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[求助]HUVEC培养“瓶颈”
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最近在养HUVEC原代，用胶原酶消化人脐带，收集内容物进行培养，养在小培养瓶中，三天后可长满。由于是贴壁细胞，瓶子又用明胶铺底，所以我使用了0.1%的胶原酶1ml+2%胰酶的0.2%EDTA1ml，5分钟细胞就消化下来了，但是问题也来了：第二天发现细胞并不贴壁，第三天就死了！连续两次都是这个样子！很可惜啊！请教HUVEC培养达人，是不是我所使用的消化液太强了，对细胞的损伤太大了？有没有好的方法推荐？谢谢啊！
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最新回复
zhezhe (2012-4-21 12:28:54)
newway (2012-4-21 12:53:12)
newway (2012-4-21 12:53:40)
zhezhe (2012-4-21 12:54:11)
恩，那你的消化液也不强啊，为什么也不贴壁呢？另外，胶原酶是要比胰酶温和些的，我想损伤也应该小些吧，今天准备试试单纯用胶原酶的。
yapuyapu (2012-4-21 12:54:36)
当原代细胞融合80％以上后，加入0．05％ 胰蛋白酶一0．02％EDTA 溶液消化，倒置显微镜下观察，当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液，加入细胞培养液终止消化，收集细胞悬液。1 000 r／min离心10 min，弃上清，制成单细胞悬液。此时可用0．5％台盼蓝染色，计算活细胞百分率，并以血细胞计数板计数。调整细胞浓度为1×10 个／ml，接种于培养瓶或培养板中继续培养。待细胞长满，彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。
yapuyapu (2012-4-21 12:55:54)
Name: Primary Umbilical Vein Endothelial Cells; Normal, Human
Related Products:Trypsin-EDTA for Primary Cells
Trypsin-EDTA for Primary Cells is a low-concentration formulation (0.05% Trypsin and 0.02% EDTA in phosphate buffered saline without calcium or magnesium) of porcine pancreatic trypsin and EDTA that is suitable for the dissociation of cell monolayers that are susceptible to "over-trypsinization." These adherent cells include primary cells (i.e., ATCC ® Primary Cells Solutions™ cell types) as well as a variety of mammalian cell lines that are propagated in serum-free or low serum conditions. Please refer to the product sheet supplied with each primary cell for details as to use, or contact ATCC Technical Service.
ATCC上推荐的计量是0.05%的胰酶+0.02%的EDTA ：）
pengke1983 (2012-4-21 12:56:53)
2%的胰酶浓度太高，我一直用的是0.125%Trypsin+0.01%EDTA消化传代，消化的时间也不用5min，显微镜下观察细胞变圆轻轻拍打培养瓶，会有大量细胞被消化下来，离心重悬后细胞状态以及贴壁性都还好。另外HUVEC传代培养还是加生长因子吧。
toy (2012-4-21 13:00:02)
