[求助]救命啊！HepG2 细胞成团如何解决

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• tieshazhang (2012-4-17 13:51:21)

  
  不知道你的胰酶有没有加EDTA，其实对于一些细胞系，EDTA的作用还是很重要的，特别是有些细胞仅仅用胰酶消化时，细胞会呈片状掉下，但是细胞并没有分成单个，而是成团，即使反复吹打也不一定奏效，反而损伤细胞，加了EDTA对于分散细胞的作用还是很大的，如果你的胰酶加了EDTA还是这样，建议你先消化，待细胞变圆间隙变大的时候弃消化液，让残留的胰酶继续消化一段时间，这样也不容易消化过头，然后用手轻拍培养瓶，将细胞拍下，加新鲜培养基吹打分散细胞，分瓶培养。其实只要不是很大的团影响不是很大，想把细胞完全消化成单个单个的不太现实也没有那个必要。总之你自己把握这个尺度吧。

• 小螺号 (2012-4-17 13:51:42)

  谢谢楼上的帮助! 我的胰酶有加EDTA的,但我的细胞基本上都是一团一团的,没有太分散的细胞,所以不太可以看的到细胞间隙的变化,都是一团一团的掉下来,我刚刚在传的时候也增加了消化时间.可好象效果不是很明显,细胞一团一团的感觉包在里面的细胞都要死掉了,都要急死我了,这个十一看来只能和这个细胞较劲了,希望有经验的各位大侠能象xiongran一样帮帮忙啊!谢谢了!

• xueyouzhang (2012-4-17 13:52:00)

  
  需要摸一下EDTA浓度1-2mM，另外用烧过的巴氏管轻轻吹打比较有效。

• utt0989 (2012-4-17 13:52:18)

  
  也许是你的细胞长得太过了，细胞老化

• 小螺号 (2012-4-17 13:52:38)

  
  谢谢各位的帮忙!我现在的细胞还是一团一团的,而且很厉害,如何才能打散已经成团的细胞为单个细胞呢?

• Ao7 (2012-4-17 13:52:58)

  
  传代的时候需要离心重悬吧，试试

• 小螺号 (2012-4-17 13:53:19)

  
  各位要继续帮帮我啊,成团的细胞还有啥办法可以变单层,离心我试过了,可能我的离心时间有点长,好象成团的更密了

• hustwb (2012-4-17 13:53:40)

  我养的也是hepG2，刚开始消化也是这个现象，现在我一般先胰酶消化1分钟，弃去，放孵育箱让残留的胰酶继续消化2分钟左右（建议镜下观察一下细胞形态，以判断消化是否充分），然后加培养液中和，反复吹打。我试了几次，还蛮好，你也可以尝试下

• 小螺号 (2012-4-17 13:54:03)

  谢谢楼上！不知您的胰酶是啥样的
  我也试了这样做,可是离散的细胞还是很少,消化完(有8分钟以上,胰酶是买来现成分装的应该没问题),还是一团一团的,现在长的也很慢了,如何才能在传代时把成团的细胞消化成单细胞呢.谢谢!

• hustwb (2012-4-17 13:54:42)

  你这个要从解决成团的原因开始解决你的问题。
  
  我个人认为啊，是由于前1次细胞94成团生在的，由于消化的时候胰酶穿透力不够，所以还是无法打开细胞团“恶性循环”所所致。
  
  解决的办法是：
  
  1.胰酶浓度稀释1倍，使用体积提高2-5倍（如平时用1毫升，现在用1.5-2毫升胰酶加pH7.4的d-hank's液1.5-2毫升稀释好后加入）。意思94用稀胰酶、长时间、大体积，思路来自组织块消化。
  
  2.细胞转瓶后，1般2-6小时基本贴壁开始生长，这时候摇晃晃倒1次，把未贴的成团的倒掉，再重新加入培养基开始正式培养，如此这样传几次9好了。
  
  我以前的wish细胞94这样解决的，你试试8。

• 小螺号 (2012-4-17 13:55:13)

  我明天就试试,请问这样细胞成活率高吗?还有我可以用没加血清的DMEM培养基稀释一酶吗?谢谢!阿

• hustwb (2012-4-17 13:55:35)

  
  培养基的pH值低（6.8），D-hank's液稀释胰酶的我都配到接近8.0的。1般调到7.4左右使用。

• 小螺号 (2012-4-17 13:56:00)

  
  谢谢!那如果我买的胰酶和DMEM培养基都是买的配制好的是不是就可以啊?我看他们的颜色差不多啊

• 阿k (2012-4-17 13:56:20)

  还有一种方法可以试一下：
  含有EDTA的胰酶消化终止吹打之后，将平皿静置，成团的细胞下降快一点，单个的细胞悬浮，然后再把上层的含有细胞的培养基转移至另一个平皿培养。