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标题:新手请教，条带弥散

DNA[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

新手请教，条带弥散

新手请教，条带弥散 [转载]


做18s RNA基因序列，DNA提取后电泳条带清楚。
94度 denaturation 5min
anealing 55度 30s
extension 72度 3min

30个循环
94度 denaturation 30s
55度 anealing 30s
72度 extension 3min

extension 72度 10min
pcr后
琼胶糖电泳条带弥散，亮度基本是均匀的。
引物是特异性的，应该没问题。片断大小2Kb左右。  
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=菓子=[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的“电泳条带弥散”不知到什么程度？如果没有其他非目的条带的话，是不是与你没有跑好电泳？如果没有其他带的话，条带的特异性与你的条件优化程度、Mg2+浓度、Taq酶的质量和数量等因素有关！
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绿茶公子[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
应该说根本没有条带，整个都是亮的。
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发表于 2011-9-19 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那就是可能你的胶的原因，有时间我也会碰到这个问题。不过你可以试一下把你的退火温度升高2度，因为升高退火温度可以提高产物的特异性，你不妨试一下。
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雪花子[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那就是可能你的胶的原因，有时间我也会碰到这个问题。不过你可以试一下把你的退火温度升高2度，因为升高退火温度可以提高产物的特异性，你不妨试一下。
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
像你所说是优化PCR条件的一种途径之一。我还要问的就是你的目的带是否在你的弥散带之中，如果这样的话，我就要恭喜你，你离成功不远了，那就从退火温度，Mg2+浓度等方面去优化，定能得到你的特异性很强的目的条带。或者你可以用第一次的PCR产物为模板再P。GOOD LUCK TO YOU！
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发表于 2011-9-19 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
模板的量多少与pcr结果有关吗？
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喵咪[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可降低模板量，模板太多或酶太多产物会有弥散。
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
二扩如果模板的量大，就会出现这情况，一扩出现这情况可能是模板量大，可以降低循环数。因为模板量大扩增消耗光了引物后，其余的循环过程94度反复会造成产物随即降解产生弥散
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阿拉蕾[使用道具]
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发表于 2011-9-19 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
fdzhang2003和molrep说得很对,所以要保证模板和酶量的适量,不过你的循环数还是不多,你可以减少模板的量.还有不知你的模板是不是基因组,如果很大的话,最好在PCR时采用热启动.也可以将模板在PCR之前在沸水中加热5-10MIN,然后马上放在冰上,再去P.  
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