小中大一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围,所以你的梯度范围尽可能设置宽一点,争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
具体从多少度到多少度,要看你这对引物的Tm值,如果两个引物Tm值不高,可以设置48-60的梯度;否则可以设置58-70度的梯度;如果两个引物的Tm中等,则可以设置53-65的梯度范围,具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的,需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的,尤其是第2、3孔与第1孔接近,第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品,孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
ABI公司新推出的Veriti梯度PCR仪有6个独立控制的block,类似6台PCR仪,每个block上的退火温度可以独立设置,因此梯度设置更可控一些,范围还可以宽一点。