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[求助]请教关于流式细胞检测胞内蛋白的问题
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最近做流式，因为染胞内蛋白，但是每次固定，穿孔之后，感觉细胞就变的黏黏的，而且离心洗涤了几次之后，感觉细胞都快没有了，检测的时候觉得细胞液特别少，而且碎片比较多，怎么回事啊？
我的步骤是这样的：首先胰酶消化细胞之后，终止消化，离心，PBS洗涤，离心收集细胞，这都没问题，然后加百分之3的多聚甲醛固定细胞室温30分钟之后，离心，去上清，加Triton-100穿透5分钟（这个时间是我们做免疫荧光的时候老师告诉我们的2-5minutes no more than 5 minutes）.接下来离心，染一抗，二抗，就觉得细胞好少啊，而且都好像跟刚开始消化下来离心的细胞不一样。黏黏的，特别少，怎么回事呢？请求高手指点
万分感激！！
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最新回复
rxcc33 (2012-3-23 15:21:13)
应该是你固定穿孔方法不合适造成的。
固定用4%的多聚甲醛。
穿孔不要用Triton-100，用皂苷或者其他流式细胞术适合的打孔剂。
fei1226com (2012-3-23 15:21:40)
固定之后觉得细胞好像变少，离心后看不见pellet是很正常的（我2*10^6个细胞固定破膜厚后都看不见pellet的）
还有碎片比较多都是很正常的，细胞的FSC SSC都会改变，需要重新做调整。
@STAR@ (2012-3-23 15:22:15)
kewanqi2011 (2012-3-23 15:22:39)
细胞固定打孔后细胞碎片变多怎么会正常呢！
细胞固定后其物理性质会发生变化，在FSC-SSC中的位置的确会发生改变，但是也只是细胞的物理性质发生变化，并不会导致细胞碎片增多，细胞碎片增多，只能说明你固定打孔不当。
@STAR@ (2012-3-23 15:23:12)
fklo83 (2012-3-23 15:23:51)
细胞固定后其物理性质会发生变化，在FSC-SSC中的位置的确会发生改变，但是也只是细胞的物理性质发生变化，并不会导致细胞碎片增多，细胞碎片增多，只能说明你固定打孔不当。
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我今天问了实验室其他几个做细胞内染色的同事，他们都说固定穿孔后他们的细胞碎片增多。我们用的试剂盒都一样，步骤都按照eBioscience的protocol，温度，时间，转速都一样。我们讨论了一下，也认为固定穿孔理论上不会令碎片变多，但却解释不了见到的现象。
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