[求助]这是真菌污染么？

最新回复

• ha111 (2012-4-16 17:19:16)

  
  再发一张

  
  58856516.snap.jpg

• ha111 (2012-4-16 17:19:38)

  
  可能是，也可能不是，因为照片不够清楚，关键是看不到立体的形态。
  从这张照片判断“是”的原因：一大砣，比单个细胞大，像霉菌；第二张图，视野里面有两个；应该拍更大视野，放大倍数小一点，让看看污染有多高丰度——因为可能不是。
  判读不是：因为也可能是一砣细胞，外周的开始凋亡或坏死，气泡状溶解聚堆；但这种一般丰度不太高。
  因此从照片上难以准确判断。
  实际上，看细胞间隙没有小的黑色颗粒，基本可以认为没有污染细菌之类；那么，如果此时污染了霉菌，培养基颜色会越来越紫——主要判断依据。
  此外，镜检的时候，故意晃动一下培养基；如果是霉菌污染，有照片所见的大小，应该此时丰度很高，在镜检下，会类似流沙（目测倒不一定看见，如果目测看见流沙状，要么污染非常非常严重；要么就是细菌，通常细菌污染可能性大）；
  而如果是死细胞团，在你现在所示密度下，培养基又没有问题，丰度不会很高，因此不会出现流沙样。
  此外，霉菌的3D纵深通常会比死细胞团高，就是死细胞团会扁平些；因为纵深高，透光会差不少，所以霉菌团会更黑（并且拉伸镜头微调焦距，每一层都比较黑），死细胞团会透亮一点。
  
  因此，如果你判断一定污染了，那么这张图确实像霉菌污染。

• ha111 (2012-4-16 17:21:44)

  这是倍数稍低一点的视野情况，像上图的大块状物没有很多，但是跟正常细胞形态差别很大

  
  28570718.snap.jpg

• ha111 (2012-4-16 17:23:28)

  
  我同时养了两种细胞，上面的是其中一种细胞，细胞间有小黑点。另外一种细胞的培养液可能被污染了，这两天夜色变紫了。我不敢再用了。并且在另外一种细胞的视野下发现了，细胞周围杂线状物质。

  
  90738872.snap.jpg

• ha111 (2012-4-16 17:24:07)

  
  在我养的两种细胞中都出现了像水中漂浮的海藻一样的物质，有的成堆出现，一端与贴壁细胞相连，另一端在培养液中飘浮。但是也不能排除为相连接的死亡细胞

• ha111 (2012-4-16 17:26:43)

  
  如图中视野中心成串的透亮细胞

  
  47172600.snap.jpg

• summerxx (2012-4-16 17:29:00)

  
  培养的什么细胞

• ha111 (2012-4-16 17:29:49)

  
  
  sk-br3和nci-n87

• october7 (2012-4-16 17:30:16)

  
  细胞间隙的小黑点，你应该拍高倍的大图，让我们看清黑点的情况。不过正常情况下，不应该有黑点在细胞间隙；如果染菌，细胞间隙的黑点，会成片，形成一层黑色的布满这个间隙，不是一个个单菌落似的。
  嗯，不知道我猜的对不，因为这两种细胞我都没养过。你show大图的是nci-n87。
  培养基变紫，不知道是指用在细胞上的，还是说配好在瓶子里的（没加在细胞上的培养基变紫，可能只是你操作时间过长，与空气接触太久变紫；也可能是污染）；其实判断培养基有没有染菌很简单，拿个空瓶子或空平板，加点培养基扔37度培养过夜，基本上就能知道有没有污染了，因此理论上这种情况下，培养基应该始终澄清的；污染了，该长的东西就长出来了，培养基颜色该变也就变了。一天看不出来，你可以多放几天，呵呵；反正验证完，这点是扔掉的。
  总的来说，你的细胞养得很差，尽管没养过。
  1. 大量细胞成空泡状自溶。通常情况下，这是培养箱缺水的指针；同时如果你说的变紫是细胞上的培养基，也可能是缺水干掉后，颜色加深。
  2. 因为你的细胞自溶，不难理解你说的和细胞相连的漂浮物，基本判定是死细胞。
  此外，ATCC说nci-n87用1640养，这种培养基容易变黄。
  PS：养细胞的troubling shot，真麻烦，要能真实看一眼就全清楚了；但是培养基是否污染，我提的方法是最直接的。

• ha111 (2012-4-16 17:30:41)

  
  细胞间的黑点是不会动的，不太像活的东西。我溶解血清的时候没有4度过夜，而是37°直接溶的，可能血清有不溶解的东西。也有可能是细胞状态不好，部分细胞释放出的颗粒。但是也不排除真菌孢子。
  我的培养基和PBS都已经取出培养3天了，有两份发现有两个不容黑色物质，但是均未增大，未生长。
  我已经给我的细胞加了氟康唑，不知能不能救回来。
  并且，氟康唑有可能影响细胞的生长。准备再养两天观察一下，是在不行就把细胞丢了再买。

• ha111 (2012-4-16 17:32:43)

