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做了三个月的western blot，有些心得想和大家一起分享。
1、组织蛋白提取
组织蛋白提取方面得明确自己所要提的蛋白定位在细胞的哪个位置，胞浆、细胞膜、细胞核，不同位置的蛋白提取方法是不一样的。本人检测的指标是大鼠肾脏组织核蛋白，刚开始直接采用碧云天裂解液P0013B来提取蛋白质，说明书介绍说裂解核蛋白能力相当强，就按照说明书提蛋白的步骤提取总蛋白，可是提取的总蛋白经电泳后发现蛋白在浓缩胶压缩的很不理想，估计是直接提取肾脏组织总蛋白浓度太高的原因（BCA定量显示 180000ug/ml），因而不合适，后来采用专门的核蛋白裂解液配方才成功提取了核蛋白。因此，我觉得碧云天的裂解液并不是万金油，还是得根据具体情况选择最佳的蛋白提取液。
2、灌胶
首先一定要将玻璃板清洗干净。早晨清洗玻璃板时，可用洗洁精或者洗衣粉等清洗玻璃板，然后在60℃的烤箱里把水分烤干。烤干的玻璃板再装上，一般就不会漏。检测是否会漏胶我是先灌蒸馏水，5min内若蒸馏水的液面不下降或者只降低一点点那就不影响灌胶了，可放心配胶。分离胶加的量不可太多，否则上样泳道就过浅，减少了上样量。分离胶的聚合时间最好保证有40min的聚合时间，虽然多加了过硫酸铵和TEMED的话可以加快聚合速度，但是我不推荐。认真做好一块胶是做好后续实验的基础。
3、电泳
从历届师兄以及个人实验，我觉得蛋白样品在浓缩胶时的电压为80V，时间为20min左右，在分离胶时可以提升到110V，直至溴酚蓝将抛出为止，整个电泳时间大概在120min左右，当然分离胶浓度不同的话时间会有所差别。
4、转膜
多次的实验摸索让我对转膜颇有心得。有条件的话最好用新鲜配制的转移缓冲液，最好不要超过三次，否则缓冲液的成分发生改变，你用同样的转膜条件就不一定能有一样好的转膜效果了。个人觉得似乎恒压转膜要强于恒流转膜，虽然有人说采用恒压转膜可能会因为甲醇的挥发导致电流不平稳，不利于转膜，但我采用恒压效果还是相当不错的。
5、封闭
我们实验室采用10%的脱脂奶粉封闭，时间一般为2~3h，但是我是封闭过夜，效果不错，背景淡，特异条带突出。当然这跟一抗、二抗的稀释度也是有关系的。背景很深的园友可以考虑4℃封闭过夜。
6、一抗
刚开始一抗稀释度的摸索可以按说明书上限的两倍来摸索，比如说明书说1：100~1：500，我们可以从1：1000来摸索，我的指标就是这样子，其他人也很多这种情况，好的结果一抗的稀释度不一定在说明书的稀释范围。
一抗的孵育时间最好是室温摇床2h后再放入4℃冰箱过夜，利于抗原抗体结合。
7、二抗
二抗的孵育时间为1.5h~3h，不想等的话1.5h就够了，一般是2h
8、漂洗
用TBST漂洗PVDF膜 15min*3次 TBST最好两天换一次，放置过久，吐温失效。
9、曝光
在暗室里曝光时若能看到目的蛋白的荧光条带最好不过，若是不能看到也不要气馁，可以压片10min，再看看曝光效果。另外胶片从显影液取出放置定影液之前时 先过一下水 可以延长定影液的使用时间。我观察到用久了的定影液定影时间显著长于新配的定影液，若你发现定影得花上2min时间时，说明你的显影液定影液都得换了。。。。
不足之处， 请其他战友多多补充，一起交流。。。。
