蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨 论】WB半年感悟

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 20  2/2 ‹‹12
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨 论】WB半年感悟

shenkunjie[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76942
精华 0
积分 712
帖子 1124
信誉分 100
可用分 6420
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-11
状态 离线
11

发表于 2014-3-7 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
恕我来多几句嘴。nba是个懂行的人。我认为她（他）的意见很有价值。
关于封闭，我的意见是用5％的脱脂奶粉，RT，1～2h，效果很好。
顶部
fsdd817[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78590
精华 1
积分 590
帖子 795
信誉分 102
可用分 4841
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态 离线
12

发表于 2014-3-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是一个新手，想请教一下，在做WT时，用的抗体浓度1：200（商家推荐是1：200~1：1000），结果出来的蛋白的量的信号就很不明显，而膜本身的信号很强，我不知该采用什么样的补救措施，请教各位高手，谢谢
顶部
remonte[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114516
精华 1
积分 356
帖子 387
信誉分 102
可用分 2698
专家分 10
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
13

发表于 2014-3-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

背景高时, 应采取如下解决办法:
1. 加大抗体的稀释倍数;有时候你可能觉得已经很稀了,但你还是稀释的不够. 大胆稀释吧!!
2. 改变封闭液的配方;
3. 用封闭液抗体;
其中最有效的办法是1.
另外, 楼主应首先做的是ELISA 或DOT BLOT,尤其应做用电泳缓冲液处理的样品的DOT BLOT,以确定能否用你的单抗做WB. 原因有的战友已讲述一二,在此不再详述.
请一定循序渐进,方能成功.
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
14

发表于 2014-3-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我是一个新手，想请教一下，在做WT时，用的抗体浓度1：200（商家推荐是1：200~1：1000），结果出来的蛋白的量的信号就很不明显，而膜本身的信号很强，我不知该采用什么样的补救措施，请教各位高手，谢谢
我的意见是：
1、把一抗按照1：500或1：800来稀释
2、加大你的上样量，因为你连自己的目的条带都看不见，就算光线很强，我觉得很能看见一点的
3、增加洗膜的次数和时间
个人意见，仅供参考
顶部
bamboo16[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79663
精华 2
积分 572
帖子 696
信誉分 104
可用分 4391
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态 离线
15

发表于 2014-3-7 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对LZ我还有一个建议，可以用孔径比较大的超滤膜，先将蛋白浓缩数倍，然
后用ECL显影。如果你不太清楚自己的抗体是否可以，可以先用该细胞的其它蛋白已有的抗体做做，如果可以的话，再检测你要检测的抗体。这样应该更可说明是什么问题。
顶部
fsdd817[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 78590
精华 1
积分 590
帖子 795
信誉分 102
可用分 4841
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-30
状态 离线
16

发表于 2014-3-7 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢，我又洗了5次，每次5分钟，但是效果还是不明显，目的条带还是不明显，只能隐隐的看到一点，再重新做一个加大稀释量吧，希望这次能行啊，谢谢
顶部
hustwb[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76894
精华 0
积分 463
帖子 524
信誉分 101
可用分 3523
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态 离线
17

发表于 2014-3-7 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

先富集目的蛋白。如果没有条件做IP。那么其它富集的方法很多，比如离子交换层析，疏水层析，超滤，盐析等都行。
楼主说目的蛋白活性很好，那么肯定有测活性的方法。争取把蛋白溶液的比活性提高100倍再做WB，我就不信它不出来
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
18

发表于 2014-3-7 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我前面定的santa cruz 的抗体 说明书上有说4°保存 但是有个老师把我的冻到了-30 不知道还能不能做出来
顶部
NBA[使用道具]
五级
Rank: 5Rank: 5


UID 75229
精华 6
积分 2497
帖子 4006
信誉分 114
可用分 20946
专家分 70
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态 离线
19

发表于 2014-3-7 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问题从来没有那么绝对的，抗体忌讳的是反复冻融，而不是一两次的冻融；冻融无非是剪切力对蛋白的破坏。通常不会冻一两次就会导致完全失效，但是原始抗体通常冻融一两次效价会损失很大。所以应该还是能用的，只是效价可能会下降一些，反正抗体的最适稀释比对不同的人的操作还是有不同的，要摸索。如果标记不出来，无操作问题外，就是抗体本身不行，scbt很bt
此外，抗体的保存问题，其实以前我也回答过。
两种方案：
1. 分装。每次一管，但是可能太多占地方，而且还会有粘壁的损失，不是很推荐。
2. 1：1加甘油，冻于-20度，可长期保存，此方法实际上也被很多国内的试剂公司广泛采用，诸如博士得，中杉，它们小包装的进口抗体通常都是1：1添加甘油保存于-20（不信去查查）。值得注意的是：不是所有的抗体都可以1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，如果说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常可以采用。
顶部
DDD[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73222
精华 1
积分 587
帖子 790
信誉分 102
可用分 4768
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
20

发表于 2014-3-7 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最近忙得做实验，做啊做，都没空来看自己的帖子。
感谢各位战友的“七嘴八舌”！学习到很多东西
觉得NBA肯定是个经验丰富的老师吧~说话很专业很细节。恩，我想过自己做的一抗的无效，不过做DOT-BLOT的时候，还是可以做出结果来的。不过抗原用的是免疫的多肽，而不是细胞天然表达的蛋白。
后来又做了一次，还是膜很亮，曝光出来的片子是黑的~~~天啊~~~我要疯了！
但是我做的时候是有对照的，这个对照的抗体已经证明是可以和蛋白结合的，可最后也是一片黑~所以我想目前还不能说到底是不是抗体的无效问题，因为似乎是实验本身就没有作好的原因。如果曝光出来，对照有条带，而样品抗体无条带才能说明抗体本身的问题吧。
我决定还是加大洗涤的力度，多洗洗~~~
顶部
 20  2/2 ‹‹12