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请教一下，我用的是lipefectemine 2000进行转染，说明书上介绍的是24孔板的转染，质粒和脂质体混合起来是100微升，而24孔板通常加500微升培养液，那是要事先加入一些培养液还是就用100微升，那加多少呢？
再就是细胞的问题，我养的是HEC-1A细胞，成簇生长的，很难吹散，这样是不是影响转染效果啊，我转了好几次都没转进去，有没有转过这个细胞的前辈啊，指教一下呗，融合度是多少为好啊
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ending (2012-4-12 15:31:02)
再就是细胞的问题，我养的是HEC-1A细胞，成簇生长的，很难吹散，这样是不是影响转染效果啊，我转了好几次都没转进去，有没有转过这个细胞的前辈啊，指教一下呗，融合度是多少为好啊
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1.细胞尽量吹散
2.24孔的通常转染的体积量是500ul：先加入无血清无双抗培养基 培养一段时间，再5——8h小时换成5%——10%含血清培养基；
产品说明书上应该有详细的说明吧？
glass (2012-4-12 15:31:40)
再就是细胞的问题，我养的是HEC-1A细胞，成簇生长的，很难吹散，这样是不是影响转染效果啊，我转了好几次都没转进去，有没有转过这个细胞的前辈啊，指教一下呗，融合度是多少为好啊
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转染时先加入400ul的DMEM，再加100ul的混合液。
2541 (2012-4-12 15:32:06)
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根据ATCC的说明，我的细胞用的是McCOY's 5A培养液，转染是是不是就用无血清的McCOY's 5A，还是也用DMEM啊？
windy+++ (2012-4-12 15:32:30)
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如果原来就用McCOY's 5A培养液，转DMEM有时候细胞需要适应实验~~~~当然有些细胞例外，要根据具体实验来确定；
kuaizige (2012-4-12 15:33:02)
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你用的是什么脂质体，根据说明书上说的操作，我用的是invitrogen的脂质体2000，说明上说用Opti-MEM I,或者其他无血清的培养基，前者比较贵所以选择DMEM，我们细胞用的是DMEM培养基。
根据上面所说你应该用无血清的McCOY’s。
仅供参考。
yueban-1147 (2012-4-12 15:33:38)
我用的是6孔板。转染试剂也是用的是invitrogen的Plus和Lipo。转染的时候，我会先用200微升的optimen稀释质粒，vortex，然后加入4微升Plus，vortex，室温30min，然后加入稀释好的（200微升optimen+2微升Lipo）， vortex，室温30min，加入630微升opitmen。最后全部加入培养板。你可以4-6小时候换回正常的培养液。也可以持续到最后。
2541 (2012-4-12 15:34:00)
我就是一直用的McCOY's 5A，转了几次都没光，考虑可能是质粒时间太长失效了，换了质粒后右转了两回，100倍下一个视野也就几个荧光的细胞，转染效率也太低了，lipo和质粒都用的是推荐剂量，细胞融合度大60-70%，90%多也试过。培养液中未加抗生素。问题在哪呢，怎么才能提高转染效率呢。
one (2012-4-12 15:34:28)
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如果对操作有把握，那就更换转染试剂
2541 (2012-4-12 15:34:54)
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我只调整过细胞的融合度，如果调整一下质粒和lipo的比例呢，会不会有很大帮助呢？只能换试剂吗
one (2012-4-12 15:35:18)
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那样需要摸索条件，岂不是更麻烦
skytree (2012-4-12 15:36:37)
1，换新的lipo试试，融合度60～70时转。
2，转染GFP空载体看看。如果GFP空转染得好，你目的质粒转染得不好，说明你构建的质粒可能有问题。
3，如果荧光很少的话，你要看看到底是表达荧光的细胞少还是有很多细胞表达得很弱。
2541 (2012-4-12 15:37:08)
2，转染GFP空载体看看。如果GFP空转染得好，你目的质粒转染得不好，说明你构建的质粒可能有问题。
3，如果荧光很少的话，你要看看到底是表达荧光的细胞少还是有很多细胞表达得很弱。
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我的质粒应该是没问题的，因为有人用过，转染率还是挺高的。荧光下看过，表达荧光的细胞很少，也就1%-2%，而且好多荧光的细胞表达的很弱，这个1%-2%是把表达弱的算在内的。
转染6小时后换液，48小时观察细胞都没有死多少，我一直觉得是不是lipo有问题，那我换个试试吧。
其实我是做稳转的，这种转染率挑单克隆能成功不
2541 (2012-4-12 15:37:32)
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可是用病毒的话好贵呀，而且真的会有用吗，我就怕花了好多钱还是没结果
911 (2012-4-12 15:38:21)
将质粒+转染试剂混合物一滴一滴分散加入需要转染的孔！
一滴一滴是关键！再试试！
2541 (2012-4-12 15:38:45)
一滴一滴是关键！再试试！
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我是一滴一滴加的，从孔的一边加到另一边，加完还晃了晃，还是不行。
请教一下，质粒和转染试剂混合时加进去摇一摇就行还是用枪轻轻吹打？
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