小中大再请教老师一下：
最近我做了两次，没有条带，背景很脏。我想问一下：
1.封闭用常温摇两小时好还是四度过夜好(这两次我用的是4度过夜）
2.一抗使用5%的脱脂奶粉稀释好还是TBST好（这两次我用的是TBST)
3.我没有摸抗体浓度。抗体是国产的多抗，推荐浓度为1：100-1：400.我直接用1：300的。就是背景很脏，连杂带都看不见。
4.我的两个蛋白是20 Kd 和29Kd,用多大的胶跑好呢。我用的是12%的。感觉Marker跑的还可以，我的marker 有八条带，最好的时候跑出了七条带，一般都是六条，是不是我的胶浓度不行。
再次感谢老师回答！
===============================================================================
1，封闭建议RT 30min或者4度过夜
2，建议用封闭液稀释抗体，这样在抗体孵育过程中还可以起封闭作用
3，多抗稀释度这么低啊，建议你换厂家
4，联杂带都没有的话可能是你的蛋白没有提出来抑或是降解了，如果是磷酸化的要加磷酸酶抑制剂
5，用15%的分离胶比较好
