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肯定很多战友会问我，为什么不提高蛋白量呢？对啊，我也很想提高，可是这个蛋白就是细胞天然表达的蛋白，不是我转染的不是我能控制的，试着增加培养细胞量来改变，可依旧是很少量，和原核表达的量根本不能比呀~~一个天一个地。
一开始，磕磕畔畔地摸索了很长时间的条件，大分子量本身存在着电泳时间长转移时间长的问题。
我都是100V，180MIN，效果很不错，转移后的胶基本上染不出什么条带了。
然后封闭，一开始一直用的3%BSA，后来改用了10%小牛血清，缓冲系统也从TBS换成了PBS，也许这两者没有什么差异，或者某种程度上来说，BSA封闭会更好。但是也经常和大家交流，有战友就建议如果什么条件都换过还是不行不如试着改变一下封闭液，而在这之前我从来没想过封闭液会对抗体结合什么的会有影响，但也可以考虑试试。
有时候来得及就先封闭1~2个小时，然后一抗4度过夜，有时候来不及就封闭过夜。两者没有什么差别。
接着是二抗，DAB就用HRP标记的，BCIP/NBT就用AP标记的，买的博士得的，按说明书上比例稀释。
用什么缓冲系统就用什么来稀释抗体。
显色，很重要，自己觉得。一开始做的时候总有一不小心就背景很深，本来条带就弱吧就很容易被覆盖，就什么都看不清楚。可是微量蛋白显色有个讨厌的地方，就是要么就显过头，要么就时间不够显不出来，因为要靠肉眼来判断实在是很困难啊~~~~~
哎~~~~这么做啊做的，也已经半年了。有时候嘲笑自己，闭着眼睛都能把WB给做完，因为一直在做，太熟练太程序化了~~~~老板还总说我手法有问题，技术不过关，可我却能帮师姐表达的原核蛋白给做出来， 老板也给不出什么实质性的意见啊，他们会把实验想得太理想化，总觉得结果应该是条带清晰没有背景的，所以我那样的结果到老板那里都会被贬得一文不值。。。
很郁闷，蛋白也不是我生的，就那么点量你怎么做出超越它的条带呢？不知道有没有和我一样做如此之少的蛋白的战友？
也请各位战友多多指教~~
