[讨论帖]谈谈你是怎样消化细胞的

最新回复

• TAT (2012-3-21 15:33:28)

  
  我用的是第二种消化方法，就像你说的，这样好把握时间，在镜下观察细胞快要变圆时，吸掉胰酶，我用的细胞是平滑肌细胞，比较好消化，只要吹打的时间长一点，吹到位，再在镜下观察，基本上都下来了！

• vera+ (2012-3-21 15:33:48)

  我是第一种方法，一般每隔一个时间镜下观察，待看到细胞变圆间隙变宽，就可以终止消化离心。。。

• 8princess8 (2012-3-21 15:34:06)

  加胰酶后只让胰酶润湿细胞后立刻将多余胰酶倒掉，让剩余在瓶中的胰酶继续消化；我用的是这种方法，个人觉得这样可以避免胰酶过多消化过度，也会拍拍培养瓶，结合着用的。

• 04906 (2012-3-21 15:34:30)

  看实验目的，。如果是传代，我一般是选用第二种，如果不是，是种板实验的话我是用第一种方法，顺便胰酶中加EDTA。并且消化我一般不在镜下看的。因为这个度很难把握，我一开始实验，先把一种细胞的习性搞清楚，选择不同的消化时间用血清中和，看消化的效果及第二天贴壁后生长情况来选择一个时间。然后一直沿用这个时间，这样效果挺好。在等待的时间中，液体来回晃动，确保细胞都被消化到。每种细胞的贴壁程度不一样，不能消化过头，也不能消化下来的细胞过少，满足不了实验。所以正式实验之前一定要摸好这种细胞的脾气。

• caihong (2012-3-21 15:34:52)

  
  支持楼上的方法，我也是使用此法，相对对细胞损害小，也不怕消化时间长，如果想加速，还可以置于培养箱内。

• ha111 (2012-3-21 15:35:13)

  
  个人经验要看实验目的，细胞种类，如果细胞是很难养的那种，建议用第二种，稍有改变就是，加胰酶后，旋转培养皿或培养瓶，然后立即吸出多余液体，置培养箱约五分钟，轻轻敲打皿，镜鉴，中和，离心，再镜鉴，如果还有贴壁细胞建议重复上述操作，将两次离心所获得的细胞分别在两皿内培养。

• ladyhuahua (2012-3-21 15:35:35)

  我用的是第二种方法，因为不需要离心，相对简单一些。记得刚开始学的时候真的还不好把握这个细胞消化的程度，毕竟还是需要经验的。我就看了一些相关的文献，找到了消化的时间范围，先从时间上去控制，摸出该细胞的消化时间，后来熟练了就直接在镜下看消化的程度了。我个人觉得新手在学的时候先从时间上控制要好一些，毕竟时间是客观的，死的，而消化的程度是主观的，每个人把握的度都不太一样。还有就是开始时可以实验一下，就是拿一两瓶细胞消化时间长一些，试一下自己的细胞到底消化多久还能很好的生长，这样可以给自己一个底线，从而更好的把握消化的程度，另外细胞也能很好的吹打下来，因为个人觉得吹打细胞还是一件比较费力费时的事哈。

• shenkunjie (2012-3-21 15:35:54)

  
  其实消化离心是比较保险的办法，一般情况下，细胞并不容易消化过度

• rxcc33 (2012-3-21 15:36:12)

  
  1.加胰酶量比较少；
  2.一般等细胞完全消化或接近完全消化时候，加等体积培养基，后吹打打散细胞，然后弃去一部分；
  3.再加入培养基；
  
  一直都这么做的，也没有发现什么问题

• utt0989 (2012-3-21 15:36:32)

  不同的细胞有各自不同的特点，即使是相同的细胞由不同的人、不同的环境去养也会不一样，关键是自己摸索一下适合你自己的方法，当然消化的结果是最重要的，也就是消化得干净，消化后细胞状态要好。
  其实必要的时候可以两次消化，也就是第1次消化见有细胞变圆，即中止，稍吹打，收集上清，如果还有细胞贴壁较牢，可以PBS洗后再消化1次，应该就会比较干净，这样即可避免一些细胞消化过度，也可消化得较完全。
  还是自己去摸索一下比较好！

• redbutterfly (2012-3-21 15:36:59)

