细胞世界

原代心肌细胞培养每个人的操作差异性还是比较大的，这可能和平时的行为和习惯关联非常大，同样的材料和protocol情况下，两个人同时做出的结果会具有极明显的差异，这也是很正常的。
我也不是什么前辈，正好看到你的帖子，我就说一下我觉得可能的有问题的地方在哪儿，但希望你自己多想想和思考，我说的说不定也有可能会误导你，这也是很正常的事。
1. 你的protocol 估计是没什么大问题的，但是在各种溶液配制正确的前提下；水浴消化时不知还摇晃么，可否改为培养箱消化试试，因为水浴有可能会使酶的活力较高，容易使细胞消化过度，我也做过水浴消化，发现消化速度会快很多，或者缩短消化时间试试看。
2. 我不知道你的整个消化时间，但消化整个过程时间不要太长，不要超过3hr，尤其在收集消化上清的时候，消化过程也不要吹打，直接吸上清，加入酶液后，轻轻摇动多次，再进行消化，在酶液中吹打，细胞很容易死亡；后来的吹打最好在液面下吹打，且要轻柔，不要产生气泡，气泡的破裂对细胞的损伤也是很大的。
3. 心脏组织的量与加入酶液量的比例大约为1：5差不多，中和时1：1中和，中和后放入4度或者冰浴，以降低酶的活性，减少细胞损伤。
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不知道5Br的浓度是不是有问题，我的是0.0015%，细胞贴壁了，但不见波动，数目也很少，一天后就基本死光光了。

我用的0.06%的胰酶，一边水浴37度一边低速磁力搅拌（机器不好不知道转速），每次8分钟的消化都有很多鼻涕状的东西。。吹散后离心也有絮状物，结果细胞数量很少。都3天了，还是没多少细胞，不过都是清亮的，所以还想养看看。细胞周围会有大片大片的透明的膜状物，那是什么啊？？

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我认为这种是消化过度。大部分人认为那是细胞碎裂后释放出来的DNA。如果是大片大片的，消化应该是出问题了。

请问楼主：
Digest solution: 0.07% Trypsin with 0.05% Collagenase TypeⅡin HBSS.
这个是什么意思？是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？不知道我理解对否？
另外，请问你消化时候分别用胰酶和胶原酶，第一次消化松散组织时，也就是第一次弃掉上清液时候，用的是什么酶呢？正式消化时候，也是分别用着两个酶吗？分别的顺序是什么呢？
烦劳能不能详细介绍一下酶消化那一段的过程。非常感谢啦！！
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各位，非常抱歉，最近比较忙，回复比较晚，谅解，谢谢！
“是分别用两种酶，0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II，都是用Hanks液配的吗？”是的，是现配现用，直接粉末配制，分别在称好所需的质量，同时溶于HBSS中，微孔过滤待用。
整个消化过程用的都是都是这个消化液，即0.07%的胰蛋白酶和0.05%胶原酶II溶于HBSS中配制而成。
实验前，称量所需的胰蛋白酶和胶原酶II，分别称量好后，放在一起，溶于HBSS中，用注射器接上0.22um的微孔过滤器，过滤消化液，放入超净台中备用；在组织剪碎后，加入大约5倍体积的消化液，每次消化的上清都弃掉（即所得的细胞都不要），重新加入新鲜消化液，消化约10-12次，完成后，剩余组织在10%FBS培养基中吹打多次，收集上清，离心获取细胞，此时的细胞差速贴壁，计数并接种。

回答了几个问题后，我自己也提出一个问题，希望楼主及同道解答。
我做的是小鼠乳鼠的心肌细胞，品系是C57。经过几次，昨晚我的细胞大部分都能跳，得率还算勉强过得去，但有一个问题始终困扰。
我的细胞起初种下去的时候是一粒一粒的，差速结束后也是一粒一粒的，但第二天一早去看，就会呈现抱团，聚堆，堆与堆之间散在一些细胞，贴壁不紧，由于细胞聚堆，看不到贴在器皿上的细胞是否展开（也就是说，不知道是贴在器皿上的那个细胞驮着上面的细胞团在跳动，还是整个细胞团在跳动），聚堆的细胞能跳。也能看到个别摊开了能跳的。
同学看了，说是我消化不足（我用胶原酶消，消化到最后基本看不见东西），原因是我的细胞边缘不是十分光滑，他说那是纤维条索（图片照不清，所以这里没附图）。
请问，依你分析，我的细胞抱团的可能问题有哪些：如果我的同学说的是正确的，那么就是细胞种下去之后，细胞之间相互碰撞，纤维条索把细胞与细胞粘在一起，使得上层的细胞无法贴在瓶皿上？这样的话，跳动的应该就是紧贴着瓶皿的细胞驮着上面粘着的细胞在跳？
我应该如何解决这个问题呢？延长消化时间？
谢谢楼主了，这个贴子给你添了不少麻烦，望谅！
(细胞团块)
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您说的这种情况，我也遇到过，但很抱歉，无法给你比较合理的解释。
一种现象，被后的原因可能会有多种，因此可能需要具体情况具体分析，你用的C57小鼠，我没做过，有可能会和SD乳鼠心肌细胞存在差异，所以不能生搬硬套的给你一些解释，很可能我说的就是错的。
但我想提一下，细胞聚团是不是一个不好的现象，还是这本身就是心肌细胞一种的正常现象？这样聚团现象是不是对你的实验有很大的不良影响，这个问题是不是一定需要解决的？谢谢这位战友的支持！

不知道5Br的浓度是不是有问题，我的是0.0015%，细胞贴壁了，但不见波动，数目也很少，一天后就基本死光光了。

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我个人觉得是5-Brdu的问题可能性较小，你若怀疑，就一半不用，一半使用，相互比较看看，结果如何。