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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

zzzz[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是啊 western blotting 追常用了
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的.是因为加样时太满溢出来的原因吗?上样量一共14微升,多吗?大家有什么好办法可以使条带之间有空隙,怎样做才能又直又齐呢?
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上样量一共14微升多不多要看你的目的蛋白浓度啊。
蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的，原因可能是胶的问题，要不然就是你的蛋白多了，减少点试试
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上，蛋白条带显色后脱尾是什么原因?
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图附上,内参有的拖尾,条带之间有连接,不齐,大家有什么建议吗?谢谢.


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2013-5-14 12:40
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douding66[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我正做Western blot，C-JUN，但是跑出的带在70Kd，而C-JUN的分子量是43kd,已经重复了3次，结果1都一样，我的分离胶浓度10%。为什么会这样？请各位前辈帮我分析原因何在？多谢
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douding66[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的经验如下:
1.蛋白抽取后最好分装成5次左右的量,这样以后再用的时候就不要反复冻融了,反复冻融蛋白会降解.
2.配胶:首先玻璃一定要洗干净,同时根据你的目的基因的大小决定胶的浓度,要想得到漂亮的图片,配好后最好用针头冲洗干净加样孔.
3.电泳:初次做实验蛋白上样量最好做不同梯度的,同事不要为了省事就120V跑到底,最好分离胶的时候用80V跑半小时左右.
4.转膜:熟能生巧,不要用气泡,必要是可以湿转.
5.染色,标记膜.同时转几张膜时Marker可以上样在不同的位置,以示区分.
6.封闭和一抗:抗体很关键.我们曾经因为抗体不好做了半天的都有.买抗体的时候如果BD, Cell signaling等公司有,就不要选择Santa Cruz 的.新的抗体要摸最佳稀释浓度.
7.二抗和显影.

Good luck!
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的蛋白条带间总是有连接,不好看.有的还弯弯曲曲的.是因为加样时太满溢出来的原因吗?上样量一共14微升,多吗?大家有什么好办法可以使条带之间有空隙,怎样做才能又直又齐呢?

===========================================================================================================

结合自身经历，原因分析如下：

1、蛋白条带间总是有连接，提示蛋白上样量是否过高？降低蛋白量看看有无改善。14微升量不算多，主要看你加上的蛋白量的多少。我加过15ul的条带都是分开的。

2、蛋白条带弯弯曲曲的，可能与电泳缓冲液配制、PH值和电泳设备有无质量问题等相关。建议重新配制电泳缓冲液试试看（也可把配方发出来我们来分析一下组分），若效果不佳的话，更换电泳仪试试看。
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近要做WB了，在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白，对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的，已经订了一种一抗，是兔抗大鼠的，不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的，那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。
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ukonptp[使用道具]
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发表于 2013-5-14 12:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 mimili_901 于 2013-5-14 12:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近要做WB了，在提的胞核蛋白中要同时跑三种不同的蛋白，对于一抗的选择很是苦恼啊。我做大鼠的，已经订了一种一抗，是兔抗大鼠的，不知道另外两个能否也订兔抗大鼠的，那样就能用同一个二抗了。希望各位能多多指教。 ...

我的观点是：

1、若三种蛋白的分子量相差较大，可以通过一次电泳和混合一抗反应进行。那么一抗都可以用兔抗大鼠的。但是条件摸索的确有点费时。

2、若混合一抗反应效果不佳，也可先用同一张膜进行一种抗体反应，做好后，用抗体去除液进行去除后再用另一种抗体进行反应，依次进行即可。

3、若三种蛋白的分子量相差较近，那就不能同时进行抗体抗原反应，那就不存在这个选择问题，但建议还是用同一个来源的一抗，这样二抗就买一种就可以了。
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