荧光光度法研究微乳介质中丹参酮ⅡA与牛血清白蛋白

　　目的研究微乳介质中丹参酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用行为。方法采用荧光光度法，通过 Stern Volmer公式计算荧光猝灭数据和结合常数，通过计算热力学数据探讨丹参酮ⅡA和牛血清白蛋白的相互作用机理。结果常温下结合常数为 1.93×104L·moL-1，且结合常数、猝灭常数均随温度升高而降低，热力学数据ΔH0、ΔS0和ΔG0均为负值。结论在微乳液中，丹参酮ⅡA对牛血清白蛋白的猝灭机制属于复合物的静态猝灭过程，其结合机制可能为范德华力和氢键作用力。

　　药物小分子与生物大分子相互作用的研究是化学和生命科学热门课题之一。研究血清蛋白质与内源性化合物及药物相互作用的方法有荧光光谱法、电化学法、平衡透析法、液相色谱法和毛细管电泳法等。作者曾用紫外分光光度法研究了微乳体系中丹参酮Ⅱ A(tanshinoneⅡA,Tan ⅡA)和牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)的相互作用，结果表明，微乳液可以做为脂溶性药物Tan ⅡA和水溶性大分子BSA的共溶剂，并且二者在这样一个体系中有相互作用。本文通过荧光光度法进一步证明了Tan ⅡA和BSA在该体系中的相互作用，并研究了其作用机理。

　　一、仪器与试剂

　　UV 2450型紫外分光光度计;F 2500型荧光分光光度计;Orion828型酸度计;HH 2恒温水浴锅。

　　牛血清白蛋白(BSA,相对分子质量67000,分析纯)，1.08×103mol/L的水溶液，于4℃冰箱中保存;丹参酮ⅡA(对照品)，2.51×10-3mol/L的95%乙醇溶液;冰乙酸 磷酸 硼酸 氢氧化钠的B R缓冲溶液。其他化学试剂均为分析纯;实验用水为蒸馏水。

　　二、实验方法

　　用含水50%、pH值为7.24的微乳液作为共溶体系，固定BSA浓度在1.5×10-5mol/L，变化药物浓度范围 10×10-6～200×10-6mol/L。充分混合均匀，20℃下静置过夜至完全平衡。在波长283nm的激发光下，荧光分光光度计扫描3个温度(293K、298K和303K)时BSA在290～500nm范围内的发射光谱。激发光和发射光狭缝宽度均为5nm。

　　三、结果与讨论

　　1、微乳体系的确定

　　实验结果表明十二烷基*钠 正丁醇 正庚烷 蒸馏水微乳体系稳定，对药物的紫外光谱没有影响。不同含水量微乳液Tan ⅡA和BSA的溶解度实验表明:含水量10%～30%的微乳液可溶解Tan ⅡA，但使BSA沉淀;含水量70%～90%的微乳液可溶解BSA，但使Tan ⅡA沉淀;含水量40%～60%的微乳液可同时溶解Tan ⅡA和BSA。因此本文选择含水量为50%的微乳液作为溶剂体系。

　　另外，为选出能同时溶解药物和BSA的最适宜的微乳液，对非离子活性剂80 正丁基酒精 正戊烷 水和十二烷基*钠 正丁基酒精 正庚烷 水组成的两种微乳液的吸收光谱分别进行了测试。结果显示由十二烷基*钠 正丁基酒精 正庚烷 水组成的微乳液经振荡并放置一段时间待其稳定后对光谱没有什么影响。而在超声波下制备的非离子活性剂80 正丁基酒精 正戊烷 水和十二烷基*钠 正丁基 酒精 正庚烷 水组成的微乳剂系统都不稳定，而且在药物光谱上显示有很多杂质峰。

　　2、不同介质中BSA的荧光光谱

　　分别扫描在B R缓冲溶液中和在pH7.24的微乳液中的BSA的荧光光谱。比较B R缓冲溶液和微乳液中BSA的荧光发射光谱可见(λem=338nm,F=1070)，在微乳中的BSA的最高峰蓝移到332nm。荧光强度减弱到 643，这可能归因于微乳溶液的低界面张力和低黏度。

