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标题:【讨论帖】western blot问题解答

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您好 我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度,用曲线计算后大约是10毫克每毫升,上样量是20微升,GAPDH的条带特别宽相邻的泳道,染色后都连在一起,是不是上样量太多?
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确,该怎样调平?
3、我跑的条带有的呈锯齿状,还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样,是怎麽回事?
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你好,我停了几个月没做试验,今天重新开工,结果发现跑WB时,蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的,而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的,应该没问题,后来想起来,去年也出现过类似情况,但是还没弄明白的时候就自己恢复了。
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您好 我是新手想请教几个问题
1、我用BCA方法测的蛋白浓度,用曲线计算后大约是10毫克每毫升,上样量是20微升,GAPDH的条带特别宽相邻的泳道,染色后都连在一起,是不是上样量太多?
2、以BCA法测得的蛋白浓度条内参是不是不准确,该怎样调平?
3、我跑的条带有的呈锯齿状,还有的在染色条带周围还有较淡的染色像扩散了一样,是怎麽回事?
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1,上样量太大了,一般蛋白的上样量为20~40ug总蛋白
上样量的大小取决于电泳槽上样孔大小与凝胶的厚度
2,BCA测定蛋白浓度的时候想要准确的话应该至少做双管测定
想让内参很匀的话可以做一次WB,把条带的IOD值读出来,通过IOD值再来调整总蛋白的上样量
3,分离胶在配制的时候没有充分混匀
没有凝充分
浓缩胶与分离胶同样没有处理好
都会出现你说的这种情况
good luck
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你好,我停了几个月没做试验,今天重新开工,结果发现跑WB时,蛋白样品跟Marker都在浓缩胶里分离了。
所有的试剂都新配的,而且配胶的试剂跟电泳缓冲液的pH也是昨天晚上才调的,应该没问题,后来想起来,去年也出现过类似情况,但是还没弄明白的时候就自己恢复了。

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1,浓缩胶的高度一般在1cm左右,太多了会影响分离胶的高度,进而影响分离胶的分辨率
2,电泳缓冲液是不用调整pH的
建议用双蒸水新配电泳缓冲液,别调整pH
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相关疾病:
肺癌
我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量,如何选择内参,查文献发现这些上清中不存在β-actin,β-tubulin等常用的内参,但看到有人提到可引入外源性的参照物,好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中,再进行western,由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的,因此,也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗?还有没有其它的办法比较?
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我想问,我做小鼠的VEGF Western blot , 我该选择什么样的一抗呢?VEGF亚型比较多。
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我们的浓缩胶高度是按照梳子孔一下1cm左右留的,现在的主要问题是蛋白在浓缩胶跟分离胶里都一直分离,就没有被压缩。
然后我们的电泳缓冲液是调成8.3,好像就是因为出过类似的问题,然后才强调要调pH的,5*,1*都这样调的,您认为这个可能是问题的所在是吧。
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相关疾病:
肺癌


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我想比较肺癌组织培养液上清与正常肺组织培养液上清中的3种蛋白质含量,如何选择内参,查文献发现这些上清中不存在β-actin,β-tubulin等常用的内参,但看到有人提到可引入外源性的参照物,好像就是将一定量的β-actin或β-tubulin加入到一定体积的上清中,再进行western,由于加入的β-actin或β-tubulin是已知的,因此,也可作为参照来比较上清中多种蛋白质的含量。
请问楼主这样行得通吗?还有没有其它的办法比较?

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上清液中的蛋白WB本来就是一个问题
那你如何收集上清中的蛋白?
加入纯化好的beta-actin?
我觉得行不通
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我想问,我做小鼠的VEGF Western blot , 我该选择什么样的一抗呢?VEGF亚型比较多。

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我做过骨骼肌的VEGF,结果不错的
没有分亚型
亚型由你的研究目的决定啊
我用的抗体是santa cruz的
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我们的浓缩胶高度是按照梳子孔一下1cm左右留的,现在的主要问题是蛋白在浓缩胶跟分离胶里都一直分离,就没有被压缩。
然后我们的电泳缓冲液是调成8.3,好像就是因为出过类似的问题,然后才强调要调pH的,5*,1*都这样调的,您认为这个可能是问题的所在是吧。

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电泳缓冲液的pH你调整他干嘛?不用调的
这么多年了重来没有在电泳缓冲液上出过问题
另外你测定一下你的浓缩胶储液现在的pH是多少
测定之前建议你校正pH计先
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