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标题:[总结帖]细胞版疑难帖

loli[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
酶消化法中酶的浓度和时间？
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发表于 2012-8-30 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1. 1mg/mL 胶原酶， 室温消化30min ，离心，弃上清
2.1mg/mL胰酶，37摄氏度消化20min ，离心，弃上清
3.1mg/mL胰酶，37摄氏度消化20min ，离心，弃上清
4.1mg/mL 胶原酶和0.5mg/mL 弹性蛋白酶混合酶液，37摄氏度消化2小时 ，
5.rpm900离心5min，收集细胞
6.接种于1０％ＦＢＳ的DMEM
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泡泡[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位前辈：
我正在做狗的主动脉平滑肌及成纤维细胞培养，都是刚开始做，也都失败
。二者都是用组织贴块法，用的培养基都是DMEM+20%FBS，平滑肌培养用的过程中感觉困难的是：在剥除血管外膜时很困难，要想做到不污染，且动作轻柔不损伤组织，还要剥的干净，感觉特难，我总怕剥的不干净，所以每次都剥的时间很长，不知道哪位老师能够指点一二，有什么好的方法，到底要剥到什么程度才算干净等等
其二，成纤维细胞，我用的是狗的一快皮肤，第一次培养不知道用脱毛剂，光剪除毛发用了很长时间，真难弄，而且皮肤容易卷到一起，有的文献说剪成3mm大小，有的说要剪成1mm大小的组织块（个人感觉血管组织剪成1mm还能做到，但皮肤组织剪成1mm真的很难，而且皮肤伸展性很好，很难掌握），到底要剪成多大，以及培养过程中的注意事项，请各位老师不吝指教，我真的好急啊，时间好紧，可是细胞还不知道在哪，都想买了！！
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发表于 2012-8-30 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 泡泡 于 2012-8-30 17:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位前辈：
我正在做狗的主动脉平滑肌及成纤维细胞培养，都是刚开始做，也都失败
。二者都是用组织贴块法，用的培养基都是DMEM+20%FBS，平滑肌培养用的过程中感觉困难的是：在剥除血管外膜时很困难，要想做到不污染，且动作轻柔不损 ...


犬胸主动脉平滑肌贴块法
1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，时间太长就先天不足；
2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；
3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；
4、用两个小号的有齿镊，一个夹紧剥离出的脐动脉，另一个小心地撕开外膜，不能太深，以免撕开中膜。一般可以有一段像袖套样剥下来，这一段的外膜成功剥离了。如果不行可以用刀切的，买几个吉列的刮胡刀片，用时高压消一下就ok了。
5、培液Gibco的DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20％。

成纤维我没有做过，希望可以帮上你。
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发表于 2012-8-30 17:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章发表。
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 remenb 于 2012-8-30 17:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章 ...


不是只有海马神经细胞才可以。
我们实验室现在有一个细胞株，mouse Neuro-2a neuroblastoma cells （常被人们称为N2a细胞）。该细胞是来源于小鼠脑的神经瘤母细胞。
很多实验室用于AD，目前我们也在做相关研究，很快就有文章发表。
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上，,请问这个细胞株是国际上公认的么?在PUBMED中查不到啊!
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 kewanqi2011 于 2012-8-30 17:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼上，,请问这个细胞株是国际上公认的么?在PUBMED中查不到啊!


该细胞是建系不是很早，但是也是国外多个实验室公认的一个细胞株。

具体该细胞分泌什么递质我没有查过，你可以查查看看，毕竟可能我们专业不同，关心的角度可能也有所不同。

我给您发一篇文献，你看看。你可以再以此为基础查查其他文献，希望能对您有帮助。
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kulee[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-8-30 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 kulee 于 2012-8-30 17:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问有没有这样的专用试剂盒，贵吗？

有没有人做过相关的试验啊？？

请教经验，谢谢！！

鄙人做过iNOS的检测。采用的一抗是rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA)，武汉博士德的ABC试剂盒。当时没有做nNOS,但是估计sigma也有该一抗。具体请到以下网址查询：cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/Local/SA_Splash.html')

此外，在近期我们发表的一篇文章里详细介绍了试验方法，操作类似，在此提供，希望能有所帮助。
The primary anti-iNOS was rabbit multiclonal antibody (Sigma Co., USA), and the ABC kit was purchased from the Boster Company in Wuhan, China. The procedure of iNOS immunohistochemistry was as follows. Phosphate buffered saline (PBS, 0.1 mol/L, pH 7.2-7.4) was used to replace the primary antibody for negative control. The sections were soaked in double distilled water for 15 min, then incubated at room temperature in 3% hydrogen peroxide for 10 min to inactivate endogenous peroxidase, and then treated with PBS for 2 min. After the nonspecific reaction was blocked with normal goat serum at room temperature for 20 min, the sections were incubated with a reaction buffer containing primary antibody at a dilution of 1:100 for at least 14 h at 4°C. The sections were then washed three times with PBS for 15 min before being incubated with biotinylated anti-rabbit IgG for 20 min at 37°C. The reaction was terminated by washing the sections with PBS for 15 min. Then the sections were incubated with streptavidin biotin complex solution at 37°C for 20 min, followed by four washings with PBS for 5 min each time. Finally, they were visualized with diaminobenzidine substrate working solution and then counterstained with hematoxylin.
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