　　3、荧光法测定Tan ⅡA和BSA在微乳液中的结合行为

　　化合物的荧光强度可能因为某些分子的结合而降低，测定大分子的荧光性质可以得到小分子与蛋白结合的信息，如结合机理，结合方式，结合常数等。

　　记录283nm激发光下290～500nm波长范围内，BSA与不同浓度的Tan ⅡA反应后的荧光光谱。显示随着Tan ⅡA浓度的增加BSA的内源荧光强度有规律地降低，且峰形均基本不变，说明Tan ⅡA对BSA的荧光有猝灭作用。通过Stern Volmer公式：F0/F=1 KSV[Q]计算荧光淬灭数据，式中F0为淬灭剂不存在时的荧光强度，F为加入淬灭剂后的荧光强度，Ksv是Stern Volmer淬灭常数，[Q]是淬灭剂浓度。在不同的温度下，Stern Volmer图是线性和向上倾斜的，表明Tan ⅡA结合BSA的淬灭机制可能是静态淬灭过程，因为Ksv值随温度的升高而降低，如果是动态淬灭会出现相反的现象。

　　Tan ⅡA与BSA结合的信息可以通过计算荧光淬灭速度常数Kq得到进一步确定。Kq用下式计算：Kq=Ksv/τ0,τ0是没有猝灭剂时蛋白质的荧光平均寿命，生物高聚物τ0值是10-8s-1，因此Kq值是1012L·mol-1·s-1数量级，比最大散射碰撞淬灭常数2×1010L·mol-1·s-1 大。这显示淬灭不是由动态的碰撞开始的而是与化合物的分子结构有关。根据Stern Volmer曲线得淬灭常数。

　　4、Tan ⅡA和BSA的结合常数以及相互作用力类型

　　当小分子结合大分子，结合常数和结合的位置数目可从下面的方程式得出：

　　logF0-FF=logK nlog[Q]

　　式中，K为结合常数，n为结合位点的数目。用log(F0-F)/F和log[Q]的点作图能算出K和n。结合常数随着温度的升高而降低，其结果是导致Tan ⅡA BSA复合物的稳定性降低;同时，从n的数据也可以推断出BSA对Tan ⅡA是一个单独级别的结合位点。Tan ⅡA和BSA的结合参数和热力学参数。

　　通过分析与温度相关的热力学参数可以进一步说明BSA和Tan ⅡA之间的作用力类型。小分子和大分子作用力主要含有氢键、范德华力、静电力、疏水力等。从热函的改变(ΔH0)，熵值改变(ΔS0)和自由能的改变(ΔG0)，可以判断结合方式。热力学参数可用下面的方程式计算:

　　logK=-ΔH02.303RT ΔS02.303R

　　ΔG0=ΔH0-TΔS0

　　K和R分别是结合常数和气体常数。

　　ΔG0≤0，说明Tan ⅡA和BSA的结合是自发的过程。负的ΔH0和ΔS0一般被认为是在低电解质液中范德华力和氢键结合的证据，静电力相互作用中负的ΔH0值也可能扮演一定的角色。但这与BSA和Tan ⅡA分子结构分析不一致，在pH=7.24时，它们都带负电荷。因此推断，在微乳液中Tan ⅡA与BSA之间的结合方式可能是氢键和范德华力。

　　四、结论

　　本文以微乳液为共溶体系，用荧光分光光度法研究了脂溶性药物分子丹参酮ⅡA与BSA的结合作用，用Scatchard方程计算了二者的结合常数，结合常数为1.93×104L·mol-1，该结果与文献的研究结果基本一致。通过热力学参数的计算推得微乳液中丹参酮ⅡA对BSA的猝灭机制属于复合物的静态猝灭过程，其结合机制可能为范德华力和氢键作用力。