[求助]问一个细胞复苏后培养的问题

最新回复

• 8s5g (2012-4-05 15:30:44)

  我感觉方法二更好
  
  因为细胞密一点生长状态会更好

• 园丁## (2012-4-05 15:31:12)

  复苏后两种培养：
  
  方法一：复苏时将细胞直接进行稀释到5盘，每隔2天换液一次，至第六天细胞长满，共5盘。
  
  方法二：复苏时接种到1盘，细胞将很快长满，然后传代到5盘。最后的结果是同样到第六天的时候细胞长满共5盘。
  
  请问这两种方法有啥不同？如果有不同，为啥呢？
  
  谢谢！
  
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  这两种法是不同的。因为细胞冻存后，各项生理指标都受到了不同程度的影响。所以一般都是在传三代后达到稳定状态，实验结果才更稳定。因此您的第二种方法更好一些，而第一种方法，细胞还是第一代。
  
  能为版主提供一点我们的方法，非常荣幸。希望对您有所启示。

• 西子 (2012-4-05 15:32:39)

  谢谢2位！
  
  三代之内达到稳定状态？有没有经典的参考文献推荐我学习一下？书籍也可以。

• 园丁## (2012-4-05 15:33:09)

  sorry，我也是听老师教的。自己没有找过这个资料。

• dongdongqiang (2012-4-05 15:33:45)

  
  这个国内有一本权威的细胞培养的书，超星上面有，可以下来看看

• 西子 (2012-4-05 15:34:05)

  我的看法：两种方法都是细胞在不断分裂增殖，但是方法二要经过胰酶消化或者刮，而方法一不需要这些操作，没有disturbe。所以我认为方法一更好。
  
  不知道我错在哪里？

• plaa (2012-4-05 15:34:30)

  
  呵呵 方法二好的
  细胞冻存时DMSO的浓度比一般做溶剂时的浓度要大，对细胞是有毒性的，影响了细胞的各项生理指标。而且冻存复苏后的细胞直接用，状态是不稳定的。
  推荐比较经典的《细胞培养》，司徒镇强著。

• plaa (2012-4-05 15:35:03)

  
  我们实验室的方法是 细胞复苏后，至少要传代一次才能用于实验。

• 西子 (2012-4-05 15:35:32)

  呵呵 方法二好的
  细胞冻存时DMSO的浓度比一般做溶剂时的浓度要大，对细胞是有毒性的，影响了细胞的各项生理指标。而且冻存复苏后的细胞直接用，状态是不稳定的。
  推荐比较经典的《细胞培养》，司徒镇强著。
  
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  不管是哪种方法我在复苏第二天都换液去除DMSO的。

• 西子 (2012-4-05 15:35:57)

  我们实验室的方法是 细胞复苏后，至少要传代一次才能用于实验。
  
  我想知道的是为什么要传代之后细胞状态才能稳定？一直放着长5天细胞状态就不稳定吗？
  
  我想知道为什么。。。呵呵
  
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  二者之间有啥不同。

• is2011 (2012-4-05 15:36:18)

  
  我也有同样的疑惑，想求高人指点。我的细胞是原代冻存的，复苏后算是一代，但这种细胞最多只能传到第三代，所以实验用最好是第一代。现在我复苏种在一个瓶子里发现损失了不少细胞，除过贴壁的外很多细胞都没有贴，是不是在一个瓶子内密度过大影响贴壁呢？下次复苏时分开种植是不是好点？

• plaa (2012-4-05 15:36:56)

  冻存的细胞并非100%都能复苏成功，失败可能与以下因素有关：
  
  1、冻存时细胞数量较少或细胞生长状态不良
  2、细胞受细菌或支原体污染
  3、液氮罐保管不善，没有及时补充液氮。（我们有时候放在-80℃冰箱，但是夏季用电量太大，会时常停电，警惕之！）
  4、复苏时培养条件改变，如换用另一批号小牛血清或者不同种培养液
  5、复苏方法不得当

• tianmei001 (2012-4-05 15:37:15)

  我也认为第二种方法好，理由是这样，细胞在培养基内生长，有一个对培养基同化的过程，在一定程度上能促进细胞生长，细胞越多，同化过程越强，细胞整体的状态就越好。细胞太少，得对培养基的同化作用就慢，细胞的状态相对就差些。

• 西子 (2012-4-05 15:37:44)

  我也认为第二种方法好，理由是这样，细胞在培养基内生长，有一个对培养基同化的过程，在一定程度上能促进细胞生长，细胞越多，同化过程越强，细胞整体的状态就越好。细胞太少，得对培养基的同化作用就慢，细胞的状态相对就差些。
  
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  那么时间长是不是可以达到同样的同化程度呢？

• kulee (2012-4-05 15:38:08)

  我也认为第二种方法好，理由是这样，细胞在培养基内生长，有一个对培养基同化的过程，在一定程度上能促进细胞生长，细胞越多，同化过程越强，细胞整体的状态就越好。细胞太少，得对培养基的同化作用就慢，细胞的状态相对就差些。
  
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  同化?是指细胞对培养基的适应吗?

• 969 (2012-4-05 15:38:35)

  同化?是指细胞对培养基的适应吗?
  
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  我看到的同化是指细胞会分泌一些不明的物质释放到培养基内，对细胞生长有促进作用，但同时也释放一些代谢物，这些代谢物太多最终就会改变培养基pH值

• 969 (2012-4-05 15:38:51)

  那么时间长是不是可以达到同样的同化程度呢？
  
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  我不这样认为，如果你在100mm dish中接种很少很少的细胞，长时间培养，细胞不但不长，相反有可能慢慢全死光呢

• 西子 (2012-4-05 15:39:21)

  我不这样认为，如果你在100mm dish中接种很少很少的细胞，长时间培养，细胞不但不长，相反有可能慢慢全死光呢
  
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  你说的对，但是我的方法一里面细胞不是“很少很少”，而是有一定的密度但是比放在一盘里面密度要低，不需要第二天第三天就去传代。你说的这种情况细胞之所以会死是因为细胞之间的communication太少或者没有了，但是我的方法一里面不会存在这种情况。

• 969 (2012-4-05 15:40:03)

  你说的对，但是我的方法一里面细胞不是“很少很少”，而是有一定的密度但是比放在一盘里面密度要低，不需要第二天第三天就去传代。你说的这种情况细胞之所以会死是因为细胞之间的communication太少或者没有了，但是我的方法一里面不会存在这种情况。
  
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  我以前养了细胞但是又不急用的时候，会留四分之一或五分之一继续培养，这样过大概五六天后才需要再传代。不过这种方法似乎会影响某些细胞后续的生长，比如293这样操作后生长速度明显会下降，但是感觉对pk15却没什么影响。
  不知楼主有没有比较两种操作方法对不同细胞的影响？

• zranqi_1 (2012-4-05 15:41:00)

  
  也来试着回答一下：
  
  我会选择方法二，实际也是这样做的。理由是使细胞尽可能‘同步化’：从冻存到复苏过程中细胞经历一次‘重生’，细胞的各种特性都可能发生一些不可预知的改变。放到一个盘子里，增加细胞密度和之间的communication，促使细胞尽快增殖和适应新环境，同步发展。另外，在对要复苏细胞的数量和状态不清楚的情况下，分到几个盘子复苏的风险就更大了。
  
  细胞复苏到适应新环境确实需要一个过程，比如增殖周期、分泌某些因子的功能、蛋白的表达等，都需要一个时期来‘唤醒’和稳定。否则可能出现结果不稳定，组间不明原因差异等情况。一般需要传2-3代。