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标题:求助:提取临床血常规标本的DNA

caihong[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

求助:提取临床血常规标本的DNA

求助:提取临床血常规标本的DNA


我希望能够得到纯度较好的DNA模板,是从不同病人的血常规标本中提取,当然是EDTA抗凝的,谁能告诉我一个简便的方法或效果较好的试剂盒.还有个问题是因为我这里的紫外分光光度仪(BIO-RAD)老是测的波动很大,但荧光定量都会有结果,当然结果有时候符合我的要求,有时候却相反,我想请教大家,纯度对PCR的影响主要有哪些
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冰激凌小姐[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
QIAGEN公司有从全血里提取基因组DNA的kit,我用过，效果可以，用kit提取的DNA ratio值一般都较好，对PCR都不会有影响。紫外分光光度仪是实验室最常用的仪器之一，如果认为有问题，应该叫公司的技术人员来校准（calibration)一下，定期对仪器进行校准是仪器维护的重要环节之一。  
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caihong[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我原先用过生工还有TAKARA的,但效果不是很理想,我所做的是荧光定量PCR,如果核算不纯会不会影响它的CT值或扩增效率,QIAGEN的我会订来试试,谢谢你的建议
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椰子叶子[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
抽提外周血WBC中DNA的KIT很多,GUGU推荐使用QIAGEN的BLOOD MINI 或MIDI DNA EXTRACTION KIT,看你所用的血量,方法非常简单,需时2小时不到,对于EDTA抗凝血,你可以离心分离血浆用于生化分析,细胞只要用PBS补到相应体积抽提,质量和纯度较高,建议使用,每抽提一个费用大概60-80元RMB.
DNA中离子,有机溶剂等会影响PCR扩增效率.对于紫外分光光度计,使用时要注意紫外灯在检测前需预热20分钟以达到稳定检测,而且需要定期检查,如果紫外灯超过使用寿命则需及时更换.而对于测定的容器及管道需要清洗.
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caihong[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哦你建议的KIT太昂贵了,我们要做2000例临床标本,60--80RMB那还得了.我就是想找一个能够针对很多标本的小量血的大规模提取,离子和有机溶剂的影响会在紫外分光光度计中显示出来,会对扩增有影响反应在它的纯度上,所以我希望可以有一个相对稳定的有效的提取方法.谢谢你的建议
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发表于 2011-9-20 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那么多标本的话费用确实昂贵,所以建议你还是用普通的酚氯仿法抽提,所有可用的PROTOCOL很多,但是基本步骤类似,包括:,裂解细胞和细胞核,蛋白酶K消化蛋白质释放核酸,然后用酚抽提,去除蛋白,上清液在用氯仿-酚,氯仿依次抽提去除酚,再用无水乙醇沉淀DNA,然后用70%乙醇洗涤,最后空干溶解,测定纯度和浓度.一般抽提所的DNA质量比较好,做PCR基本没有问题,而且在最后的过程中你还可以亲眼看到沉淀的所谓呈云絮状的DNA.只要在酚氯仿抽提时不要尽量不要带入有机相溶液,一般没问题.TRY IT.我也用该法做过好几百个.  
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发表于 2011-9-20 13:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
经典方法我试过,操作步骤也基本如你所描述的.纯度不成问题,但浓度却大到白细胞(1个白细胞相当于6PGDNA)完全不可能产生那么多DNA,你能将你的PROTOCOL发给我吗?非常感谢
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HOT兔[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
老兄，不要再用分光光度计了，太不准。老兄可以翻一翻《分子克隆〉第三版，已经明确地指出了这个问题，不提倡了。
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caihong[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不用的话心里怎么有底啊,现在就是在排除纯度差导致我结果的CT值不稳定的原因了
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韩梅梅[使用道具]
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发表于 2011-9-20 13:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
给你个建议，打电话给0531-8382043，找一个姓陈的老师，他们那里有你所要的外周血DNA提取KIT，效果和QIAGEN的差不多，但价钱只有几百块钱100人份  
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