[求助]求助成骨细胞培养

最新回复

• newway (2012-4-20 15:27:22)

  
  实验办法有点问题。
  1.骨松质切成3*3mm大小偏大。最好再小点，1*1mm左右。
  2.25%胰酶37度消化30分钟.（ps：25%胰酶是不是有误？！ ）如果能仔细分离血管骨膜等，可不做此步消化。
  3.再给予2型胶原酶2ML消化90分钟，第一消化后弃酶液。第一次消化的时间太长，一般30分钟即可。（不知胶原酶浓度？）
  成骨细胞培养是较成熟的方法。但原代细胞培养很考验人的功底。
  祝顺利。

• qumm1985 (2012-4-20 15:28:05)

  是100mg的2型胶原酶溶到100ml的PBS液中，不知道是否应该用蒸馏水来溶解呢？
  请问具体的实验过程应该是怎么样呢？可否留个联系方式，qq或者MSN的，让我请教一下您！
  谢谢你的指导。

• qumm1985 (2012-4-20 15:28:43)

  
  胰酶是0.25%含有EDTA的。

• toy (2012-4-20 15:29:04)

  
  我用的是组织块培养法，感觉这种方法很好用，就没试过酶消化法，用一周的大鼠取颅骨，去除骨膜和组织等，尽量分离干净，然后剪颅骨中间那一块，宁愿少剪点，一定要取最好的那一块，外周弄不好的话，将来养出的细胞成纤维会比较多。还有你用28天的大鼠，我想问一下养出来的成骨细胞会不会混有成纤维细胞很多。
  将取好的颅骨剪碎，铺在培养瓶中，将培养瓶放入培养箱倒置4小时，取出培养瓶仍倒置，加培养基，再缓缓将瓶转过来，注意动作要轻，防止未贴牢的组织块掉下来，然后就等着细胞从组织块里爬出来 就OK了。
  第一次换液不要太急，一定要等细胞爬出来之后。
  希望能对你有帮助

• qumm1985 (2012-4-20 15:29:22)

  
  谢谢你的建议，可以写仔细一点你的组织块培养法的具体步骤，和用什么试剂吗？谢谢

• 小螺号 (2012-4-20 15:29:43)

  请问一下这样提出的成骨细胞可以传多少代，用成骨细胞做实验必须要原代培养嘛。谢谢各位高手！

• BUK (2012-4-20 15:31:12)

  1，将4-6天大鼠处死。
  2，将大鼠浸 入75%酒精，置10-15分钟，，取出置于消毒纸巾上，吸干表面乙醇，用剪刀符合颈部 前下头。
  3，放入消毒好的平皿中，用一尖镊子把穿着主头皮向后翻去，暴露出头骨更换用新尖剪刀，轻轻剪除暴露部分头盖骨。
  4，转入另一消毒好的平皿中，用两支镊子小心从颅骨片外方剔下颅骨膜，弃掉。用PBS冲洗三次。
  5，移入另一平皿中，将取好的颅骨剪成1mm大小小块，置入培养瓶底上，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20-30块
  6，轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿令组织小块流动，塞好瓶塞置37度温箱2小时左右，勿超过4小时，使小块微干
  7，从温箱中取出培养瓶，打开瓶盖，46度斜持培养瓶，使瓶底仍向上，向瓶底角部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块，因组织小块附着尚不牢，加液过猛时，能把组织块冲走，置温箱中静止培养。
  注意事项在上面已经写过了。
  
  培养液是DMEM+10%小牛血清
  缓冲液用的是PBS

• fklo83 (2012-4-20 15:31:31)

  
  我们用的是新生的SD大鼠（24小时）

• qumm1985 (2012-4-20 15:32:13)

  
  谢谢高手们的指点，我终于用二次酶消化法培养到了成骨细胞。但又遇到问题是：最后那次消化连消化剩余的骨片一起移入培养瓶内培养，那些骨片多久移除比较适合？而且杂质比较多，怎么提纯呢？还有成骨细胞贴壁牢固大概需要多久呢？我打算第一次液是7天，是否适合呢？请高手指点一下。