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[讨论帖]细胞贴壁最快能是多久？
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我养的是A549细胞，昨天传代过程中，加了胰酶2mL（失手加多了），消化够了以后，加入培养基终止消化，然后按照以前的做法，没有离心去除胰酶，就直接传代到新的培养瓶里了。
今天去看细胞，昨天传代的两瓶细胞都贴得很少，而且细胞形态也不是正常的A549所呈现的梭形，而是更靠近圆形。
跟实验室的同学讨论了很久，分析可能是因为胰酶加得多，且没有倒出胰酶，导致的贴壁不良。而且吹打得也不够，镜下能看到细胞聚呈一团团的。
所以，我把两瓶细胞做了不同处理，想等明天看看会不会有不同的结果。
一瓶观察，不处理。
另一瓶拿出来，直接把里面的培养基抽出来离心，弃上清，重新加入培养基，混匀，然后重新加到之前的培养瓶里了。操作完之后，我立即拿到镜下观察，看到之前的聚集成团的细胞很少了，被我吹打开了。但是一个新的疑问产生：就在我观察了1分钟以后，漂浮的细胞渐渐不动了，轻摇培养瓶，大多数的细胞都不动了，感觉已经贴壁了。
两个疑问：
1、细胞贴壁最快是多久？文献里看到的最快的贴壁是在传代2个小时以后，可是我在镜下1分钟就看见细胞不动了，这是为什么？
2、传代过程中，消化用的胰酶到底要不要离心然后弃之？每个人的做法都不同。我的感受，每次传代以后不离心去掉胰酶的话，细胞状态好像都不怎么好。可是离心又再次损伤细胞……
请大家讨论下这两个小问题。谢谢
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最新回复
one (2012-3-23 16:32:44)
消化完成后，直接吸掉胰酶，然后加入培养基将细胞吹打下来即可。
BUK (2012-3-23 16:33:32)
one (2012-3-23 16:33:51)
不贴壁可能和细胞种类/培养基等原因有关，我们养的细胞传代都没有离心过
fei1226com (2012-3-23 16:34:13)
1. 消掉培养液
2. 2-3ml 胰酶消化
3. 加10ml PBS-BSA并吹打
4. 丢弃一半，其余的离心（400-500g）
5. 去上清，3ml培养液重悬
6. 放回培养瓶，加培养液至15ml
技师说他前任告诉他的，也没找什么根据等，但他做了快10年都是这样操作，效果十分好。
大家一起来讨论吧
园丁## (2012-3-23 16:34:39)
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胰酶都吸掉了，哪来的还有胰酶。
BUK (2012-3-23 16:35:12)
今天去看了细胞，离心的那一瓶果然贴壁了。
fei1226com (2012-3-23 16:36:19)
啊，不吸掉胰酶？
我好像没见过把胰酶留在培养瓶里的啊
BUK (2012-3-23 16:37:09)
园丁## (2012-3-23 16:38:24)
今天去看了细胞，离心的那一瓶果然贴壁了。
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不是告诉你了，消化完成后吸掉胰酶，然后加入培养基吹打细胞。
我们的回复你都不看，你问什么问题呀！
hot_hot_hot (2012-3-23 16:38:43)
我养的脐静脉内皮细胞HUVEC,之前也是消化后没有倒掉胰酶，就直接加培养基吹打，感觉有部分传下来的细胞形态改变，不是原来的梭形而是成了圆形。跟周围的人讨论也考虑胰酶消化过度，还有人说是不是细胞长老了皱缩了···而且我用的索莱宝的胰酶每次加1ml左右，消化30-60S，不知道是不是加多或者时间太长了
hot_hot_hot (2012-3-23 16:39:26)
今天在板里看到前辈们的发言，我打算用胰酶润洗一下就吸出，然后在37℃孵育30-60S，然后加培基吹打，打算这样尝试一下。如果消化不够的话，再按照消化吸取胰酶，加培基吹打这样来做。
另外再问个已经讨论过很多的问题：我提取DNA、RNA或者蛋白做后续实验室，贴壁细胞到底要不要用胰酶消化？还是用细胞刮刀呢？
BUK (2012-3-23 16:39:57)
我们的回复你都不看，你问什么问题呀！
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我见过有人不倒胰酶，直接加培养基，也不离心，细胞照样贴。
吸出胰酶、不吸出胰酶，两个办法我都试了，想试试我师兄告诉我的两个办法哪个更好而已。
息怒。
BUK (2012-3-23 16:40:33)
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变成圆形、细胞间隙增宽，这个时候就可以倒掉胰酶，加培养基吹打。这是我另外一个师姐告诉我的方法。不同人用不同方法。这次我的经验教训是，可能是胰酶加多了。所以对于太强的胰酶，胰酶一定要弄出来。
fei1226com (2012-3-23 16:40:55)
我们技师传代的操作其实蛮粗暴的，加胰酶后放培养箱五分钟（当然这个时间不同细胞有区别），有时消化的不太好的话就直接用手拍打培养瓶。但每次传代都长的好好的。建议楼主试试
lagua123 (2012-3-23 16:41:15)
上午在板块里面看到一个前辈的帖子，说消化可以只用胰酶润洗后倒掉，再放到37℃孵育就可以了，残留在细胞表面的胰酶会继续消化作用。我今天下午处理细胞的时候用了这个方法，25cm2的培养瓶加1ml的胰酶，润洗约20s后倒掉胰酶再放在培养箱里1分钟，镜下观察细胞间隙不是很明显；又怕消化时间太久只有再加胰酶轻轻摇动瓶身后弃胰酶用培基终止消化···还好细胞最终能吹打下来。
之前因为觉得倒掉胰酶就浪费了部分细胞，直接加胰酶在培养箱孵育1分钟然后胰酶也没倒掉就加培养基，还好细胞也长得很快经常一天半旧长满瓶底了···现在两种比较下来我觉得还是用我原来的方法，只是胰酶还是要倒掉，细胞也要舍掉一部分···
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