不太容易计数。

我的实验条件：秋水仙素0.15--0.20微克/毫升，作用时间3.5h－－7h，低渗浓度0.05--0.075M KCL，低渗时间15min－－30min，滴片高度1.2--2.0m，也作过涂片烤干，

但是，总是出现上述两种问题，请高人指点。
顶部
wmp1234[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79925
精华 0
积分 588
帖子 855
信誉分 100
可用分 5078
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
284

发表于 2012-8-31 12:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #284 小糖块 的帖子

本科时候做过，但现在的确记得不是很清楚了，关于染色体分散不开是否考虑在往载玻片上滴的时候最好滴管口距离载玻片5-10cm，并且载玻片呈30度左右倾斜，此时滴上去的溶液在重力的作用下摔到载玻片上，并在一定的倾斜度下扩散均匀，然后观测的话可能会分散好一些。只记得这些了，具体操作还真记不起来，请见谅！
顶部
zwsyrt[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79787
精华 0
积分 594
帖子 867
信誉分 100
可用分 5136
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-15
状态 离线
285

发表于 2012-8-31 12:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为出现上述情况的原因可能是：
1、染色体高度聚集：秋水仙素处理过度。
2、染色体分散不开：低渗处理及固定得不好。
不知道你上面提到的实验条件是不是都试过了。我们做的是一种动物的核型，处理条件是秋水仙素0.4ug/ml，时间是5-6h。低渗液为0.4%KCl，37度低渗20min。固定两次，每次15分钟。最后滴片的时间跟meixsy说得差不多。做出来效果一般都不错。
顶部
dragonkilly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77754
精华 3
积分 596
帖子 699
信誉分 106
可用分 4371
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-21
状态 离线
286

发表于 2012-8-31 12:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 小糖块 于 2012-8-31 12:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

作hES核型分析，目前我遇到这样的问题：

1。染色体高度凝集－－所有染色体看起来都是一个小短棒的形状，无法分辨配对。

2。染色体分散不开－－基本上聚集在小范围内，不太容易计数。

我的实验条件：秋水仙素0.15--0.20微克/毫升，作 ...

我做过几次，也遇到过你的情况，后来改变以下面的条件做了几次，效果不错，希望对你有所帮助。细胞状态很重要，我一般在传代48小时后，增值旺盛时期。
1。秋水仙素浓度40ug/ml,作用2.5-3小时。
2。低渗30－40 分钟。37度
3。固定液预冷，重复冰上固定三次。
4。载玻片预冷，50CM 滴片。
5。室温放置两天，染色。
另外，载玻片应该是处理过的，未涂胶的，给我感觉你的问题在于秋水仙素浓度和低渗时间和细胞时期的选择，其他条件都是次要的。
顶部
dragonkilly[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77754
精华 3
积分 596
帖子 699
信誉分 106
可用分 4371
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-21
状态 离线
287

发表于 2012-8-31 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我欲购P53 null saos-2细胞，有哪位战友知道哪个公司代理的比较好，价格比较合理，售后服务较好。有知道请信箱回复lixinmin1999@163.com
盼回音！多谢了。

——————————————————————————————————————————————————————————

此细胞系国内文献还未见到，但国外文献中见到过
题目：A Genomic Map of p53 Binding Sites Identifies Novel p53 Targets
Involved in an Apoptotic Network
出处：Cancer Res 2005; 65: (12).
另外我想知道的是，H1299细胞也是p53 null细胞，如果没有saos-2细胞，可否选择H1299呢？这个细胞很常见的啊！
我这里有，你可以拿别的我感兴趣的细胞交换哦。呵呵
顶部
66+77[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75637
精华 1
积分 596
帖子 785
信誉分 103
可用分 4751
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态 离线
288

发表于 2012-8-31 12:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大佬,本人现在急需帮助!!!

我想看蛋白在水稻中的亚细胞定位,预期是在细胞质中表达,要求必须排除在细胞核及线粒体中表达,我用Rhodamin 123染色,Leica的confocal, 以愈伤做材料,问:
1, 是不是一定要做切片或者分离单细胞才能得到好片子?
2, Rhodamine 123染色时间多长为好, Dulbecco's PBS漂洗有什么具体的要求没有,例如时间等条件?
3,如果可能的话,能否推荐一个理想的制片方法及confocal条件?本人是这方面的菜鸟!

哪位热心人能否给点建议呀,能给我留个联系方式最好,我好再次联系!

多谢了!
顶部
avi317[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态 离线
289

发表于 2012-8-31 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #289 66+77 的帖子

线粒体膜电位和线粒体肿胀度是观察线粒体膜通透性和流动性功能，进而评价线粒体功能的敏感指标。线粒体对Rhodamin 123的摄取过程是依赖膜电位差与逆向扩散的综合效应，故检测Rhodamin 123的荧光强度可间接反映线粒体膜电位。而我不明白的是楼主做的是亚细胞的定位，而并非检测线粒体膜电位的变化，因此楼主拿Rhodamin 123染色为何？我想要说的是，如果你要检测你的目的蛋白是否在胞质中表达而又要排除细胞核与线粒体，我想最好的办法就是荧光观测，你的目的蛋白可以构建有带有绿色荧光的标签，表达后的细胞分别用mito tracker（线粒体marker，有红色的）标记线粒体，DAPI或者Hochest染核（蓝色），然后三张图重叠起来比较一下马上就能辨别。不知道说清楚没有？
顶部
3648755[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77481
精华 0
积分 574
帖子 767
信誉分 100
可用分 4731
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
290

发表于 2012-8-31 12:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大家好，我欲购P53 null saos-2细胞，有哪位战友知道哪个公司代理的比较好，价格比较合理，售后服务较好。有知道请信箱回复lixinmin1999@163.com

——————————————————————————————————————————————————————————

此细胞系国内文献还未见到，但国外文献中见到过
题目：A Genomic Map of p53 Binding Sites Identifies Novel p53 Targets
Involved in an Apoptotic Network
出处：Cancer Res 2005; 65: (12).
另外我想知道的是，H1299细胞也是p53 null细胞，如果没有saos-2细胞，可否选择H1299呢？这个细胞很常见的啊！
我这里有，你可以拿别的我感兴趣的细胞交换哦。呵呵
顶部
 369  29/37 |‹‹‹27282930313233343536›››|