  
  一种细胞消化的时间真的是一定的吗？三个月前，我们养的细胞放在培养箱中消化需要3分钟，可是之后同样的细胞在培养箱外只要2分钟，而昨天消化时居然用了4分钟。撇开胰酶的浓度、胰酶配制的时间以及消化时的温度不说，我觉得消化时间不仅跟细胞种类有关，而且还跟细胞数量有关。所以我们消化细胞先计时2分钟，然后看瓶底是否发白和出现细针孔样空隙，有就终止，没有就继续消化。

• ending (2012-3-21 15:37:58)

  
  不知道有没有养过MDCK细胞的， 能谈谈您对这个细胞的消化经验吗？

• viviwang1987 (2012-3-21 15:38:16)

  
  MDCK细胞不好消化，可以用浓度高些的胰酶来消化，一般我都是用0.25％胰酶泡2－3分钟，倒去胰酶，再用残液作用个7－8分钟的

• 中国特色 (2012-3-21 15:38:37)

  
  我养的A549不知道怎么了，一般消化七八分钟吧，往往是加两次胰酶。晕吧？

• 131415 (2012-3-21 15:38:58)

  
  消化不仅要看细胞的状态，胰酶的酸碱度也很重要。或许在讨论怎样更好的消化细胞前也要对胰酶的酸碱性进行讨论。
  我们实验室里不同组的胰酶消化能力不同，偏碱更容易消化下来，但太碱对细胞的损伤也变大。所以在配置胰酶的时候要精确测定PH值。
  我们的做法：
  先用少许胰酶讲培养瓶底层涮洗一遍，弃之，再重新加胰酶，只留一薄层，以覆盖细胞，当然，若细胞比较密可以稍微多加点胰酶，放培养箱37°片刻，镜下观察大部分细胞变圆，折光性增强，轻敲几下，加新鲜培养基终止。据说敲比吹打对细胞的损伤更小一些。

• cocacola (2012-3-21 15:39:18)

  
  我这两种方法都用过，是各有利弊的。有一次，一种巨噬细胞我消化了三次，才弄下来。真够麻烦的！跟细胞的品系有很大关系，还有细胞生长状态，细胞数量，加胰酶前有没有用PBS洗涤，这些都有关系的。我一般还是用第一种方法，只要肉眼看见细胞开始像流沙样流下时，就立即终止消化，剩下的用电动移液枪就能吹打下来的！

• qumm1985 (2012-3-21 15:39:35)

  
  我用的类似第二种，也是加胰酶，在显微镜下观察，待消化得变圆时，我不弃胰酶，直接往里面加血清，然后吹打，这样细胞丢失得比较少，消化得比较完全。美国那头基本都是这么消化。只不过这种消化要求血清质量得比较好！！血清是可以中和胰酶的！1

• rxcc33 (2012-3-21 15:39:53)

  为啥不能两种方法综合那？
  
  一种就是需要离心的，即弃培养基，PBS洗，加胰酶消化，待细胞呈流沙状往下流
  
  （等镜下看变圆的时候就加培养液啊 不要等到流沙河了）
  
  的时候加新鲜培养基终止消化，吹打下细胞，离心收集细胞，重悬之后分瓶培养。
  另外一种就是不需要离心的，具体做法就是胰酶消化的过程中镜检，待细胞变圆，细胞间隙变大的时候，弃胰酶，加少许新鲜培养基，吹打下细胞，分瓶培养。
  其实两种方法各有利弊，这里谈谈两者的缺点：

• HP007 (2012-3-21 15:40:18)

  
  我最近在养MDCK细胞
  用的是TPCK-Trypsin（这是一个外国专家反复要求的！！！）
  方法和一般传细胞没什么区别。胰酶先洗一遍，在加胰酶放在37度孵箱。
  抚育时间约10min，如果细胞太密考虑延长时间。
  
  在倒置显微镜下观察细胞立体形态，可以判断是否消化完全。

• 8s5g (2012-3-21 15:40:47)

  
  个人习惯，pbs清洗，加胰蛋白酶（不含EDTA），反复摇匀，使细胞与胰蛋白酶充分接触。肉眼观，有细胞开始脱落（瓶底出现间隙）时用力拍打，至完全脱壁时，直接加含血清的培养基终止并分瓶培养。