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呵呵。看你的描述，多半是消化过度，导致细胞损伤了。你用混合酶液，而且所用的浓度都特别的高。。 这个浓度，太吓人了哈。。 胰酶我们一般都是0.25%+0.02%EDTA，你看，你的浓度都是我们的10倍（而且还加了胶原酶的），同样的消化时间下（消化时间我们差不多是4分钟左右）这么高的酶浓度，细胞膜外被的一些起贴附作用的纤连蛋白或膜整合蛋白受到严重的损伤了，怎么可能会让细胞帖壁的呢。。呵呵，特别是你养的是原代细胞哦，更脆弱，一般原代培养胰酶有的还推荐用0.1% 胰酶+ 0.02%EDTA 的来做原代培养后的传代。对于贴壁细胞传代， 用酶，无非就是想让细胞分散脱离成单细胞，建议你以后用的酶浓度适当降低点试一试。 呵呵。以上为拙见， 请指教。 。
zhezhe (2012-4-21 13:00:53)
谢谢大家的热情帮助！告诉大家一个好消息——我的细胞昨天传的，今天贴壁了，谢谢楼上的所有人，大家说我的消化液浓度太高了，于是昨天我仅用了0.1%的胶原酶500ul和0.02%EDTA500ul，没加胰酶，消化的时候不规定时间，而是在显微镜下观察，细胞一旦大部分变圆即可终止，我觉得也应该尽量减少细胞在外界暴露时间，操作尽快。现在和大
xingyi08 (2012-4-21 13:01:30)
我建议你下次分了原代，不要养在25的瓶子中，而是分种在24孔板的多个孔内，应该能种4-5个孔吧，等长满后每个孔用不同的方法进行消化，这样可以用一根脐带在一次实验中比较不同的消化液配方了！
131415 (2012-4-21 13:02:50)
这个浓度（0．05％ 胰蛋白酶一0．02％EDTA ）是原代脐静脉内皮细胞的推荐传代浓度
希望对你能有帮助
tangxin_80 (2012-4-21 13:03:59)
对了，你的内皮细胞是自己分离培养的吗？
lixi559 (2012-4-21 13:04:45)
我也是自己分的原代脐静脉内皮细胞，3-4天长满后，用无钙，镁的PBS冲洗2-3遍，加入0.05%胰酶+0.02%EDTA（gibco）800ul-1000ul，大约几十秒后细胞间隙增大，变圆，消化的过程中可以拍打培养瓶帮助其从瓶底脱落，注意观察，掌握时间（不到1分钟），及时加完全培养基终止胰酶，并1000r 10min离心去掉EDTA，passage。
你用的0.25%的胰酶浓度可能偏高，且消化时间过长（4-8min），原代细胞很脆弱，可能消化过度造成细胞损伤不贴壁。我用0.05%的浓度不到一分钟就能消化下来，建议你重新配置胰酶
u234 (2012-4-21 13:05:30)
怎摸拍打培养瓶
987789 (2012-4-21 13:05:57)
胰酶浓度太高，0.25%就行。消化大约2-3分钟。这么高的强度和这么长的时间，肯定不行了。另外根本不需要胶原酶。
u234 (2012-4-21 13:06:35)
不是吧，2，3min根本消化不下来
hyuu (2012-4-21 13:07:42)
可能是胰酶浓度高了，3分钟左右消化加吹打应该可以了，我觉得还是镜下直观观察的好
yysr238 (2012-4-21 13:08:23)
细胞的消化分难易，容易消化的细胞就不说了，对于难消化的，可以按如下方法进行，“一种万能消化细胞法”，我自己“发明”的，哈哈，如下：
1. 加2～5mL 0.25%的胰酶至培养瓶中，根据瓶大小和底面积来加，覆盖细胞就行。
2. 将细胞在室温放置，2～5min。
3. 将胰酶倒掉，可以稍微留一点在瓶底。
4. 将细胞放至37度培养箱消化3～8min，期间可以拿出在镜下观察细胞形态，开始变圆就可以终止消化了。
5. 对于多数细胞，可以用手拍打培养瓶的侧壁（促使细胞脱壁，利于后面吹打成单细胞悬液），然后赶紧加培养基终止。
这种方法经我实验，屡试不爽，无坚不摧，呵呵，而且不需要用到EDTA，不影响细胞活力，细胞成活率也比较高。
个人经验，欢迎拍砖。
DDD (2012-4-21 13:08:48)
我养HUVEC快4个月了，用的消化酶跟yizhiyu777你一样，细胞传代长在瓶子里没有问题，可是我用3代做试验时，种在6孔板里面，长24小时也没有问题，当我开始降低血清浓度为10%（原来为20%）时，部分孔中细胞形态发生改变，很虚弱，快要死掉的样子，好几次了，都如此，不知什么原因，我的试验因此耽误快2个月了，亟盼赐教 ，附照片。
DDD (2012-4-21 13:09:53)
请问下，原代HUVEC用0.05%胰酶+0.02%EDTA（gibco）消化一定要离心吗？我担心离心会对细胞活力很大损伤。还有，大家用HUVEC做试验时都是什么条件，血清浓度多少？有没有同步化什么的？
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