【讨论帖】western blotting试验技术讨论 - 经验共享

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标题:【讨论帖】western blotting试验技术讨论

duoduo[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

电泳缓冲液可以重复用,只是会延长电泳时间.
BSA比脱脂奶贵很多,一般我们尽量用后者代替.
上样量均衡,样品就不会跑斜.
想要带型漂亮,低压,长时.
胶的浓度很重要.
预染marker对转膜很有帮助.

DNA[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚做western blot 不久，跟坛子的大家们相比还是新手小菜，这里就自己的一些教训及trouble shooting过程写出来，和大家一起讨论学习。
1）从公司order的胶不可靠，即便biorad也如此。而自己做胶，Tris-HCL的PH值比较重要，配制时间比较长的液体，比如超过1月，最好应该重新调PH值，不然就会增加band不够sharp的可能性
2）一抗可重复利用，不过要稀释在TBST里面，可以维持15天到1个月，内参可到2月
3）二抗要便宜的多，可以相对过量一些，不重复使用

lgm[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在低温。
前一天晚上在实验室做预示，室温24度，20分钟凝
晚上降温，第二天上实验课，教室温度太低，1个小时没凝。开空调，20分钟搞掂。

queen[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谈起显影与压片，呵呵，正好刚搞好。
暗室操作：15W小红灯，经测试，没问题，不会曝光
压片：用片盒啦，反正一般我们是把膜用保鲜膜一包，然后把底片放在上面，曝光十分钟后，打开片盒，把底片转的方向，再用原来没曝过的地方再曝光一次，个人不喜欢把底片切来切去。
显影：我买的现成显影粉，定影粉，溶解后避光保存。使用时有温度要求，25度左右显影效果最好，低些温度的话，显影时间延长。另外，显定影时一定要多加些显影液与定影液，一定要使底片在里面能漂起来，否则底片有一面不会显影，最后结果是黑片。在显影后与定影前用水漂5-10分钟，可以使定影效果更好，而且延长定影液使用时间。定完影后，水洗20分钟，晾干。
显影与定影液都是可以回收的，反正我是回收好几次使用。

101010[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目的蛋白的一抗可以和内参的一起加吗？

memory[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做了1个多月的WB，有几点体会：
1.玻璃板用两个星期左右可以泡次酸，这样很容易洗干净；
2.浓缩胶一定要等1小时左右再拔梳子，特别是现在天冷，凝得慢，急不得；
3.AP配置分装后-20度冻存，两周内使用都有效；
4.TEMED不是越高越好，提高用量胶是凝得快，但是胶很脆，易碎；
5..丽春红染色并不是金标准，有时候做小分子量的蛋白用丽春红染膜就不太明显，这时不要认为失败了，继续做下去，同样会有结果；
6.NC膜不用泡甲醇，泡甲醇的NC膜会出现皱缩的现象；（自己误操作）
7.一抗37度过夜也能出条带，且有非特异性的条带出现；这个现象自己不清楚原因，此后都是按照标准的4度过夜。思考，如果说在37度的条件下抗体更容易结合，那么孵一抗的时间可以适当缩短。
8.用脱脂奶粉的封闭液一定要现用现配。
大家多多交流

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NC膜不泡甲醇吗？我不过甲醇做不出来，膜总像坏了似的

she[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

ECL发光：
1.涂发光剂后数十秒即有很强荧光出现，而且持续很长时间，这是最好的现象，有时压片一个小时仍能看到强而稳定的荧光；
2.荧光很强但很快淬灭，说明二抗浓度太大，很快将底物耗竭，需要稀释；另外可能与环境温度有关，温度高酶活性就高，荧光也容易淬灭；
3.荧光弱但是可以持续发光，可能与上样量、蛋白浓度、一抗二抗稀释倍数都有关系；4.不发光，延长压片时间试试，若显影后仍未见条带，则需要从头开始分析原因了。

发光剂最好分装，避光保存，可延长有效期，孵育应在暗室中进行，A\B液1：1混合，我们一般用移液枪均匀涂于膜上，正好将膜覆盖即可，迅速盖上保鲜膜。压片及显影时间根据荧光强度及第一张胶片的结果调整，压片时双手和片盒保持干净干燥可避免胶片的上龙飞凤舞

我们所用的胶片来自医院放射科，牌子不记得了，感觉这种胶片灵敏度较高，弱信号仍能压出清晰的条带，而且对信号的获取速度也较快，可减少压片时间。

xue258[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很羡慕楼上，弱信号仍能压出清晰的条带。我觉得我的条带荧光觉得已经比较强了，反而没有做出来，很是郁闷。
荧光淬灭的事情我很好奇。因为昨天做的好好的，突然拿镊子夹起来膜，把ECL液体用滤纸吸走的时候，突然发现条带看不见了。。。以前做没这样过哦。。不知道各位有没有遇到过类似的情况。
还有就是我买碧云天的东西，每瓶50ml，AB液，总共好像是285还是258。可能跟楼上的说的不完全一样。
谈谈我自己曝光的感觉。条带荧光强，压片的时间就相应缩短，我一般很强的就压30s，然后延长时间，条带很弱的话，就压片时间久点甚至压24个小时，呵呵，因为条件所限，没有暗室，只能每天晚上把PCR室占用了。。。

PPT[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-5-14 13:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

蛋白条带间总是有连接,不好看问题。谈谈自己的经验：
之前有做过一个蛋白，因为表达丰度比较低，所以上样量相应加大，最后就导致在目的蛋白条带能清楚显示的时候，内参条带间有连接，明显影响图片质量。
最后的解决办法：上样的时候不要连续上样，各间隔一个孔上样，最后图片就很漂亮了，个条带都是独立清晰明显。可以尝试一下。

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