  
  我更换了PBS和培养液，多次PBS冲洗，现在细胞状态较前好多了。

• Ao7 (2012-4-16 17:33:27)

  
  我养的也是NCI-N87，细胞长的很慢，而且空泡也很多，细胞间隙也有小黑点。第一次养细胞，不知怎么办是好，有什么好的经验传授点，谢谢了。

• ha111 (2012-4-16 17:33:56)

  
  真是汗颜啊，我的细胞也是这个样子长啊，空泡也很多啊！至于小黑点的问题，请问你是用的什么血清？

• zranqi_1 (2012-4-16 17:34:51)

  这几天实在忙没时间回复，天天做大剂量放射，精神崩得太紧了。
  实际呀，你们的毛病是类似的；什么问题呢？——血清。
  细胞长出空泡，除非特殊的细胞，多数情况下，肿瘤细胞不会长成这个样子，会很透亮很漂亮，那问题在哪儿呢？
  首先你们必须肯定，你们的细胞培养的都不好（很多空泡，空泡不是细胞的正常形态）；其次，上次我提过培养箱的水，那么即使干掉了，你们应该已经补充过了；那么就是最后一种可能，血清的质量不好，细胞生长很差。
  为什么是血清的问题呢？已经肯定过培养基不长菌，即没有其他微生物和细胞争夺养分，那么此时细胞仍然生长不好，只剩下血清质量不好（培养基粉如1640或者DMEM一定是进口的，又过滤确定无菌，那么这个不会有问题；除了培养基，那么细胞上面的只剩下血清）。
  不知道你们用什么血清。用过四季青，用过hyclone，用过gibico。两种进口的都还不错，但是hyclone血清似乎添加了某些生长因子，细胞生长过快，一些结果换用其他品牌，不一定能重复，这是一个隐忧。
  细胞间隙中的小黑点，有三种可能：污染物、血清中的杂质、细胞内容物。
  如果是污染物，切记，细菌和真菌和细胞一样也喜欢贴壁的，细菌生长过快，当间隙填充满了，就开始悬浮生长，所以看到的往往都如流沙状。真菌经常也是一端黏在培养板上，菌丝漂浮。如果是污染物，间隙的黑点会增加连成片，时间久一点培养基还会浑浊、变色，或者可见的大块彩色霉菌团。
  如果是血清中杂质。一般是颗粒沉积，那么通常不是成片的，而是一点一点，而且颗粒比较大。
  如果是细胞内容物。通常是细胞空泡自溶后，黏在培养板上细小的黑色残渣，较早的时候，还可以看出空泡，自溶前胞质的阴影；时间久了，虽然细胞界限的痕迹消失，但是始终不会变多，不会将其他原本是间隙的地方填满。
  
  最后，你提到买细胞，我还要指出的是，实践证明国内细胞库很多细胞本身就带菌，有共生菌。原因，我想很多管细胞库的人，虽然天天接触细胞，真正水平有多高很难说。总之，经验告诉我，那是很痛苦的经历。所以，后来我们使用的细胞，全是经过复杂的审批手续，直接从国外合作实验室邮寄的——非常无奈的事实；我想，唯一可行的另一方案是，自己打裸鼠，重新纯化一下。
  细胞带菌——尤其共生菌，如何检测呢？因为是共生菌，往往不影响细胞生长，最多细胞生长慢一些，培养基容易变色，间隙容易长满黑色小点，且培养基不一定浑浊，很少流沙状（细胞密度低的时候，细胞自溶会多一些）；这很容易和正常细胞相混淆。但这种共生形式，实际上是一种非常脆弱的平衡。更换不同公司的血清，第二天忘记换液，培养基中血清浓度改变等等，往往都会刺激共生菌的生长。因为毕竟细胞对外界环境变化的适应要比细菌、真菌来得慢。
  所以，除了学会排除你们过滤的培养基无污染，也要学会判断购买的细胞是否健康。最简单的方案，当细胞第一次铺满传代的时候（这很容易，因为购买的细胞通常会将培养瓶灌满培养基，你完全可以保留一部分这些原始的培养基，维持最初一代的生长直至长满），一个培养瓶加无血清培养基（当然也可以是无抗生素有血清的），一个培养瓶加你以后要用的正常培养基，有问题，一般第二天就立竿见影，最差第3天一定会变化。当然你要预先确认无血清的培养基无菌，你的培养瓶无菌（我们基本一次性，这个倒不用考虑）
  PS：还有一个无奈的问题，很多刚从国外回来的，根本不知道怎么在国内的条件下养细胞，细胞培养的条件模仿国外、过于粗旷，这和实验室的设计、安排有关，我想这个你无从改变，只能倍加小心了。

• woshituzhu (2012-4-16 17:35:30)

  
  n87空泡是正常的 我从中科院买细胞的时候 那边的老师就说这种细胞是有空泡的
  我最近在养这个细胞 长得慢不说 培养基黄的太快了 可是用PH试纸检测PH值还有7 这是什么原因啊？
  我用的培养基和血清都是GIBCO的