小中大楼主:
您好,我现在准备做SDS-PAGE电泳,欲从小鼠脑中提取蛋白,(蛋白位于神经元胞质和树突中,15kD)我现在提取蛋白,在提取液(60mmol/l,tris-cl;25%甘油;2%SDS;14.4mmol/lB-疏基乙酸;0.1%溴酚兰)手动匀浆,然后14000rpm离心25min,取上清.
这样是否可行?
我看到别人的提取液(全细胞裂解液)是(1:Tris-HCL50mmoL/L(PH7.4) 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4:NP-40或Triton-x-100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6:PMSF 1 mmoL/L 7:Aprotinin1μg/ml 8: leupeptin 1μg/ml 9: pepstain 1μg/ml10:1mM PMSF11:1mMNaF)
请问这两种是否相差好大?
可否帮我提供后一种全细胞裂解液的具体配制方法?
还有一个问题:蛋白+loading buffer 煮沸后离心的转速和时间是多少?
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你好!提组织蛋白没做过,不敢乱说。
具体的配方就是首先你要确定配的体积,然后算出相应的摩尔数,再算出质量或体积就可以了。
我一般常用6000rpm,1min。