蛋白质与蛋白组学

5. Write up and try to publish the first purification that gives any product.
There is a tendency for readers, especially inexperienced readers, to assume that a published purification is the result of many cycles of improvement and optimization, and represents the best way to purify the protein. This is very often not true. Many times, it is just a series of steps, often chosen arbitrarily that happens to result in some product. One should look very carefully at a purification to assess if it is a procedure that is worth trying to follow if one wants to purify some of the target protein. This is why a proper purification summary table is so valuable. If huge losses occur at a particular fractionation step, if the overall yield is very low, if the final purity is not high, or if similar fractionation steps are used several times, then perhaps the procedure should merely be used as a beginning point in designing a better, more effective purification.

试图复制已发表的纯化方案
对文献的读者来说，特别是那些纯化新手，倾向认为已经发表的纯化方案是多次改进和优化的结果，是纯化这种蛋白的最佳方案。不幸这常常是错的。很多时候，这一方案仅仅是一系列偶然选择的步骤组合，碰巧可以纯化出一些目标蛋白。如果你想纯化出同样的目标蛋白，那么你应该仔细地研究一下这个纯化方案，看看它是否值得去尝试。这也是为什么一个恰当的总结表是如此重要。如果在某个特定的纯化步骤有巨大的目标损失；如果最终产品的纯度不是足够高；如果相似的纯化步骤用了好几次，那么也许这个纯化方案只能作为一个起始点，用以设计一个更好更有效的纯化方案。

我也常说这些话，甚至更甚。我认为绝大多数关于蛋白质纯化的文献都不是你该去复制方案的，也很难、很难复制出来，体系的影响因素太多了。看纯化文献的精髓在于得到一个关于目标蛋白性质的描述，而这些性质在我们用computer work是得不到，或是补充的。细节不可复制，策略可以参考。另外，看文献非常重要的一点是得到目标蛋白的检测方法，干扰因素，可能是活性测定方法，也可能是纯度检测方法等。

6. What to do when purifying a protein where a fusion partner is cleaved off during
the procedure?
Very often a recombinant protein is expressed as a fusion with another protein or tag that aids in its folding or purification (see Chapter 16). Since most often the desired final product is the target protein without the fusion partner or tag, especially for structural studies, the fusion partner must be cleaved off by one of several specific proteases. Let us say that the target is 20 kDa and the fusion partner is 40 kDa, so the fusion protein expressed is 60 kDa. At the step where the fusion protein is cleaved, the yield of target protein seems to decrease by 67% even if all of it is recovered. How is this indicated in the summary table? I suggest that the column on target protein amount contain two numbers; the mg of fusion protein and the calculated mg of the final target protein in parenthesis. That way at the step where the cleavage has occurred, one can continue giving just the mg of the cleaved product and the theoretical amount of cleaved product in the first step can be used to calculate the overall yield.

纯化过程中被纯化蛋白的融合片断被切割掉怎么计算收率？
（略）


用切割之前的目标蛋白理论含量来表示就可以保持切割前后纯化过程的一致性。
这只是一个文字游戏而已。

试验室装备
（略）

本章感觉写得很乱，不够好，也没有什么很特别的地方，就不做详细的笔记了。还不如我的那个“蛋白质纯化武器-设备篇”
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15120322&sty=1&tpg=2&age=-1')
简单明了实用呢，呵呵，自我被厚脸皮了一次。

简单讲，一个蛋白质纯化试验室包括通用设备、检测设备和纯化用设备。也是一个人为的分类，界限不是清晰的。

我觉得值得拿出来讲一讲的是：
1、High-grade distilled H2O 高纯水
高纯水是一个模糊词，不恰当。当然，这有可能是由于老外和我们国情的差距，比如说我们的自来水标准与他们是不一样的。
在试验室，我们通常把水分为：自来水，纯化水（去离子水）和注射用水。当然，也许有的试验室还有双蒸水，三蒸水等，这可以归纳到纯化水当中去。
自来水不能作为蛋白质纯化过程用水。自来水只能用来洗洗刷刷用。
纯化水是蛋白质纯化用的主力军。
对高要求的蛋白制品，例如药用蛋白，蛋白质纯化用水最好全程都是注射用水了。这是为了严格控制内毒素热源的需要。
还要强调一下，双蒸水或三蒸水都不能等价于注射用水。注射用水可以用双蒸或三蒸的方法来制备，但要经过严格的检验和保存程序，合格后才能作为注射用水。
在我们普通的试验室当中，例如多数的大学和研究所，没有实际意义上的注射用水。注射用水存在于GMP的药厂中。

2、Spectrophotometer 分光光度计
这个不是指连接在纯化系统中的分光光度计，而是单独的全波长紫外-可见分光光度计，一般是190-760nm波长范围，可以做全波长扫描。
一个很重要的设备，要注意石英杯和玻璃杯的差别，玻璃杯只能测可见光。

3、FPLC systems
蛋白质纯化用层析设备。
在老外的文章或书中经常看到这个词FPLC，好像老外很喜欢这个东东。看来是人家市场推广做得好。
我觉得FPLC没有多大意思。是夹在中间的一个档次的层析仪器。要买好的设备那就Explorer或Purifier，否则就用P50泵搭载国产的紫外分光光度计来做简易设备好了。

4、Electrophoresis equipment 电泳仪
最好的、最明智的选择，Biorad。

缓冲液：原理与实践

1. Introduction
（略）
2. Theory
（略）

此段略去，不是因为它不重要，而是因为原文较长，公式不好粘贴。建议认真地去看看中文的分析化学书，有关弱酸、弱碱和缓冲溶液的相关章节，一定要详细地多看几遍，把它看懂、看明白。关于缓冲溶液的原理知识，很基础，但对蛋白质纯化来说非常重要。
特别是对磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、碳酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、甘氨酸、咪唑等这几种更要充分了解。

充分了解了缓冲溶液的理论，还对蛋白质纯化中所应用的关于蛋白质的理论滴定曲线，离子交换介质的pH应用范围，弱和强离子交换介质的本质区别、各种纯化介质基质的弱吸附性等有着更好的理解。

滴定曲线是这些知识的图形理解很好的方式，本质是弱酸或弱碱的电离平衡。